Actinobacillus pleuropneumoniae é o agente etiológico da pleuropneumonia suína, enfermidade amplamente distribuída no rebanho suíno mundial, responsável por prejuízos econômicos relevantes. Possui 12 sorotipos, determinados por técnicas de sorotipificação. Além disso é descrita a ocorrência de amostras não sorotipificáveis. O conhecimento do sorotipo prevalente nos surtos da enfermidade é necessário aos programas de profilaxia. Procurando contornar as dificuldades normalmente encontradas na sorotipificação de A. pleuropneumpnoae, a técnica de RAPD foi avaliada na genotipificação de amostras sorotipificáveis e não sorotipificáveis do agente. Foram utilizados amostras ATCC dos 12 sorotipos e amostras dos sorotipos, 1, 3, 5a, 5b, 7, 11 e 12 isolados no Brasil. Os primers OPG e OPG-19, utilizados individualmente nas reações, foram mais adequados para a diferenciação dos sorotipos. O primer OPG-19 detectou polimorfismos semelhantes entrer os sorotipos 1, 3, 4, 5 e 11; e sorotipos 7 e 12. O perfil de RAPD detectado pelo primier OPGF-10 diferenciou os isolados de campo dos sorotipos 1, 7, 11 e 12. Os sorotipos 3 e 5 apresentaram padrão de RAPD semelhantes, sendo diferenciados pelo perfil de exotoxinas característico, determinado previamente através de PCR. Este primer identificou quatro diferentes perfis de RAPD no sorotipo 3. Um destes foi semelhante ao obtido como sorotipo 11. Neste isolado, foi detecta a presença dos genes para ApxI e ApxII, características do sorotipo 11. As amostras do sorotipo 4 apresentaram perfil de RAPD semelhante ao identificado nos sorotipos 3 ou 5 com o primeir OPG-10, sendo identificada, por PCR, a presença dos genes para ApxI e ApxI, os quais não são característicos do sorotipo. Estas amostras foram isoladas em anos posteriores à amostras dos sorotipos 3 e 5 analisadas. Foi possível caracterizar 14 das 14 amostras não sorotipificáveis de A.pleuropneumpniae obtidas de suínos com sinais da doença. Entre as 4 amostras não sorotipificáveis isoladas de leitões sem sinais clínicos, apenas uma foi caracterizada através de RAPD. É possível que as demais amostras sejam outrtas bactérias NAD-dependente isoladas do trato respiratório de suínos. Amostras caracterizadas como A. minor e A. indolicus apresentaram perfis de RAPD divergentes dos identificados em isolados puros de A. pleuropneumoniae, comprovando a capacidade da técnica na caracterização do agente. Diferentes amostras do mesmo sorotipo de A. pleuropneumoniae apresentaram polimorfismos de RAPD idênticos, demonstrando reprodutividade da técnica. Os resultados comprovam a capacidade de tipificação de A. Pleuropneumoniae através de RAPD. A pesquisa de primers adequados para a diferenciação dos sorotipos 3, 4 e 5 aprimorar sua caracterização, o que pode vir a contribuir com as técnicas de sorotipificação tradicionalmente utilizados, ou permitir o uso como método de confirmação nas amostras cuja sorotipificação é problemática.

Gliomas são os tumores mais comuns no SNC, apresentando altas taxas de invasibilidade e proliferação, resistência à quimio e radioterapias, e elevados índices de recorrência e morte. As células-tronco tumorais constituem uma minoria dentre as células do tumor, apresentam características de células tronco neurais podendo sofrer diferenciação e auto-renovação. Linhagens celulares de gliomas, como U87, são capazes de produzir tumoresferas quando em alta confluência, que são similares às neuroesferas produzidas por células tronco neurais, e são ricas em células tronco tumorais (CSCs). Em gliomas, CSCs podem ser identificadas por expressarem o marcador de superfície CD133. Receptores purinérgicos estão envolvidos em diversos processos biológicos. O ATP induz respostas celulares como proliferação e diferenciação, e a degradação deste nucleotídeo por células de glioma é lenta, o que resulta no seu acúmulo no espaço extracelular. O objetivo deste trabalho é identificar a população de CSCs em U87 bem como o efeito do ATP na formação de esferas, expressão do marcador CD133, a expressão de genes de receptores purinérgicos e de genes marcadores de células diferenciadas (GLAST e CAMKII) e de células indiferenciadas (CD133 e OCT-4). U87 foram mantidas em condições padrão com 5% de SFB e esferas foram obtidas através de crescimento sobre ágar 1%. RNA total foi extraído de esferas e monocamada, e os genes de interesse foram amplificados em reação de RT-PCR com primers específicos. Esferas apresentam uma maior expressão de CD133, visto por citometria e imunodetecção. O mRNA de OCT-4 também foi mais expresso em esferas do que em monocamada, que expressa mais CAMKII e GLAST. ATP em uma concentração final de 100 µM reduz significativamente o número de esferas formadas (P<0.05) durante um período de 7 dias e também reduz a expressão de CD133. Dentre os receptores purinérgicos, a expressão de P2X4 foi maior em esferas, e P2X6 em monocamada. Estes resultados indicam que as esferas possuem componentes de células tronco e que a sinalização purinérgica pode estar envolvida em importantes aspectos da biologia de CSCs. / Glioblastoma multiformes are the most aggressive tumors in the CNS and are characterized by high invasion and proliferation rates, as well as for being resistant to chemo and radiotherapies. This leads to one of the worst prognosis among cancers. Cancer stem cells (CSCs) are scarce among the tumor cells, but can undergo differentiation and self-renewal, being fundamental for tumor maintenance. Tumorspheres, which resemble neurospheres, can grow in glioma cell cultures and are rich in CSC. Additionally, CSCs seem to be more resistant to radiotherapy and strategies aimed at differentiating these stem cells have potential to produce less aggressive and more efficient treatment regimes. CSCs have been identified in different tumor types as well as in established cell lines such as the human glioma cell line U87, and are characterized by the presence of the CD133 glycoprotein. Purinergic receptors are stimulated by nucleotides and nucleosides, and are involved in many biological processes, including embryonic development. ATP induces several cellular responses, such as proliferation and differentiation, and it has been demonstrated that the degradation of this nucleotide is slow in glioma cells, which results in its accumulation in the extracellular space. The aim of this work was to characterize the CSC population in U87 and the effect of ATP in sphere formation. Spheres were obtained by plating cells on a thin layer of agar. Tumorspheres presented a higher amount of CD133 marker as analyzed by flow citometry and western blotting. mRNA expression of OCT-4, a marker of undifferentiated cells, was higher in spheres, while GLAST and CAMKII, markers of differentiated glial and neuronal cells respectively, presented higher expression in the monolayer cells. Cells plated in the presence of ATP 100 µM formed 54% less spheres (P<0.05) when compared to control and also had a reduced level of CD133 marker. Among the purinergic receptors, P2X4 expression was higher in spheres, whereas P2X6 expression was higher in the monolayer. Our results indicate that spheres have components of stem cells and that the purinergic signaling is involved in important aspects of CSC biology.

Carrapatos são artrópodos hematófagos distribuídos por todo o mundo e vetores de diversas doenças. Como todos os hematófagos, os carrapatos possuem um arsenal de moléculas que inibe a resposta hemostática do hospedeiro, o que viabiliza o repasto sanguíneo bemsucedido. O carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um carrapato de um só hospedeiro e considerado o mais importante parasito de animais domésticos da América Latina. O R. microplus causa sérios danos aos bovinos, direta, e principalmente, devido à espoliação de sangue que leva à anemia e diminuição da produção de leite e do ganho de peso; e, indiretamente, via a transmissão de patógenos, como Babesia spp. e Anaplasma spp. O R. microplus é também um modelo interessante para o estudo das relações parasitohospedeiro, visto que ele permanece fixado ao mesmo hospedeiro durante toda a sua vida parasitária, o que leva em torno de três semanas. Os objetivos deste trabalho são explorar os mecanismos farmacológicos da saliva do carrapato R. microplus capazes de modular o sistema hemostático, bem como o papel que esta modulação desempenha na relação parasito-hospedeiro. Nesse sentido, este estudo foi organizado em duas partes. Primeiramente, foi realizada uma investigação sobre os parâmetros hemostáticos em bovinos infestados por carrapatos. Em um segundo momento, foram estudados os mecanismos da saliva do carrapato envolvidos na inibição da hemostasia, assim como a habilidade do soro de bovinos repetidamente infestados (que apresentam resistência imunológica naturalmente adquirida contra o carrapato bovino) em interferir na ação antihemostática da saliva do carrapato. Na primeira parte do estudo, foi demonstrado que bovinos experimentalmente infestados com 20.000 larvas de R. microplus apresentam uma diminuição na capacidade de agregação plaquetária (em resposta a colágeno e ADP), bem como na coagulação sanguínea (evidenciada por um aumento nos tempos de tromboplastina parcialmente ativado e de protrombina), enquanto a contagem de plaquetas e os níveis de fibrinogênio aumentaram significativamente ao longo da infestação. Na segunda parte, foi demonstrado que a saliva de R. microplus: (i) apresenta atividade inibitória in vitro sobre a agregação plaquetária induzida por colágeno; (ii) inibe a indução de ativação endotelial; e (iii) reduz a trombogênese in vivo. Ademais, o soro de bovinos repetidamente infestados (RIBS) foi capaz de bloquear parcialmente a atividade anticoagulante e antitrombótica da saliva e totalmente a modulação da ativação endotelial, ao passo que o RIBS não apresentou nenhum efeito sobre a inibição da agregação plaquetária. O conjunto dos dados apresentados permite um melhor entendimento dos fenômenos que ocorrem no hospedeiro durante o parasitismo, e também fornece mais subsídios para uma maior compreensão do processo de hematofagia e dos mecanismos fisiopatológicos que regem a relação parasitohospedeiro. / Ticks are blood-feeding arthropods widely distributed in the world and vectors of several diseases. Like all hematophagous animals, ticks resort to a variety of molecules in order to avoid the host hemostatic response, which in turn allow a successful blood-meal. The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is an one-host tick, and is considered the most harmful parasite of domesticated animals in Latin America. R. microplus causes expressive injuries to bovines, directly, mainly due to blood spoliation, leading to anemia, and diminution of milk production and weight gain. Indirectly the tick is responsible for the transmission of pathogens such as Babesia spp. and Anaplasma spp. R. microplus is also a consistent model to study the parasite-host relationship, since it remains attached to the same host throughout the whole parasitic stage, which lasts around three weeks. This work aims at exploring the pharmacological mechanisms of R. microplus tick saliva able to modulate hemostasis, and the role of this modulation in tick-host relationship. In this sense, this study was organized in two parts: firstly, an investigation about the hemostatic parameters in tick infested bovines was performed. Secondly, the tick salivary mechanisms involved in the inhibition of hemostasis were studied, and the ability of serum from repeatedly infested bovines (which displays natural acquired immunological resistance to the cattle tick) to interfere in anti-hemostatic activity of tick saliva was also investigated. In the first part of this study it was shown that calves experimentally infested with 20,000 R. microplus larvae display a decrease in platelet aggregation (in response to collagen and ADP) as well as in coagulation ability (evinced by an increase in activated partial thromboplastin time and prothrombin time), whereas platelet blood count and fibrinogen level significantly increased during the course of infestation. In the second part of this work, it was demonstrated that R. microplus saliva: (i) displays in vitro inhibitory activity upon collagen-induced platelet aggregation; (ii) inhibits the induction of endothelial activation; and (iii) reduces thrombogenesis in vivo. Moreover, repeated infested bovine sera (RIBS) were shown to be able to partially block the delay of coagulation and the antithrombotic effect of saliva, and to totally abolish the modulation of endothelium activation, in spite of the fact that RIBS has no effect on the inhibition of platelet aggregation. The set of data presented in this work allows a better understanding of the phenomena occurring in the host during parasitism, and also gives more insights to improve the understanding of the hematophagy process and the pathophysiological mechanisms behind host-tick interaction.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:34:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 332307.pdf: 4190550 bytes, checksum: 47afc464a32ec01695950d5da6b3dda6 (MD5) Previous issue date: 2014 / A placenta é um órgão essencial no desenvolvimento embrionário e fetal. Este órgão contém vários tipos de células, entre as quais diferentes populações de células-tronco ou progenitoras, tais como as células-tronco mesenquimais (CTM), células-tronco hematopoéticas (CTHs) e trofoblásticas. O objetivo deste trabalho foi estudar a organização do nicho molecular de células-tronco no tecido da placenta humana a termo. Para isto, foram utilizadas técnicas histológicas, histoquímicas, imuno-histoquímicas e de microscopia eletrônica de transmissão (MET). As técnicas de coloração histológica empregadas nas amostras do tecido tiveram como objetivo identificar, principalmente, as características estruturais das vilosidades coriônicas (VC) e da decídua basal (DB). A técnica de coloração de Hematoxilina e eosina proporcionou uma visão geral do tecido placentário, de modo a permitir a identificação dos elementos teciduais da placenta. A técnica de coloração azul brilhante de Coomassie foi utilizada para identificar a presença de proteínas totais neste tecido. Outro teste utilizado foi Azul de toluidina (ATO) para identificar a presença de polissacarídeos ácidos, através da reação de metacromasia. As amostras, contendo o tecido placentário, reagiram mais fortemente com o ATO nas regiões do sinciciotrofoblasto, nos núcleos das células que compõem o estroma e na parede dos vasos sanguíneos das vilosidades coriônicas. Na região da decídua basal, a reação também foi positiva ao ATO nas células deciduais, porém, na matriz extracelular esta reação foi menos intensa, quando comparada com as regiões do sinciciotrofoblasto e da parede dos vasos sanguíneos das vilosidades coriônicas. Testes realizados com o ácido periódico de Schiff mostraram que a reação foi positiva em praticamente todas as regiões das vilosidades, mas houve uma positividade maior na região do sinciciotrofoblasto. Com relação à decídua basal (DB), a presença de polissacarídeos neutros também foi confirmada em praticamente todas as regiões da decídua. A técnica de Mallory revelou que fibras de colágeno estão presentes em grande parte nas regiões tanto das vilosidades coriônicas, bem como, na decídua basal. Esta técnica é capaz de revelar a presença dos diferentes tipos colágenos que estão presentes tanto nas vilosidades coriônicas quanto na decídua basal, porém, sem a identificação de quais são os tipos presentes neste tecido. A técnica de imuno-histoquímica empregada no tecido da placenta teve como objetivo avaliar a expressão dos marcadores CD73, CD105 e CD34, bem como, o perfil de expressão do colágeno do tipo I, fibronectina e laminina na matriz extracelular (MEC). O perfil expresso10pelos marcadores CD73+, CD105+ e CD34+ na superfície da membrana das células, e pelas moléculas de MEC como o colágeno do tipo I, a fibronectina e a laminina, se mostrou positivo. Estes resultados nos mostram que as CTMs tem uma disposição na região das vilosidades coriônicas, em associação com moléculas de laminina e de colágeno. A fibronectina se expressa nas vilosidades coriônicas sempre com associação à lâmina basal e perivascularmente. No sinciciotrofoblasto as CTM se associam próximas às células CD34+ com característica de CTH. As análises ultraestruturais demonstraram plena atividade metabólica e de células que organizam a placenta, tanto bioquimicamente quanto metabolicamente, sugerindo que a placenta, mesmo a termo, é ainda capaz de produções celulares, tanto de CTs quanto na homeostase do tecido.<br> / Abstract : Placenta is an essential organ in the development of the embryo and/or fetus. It is a readily available material, easy to obtain, and there is no association between its use and risks for the mother or fetus health. The organ contains several types of cells, including different populations of stem cells or progenitor cells, such as mesenchymal stem cells (CTM), hematopoietic stem cells (CTHs) and trophoblast. The aim of this work was to study the molecular niche organization of stem cells in the tissue of human placenta at term. Therefore, it was possible to use histological, histochemical and immunohistochemical techniques, and also, transmission electron microscopy (TEM). Histological staining techniques employed on tissue samples aimed to identify, mainly, the structural characteristics of chorionic villi (VC) and decidua basalis (DB). Hematoxylin and eosin stain provided placental tissue overview in order to enable the identification of placenta tissue elements. Coomassie brilliant blue staining technique was used to determine the presence of total protein in the tissue. Results showed the placental tissue structures as a whole. Another test performed was toluidine blue (ATO) to identify the presence of acidic polysaccharides by metachromasia reaction. Samples with placental tissue reacted more strongly to the ATO in regions of syncytiotrophoblast, cells nuclei comprising the stroma and blood vessels wall of the chorionic villi. In the basal decidua region, there was also a positive reaction to ATO. However, it was less intense when compared to the regions of syncytiotrophoblast of chorionic villi of tissue. Tests performed with periodic acid of Schiff showed that the reaction was positive in virtually all regions of the villi, but there was a greater positivity in the syncytiotrophoblast region. With respect to basal decidua (DB), the presence of neutral polysaccharides was also confirmed in practically all regions of decidua. Mallory technique revealed that collagen fibers are present largely in the areas of both chorionic villi and basal decidua. That technique can reveal the presence of different collagen types that are present in both chorionic villi and basal decidua; however, without identifying which types are present in the tissue. The immunohistochemical technique employed in placental tissue aimed to evaluate the markers expression: CD73, CD105 and CD34, as well as the expression profile of collagen type I, fibronectin and laminin in the extracellular matrix (MEC). Profile expressed by markers CD73+, CD105+ and CD34+ on cells membrane surface and MEC molecules such as collagen type I, fibronectin and laminin showed in a positive12way. These results show that CTMs have a disposition in the region of chorionic villi in association with molecules of laminin and collagen. Fibronectin is expressed in chorionic villi always associated with basal lamina and perivascularly. In the Syncytiotrophoblast, CTM associate close to CD34+ cells with CTH characteristics. Ultrastructural analysis presented full metabolic activity and cells that organize the placenta both biochemically and metabolically, suggesting that the placenta even at term is still capable of cells production not only of CTs, but also for tissue homeostasis.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2016-01-15T14:46:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 331766.pdf: 1793008 bytes, checksum: 2362897a8513fad6a59efa1d2242d7bd (MD5) Previous issue date: 2014 / A deficiência intelectual (DI) afeta cerca de 1 a 3% da população mundial, estando distribuída desigualmente entre os países industrializados e os países em desenvolvimento. É caracterizada como capacidade intelectual sensivelmente inferior à média, com significativas limitações que influenciam diretamente o funcionamento intelectual, as habilidades práticas, conceituais e sociais, que se manifestam até os 18 anos de idade, caracterizando-se assim uma doença do neurodesenvolvimento. Para avaliar o funcionamento intelectual, são realizados testes variados, sendo que o mais comum ainda é o do quociente de inteligência (QI). Dentre as DI herdadas, a consanguinidade é um considerável fator de risco. Quando casos semelhantes de deficiência intelectual ocorrem várias vezes em uma mesma família, geralmente se caracteriza a DI familial. O presente estudo teve como objetivo avaliar a etiologia da DI familial na Grande Florianópolis (18º SDR). Para o levantamento epidemiológico da DI e para a identificação de grupos familiais com mais de um indivíduo com DI, foram aplicados questionários de triagem, respondidos pelos pais e ou responsáveis dos alunos de 10 escolas especiais dessa região. Adicional ao objetivo principal foi implementado um Banco de Dados Biológico (BDB), devido a necessidade de se obter uma melhor organização e eficiência na guarda e coleta de dados do presente estudo. 884 questionários foram respondidos e analisados. Observamos uma maior prevalência do sexo masculino na população estudada, 34% dos alunos avaliados apresentam casos possivelmente familiais, um total de 306 casos. Dentre os casos com etiologia conhecida a Síndrome de Down (SD), foi a mais relevante, representando 14% de todos os 884 alunos investigados. E quando analisados os diagnósticos feitos conforme os níveis de gravidade, a queteve um maior predomínio foi a deficiência intelectual moderada (DIM). Cinco casos familiais foram selecionados para serem investigados em maior profundidade. O presente estudo vem a contribuir no conhecimento da DI familial e levanta reflexões sobre a alta incidência da DI familial. Este trabalho chama atenção para a necessidade de medidas públicas de prevenção e de aconselhamento genético para as famílias dos pacientes com doenças genéticas, em todos os níveis de atenção à saúde.<br> / Abstract : Intellectual disability (ID) affects about 1-3% of the world population and is unevenly distributed between industrialized and developing countries. It is characterized as an intellectual ability significantly below average, with significant limitations that directly influence intellectual functioning, practical, conceptual and social skills, which manifest before 18 years of age, thus characterizing a disease of neurodevelopment. To assess intellectual functioning, various tests are performed, and the most common is still the intelligence quotient (IQ) test. When similar cases of intellectual disability occur repeatedly in the same family, it usually characterizes familial ID. Among the inherited causes of ID, inbreeding is a major risk factor. The present study aimed to evaluate the etiology of familial ID in the Florianópolis Region (SDR 18). For the epidemiological survey of ID and to identify familial groups with more than one individual with ID, screening questionnaires were answered by the parents or guardians of students with special needs from 10 special education schools in this region. Additional to the main design, a Biological Data Bank (BDB) was implemented because of the need for a better organization and efficiency in guarding and collecting data from the present study. 884 questionnaires were returned and analysed. We observed a higher prevalence of males in the study population, 34% of the enrolled students represent possible familial cases, a total of 306. Among the students with known etiology, Down Syndrome (DS) was the most important, accounting for 14% of all 884 students investigated. And when the analysis of the diagnoses was made according to levels of severity of the ID, the higher prevalence was moderate ID. Five familial cases were selected to be investigated in greater depth. The present study contributes to the knowledge of familial ID and raises reflections about the high incidence of familial ID. This paper calls attention to the need for public prevention policies and genetic counselling for families of patients with genetic diseases, at all levels of health care.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento. / Made available in DSpace on 2012-10-26T10:20:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 310643.pdf: 1837787 bytes, checksum: e8147907865fe292d9b5e994a3ae1a21 (MD5) / A psoríase é uma doença inflamatória crônica, de etiologia desconhecida, que afeta a pele e as articulações. Nessa doença, assim como em outras doenças inflamatórias, tem sido observada a indução da expressão do gene HLA-G e a molécula produzida é sugerida como um possível mecanismo de proteção tecidual às respostas imunes pró-inflamatórias. O HLA-G possui na sua 3#UTR oito sítios polimórficos descritos: um polimorfismo de presença ou ausência de um fragmento de 14pb (14pb InDel) e sete SNPs (+3003 T/C, +3010 C/G, +3027 A/C, +3035 C/T, +3142 G/C, +3187 A/G e +3196 G/C). A partir disso, o objetivo deste estudo foi genotipar os polimorfismos da 3#UTR, em 100 pacientes e 100 controles (pareados por idade e gênero) e verificar a influência desses polimorfismos na patogênese da doença. Para isso, foi realizado um levantamento de dados epidemiológicos relacionados ao desenvolvimento e gravidade da doença (presença de sintomas de artrite psoriásica, história familial para a psoríase e idade de manifestação dos primeiros sintomas da doença) e estes foram testados como fatores de risco. O DNA foi extraído de sangue total e a genotipagem feita por PCR e visualizada em PAGE 7% corado com nitrato de prata, no qual o polimorfismo de 14pb foi identificado, e por sequenciamento os outros sete SNPs. Do total de pacientes, 57 eram mulheres, 44 indivíduos apresentaram casos na família, 43 manifestaram a doença antes dos 30 anos e 16 manifestaram artrite psoriásica. Foram realizados cálculos das frequências alélicas e genotípicas, análises de associações e a inferência de haplótipos. Após as análises foram encontradas associações, para pacientes que apresentam sintomas de artrite psoriásica, com o alelo *Del (OR=2,929; p=0,019) e o genótipo *DelDel (OR=4,398; p=0015) do polimorfismo de 14pb, assim como o genótipo +3142*CC (OR=6,02; p=0,015) e para aqueles que apresentaram sintomas antes dos 30 anos de idade o genótipo +3003*CT (OR=0,046; p=0,013). Em conclusão, os polimorfismos da 3#UTR do HLA-G são associados à doença bem como aos dados epidemiológicos considerados neste trabalho

Orientador : Prof. Dr. Alexander Welker Biondo / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 24/10/2014 / Inclui referências / Área de concentração : Biologia Celular e Molecular / Resumo: Micoplasmas hemotrópicos, também conhecidos como hemoplasmas, são bactérias pertencentes à classe Mollicutes, patógenos obrigatórios dos eritrócitos de uma diversidade de espécies animais. São responsáveis pelo desenvolvimento de quadro agudo caracterizado por anemia ou uma infecção crônica assintomática ou com variadas síndromes ainda pouco caracterizada podendo, inclusive, interferir em resultados de estudos experimentais em animais de pesquisa. Devido à incapacidade em cultivar estes organismos, técnicas moleculares tem sido utilizadas como padrão no seu diagnóstico e estudo, e novas espécies vem sendo descritas em todo o mundo, principalmente em animais silvestres e de vida livre. Mycoplasma coccoides e Mycoplasma haemomuris são os hemoplasmas mais comumente reconhecidos no sangue de roedores selvagens e de laboratório. Até o presente momento nenhum trabalho tratou de estudar a ocorrência, epidemiologia e caracterização clínica e molecular de hemoplasmas de roedores de vida livre no Brasil. Como a presença de animais selvagens em cativeiro em zoológicos inviabiliza a utilização de raticidas tóxicos ou anticoagulantes, a captura dos animais vivos tem sido utilizada como método de controle paliativo da infestação por roedores nestes locais. O objetivo deste estudo é investigar a ocorrência de micoplasmas hemotrópicos em ratazanas (Rattus norvegicus) de vida livre capturados no Passeio Público e Zoológico de Curitiba e comparar com variáveis hematológicas. Quarenta e três ratazanas foram capturadas entre o Passeio Público e o Zoológico de Curitiba, e 20 outras foram amostradas do criatório do Passeio Público, onde são mantidas para a alimentação dos animais carnívoros do acervo. Mais de sessenta e três porcento das ratazanas foram positivas em triagem universal para micoplasmas hemotrópicos por PCR quantitativa através de técnica de SYBR® Green. Uma amostra de ao menos 50% de cada TM obtida foi submetida a sequenciamento e determinadas como M. haemomuris com exceção de uma amostra, 94% similar ao hemoplasma felino 'Candidatus M. turicensis'. Análise filogenética de um fragmento de aproximadamente 1300 pb do gene 16S rRNA revelou que esta amostra é homóloga a um micoplasma hemotrópico descrito infectando um rato de colheita europeu da espécie Micromys minutus. A relevância da presença de uma nova espécie de micoplasma hemotrópico infectando essas duas espécies diferentes de roedores de vida livre em continentes tão distantes é incerta. Não foram detectadas alterações estatisticamente significativas nos parâmetros hematológicos entre as ratazanas infectadas e não infectadas, o que corrobora o caráter de baixa patogenicidade e/ou infecção silenciosa destes microrganismos. Estes achados sugerem que hemoplasmas possivelmente são endêmicos na região de Curitiba, e a epidemiologia destes microrganismos precisa ser investigada, assim como seu impacto na fauna local, nos animais selvagens e de cativeiro dos parques, com especial atenção ao seu potencial zoonótico. Palavras-chave: ratazana, anemia, hemoplasmose. / Abstract: Hemotropic mycoplasmas, also known as hemoplasmas, are bacteria belonging to the class Mollicutes, obligatory pathogens of the red blood cells of a variety of animal species. There organisms are responsible for the development of anemia and disease with acute or chronic course and may occur silently interfering with results of experimental studies in animal research. Due to the inability to cultivate these organisms, molecular techniques have been used as standard diagnosis and study, and new species are being described worldwide, mainly in wild and free living animals. Mycoplasma coccoides and Mycoplasma haemomuris are the most commonly recognized hemoplasmas in the blood of wild and laboratory rodents. To date no work attempted to study the incidence, epidemiology, and clinical and molecular characterization of hemoplasmas in free-ranging rodents in Brazil. As the presence of wild animals in captivity in zoos hinders the use of toxic rodenticides or anticoagulants, capturing live animals has been used as a method of palliative control of rodent infestation in these locations. The aim of this study is to investigate the occurrence of hemotropic mycoplasmas in free-ranging rats (Rattus norvegicus) captured in the Passeio Público and the Curitiba Zoo and compare with hematological parameters. Fourty three rats were captured and 20 others were sampled from the nursery, where they are kept for feeding the carnivorous animals of the parks. 63.5% of rats were positive in universal screening for hemotropic mycoplasmas by quantitative PCR using the SYBR® Green technique. A sample of at least 50% of each TM was subjected to sequencing and determined as M. haemomuris except for one sample, 94% similar to the feline hemoplasma 'C M. turicensis'. Phylogenetic analysis of a fragment of approximately 1300 bp of the 16S rRNA gene showed that this sample was homologous to a hemotropic mycoplasma described infecting a European harvest mouse (Micromys minutus). The relevance of the presence of a new species of hemoplasma infecting two different free-ranging rodent species in such distant continents is uncertain. No statistically significant changes in hematological parameters between infected and uninfected rats were found, which confirms the low pathogenicity and/or silent infection character of these microorganisms. These findings suggest that possibly hemoplasmas are endemic in the region, and the epidemiology of these organisms need to be investigated as well as its impact on local wildlife, captivity animals, with special attention to its zoonotic potential. Key-words: rats, anemia, mycoplasmal disease.

A insulina é um hormônio que apresenta ação anabólica em diferentes tipos celulares. Deficiência na secreção e/ou na ação deste hormônio resulta na diabetes mellitus, doença que acomete milhões de pessoas no munto. A busca por novas drogas que atuam na melhoria do estado diabético tem sido foco de intensos estudos, objetivando melhorar a qualidade de vida dos indivíduos diabéticos. Este trabalho investigou a ação de dois compostos de vanádio (sulfato de vanadil e ortovanadato, ambos peroxidados), sobre a glicemia e sua sinalização no músculo sóleo de ratos diabetizados com estreptozotocina (45 mg/kg). A administração do sulfato de vanadil e ortovanadato peroxidados (0,25 mM) na água de beber pelo período de uma semana, promoveu redução do consumo de água e ração, bem como redução significativa da glicemia quando comparados ao grupo diabético sem tratamento (D). A expressão das proteínas IR-ß e Akt não foi diferente entre os grupos. A ERK-1 apresentou grau de fosforilação significante maior no grupo controle estimulado com insulina (C+I). Por outro lado, em todos os grupos diabéticos sua fosforilação estava reduzida, exceto naquele tratado com POV e estimulado com insulina, cujo grau de fosforilação da ERK-1 foi similar à do grupo C+I. O grupo Diabético tratado com sulfato de vanadil peroxidado apresentou níveis de fosforilação da ERK-2 similares à do do grupo Diabético estimulado com Insulina (D+I). Ambos os grupos tratados com POV ou PSV e estimulados com Insulina apresentaram aumento significativo no grau de fosforilação de, aproximadamente, 25 % quando comparados ao grupo D+I. Nossos dados mostram que a administração dos compostos de vanádio peroxidados reduzem a glicemia em aproximadamente 30% e a sinalização intracelular em músculo sóleo pelo qual o vanádio promove este fenômeno é executado através de algumas proteínas da via de sinalização da insulina

Actinobacillus pleuropneumoniae é o agente etiológico da pleuropneumonia suína, enfermidade amplamente distribuída no rebanho suíno mundial, responsável por prejuízos econômicos relevantes. Possui 12 sorotipos, determinados por técnicas de sorotipificação. Além disso é descrita a ocorrência de amostras não sorotipificáveis. O conhecimento do sorotipo prevalente nos surtos da enfermidade é necessário aos programas de profilaxia. Procurando contornar as dificuldades normalmente encontradas na sorotipificação de A. pleuropneumpnoae, a técnica de RAPD foi avaliada na genotipificação de amostras sorotipificáveis e não sorotipificáveis do agente. Foram utilizados amostras ATCC dos 12 sorotipos e amostras dos sorotipos, 1, 3, 5a, 5b, 7, 11 e 12 isolados no Brasil. Os primers OPG e OPG-19, utilizados individualmente nas reações, foram mais adequados para a diferenciação dos sorotipos. O primer OPG-19 detectou polimorfismos semelhantes entrer os sorotipos 1, 3, 4, 5 e 11; e sorotipos 7 e 12. O perfil de RAPD detectado pelo primier OPGF-10 diferenciou os isolados de campo dos sorotipos 1, 7, 11 e 12. Os sorotipos 3 e 5 apresentaram padrão de RAPD semelhantes, sendo diferenciados pelo perfil de exotoxinas característico, determinado previamente através de PCR. Este primer identificou quatro diferentes perfis de RAPD no sorotipo 3. Um destes foi semelhante ao obtido como sorotipo 11. Neste isolado, foi detecta a presença dos genes para ApxI e ApxII, características do sorotipo 11. As amostras do sorotipo 4 apresentaram perfil de RAPD semelhante ao identificado nos sorotipos 3 ou 5 com o primeir OPG-10, sendo identificada, por PCR, a presença dos genes para ApxI e ApxI, os quais não são característicos do sorotipo. Estas amostras foram isoladas em anos posteriores à amostras dos sorotipos 3 e 5 analisadas. Foi possível caracterizar 14 das 14 amostras não sorotipificáveis de A.pleuropneumpniae obtidas de suínos com sinais da doença. Entre as 4 amostras não sorotipificáveis isoladas de leitões sem sinais clínicos, apenas uma foi caracterizada através de RAPD. É possível que as demais amostras sejam outrtas bactérias NAD-dependente isoladas do trato respiratório de suínos. Amostras caracterizadas como A. minor e A. indolicus apresentaram perfis de RAPD divergentes dos identificados em isolados puros de A. pleuropneumoniae, comprovando a capacidade da técnica na caracterização do agente. Diferentes amostras do mesmo sorotipo de A. pleuropneumoniae apresentaram polimorfismos de RAPD idênticos, demonstrando reprodutividade da técnica. Os resultados comprovam a capacidade de tipificação de A. Pleuropneumoniae através de RAPD. A pesquisa de primers adequados para a diferenciação dos sorotipos 3, 4 e 5 aprimorar sua caracterização, o que pode vir a contribuir com as técnicas de sorotipificação tradicionalmente utilizados, ou permitir o uso como método de confirmação nas amostras cuja sorotipificação é problemática.

Gliomas são os tumores mais comuns no SNC, apresentando altas taxas de invasibilidade e proliferação, resistência à quimio e radioterapias, e elevados índices de recorrência e morte. As células-tronco tumorais constituem uma minoria dentre as células do tumor, apresentam características de células tronco neurais podendo sofrer diferenciação e auto-renovação. Linhagens celulares de gliomas, como U87, são capazes de produzir tumoresferas quando em alta confluência, que são similares às neuroesferas produzidas por células tronco neurais, e são ricas em células tronco tumorais (CSCs). Em gliomas, CSCs podem ser identificadas por expressarem o marcador de superfície CD133. Receptores purinérgicos estão envolvidos em diversos processos biológicos. O ATP induz respostas celulares como proliferação e diferenciação, e a degradação deste nucleotídeo por células de glioma é lenta, o que resulta no seu acúmulo no espaço extracelular. O objetivo deste trabalho é identificar a população de CSCs em U87 bem como o efeito do ATP na formação de esferas, expressão do marcador CD133, a expressão de genes de receptores purinérgicos e de genes marcadores de células diferenciadas (GLAST e CAMKII) e de células indiferenciadas (CD133 e OCT-4). U87 foram mantidas em condições padrão com 5% de SFB e esferas foram obtidas através de crescimento sobre ágar 1%. RNA total foi extraído de esferas e monocamada, e os genes de interesse foram amplificados em reação de RT-PCR com primers específicos. Esferas apresentam uma maior expressão de CD133, visto por citometria e imunodetecção. O mRNA de OCT-4 também foi mais expresso em esferas do que em monocamada, que expressa mais CAMKII e GLAST. ATP em uma concentração final de 100 µM reduz significativamente o número de esferas formadas (P<0.05) durante um período de 7 dias e também reduz a expressão de CD133. Dentre os receptores purinérgicos, a expressão de P2X4 foi maior em esferas, e P2X6 em monocamada. Estes resultados indicam que as esferas possuem componentes de células tronco e que a sinalização purinérgica pode estar envolvida em importantes aspectos da biologia de CSCs. / Glioblastoma multiformes are the most aggressive tumors in the CNS and are characterized by high invasion and proliferation rates, as well as for being resistant to chemo and radiotherapies. This leads to one of the worst prognosis among cancers. Cancer stem cells (CSCs) are scarce among the tumor cells, but can undergo differentiation and self-renewal, being fundamental for tumor maintenance. Tumorspheres, which resemble neurospheres, can grow in glioma cell cultures and are rich in CSC. Additionally, CSCs seem to be more resistant to radiotherapy and strategies aimed at differentiating these stem cells have potential to produce less aggressive and more efficient treatment regimes. CSCs have been identified in different tumor types as well as in established cell lines such as the human glioma cell line U87, and are characterized by the presence of the CD133 glycoprotein. Purinergic receptors are stimulated by nucleotides and nucleosides, and are involved in many biological processes, including embryonic development. ATP induces several cellular responses, such as proliferation and differentiation, and it has been demonstrated that the degradation of this nucleotide is slow in glioma cells, which results in its accumulation in the extracellular space. The aim of this work was to characterize the CSC population in U87 and the effect of ATP in sphere formation. Spheres were obtained by plating cells on a thin layer of agar. Tumorspheres presented a higher amount of CD133 marker as analyzed by flow citometry and western blotting. mRNA expression of OCT-4, a marker of undifferentiated cells, was higher in spheres, while GLAST and CAMKII, markers of differentiated glial and neuronal cells respectively, presented higher expression in the monolayer cells. Cells plated in the presence of ATP 100 µM formed 54% less spheres (P<0.05) when compared to control and also had a reduced level of CD133 marker. Among the purinergic receptors, P2X4 expression was higher in spheres, whereas P2X6 expression was higher in the monolayer. Our results indicate that spheres have components of stem cells and that the purinergic signaling is involved in important aspects of CSC biology.