Les proteïnes fosfatases de tipus 2C (PP2C) conformen una família d’enzims monomèrics conservats al llarg de l’evolució. En Saccharomyces cerevisiae hi ha 7 gens estructuralment relacionats que codifiquen set isoformes de les PP2C (PTC1-7). La isoforma més estudiada en llevats és Ptc1 ja que aquesta fosfatasa pot dur a terme múltiples funcions específiques que no comparteix amb les altres PP2C. Com a resultat, el mutant ptc1 presenta defectes de creixement enfront diverses formes d’estrès com els que activen la via de senyalització de la integritat de la paret cel·lular (ex. pH alcalí, blanc de calcoflúor i cafeïna), en presència de cations (LiCl, CaCl2, ZnCl2...), enfront rapamicina (un inhibidor de la via TOR que senyalitza la manca de nutrients) o en presència d’etanol com a única font de carboni. A més, presenta problemes en l’herència de diferents orgànuls com són els mitocondris, el reticle endoplasmàtic o les vacuoles, entre molts altres defectes. Malgrat totes aquestes alteracions només es coneixen dos substrats de Ptc1: la quinasa Hog1 implicada en la via d’estrès osmòtic, i Ste5, una proteïna adaptadora de la MAPK que respon a les feromones. L’objectiu d’aquest treball consisteix en identificar possibles dianes d’acció de Ptc1 que permetin entendre millor els mecanismes funcionals d’aquesta fosfatasa. Degut a dificultats metodològiques inherents al treball amb fosfatases, vam dissenyar dues aproximacions genètiques que ens permetessin assolir el nostre objectiu. La primera estratègia consistia en rastrejar biblioteques genòmiques de llevat per trobar gens que sobreexpressats alleugerin la sensibilitat a pH alcalí, blanc de calcoflúor i rapamicina d’una soca ptc1Δ. Com a resultat de la cerca s’han identificat un total de 25 gens que alleugeren un o varis fenotips característics d’un mutant ptc1. La majoria dels gens s’han classificat en tres grups funcionals: cicle cel·lular, funció vacuolar i tràfic de proteïnes, i manteniment de la integritat de la paret cel·lular. En aquest treball es presenta un model que apunta que la hiperactivació del mòdul MAPK de la via Slt2 influiria en l’activitat de Cdc28 la qual seria limitant en un mutant Ptc1. D’aquesta forma es relaciona per primera vegada Ptc1 amb el cicle cel·lular. Degut que PPH21 i PPH22 (que codifiquen dues subunitats catalítiques redundants de la proteïna fosfatasa de tipus 2A) són els supressors que han presentat major potència de recuperació fenotípica en un mutant ptc1, hem aprofundit l’estudi de la interacció entre Ptc1 i aquests dos supressors. Els resultats obtinguts indiquen que la pèrdua de Ptc1 alteraria els diferents complexes de les PP2A que actuen com efectors de la via TOR quan aquesta es troba inhibida. La segona aproximació genètica es va basar en la hipòtesis que els defectes observats en un mutant ptc1 probablement es deuen a un estat hiperfosforilat d’un o més possibles substrats de Ptc1. Per això, vam generar una col·lecció de 115 mutants on es van combinar la supressió dels gens no essencials que codifiquen proteïnes quinases o subunitats reguladores d’alguna d’elles amb la mutació ptc1 i es va analitzar el seu creixement en vuit condicions on el mutant ptc1 és sensible. A partir de la integració dels resultats s’han detectat una àmplia varietat d’interaccions genètiques entre Ptc1 i diferents quinases, en consonància amb una àmplia extensió funcional de Ptc1. Tot i així, només la mutació de Mkk1 (una de les dues MAPKK de la via de la integritat de la paret cel·lular) és capaç de suprimir o alleugerir tots els defectes fenotípics estudiats de la soca ptc1Δ. Les dades obtingudes mostren que part dels defectes de ptc1 estan relacionats amb la hiperactivació de la quinasa Slt2 que actua downstream de Mkk1, reforcen la idea que Mkk1 és la principal MAPKK que actua sobre Slt2 i permeten postular que Mkk1 podria ser una diana important de Ptc1. / Type 2C protein phosphatases (PP2Cs) form a family of monomeric enzymes conserved throughout evolution. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, there are seven structurally related genes that encode different isoforms of PP2Cs (PTC1-7). Ptc1 is the most studied PP2C isoform in yeast because this phosphatase can perform multiple specific functions not shared by the other PP2Cs. As a result, a ptc1 mutant fails to grow against various forms of stress such as those that activate the cell wall signaling pathway (eg. alkaline pH , Calcofluor white and caffeine), in the presence of cations (LiCl, CaCl2, ZnCl2, …), rapamycin (an inhibitor of the TOR pathway that mediates the lack of nutrients response) or in plates with ethanol as the sole carbon source. A ptc1 mutant also presents defects in organelle inheritance such as mitochondria, endoplasmic reticulum or vacuoles, among many other defects. Despite all of these alterations only two substrates of this isoform are known: the Hog1 kinase involved in osmoregulation, and the pheromone-responsive MAPK scaffold protein Ste5. The aim of this study is to identify possible functional mechanisms of Ptc1. Due to methodological difficulties inherent in working with phosphatases, we designed two genetic approaches to achieve our goal. The first strategy was based on the screen of yeast genomic library to find genes that, when overexpressed in a ptc1 mutant, abolish or alleviate the sensitivity of this strain to alkaline pH, Calcofluor white or rapamycin. As a result we identified a total of 25 genes that alleviate one or several characteristic phenotypes of the ptc1 mutant. Most of these genes were classified into three functional groups: cell cycle regulation, vacuolar function and protein sorting, and cell wall integrity. We present a model where the hyperactivation of the Slt2 MAPK module would decrease the activity of Cdc28, which could become limiting in a ptc1 mutant. This would represent the first evidence of a possible role of Ptc1 on cell cycle regulation. We have focused on the relationship between Ptc1 and the two suppressors that exhibited the strongest ability to recover different phenotypes: PPH21 and PPH22, which encode two redundant catalytic subunits of protein phosphatase type 2A. The results indicate that loss of Ptc1 alters different PP2A complexes that act as effectors of the TOR pathway when it is inhibited. The second genetic approach was based on the hypothesis that the ptc1 mutant defects are probably due to an hyperphosphorilated state of one or more Ptc1 substrates. Therefore, we generate a collection of 115 mutants in which we combined the deletion of nonessential genes encoding catalytic subunits of protein kinases or their regulatory proteins with the ptc1 mutation, and analyzed their growth in eight different conditions in which the ptc1 mutant is sensitive. Integration of the results allowed detecting a wide variety of genetic interactions between Ptc1 and different kinases, in agreement with the wide functional spread of the Ptc1 phosphatase. However, only the Mkk1 mutation (one of the two MAPKK of the cell wall integrity pathway) can lighten or eliminate all phenotypic defects studied in the ptc1Δ strain. The data obtained show that at least part of ptc1 defects are related to the hyperactivation of the Slt2 kinase downstream Mkk1, reinforces the idea that Mkk1 is the main MAPKK acting on Slt2 signaling, and points to Mkk1 as a likely target for the Ptc1 phosphatse.

Tesi realitzada al Centre de Recerca en Agrigenòmica (CRAG) / Los isoprenoides constituyen la familia de metabolitos funcional y estructuralmente más diversa que se conoce. Se encuentran en todos los organismos aunque son especialmente abundantes y diversos en el reino vegetal, donde desempeñan papeles fundamentales en el metabolismo primario y secundario de las plantas. Derivan de un precursor común el isopentenil difosfato (IPP). La condensación de tres moléculas de IPP y una de su isómero dimetilalil difosfato (DMAPP) catalizada por la enzima geranilgeranil difosfato (GGPP) sintasa (GGPPS) genera GGPP, un compuesto precursor de isoprenoides plastídicos como carotenoides, giberelinas, plastoquinonas y la cadena fitol de clorofilas, tocoferoles y filoquinonas. El genoma de Arabidopsis thaliana presenta doce genes codificantes para proteínas con homología a GGPPS, de los cuales sólo diez codifican proteínas con actividad GGPP sintasa. Siete isoformas presentan localización plastídica, dos se encuentran en el retículo endoplasmático y una en la mitocondria. De los genes codificantes, sólo tres presentan un patrón de expresión ubicuo, mientras que el resto se expresan en tejidos y estadios de desarrollo muy concretos. Estos resultados sugieren que diferentes isoformas de GGPPS podrían estar asociadas a la formación de isoprenoides específicos. El primer objetivo de esta tesis fue investigar si en la célula vegetal existe una canalización de precursores (GGPP) hacia la síntesis de grupos concretos de isoprenoides, y en concreto hacia la síntesis de carotenoides. De las 10 isoformas de Arabidopsis, nuestra investigación se ha centrado en la isoforma GGPPS11 por ser la única plastídica de expresión ubicua, alta en tejidos fotosintéticos e inducible por luz, aspectos imprescindibles para estar relacionada con la síntesis de carotenoides. El análisis de tres mutantes de inserción de T-DNA ha revelado que esta isoforma es esencial en la síntesis de isoprenoides y que no presenta redundancia génica con el resto de la familia. La pérdida total de función GGPPS11 es letal y las semillas homocigotas del alelo ggpps11-3 se abortan como consecuencia de un bloqueo en los primeros estadios del desarrollo embrionario. En el mutante ggpps11-2 el T-DNA está insertado en la secuencia codificante del péptido de tránsito a plastos. Hemos demostrado que se traduce una proteína más corta cuya actividad se ejerce fuera del plasto permitiendo el correcto desarrollo embrionario y dando lugar a plántulas albinas incapaces de desarrollar hojas verdaderas como consecuencia de la ausencia de isoprenoides plastídicos. Por último, el mutante ggpps11-4 de pérdida parcial de función presenta un fenotipo de plantas más pequeñas y pálidas con una reducción del 20% en los niveles de carotenoides, clorofilas, tocoferoles y plastoquinonas, lo que permite concluir que esta isoforma está involucrada en la síntesis de la mayoría de los isoprenoides plastídicos derivados del GGPP. Además hemos demostrado que GGPPS11 puede interaccionar con varias enzimas que transforman el GGPP en los primeros intermediarios de las rutas que producen estos isoprenoides plastídicos, las enzimas fitoeno sintasa (PSY) hacia carotenoides, geranilgeranil reductasa (GGR) hacia clorofilas y tocoferoles y solanesil difosfato sintasa (SPPS2) hacia plastoquinonas. Proponemos que estas interacciones estarían facilitando la canalización de GGPP hacia las correspondientes rutas biosintéticas. El segundo objetivo de esta tesis fue analizar la canalización del flujo metabólico hacia la síntesis de carotenoides precursores del ABA en respuesta al estrés salino. Hemos demostrado que el único gen codificante para PSY en Arabidopsis se induce específicamente en la raíz después de un estrés salino para aumentar el flujo hacia la síntesis de carotenoides y que el estrés salino también provoca una inducción de los genes codificantes para las enzimas que sintetizan los precursores carotenoides (β,β-xantofilas) del ácido abscísico (ABA) reconduciendo el flujo de la vía hacia la síntesis de la hormona. / Isoprenoid represent the functionally and structurally most diverse group of metabolites. They are found in all organisms but are especially abundant and diverse in the plant kingdom, which play key roles in the plant primary and secondary metabolism. Most groups of plastidial isoprenoids derive from geranylgeranyl diphosphate (GGPP), which is produced from universal isoprenoid precursors by the enzyme GGPP synthase (GGPPS). In Arabidopsis thaliana, seven active isoforms have been confirmed to localize in plastids, one in the mitochondria and two in the endoplasmatic reticulum. GGPPS11, the most abundant plastidial isoform in vegetative tissues, has been proposed to be the main enzyme producing GGPP in plastids. Our comprehensive analysis of visual, molecular, and metabolic phenotypes of full and partial ggpps11 loss‐of‐function mutants has confirmed this hypothesis and established that GGPPS11 produces GGPP for the major groups of plastidial isoprenoids (carotenoids, chlorophylls, tocopherols, and plastoquinones). We also show that the GGPPS11 protein can physically interact with the enzymes that transform GGPP into the first committed intermediates of the pathways for the production of these plastidial isoprenoid metabolites. We propose that multienzyme complexes containing GGPPS11 and particular GGPP‐consuming enzymes might facilitate the channeling of GGPP to the corresponding isoprenoid biosynthetic pathways. Furthermore, we demonstrate that GGPPS11 might have an extra‐plastidial activity essential for the correct embryo development. As a second objective, we have analyzed the regulation of the carotenoid pathway in response to salt stress. We have demonstrated that the single gene encoding phytoene synthase (PSY), the first committed and flux regulator step or the pathway, in Arabidopsis is specifically induced in the root under salt stress increasing the flow through the synthesis of carotenoids. This stress also leads to the upregulation of other enzymes of the pathway that produce the abscisic acid (ABA) precursors, β,β‐xanthophylls. This root specific transcriptional regulation of the pathway promotes the channeling of carotenoid precursors through the synthesis of the hormone under such stress situation.

La mitocondria es un orgánulo de las células eucariotas en el cual se desarrollan multitud de procesos esenciales para la célula de los cuales se destacan la cadena de transporte de electrones, la síntesis de ATP, el ciclo de Krebs, regulación de la osmosis del calcio, apoptosis, etc. La mitocondria posee su propio genoma (mtADN) y su conservación es esencial para la viabilidad de la mitocondria y por tanto de la célula. El mtADN se transcribe y replica de modo independiente a la división celular y posee su propia maquinaria de replicación y transcripción. En este trabajo se expone el estudio de dos proteínas implicadas en el metabolismo del mtADN con funciones muy diferentes. La primera es Twinkle, es una helicasa y participa en la replicación del ADN mitocondrial. La segunda es TFAM, es una proteína implicada en múltiples procesos del metabolismo del mtADN, tales como transcripción mediante la interacción en las secuencias LSP y HSP, compactación del genoma mitocondrial, unión de las secuencias Site-X y Site-Y, reconoce estructuras dañadas del ADN, etc. El estudio de ambas proteínas se desarrolló principalmente en el marco de la biología estructural empleando técnicas como cristalografía de proteínas, microscopía electrónica y dispersión de bajo ángulo de rayos-X (SAXS). Además, los datos de obtenidos con estas técnicas fueron complementados con técnicas bioquímicas como calorimetría de titulación isotérmica (ITC), barrido diferencial de fluorescencia (DSF), ensayos enzimáticos y estudios de interacción proteína-ADN mediante técnicas electroforéticas y dispersión dinámica de la luz (DLS). El complejo proteína-ADN TFAM/ Site-X fue cristalizado y su estructura tridimensional resuelta. TFAM se compone de dos dominios HMGbox1 y 2 que contactan al ADN por el surco menor y además cada unos de ellos provoca que se doble 90 º el ADN. Además están conectados entre sí por un “linker” que posee una estructura tipo hélice que también interacciona con el surco menor. Finalmente TFAM envuelve al ADN doblado formando una estructura tipo “U-turn”. Los estudios termodinámicos no mostraron diferencias importantes entre distintos complejos TAFM/ADN con respecto a TFAM/Site-X. Todos ellos presentaron en todos los casos el típico perfil endotérmico de asociado a proteínas de unión al surco menor, excepto el complejo TFAM/poli-dA cuyo ADN es rígido y mostró un perfil exotérmico. Mediante estudios de dinámica molecular se evaluó la rigidez del ADN y se realizó una simulación de su estructura en disolución. Estos resultados mostraron que TFAM reconoce un patrón estructural del ADN definido por una región rígida y pre-doblada a 10pb de una región flexible también pre-doblada en las cuales contactan HMGbox1 y 2, respectivamente. En el segundo proyecto, Twinkle se logró expresar de modo recombinante en E.coli a gran escala de un modo soluble. Se estudió biofísicamente mediante DSF y DLS, y bioquímicamente se estudió su actividad helicasa y su interacción con el ADN. Además gracias a los estudios por crio-microscopía y SAXS, y con la ayuda de un programa de modelaje por predicción de estructura por homología de secuencia, se realizó un modelo del hexámero por microscopía, del heptámero por SAXS. Además mediante ambas técnicas de observo la gran flexibilidad de la proteína, principalmente del dominio N-terminal que se componer por dos subdominios ZDB y RDP los cuales se unen entre ellos por un “linker” desordenado e además tienen una interacción tipo trans entre los subdominios ZBD y RPD del monómero adyacente. Twinkle tiene otro “linker” flexible entre el RDP el dominio helicasa C-terminal. El domino C-terminal forma una estructura rígida de anillo y es responsable de la oligomerización, tanto para formar hexámeros como heptámero. En disolución Twinkle está en equilibrio entre los dos estados oligoméricos: hexámero y heptámero. / In this thesis are described two projects with two different DNA binding proteins: TWINKLE and TFAM in complex with DNA (Site-X). Both protein are human proteins and are involved into DNA mitochondrial metabolism, Twinkle is involved in mitochondrial DNA replication and TFAM in the DNA transcription and mitochondrial genome packaging. Crystallographic structure of TFAM/Site-X complex was solved using a molecular replacement method. TFAM is composed by two HMGbox, each one of them bind and bend the DNA Site-X in one point, bending the DNA 90º, and adopting a “U-turn” shape. From a structural point of view, all TFAM/DNA complexes did not show great differences between them. The TFAM/DNA complexes were analyzed by Isothermal Titration calorimetry and showed the same endothermic profile, typical from DNA-binding protein which bend the DNA as a consequence of minor groove interactions, and also similar thermodynamic values. However, TFAM-poly-dA complex showed an exothermic profile. In addition, molecular dynamic technique was used to study the rigidity and simulated the structure of Site-X in an unbounded state. This result showed that TFAM recognize a prebending Site-X DNA, and HMGbox1 bends in a rigid region and HMGbox2 in a flexible region, but both are prebended. This result may suggest this is a general recognition for others DNA sequences. The second project, consisted on the study of a human mitochondrial helicase: Twinkle. The structural data from this protein was obtained with a low resolution techniques: electron microscopy (EM) and Small Angle X-ray Scattering (SAXS). Despite the big difference between these two techniques, both showed similar results. With both techniques was seen that Twinkle is in equilibrium between a hexamer and heptamer in solution. Several 3D structure models were generated for both oligomeric states. In these model the C-terminal domain is responsible of oligomerization in a ring shape, even six or seven units for hexamer and heptamer respectively. The N-terminal domain is divided in two subdomains called ZBD and RPD. These domains are responsible of the Twinkle flexibility, both are connected by a disorded linker, and also the subdomains RDP are connected to the ring domain through other disorded linker. This flexibility was observed by EM and SAXS

Mantenir la homeòstasis de cations és essencial per la supervivència dels éssers vius, i en especial pels organismes unicel·lulars. El llevat Saccharomyces cerevisiae s’ha utilitzat al llarg dels anys com un organisme model per l’estudi del conjunt de processos que controlen els nivells intracel·lulars de cations. El potassi és el principal catió intracel·lular del llevat i està involucrat en diversos processos de la fisiologia d'aquest organisme. Per aquest motiu la seva homeòstasis està minuciosament controlada per un seguit de transportadors que permeten la seva captació, distribució intracel·lular i eliminació de la cèl·lula i per un conjunt de proteïnes reguladores d’aquests processos. Encara que es té constància de la rellevància del potassi en el llevat, les seves dianes específiques i les bases moleculars d’algunes de les seves funcions són poc conegudes. En aquest treball, mitjançant aproximacions d’eliminació del potassi del medi de cultiu, s’han pogut determinar els mecanismes d’algunes de les funcions conegudes del potassi i descobrir-ne de noves. S’ha demostrat que la manca de potassi provoca profundes alteracions en el perfil transcripcional del llevat. Entre elles destaquen l’accentuada repressió del gens que codifiquen proteïnes ribosomals i elements necessaris per la síntesi del ribosoma, dotant d’explicació molecular al ja conegut bloqueig en la síntesi de proteïnes provocat per la manca de potassi. L’eliminació del potassi del medi també provoca una caiguda dels nivells dels aminoàcids cisteïna i metionina que condueix a una activació del gens relacionats amb el metabolisme del sulfat i la síntesi d’aminoàcids sulfurats. Igualment, la privació del potassi comporta una acumulació d’espècies reactives de l’oxigen que produeixen un estat d’estrès oxidatiu a la cèl·lula. Aquesta respon amb l’activació transcripcional dels gens necessaris per combatre l’estrès oxidatiu, eliminar els oxidants i retornar la cèl·lula a un correcte estat redox. El llevat creixent en un medi sense potassi i en presència d’amoni acumula grans quantitats d’amoni a l’interior cel·lular a través del transportador de potassi Trk1 aprofitant la similitud química d’ambdós cations. Aquesta acumulació d’amoni activa vies per la seva fixació i eliminació en forma d’aminoàcids com és la via retrograda mitocondrial. L’eliminació del potassi del medi atura la proliferació cel·lular. Els nostres resultats han demostrat que aquesta aturada podria ser deguda a la disminució de les ciclines i d’elements reguladors de la formació dels anells de septines que afecten la progressió del cicle cel·lular. El potassi també l’hem relacionat amb la homeòstasi d’un nutrient essencial com és el fosfat. L’absència de potassi o la pertorbació de la entrada normal d’aquest catió indueix els gens involucrats en la obtenció i mobilització del fosfat, d’igual manera com ho faria la depleció o limitació del fosfat. En aquetes condicions, la resposta transcripcional d’aquets gens està regulada pels diferents elements que composen la via PHO. L’afectació en l’obtenció del potassi impacte en la normal homeòstasis del fosfat provocant la mobilització de les reserves emmagatzemades en forma de polifosfats. La limitació del potassi, però, no modifica els nivells de fosfat lliure intracel·lular però sí que provoca una caiguda del nivells d’ATP i d’ADP, que podrien ser el senyal d’activació de la via PHO. A més, la pertorbació de la homeòstasis del potassi afecta el creixement dels llevats en medis amb baixos nivells de fosfat. El conjunt de dades obtingudes en aquest treball ha permès descobrir nous vincles entre la homeòstasis del potassi i diversos processos cel·lulars, a més de la connexió d’aquest catió amb la homeòstasis de nutrients com el nitrogen, el sulfat i el fosfat. / The maintenance of cation homeostasis is essential for the survival of all living organisms and especially for microorganisms. The yeast Saccharomyces cerevisiae has been used over the years as a model organism for study the processes that control intracellular cation levels. Potassium is the major intracellular cation in yeast and it has been associated with various relevant cellular processes. For this reason, potassium homeostasis is tightly controlled by several transporters, that allow the cation uptake, intracellular traffic and efflux, and by a set of proteins regulating these processes. In spite of the importance of potassium for yeast physiology, not all relevant functional potassium-related targets have been identified. In this work, potassium starvation conditions are used to determine the mechanisms of some of the known potassium functions and to discover new ones. We show that lack of potassium causes major alterations in the transcriptional profile of yeast cells. These transcriptional changes include the marked repression of genes encoding ribosomal proteins and elements necessary for the synthesis and assembly of ribosomes, providing the molecular basis for previously observed halt in protein synthesis caused by potassium deprivation. The elimination of potassium from the medium also causes a drop in cysteine and methionine levels which lead to transcriptional activation of genes related to metabolism of sulfate and biosynthesis of sulfur-contain amino acids. Similarly, cells deprived for potassium accumulate reactive oxygen species which results in oxidative stress. Concomitantly, cells trigger the transcriptional activation of genes necessary to combat oxidative stress, eliminate oxidants and return cells to the proper redox state. Yeast cells growing on ammonium as nitrogen source but lacking potassium accumulate large amounts of intracellular ammonium, which is transported through Trk1 taking advantage of the chemical similarity of both cations. Ammonium accumulation activates the retrograde mitochondrial pathway, resulting in detoxification of ammonium by its integration into amino acids. The complete removal of potassium from the medium leads to growth arrest. Our results show that this arrest could be due to the decrease in cyclins levels and in proteins involved in the assembly of septin rings, elements that are necessary for cell cycle progression. We also have related potassium to the homeostasis of other essential nutrients such as phosphate. Depletion of potassium from the medium or disturbance of normal potassium uptake induces genes involved in the acquisition and release of phosphate, as it is usually observed in a situation of phosphate starvation. Under these conditions, the transcription of PHO-controlled genes is activated by different regulatory elements of the PHO pathway. Situations that impact on normal potassium homeostasis also cause mobilization of the phosphate reserves stored in form of polyphosphates. Potassium restrictions, however, does not alter the levels of intracellular free phosphate but it causes a drop in the levels of ATP and ADP, which could be the signal for the activation of the PHO pathway. In addition, on media with low levels of phosphate, disruption of normal potassium homeostasis effects yeast growth. The results obtained in this work have been crucial to uncover new links between potassium homeostasis and many important cellular processes, in particular establishing the link between the homeostasis of this cation with that of other essential nutrients such as nitrogen, sulfate, and phosphate.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques de Barcelona (IIBB-CSIC) / Ischemia-reperfusion injury (IRI) is an inevitable situation in clinical settings such as liver transplantation and hepatic resection. It develops when blood flow is interrupted for a long period of time (ischemia) and then it restarts (reperfusion). IRI pathophysiology is highly complex and includes a number of mechanisms, such as oxidative stress, inflammation, apoptosis, microcirculatory disturbances, that contribute to organ damage and limit the clinical outcome. In addition, in order to reduce the gap between the need and availability of donors, many transplantation teams now use liver grafts, that previously have been considered unsuitable for transplantation, such as the steatotic livers. Steatotic livers are characterized by an excessive lipid accumulation and present higher vulnerability against IRI in comparison to normal ones. Subsequently, the use of steatotic liver grafts has been associated with poorest transplantation outcome and higher incidence of dysfunction. In spite of the extensive investigations, IRI remains an unsolved problem and it is necessary the identification of new targets that could mitigate its adverse effects. Recently, sirtuin 1, (SIRT1) a nicotinamide adenosine dinucleotide (NAD+)-dependent deacetylase has gained increasing attention from researchers, due to its involvement in various cellular functions, including cell response to stress, cell cycle and metabolism. Although SIRT1 has been associated with beneficial effects against IRI in heart and brain, no data have been reported concerning its potential implication in hepatic IRI and liver transplantation. Consequently, the present thesis aims to investigate the potential role of SIRT1 in rat liver IRI in a model of warm ischemia-reperfusion in steatotic livers (first study), in a model of rat orthotopic liver transplantation, OLT, (second study) and in reduced-size orthotopic liver transplantation, ROLT, (third study). In the first study, SIRT1 has been associated with the beneficial effects of ischemic preconditioning (a well-known surgical strategy to prevent IRI). In rat OLT SIRT1 has been correlated with the activation of autophagic pathway. In ROLT SIRT1 has been shown to contribute to the beneficial effects exerted by angiotensin II inhibition. According these results, the present thesis concludes that SIRT1 is implicated in the hepatic IRI and that strategies that enhance its activity can be a promising approach to reduce liver IRI. / La lesión por isquemia-reperfusion (LIR) hepática es causa de una significativa mortalidad en caso de resecciones hepáticas y en el trasplante hepático. La LIR está relacionada con el desarrollo de fallo primario y con la disfunción primaria del injerto. Ella se está desarrollando por la privación del oxígeno durante la fase de isquemia y la nueva entrada de oxígeno, durante la reperfusión, la cual daña más el órgano sometido a isquemia. La LIR es un proceso muy complejo y varias investigaciones intensivas se han llevado a cabo para explorar los mecanismos de su patogénesis. Entre los más estudiados son el estrés oxidativo, la inflamación y la apoptosis. Además, debido a la gran demanda por órganos, muchos centros de trasplante se han visto obligados a utilizar injertos que anteriormente eran considerados inapropiados para trasplantar. Los hígados esteatósicos son un ejemplo; se caracterizan de una acumulación exagerada de lípidos y son más vulnerables frente la LIR. Además, están correlacionados con una incidencia elevada de disfunción después del trasplante. Consecuentemente, es necesario la identificación de nuevas estrategias que confieren una protección eficaz frente la LIR y especialmente en caso de hígados esteatósicos. La sirtuina 1 (SIRT1) es una enzima que elimina el grupo acetilo en varias proteínas y así regula varios procesos celulares, como la respuesta frente varios tipos de estrés, el ciclo celular y el metabolismo. Estudios recientes en el corazón y el cerebro han asociado la activación de la SIRT1 con una aumentada resistencia frente la LIR. No obstante, no se ha reportado todavía una posible implicación de la SIRT1 en la LIR hepática o en el trasplante. La presenta tesis tiene como objetivo investigar la implicación de la SIRT1 en la isquemia-reperfusión caliente en hígados esteatósicos de rata y su correlación con el precondicionamiento isquémico, una estrategia previamente reportada para prevenir la LIR. Además, se ha investigado la implicación de la SIRT1 en un modelo de trasplante ortotópico y en un modelo de trasplante con tamaño reducido en la rata. Así, el presente estudio demuestra que SIRT1 está involucrada en la LIR hepática y su activación podría ser una estrategia prometedora para disminuir los efectos adversos de la LIR.

La prevalencia del denominado Síndrome Metabólico (SM) está aumentando rápidamente en todo el mundo a tal punto que se está convirtiendo en un problema de salud global. Se conoce como SM a un conjunto de factores de riesgo para la salud, que incluyen la obesidad (obesidad central), resistencia a la insulina (RI), dislipidemia, hígado graso no alcohólico y la hipertensión. Estas alteraciones se han relacionado con un alto riesgo de desarrollar diabetes tipo 2 (DM2) y enfermedades cardiovasculares (ECV). Todo esto ha estimulado el estudio de sus causas y la búsqueda de estrategias preventivas. Los roedores se han utilizado como modelos de enfermedades humanas, para mejorar la comprensión de las causas, la progresión de los síntomas y para poner a prueba nuevas intervenciones terapéuticas o preventivas. En el caso de estudios relacionados con el SM tres modelos son los de mayor uso, modelos genéticos, dietéticos y farmacológicos. En esta memoria nos hemos centrado en los dos primeros, el genético y el dietético. El modelo genético empleado, consistió en ratas obesas espontáneamente hipertensas (SHROB) ratas Koletsky. Las ratas SHROB presentan una mutación (fak/fak) sin sentido del gen para el receptor de la leptina, que es una hormona producida principalmente en el tejido adiposo cuya función principal es de señalización al sistema nervioso central (SNC) para conservar el balance energético y el peso corporal estable. En las ratas SHROB esta señalización está truncada porque el receptor es inactivo, el animal no regula la ingesta y la acumula en forma de lípidos. El modelo dietético empleado consistió en ratas hembras Wistar Kyoto (WKY) sanas y ratas machos Sprague-Dawley (SD) sanos a los que les suministró una dieta alta en grasa y alta en sacarosa (HFHS) que mimetiza hábitos dietéticos humanos que se reconocen como inadecuados (alto consumo de grasas y azúcar refinado). Desde hace décadas ciertos compuestos naturales como los ácidos grasos poliinsaturados (AGPIs) polifenoles, y más recientemente iminociclitoles, han sido propuestos como agentes preventivos de algunos de los factores del SM. La tesis se proponía evaluar el efecto de diferentes mezclas de AGPIs, el posible efecto colaborativo o sinérgico entre AGPIs y polifenoles y explorar un iminociclitol presente en la dieta (D-fagomina) como nuevo agente preventivo. En el modelo genéticamente modificado (ratas SHROB) la suplementación con mezclas de AGPIs EPA/DHA a distintas proporciones contrarrestó las alteraciones del perfil lipídico; disminuyó los niveles de triglicéridos (TG) plasmáticos, colesterol total, lípidos totales; aumentó la cantidad de AGPIs n-3 en plasma y en la membrana de los eritrocitos; y disminuyó la cantidad de AGs n-6 en los eritrocitos. Mezclas de EPA/DHA en las proporciones 1:1 y 2:1 disminuyeron significativamente la inflamación (nivel de PCR) y aumentó significativamente la cantidad de ácidos grasos monoinsaturados (AGMIs) y AGPIs en plasma. Las suplementaciones redujeron el nivel de isoprostanos en orina (principalmente la mezcla EPA/DHA, 1:2), y aumentaron las actividades de las enzimas antioxidantes como la SOD en los eritrocitos, hígado, grasa abdominal, riñón, corazón y cerebro (especialmente EPA/DHA, 1:1); SOD, CAT, GR, GPx en los riñones (EPA/DHA, 2:1). La concentración de LDL-ox aumentó en todos los casos. Estos resultados son compatibles con la estimulación de las defensas antioxidantes por las mezclas de EPA/DHA que inducen la reducción del estrés oxidativo (EO) junto con una disminución de los factores de riesgo de ECV (LDL-c y la inflamación). En conjunto, nuestros resultados indican que EPA es especialmente relevante para la disminución de la hiperlipidemia y la inflamación así como en la activación de los sistemas antioxidantes endógenos mientras que DHA es más eficaz en la reducción de los isoprostanos. En el modelo de SM inducido por dieta HFHS se observaron cambios en el peso corporal, perfil lipídico, insulina y EO. La suplementación conjunta de EPA/DHA (1:1) y extracto polifenólico de semillas de uva (GSE) produjo un efecto colaborativo protector frente al SM: reducción del incremento de peso corporal, la acumulación de grasa abdominal, TG, colesterol total e insulina. Además, la administración conjunta de EPA/DHA (1:1) y GSE aumentó significativamente la excreción de metabolitos conjugados de EC y EGC, y de sus metabolitos microbianos. Los resultados sugieren que EPA y DHA aumentaron la cantidad de polifenoles disponibles porque contribuyen a la reducción del EO. La tesis examina por primera vez, la posible acción preventiva del iminociclitol D- fagomina sobre la adiposidad, la dislipidemia; la homeostasis de la glucosa, la RI, el EO y la inflamación en el modelo de SM inducido por dieta (HFHS). Por la poca información con que se disponía fue necesario realizar estudios in vitro para explorar sus mecanismos de acción y postprandiales in vivo para establecer la dosis efectiva. D-Fagomina redujo la concentración de glucosa plasmática tras la ingesta de sacarosa y almidón de forma dosis dependiente. Además, se describe una nueva actividad de este iminociclitol: la inhibición selectiva de la adhesión bacteriana a la mucosa intestinal, lo cual abre la puerta a nuevas aplicaciones de la molécula y a la explicación de su actividad in vivo. El modelo de SM inducido por dieta HFHS y suplementado con D-fagomina redujo la ganancia de peso corporal, mejoró el perfil lipídico, atenuó los efectos de la dieta HFHS sobre el EO y los niveles de glucosa grelina, leptina, glucagón e insulina. En esta tesis se han evaluado distintos modelos animales de SM y se han examinado los efectos de AGPIs, polifenoles y el iminociclitol D-fagomina. Los resultados muestran que diferentes suplementos nutricionales pueden ejercer efectos diferentes sobre factores del SM y que sus acciones pueden ser complementarias, como se ha visto con los AGPIs y los polifenoles de semilla de uva. La tesis abre además el camino para la utilización de D-fagomina como un agente complementario a otros suplementos disponibles para el consumidor. En el futuro, nuevos estudios sobre efectos colaborativos como los descritos aquí podrían ofrecer nuevas opciones nutricionales para la prevención de trastornos metabólicos relacionados con la dieta. / The prevalence of metabolic syndrome (MS) is rapidly increasing worldwide to the point that it is becoming a global health problem. The SM is known as a set of risk factors to health, including obesity (central obesity), insulin resistance (IR), dyslipidemia, nonalcoholic fatty liver disease and hypertension. These alterations have been associated with a higher risk of developing diabetes type 2 (DM2) and cardiovascular disease (CVD). All this has stimulated the study of its causes and search for preventive strategies. Rodents have been used as models of human diseases, to improve the understanding of the causes, progression of symptoms and to test new therapeutic or preventive interventions. In the case of studies related to SM three models are the most used: genetic, dietary and pharmacological models. In this memory we focused on the genetic and dietary models. The genetic model used consisted of obese spontaneously hypertensive rats (SHROB) Koletsky rats. The SHROB rats have a mutation (fak/fak) nonsense gene for the leptin receptor, which is a hormone produced primarily in adipose tissue whose main function is signaling to the central nervous system (CNS) to conserve energy balance and body weight stable. In rats SHROB this signaling is truncated because the receiver is inactive, the animal does not regulate the intake and accumulates as lipids. The dietary model used consisted of female Wistar Kyoto rats (WKY) healthy and Male Sprague-Dawley (SD) healthy which were given a diet high in fat and high sucrose (HFHS) that mimics human dietary habits which are recognized as inadequate (high fat and refined sugar). For decades, certain natural compounds such as polyunsaturated fatty acids (PUFAs), polyphenols and more recently iminocyclitols, have been proposed as agents prevention of some of the factors of MS. The objectives were to evaluate the effect of different mixtures PUFAs, the possible synergistic effect or collaboration between PUFAs and polyphenols, and explore an iminocyclitol present in the diet (D- fagomine) as a novel preventive agent for SM In the genetic model (SHROB rats) the supplementation whit mixtures PUFAs EPA/DHA in different proportions offset changes in the lipid profile; decreased triglycerides (TG), total cholesterol, total lipids; increased the amount of n-3 PUFAs in plasma and erythrocyte membrane; and decreased FAs the amount of n-6 into erythrocytes. Mixtures of EPA/DHA in the ratios 1:1 and 2:1 decreased significantly the inflammation (CRP level) and increased significantly amount of monounsaturated fatty acid (MIFAs) and PUFAs in plasma. Supplementations reduced the level of urinary isoprostanes (mainly EPA/DHA mixture, 1:2), and increased activities of antioxidant enzymes such as SOD in erythrocytes, liver, abdominal fat, kidney, heart and brain (especially EPA/DHA, 1:1); SOD, CAT, GR, GPx in the kidneys (EPA/DHA, 2:1). The concentration of oxidized LDL (LDL-ox) increased in all cases. These results are consistent with stimulation of antioxidant defenses by mixtures of EPA/DHA which induce reduction of oxidative stress (OS) coupled with a reduction in CVD risk factors (LDL-c and inflammation). Taken together, our results indicate that EPA is especially relevant for reducing hyperlipidemia and inflammation as well as in the activation of endogenous antioxidant systems while DHA is more effective in reducing isoprostanes. In the dietary model (HFHS) changes in body weight were observed, lipid profile, insulin and OS. The combined supplementation of EPA/DHA (1:1) and grape seed extract (GSE) had a protective effect collaborative against SM: reduction of body weight increase, the accumulation of abdominal fat, TG, cholesterol total and insulin. In addition, co-administration of EPA/DHA (1:1) and GSE increased significantly excretion of conjugated metabolites of EC and EGC, and its metabolites microbial. The results suggest that EPA and DHA increased the amount of polyphenols available because they contribute to the reduction of OS. The thesis examines for first, the possible preventive action iminocyclitol D-fagomina on adiposity, dyslipidemia; glucose homeostasis, IR, OS and inflammation in the model of diet-induced SM (HFHS). For the little information that was available was necessary in vitro studies to explore their mechanisms of action and in vivo postprandial to establish the effective dose. D-Fagomine reduced the concentration of plasma glucose after ingestion of sucrose and starch dose-dependent manner. Furthermore, this new activity described iminocyclitol: selective inhibition of adhesion bacterial intestinal mucosa, which opens the door to new applications of the molecule and the explanation of its in vivo activity. The model of diet- induced SM HFHS and supplemented with D-fagomina reduced body weight gain, improved lipid profile, attenuated the effects of diet on OS HFHS glucose levels and ghrelin, leptin, glucagon and insulin. In this work we have evaluated different animal models of MS and have examined the effects of PUFAs, polyphenols and iminocyclitol D-fagomine. The results show that different nutritional supplements can have different effects on factors of MS and that their actions can be complementary, as has been seen with PUFAs and polyphenols grape seed. The thesis also opens the way for the use of D- fagomina as a complementary to other supplements available to the consumer. In the future, further studies on collaborative effects as described herein could offer new nutritional options for prevention of metabolic disorders related to diet.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / El estudio de los gamma-péptidos miméticos basados en cis-gamma-amino-L-prolina con capacidad de atravesar la membrana celular en diferentes organismos, constituye una temática de gran interés en el área de biomedicina para su futuro desarrollo como transportadores moleculares. Estos análisis ayudan a profundizar y entender, como las características intrínsecas de cada compuesto asociadas a su estructura, constituyen factores cruciales para su desarrollo como transportadores. Como continuación de una línea de trabajo de nuestro grupo de investigación, en esta tesis doctoral se estudió el uso de gamma-péptidos seleccionados como potenciales transportadores en distintos tipos de barreras biológicas, como la membrana citoplasmática de distintos tipos de células (HeLa y MAEC), del parásito Leishmania donovani y de la barrera hematoencefálica (BHE) utilizando Drosophila melanogaster como modelo. Los resultados del estudio de entrada de estos péptidos a las células HeLa mediante citometría de flujo y microscopia confocal, demostraron que del conjunto de gamma-péptidos estudiados, solo tres de estos presentaron un porcentaje de entrada celular superior al 50% con respecto a CF-Tat, a las dos horas de incubación. Mientras que al aumentar el tiempo de incubación a 24 h se favoreció la entrada de cinco gamma-péptidos en comparación al control CF-Tat. Esto sugiere que la presencia de grupos alifáticos en la cadena, aunque propician una entrada más lenta al interior de la célula, favorecen su permanencia en ésta a tiempos más largos. Los gamma-péptidos probados internalizan en estas células mediante procesos endocíticos por dos o más mecanismos de entrada que incluyen la vía caveola, clatrina y macropinocitosis. Además, se determinó la capacidad de estos compuestos de internalizar en un cultivo primario de células MAEC, las cuales constituyen el modelo in vitro para estudiar la enfermedad de Fabry. En estas células se favoreció la entrada de los gamma-péptidos que presentaban grupos guanidinios. Por otra parte, se estudió la relación correspondiente al número de residuos guanidilados/capacidad como CPPs de la familia de gamma-péptidos frente a Leishmania donovani, determinándose que la capacidad de entrada a los promastigotes fue proporcional al número de residuos guanidilados, pero también aumenta la toxicidad de estos compuestos. El gamma-péptido con seis grupos guanidinios en su estructura, resultó el mejor candidato para su evaluación como transportador de fármacos, empleándose para formar conjugados con la doxorubicina y mitelfosina, los cuales se evaluaron frente a promastigotes de este parásito. El conjugado con la doxorubicina mostró una marcada actividad leishmanicida a las 4 h de incubación a concentraciones inferiores a 10 milimicras (IC50= 6 milimicras). También se demostró que su internalización ocurre mediante un mecanismo dependiente de energía. El conjugado del gamma-peptido con miltefosina marcada con BODIPY frente a cepas de Leishmania donovani resistentes a miltefosina presento actividad leishmanicida a concentraciones ≤5 milimicras, mientras que frente a MT libre se observó la resistencia esperada en el mismo rango de concentración. Este hecho demostró las aptitudes del péptido como transportador de fármacos frente a la resistencia farmacológica desarrollada por el parásito. Finalmente, se estableció una metodología para estimar la capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica (BHE), utilizando a Drosophila melanogaster como modelo in vivo, siete péptidos modelos y seis gamma-péptidos, basándonos en técnicas de microscopia de fluorescencia. Los resultados de epifluorescencia de la retina, constituyeron una primera aproximación a la capacidad de este modelo in vivo, aunque no pueden considerarse concluyentes. La microscopia confocal de barrido de laser permitió validar a Drosophila melanogaster como modelo apropiado para estudiar la permeabilidad de la BHE frente a diferentes compuestos, mediante estudios tanto cualitativos como cuantitativos. El trabajo desarrollado permite concluir, que algunos de los gamma-péptidos seleccionados fueron capaces de atravesar la membrana plasmática de células HeLa y MAEC, de promastigotes de Leishmania donovani, así como la BHE de Drosophila melanogaster. Estos resultados, abre nuevos horizontes para la utilización de estos compuestos como transportadores de fármacos y/o nanotransportadores. / The discovery of cell-penetrating peptides (CPPs) is a promising breakthrough to achieve non-invasive delivery of non-permeable biomolecules in the intracellular compartment. Peptidomimetics with sequences that contain non-natural amino acids have been studied for diverse biological applications. One of the most explored applications of these peptidomimetics was their use as CPPs. Our group have been worked on the design and synthesis of gamma-peptide libraries based on (2S, 4S)-4-amino- L-proline. Some of these compounds showed low cytotoxicity and high capacity to cross cell membranes. Here we have studied the capacity of selected gamma-peptides to cross cell membranes in mammalian cells and a human protozoan parasite. Moreover, we have established a methodology using fluorescence microscopy that estimates the ability of these gamma- peptides to cross the blood brain barrier (BBB) in Drosophila melanogaster as in vivo model. Our results showed that three of these peptides are taken up in HeLa cells, with cells uptake greater than 50 % relative to Tat at 2 h. Whereas at 24 h, five of these peptides are internalized in these cells with remarkable differences relative to Tat. Flow cytometry in presence of diverse entry inhibitors and confocal microscopy studies indicated the cellular uptake mechanism of γ-peptides involves at least two endocytic pathways. In addition, a small family of guanidinylated gamma-peptides was synthetized and its CPP capacity in Leishmania donovani determined. In this parasite the property to cross membranes was directly correlated to the number of guanidinium groups present along the peptide. Leishmania toxicity also increased with the number of residues. The hexapeptide was conjugated to doxorubicin or miltefosine, displaying its capacity to deliver these therapeutic cargos into the parasite. Finally, we have developed a methodology using Drosophila melanogaster as in vivo model to study the ability of diverse peptides to cross the BBB by fluorescence microscopy. Using confocal microscopy with unmixing linear analysis, we validated this model allowing both, qualitative and quantitative studies. Some of the studied gamma- peptides were determined as good transporters through the BBB. All these studies demonstrate that gamma-peptides have good potential as powerful cellular delivery vector for scientific and therapeutic purposes.

La inducción floral es un proceso de gran importancia en el desarrollo de las plantas, que determina el punto de inicio de la formación de las estructuras reproductoras. Es necesario un estricto control genético de este proceso para optimizar el momento en que la planta movilizará sus reservas e invertirá su energía en la producción de la descendencia. Por ello, la transición de la fase vegetativa a la reproductiva debe darse en el momento fisiológico óptimo para la planta y coincidir con unas condiciones ambientales favorables. En Arabidopsis thaliana, la inducción floral se produce, principalmente, por la activación del gen FLOWERING LOCUS T (FT), en condiciones inductoras de día largo (“ruta del fotoperiodo”), y por la acción de las hormonas giberelinas (GA) en condiciones no-inductoras de día corto. La existencia de represores de la floración es esencial para garantizar una fase vegetativa suficientemente larga para asegurar el éxito del proceso reproductivo. En el laboratorio hemos trabajado con los genes TEMPRANILLO1 (TEM1) y TEMPRANILLO2 (TEM2), represores directos de FT y de los genes de síntesis de GA. El conocimiento generado en el laboratorio nos permite postular que los TEM conectan ambas rutas de control de la floración (ruta de fotoperiodo y ruta hormonal), controlando directamente la acumulación de sustancias inductoras de la floración y determinando cuándo debe desencadenarse la floración. Esta tesis doctoral parte del conocimiento previo generado en el laboratorio y explora la función de los TEM en otras rutas genéticas de control de la inducción floral. Basándonos en el amplio conocimiento del efecto de los factores ambientales en la regulación de la floración, decidimos explorar si los genes TEM están regulados por algunas de las rutas genéticas mejor conocidas: calidad de la luz (mediada por phyB y factores dependientes de phyB), temperatura ambiental (con SVP/FLC mediando la respuesta a bajas temperaturas) y el control de las transiciones de fase (fase juvenil a adulta y transición a la floración mediada por la edad, controlada principalmente por los miRNA miR156/miR172 y el factor SPL9). Así, como objetivo principal nos planteamos establecer los factores genéticos y ambientales que regulan el mecanismo molecular de control de los genes TEMPRANILLO y su posible papel como integradores de diferentes rutas del control de la floración en Arabidopsis. En paralelo a esta línea principal de investigación, nos propusimos el estudio la posible redundancia de otro factor de la familia RAV, RAV1, que es el gen más cercano a los TEM. Como objetivo secundario, nos planteamos caracterizar los genes TEM/RAV ortólogos en el género Populus, como modelo de plantas leñosas. Sabiendo que el módulo CO/FT se mantiene, nos preguntamos si TEM podría tener la misma función como represor, controlando también la floración en árboles. Para este estudio establecimos una colaboración con el grupo del Dr. Ove Nilsson (UPSC, Suecia). Para desarrollar dichos objetivos se ha trabajado desde la genética, la biología molecular y el análisis de fenotipos. / Floral induction is probably the most important process in plant development, since it determines the formation of reproductive structures. So, it is necessary to establish a strict genetic control of this process to optimize the moment in which plants should mobilize their reserves and invest their energy in producing the offspring. Therefore, the transition from vegetative to reproductive phase must happen in the best physiological moment and coincide with favorable environmental conditions. In Arabidopsis thaliana, floral induction occurs mainly by the activation of FLOWERING LOCUS T (FT) in inducing long-day conditions ("photoperiodic pathway"), and by the action of the hormone gibberellin (GA) in non-inducing short day conditions. The existence of floral repressors is essential to ensure a vegetative phase long enough to ensure the success of the reproductive process. In the laboratory we have worked with TEMPRANILLO1 and TEMPRANILLO2 genes (TEM1 and TEM2, respectively), direct repressors of FT and GA synthesis genes. The knowledge generated in the laboratory allows us to postulate that TEM connect both routes of flowering (photoperiod and hormone pathways), directly controlling the accumulation of substances that induce flowering and determining when flowering should be triggered. This thesis begins from the previous knowledge generated in the laboratory and it explores the role of TEM in other genetic pathways of floral induction. Based on the extensive knowledge of the environmental factors effect in the regulation of flowering, we decided to explore whether TEM genes are regulated by some of the best known genetic pathways: quality of light (mediated by phyB and phyB dependent factors), temperature (SVP/FLC mediating the response to low temperatures) and the control of phase transitions (adult and juvenile phase, and the age-dependent flowering, both controlled mainly by the miRNA miR156/miR172 and the transcription factor SPL9). Thus, our main objective was to identify the genetic and environmental factors that regulate the molecular mechanism of TEMPRANILLO genes control, and their possible role as integrators of different routes of flowering time control in Arabidopsis. At the same time, we proposed to study the possible redundancy of another factor of the RAV family, RAV1, which is the TEM closest gene. As a secondary objective, we planned to characterize the TEM/RAV ortholog genes in Populus as a model of woody plants. Knowing that the module CO/FT is functional in Populus, we wondered if TEM might have the same function as a repressor, also controlling flowering in trees. For this study, we established collaboration with the group of Dr. Ove Nilsson (UPSC, Sweden). To develop these goals we took genetics, molecular biology and analysis of phenotypes approaches.

Còpia digital de l'exemplar imprès de la tesi dipositat a la Biblioteca de la Facultat de Farmàcia / El mecanisme d’acció a nivell molecular de les hormones glucagó, epinefrina i insulina constitueix el centre d'interès al qual apunta el nostre treball. Un camí especialment adequat per aproximar-nos als fets desencadenats a la cèl.lula per l’arribada dels senyals hormonals esmentats és el que es basa en emprar com a testimonis d'aquests fets les vies de síntesi i degradació del glicogen, el carbohidrat de reserva als animals i a l'home. Ben justament, car: a) aquestes vies metabòliques són molt susceptibles a les accions hormonals, b) són comunes a la majoria dels teixits de mamífer, tot i que a cadascun d’aquests hi presenten característiques particulars, c) ocupen una posició clau dins del metabolisme energètic de l'organisme. A més, hem fixat l’atenció en el teixit hepàtic. Al fetge, òrgan que té un paper cabdal en l'administració de la reserva de carbohidrats de l’organisme, el mecanisme i les particularitats del control hormonal de les vies metabòliques del glicogen presenta encara molts punts obscurs. Els coneixements actuals sobre el tema estan ben allunyats de conclusions definitives. En el transcurs dels darrers vint anys treballs notabilíssims dins la Bioquímica han reeixit a mostrar bastant clarament quin és el mecanisme utilitzat per les hormones com l'epinefrina per forçar el catabolisme i la producció d’energia al teixit muscular. Ara bé, l'extrapolació gratuïta d'aquestes troballes per al cas del fetge és una operació extremadament perillosa. El glucagó i la pròpia epinefrina impulsen la glicogenolisi hepàtica. Per la temptació de simplificar hom podria atribuir a ambdues hormones un mecanisme d'acció al fetge igual al que opera al múscul esquelètic a mercè de l'epinefrina. Durant una bona colla d'anys recents no s'ha comptat amb cap evidència experimental séria contra aquesta suposició. Però certes troballes han anat suggerint grans diferències entre la manera de fer del glucagó i de l'epinefrina al fetge, i entre la manera com actua aquesta darrera hormona al teixit muscular o a l’hepàtic. D'altra banda també cal contemplar l'acció de la insulina. L'efectivitat del control del metabolisme hepàtic per aquesta hormona ha estat motiu de controvèrsia àmpliament debatut. A aquest fet hi han contribuït la dificultat per observar efectes directes de l'hormona sobre els elements cel.lulars i el desconeixement existent sobre els detalls del seu mecanisme d'acció el qual es revel.la complexíssim. Tal estat de coses ofereix una oportunitat àmplia per a treballar-hi. Per fer-ho hem escollit la tècnica que actualment permet la millor aproximació als esdeveniments desencadenats pels estímuls hormonals sobre el metabolisme hepàtic; ens referim a l'isolament i utilització corn a material d'estudi de cèl.lules del parènquima hepàtic de mamífer (rata) intactes estructural i funcionalment. Les dades obtingudes en el present estudi clarifiquen el mecanisme d'acció del glucagó, defineixen el caràcter dels efectes de l'epinefrina i recolzen fermament la possibilitat del control del metabolisme hepàtic del glicogen per la insulina.

Tesi realitzada a l'Institut de Química Avançada de Catalunya (IQAC-CSIC) / Biocatalysis is the chemical transformation of organic substrates by enzymes. This is the driving force of some of the oldest transformations known to humans. Nowadays, methods involving biocatalysts are gaining importance in organic synthesis owing to their high efficiency and selectivity, and driven by the need to develop processes that are economical and environmentally sustainable. Recombinant DNA technology has paved the road for mass production of enzymes and recently their major limitation, i.e., narrow substrate spectrum is also being addressed by the development of enzyme engineering. Rational design and directed evolution has been used to tackle a number of limitations associated with the use of wild-type aldolases as catalysts in synthetic organic chemistry. Aldolases, which catalyze carbon-carbon bond formations (one of the most challenging transformations in synthetic organic chemistry) with high stereospecificity have substantial utility as biocatalysts in the synthesis of chiral complex bioactive compounds such as carbohydrates, amino acids and their derivatives. D-fructose 6-phosphate aldolase (FSA) from E. coli is a unique member of this class of enzymes for accepting non-phosphorylated analogues of dihydroxyacetone phosphate (DHAP), and constitutes an exception to the strict donor specificity of aldolases. This dihydroxyacetone-dependent aldolase accepts a wide range of donor analogues of dihydroxyacetone (DHA), becoming an extremely promising catalyst for direct stereoselective aldol reactions. In this thesis an unprecedented expansion in the nucleophile and electrophile substrate scope of FSA is presented with the assistance of enzyme engineering. Strategies for the structure guided redesign by site-directed and site-saturation mutagenesis was used to modify the enzyme to improve its tolerance for a wide range of donor and acceptor substrates. We report the structure-guided rational protein engineering of FSA to accept a unique variety of 1-hydroxy-2-alkanones and related ether components as novel donor substrates. The double-active-site variant FSA L107A/L163A was found to convert outstanding variety of donor structures with good reaction rates, retaining high diastereoselectivy for the D-threo configuration. This newly designed FSA variant opens new avenues towards the synthesis of novel product families that were before inaccessible by biological catalysis. In a similar fashion, structure-guided engineering of the enzyme’s active site was applied to design a set of FSA variants highly active for aldol additions of glycolaldehyde (GO). The A129 residue was chosen as target position to improve the activity and selectivity towards GO, resulting a variant with highly increased affinity for catalyzing reactions with GO. This mutation in combination with others in the active site led to FSA variants with improved acceptor tolerance. Thus, a toolbox of new FSA variants was built up, expanding the synthetic possibilities of this biocatalyst towards the preparation of aldose-like carbohydrate compounds. The ideal strategy for biocatalytic synthesis of aldose sugars would be the consecutive aldol additions of GO with high enantio- and diastereoselectivity. Thus, to exploit this newly found activity of the FSA mutants in catalyzing self-aldol reaction of GO, we have developed a procedure for the preparation of a number of aldose carbohydrates (D-idose and derivatives) and derivatives from formaldehyde, glycolaldehyde and other simple aldehydes by biocatalytic tandem reactions by two consecutive additions of GO. Furthermore, the stereochemical course of the reaction was also altered to allow the one-pot synthesis of L-glucose from the stereoselective trimerization of glycolaldehyde using a combination of FSA variants. Examples of catalytic cascade reactions are scarce in literature, hence as a proof of concept we intended to combine organo- and biocatalytic aldol additions for the synthesis of deoxysugars. Proline catalyzed self-aldol reaction of propionaldehyde was coupled with FSA catalyzed addition of hydroxyacetone and dihydroxyacetone, proving once again the versatility of this aldolase, in the catalysis of aldol-additions with high stereoselectivity. / Los compuestos polihidroxilados, como carbohidratos y sus derivados son moléculas de gran importancia en procesos bioquímicos. La síntesis de estos compuestos es compleja debido principalmente a tres factores: i) su alta funcionalización, ii) su elevado número de centros estereogénicos iii) y su aislamiento. Por lo tanto, el desarrollo de metodologías simples y selectivas que permitan la preparación de colecciones de estas sustancias con diversitad estructural son de gran importancia. Las aldolasas, que catalizan una reacciones aldólica o retro-aldólica son unas de las liasas mas importantes para la formación estereoselectiva de enlaces carbono-carbono. Estos biocatalizadores son uno de los dos clases de enzimas que son utilizadas en la síntesis de monosacáridos, permitiendo la funcionalización y fromación de nuevos centros esterogenicos. La D-fructosa 6-fosfato aldolasa (FSA) de E. coli es la unica aldolasa que cataliza la formación reversible de D-fructosa 6-fosfato. La enzima puede utilizar varios dadores no fosforilados como dihidroxiacetona (DHA), hidroxiacetona (HA) y glicolaldehído (GO). El objecto de esta tesis es el rediseño racional de FSA para la síntesis de varios carbohidratos. Diferentes estrategias de ingeniería genética han sido aplicadas para ampliar la tolerancia frente a varios sustratos dadores y aceptores, que permitió la síntesis de aldosas. También se ha modificado la estereoquímica y mejorado el rendimiento de la reacción enzimática. Utilizando mutagénesis sitio específica se desarrolló una variante de FSA que acepta varios 1-hidroxi-2-alcanones y sus análogos como sustratos dadores con alta diastereoselectividad. Así se abren nuevas rutas para la síntesis de colecciones de compuestos inovadores, inaccesibles hasta el momento por biocatálisis. También se aplicó mutagénesis para el diseño de mutantes activos hacia las adiciones aldólicas de GO. Además combinando las diferentes mutaciones la reactividad de la FSA se ha visto mejorada frente a sustratos aceptores. Esta nueva actividad ha sido aplicada en la preparación de un gran número de aldosas mediante reacciones tándem biocatalíticas por dos adiciones secuenciales de GO. En la literatura se encuentran pocos ejemplos de reacciones catalíticas en cascada. Por ello, se realizó un estudio de la combinación de adiciones aldólicas organo- y biocatalíticas para la síntesis de desoxiazúcares.