Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques de Barcelona (IIBB)- CSIC / H-Ras es un protooncogen que codifica para dos proteínas por splicing alternativo la p19 y la p21 (1,2). La p21 presenta mayor tamaño y se localiza en la membrana en donde realiza la función de GTPasa que activa múltiples vías de señalización (3-8) en cambio la p19 de menor tamaño, atraviesa la membrana nuclear, en donde forma complejos proteicos con otras proteínas y desde ahí regula múltiples vías de señalización (9-10). Las mutaciones en H-Ras inducen a la carcinogénesis y han sido frecuentemente detectadas en los tumores de los pacientes (30%) con melanoma, cáncer oral, de riñón y vejiga Para nuestros experimentos evaluamos las siguientes líneas celulares: 1) Células HeLa transfectadas en forma transiente, y que sobreexpresaban las proteínas H-Ras de nuestro interés en forma separada (vectores PRK5); 2) Fibroblastos embrionarios de ratón knock-out H-Ras (-/-) o bien doble knock-out H-Ras (-/-), N-Ras (-/-), transfectados de manera estable con los vectores pEGFP-p19 ó pEGFP-p21 y 3) líneas mutantes de fibroblastos obtenidas de los tumores extraídos por cirugía de los pacientes con Síndrome de Costello, el cuál es un raro desorden congénito causado por la activación en la línea germinal del oncogen H-Ras que afecta tanto a la proteína p19 como a la p21 (11-13). Nuestros resultados mostraron que las proteínas H-Ras promueven el incremento en la expresión de los miRNAs evaluados, y en forma diferencial, la p19 incrementa la expresión de miR-206 y promueve un estado de quiescencia celular en la fase G0/G1 provocando una disminución en la proliferación celular, la capacidad invasiva y la capacidad formadora de tumores; además la sobreexpresión de p19 incrementa la expresión de la proteína NM23H1 la cuál confiere protección contra el daño producido al DNA por las especies reactivas de oxígeno. En cuanto a las líneas mutantes de los fibroblastos de los pacientes con Síndrome de Costello, detectamos que 1) la mutación G12S posee mayor capacidad invasiva que la G12A, y 2) una disminución en la expresión de miR-206, la cuál ha sido relacionada recientemente con la aparición de rabdomyosarcoma en los pacientes por lo que se ha propuesto como un marcador del pronóstico de la enfermedad. REFERENCIAS 1. Cohen J.B., Broz S.D., and Levinson A.D. (1989). Expression of the H-Ras proto-oncogene is controlled by alternative splicing. Cell. 58: 461-472 2. Guil S, de La Iglesia N, Fernández-Larrea J, Cifuentes D, Ferrer JC, Guinovart JJ, Bach-Elias M. (2003a). Alternative splicing of the human proto-oncogene c-H-ras renders a new Ras family protein that trafficks to cytoplasm and nucleus.Cancer Res. (2003 a) 1;63(17):5178-87 3. Malumbres M., and Barbacid M. (2003). Ras oncogenes: the first 30 years. Nature Reviews 3,7-13. 4. Rodriguez-Viciana P., Sabatier C., and McCormick F. (2004) Signalling specificity by Ras family GTPases is determined by the full spectrum of effectors they regulated. Mol. Cell. Biol. 24(11):4943-4954. 5. Mitin N., Rossman L. K., and Der C. J. (2005). Signaling interplay in Ras superfamily function. Current Biology15 (14): R563 - R574. 6. Malaney S., and Daly R.J. (2001). The Ras signalling pathway in mammary tumorigenesis and metastasis. J. Mammary Gland Biol Neoplasia. 6(1):101-113 7. Downward, J. (2002). Targeting Ras signalling pathways in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer 3: 11-22 8. Colicelli J. (2004). Human Ras superfamily proteins and related GTPases. Sci.Signal 250: re13 9. Camats-Malet., Calin G.A., Heesom, K.J., Liu cG., Volinia S., Croce M., Ladomery M., and Bach-Elias M. (2008b). P19 activates telomerase, regulates expression of proteins of the tuberous sclerosis (TSC) pathway and upregulate miRNA’s expression. Submitted to Plos One. 10. Camats-Malet M. (2008a). Mecanismes de Senyalitzacio intracellular regulats per la proteina p19 H Ras. Tesis de Doctorat. Departament de Bioquimica I Biologia Molecular. Unitat de Ciencies.Universitat Autonoma de Barcelona. 11. Costello, J.M. (1977). A new syndrome: mental subnormality and nasal papillomata. Aust Paediat J. 13: 114-118. 12. Gripp K.W., Innes A.M., Axelrad M.E., Gillan T.L., Parboosingh J.S., Davies C., Leonard N.J., Doyle D., Catalano S., Nicholson l., Stabley D., and Sol-Church K. (2008). Costello syndrome associated with novel germline H-Ras mutations: An attenuated phenotype? American Journal of Medical Genetics Part A. 146 A:683-690 13. Gripp KW, Lin A.E, Stabley D., Nicholson L., Scott Jr. C.I., Doyle D., Aoki Y., Matsubara Y., Zachai E.H., Lapunzina P., Gonzalez-Meneses, A., Holbrook J., Agresta C.A., Gonzalesz I.L and Sol-Church K. (2006). HRAS mutation analysis in Costello Syndrome: Genotype and Phenotype correlation. Am J. Med. Genet.A 140 (1):1-7 / Ras is an evolutionary and conserved family of genes present in many organisms, in humans, Ras is conformed by three members called N-Ras, K-Ras and H-Ras located on chromosomes 1, 11 and 12 respectively (1, 2). Ras proteins act as a molecular switch, activating many signalling pathways through phosphorylation of GTPases; so their punctual mutations promote a constitutive activation in their GTPase function that fosters carcinogenesis, loss of adhesion and invasion of malignant cells (3-9). In the case of H-Ras, 30% of the malignant tumours analyzed have showed mutations and they were frequently detected in melanoma, thyroid, oral, bladder, and kidney cancers (10-14). H-Ras gene renders two different proteins by their alternative splicing called p19 and p21 (15, 16); even though both proteins have the same origin, they differ in their size function and localization. P19 and p21 are similar in their first 150 aminoacids, but they differ in the C-terminal amino acid sequences, meanwhile p21 contains 152-165 residues that confer the GTPase function, p19 lacks of it. Nevertheless p19 protein is smaller than p21, is able to cross the nuclear membrane and then p19 can bind with other proteins as such as RACK1, PKCβII, p73 and NSE (neuron specific enolase), (17,18) forming protein complexes; which suggest that p19 protein indirectly orchestrates multiple cell functions from the nucleus (19). For the experimental development of this PhD thesis we decided to overexpress p19, p21, or their mutant protein variants transient and ectopically in HeLa cells. Three mutations were analyzed in these assays: Q61L, G12S, and G12A, the first of them induces a constitutive activation of GTPase activity and G12S, G12A are both a frequent mutations observed in Costello Syndrome, a rare congenital disorder caused by germ-line activation of H-Ras oncogenes that affects both p19 and p21(20-22). We also analyzed the contribution of p19, or p21 proteins in knock-out H-Ras (-/-) and double knock-out for H-Ras (-/-), N-Ras (-/-) murine embryonic fibroblasts (MEFs); these cell lines have the advantage that they do not show gene redundancy in their expression, so in other words this means that the absence of one member of Ras proteins does not cause that other Ras protein assume its functions. We also analyzed mutated fibroblasts obtained from tumours of Costello Syndrome patients in order to determinate the contribution of G12S and G12A mutations in this syndrome. A general increment in the miRNA expression profile was detected when p19, p21 and their mutant variants were overexpressed in HeLa cells, even though further experiments in our knock-out H-Ras (-/-) and double knock-out H-Ras (-/-), N-Ras (-/-) MEFs transfected with pEGFP-p19 or pEGFP-p21, we detected a differential expression of miR-206 and miR-342 when p19 and p21 were expressed respectively. In addition, miR-206 was consistently downregulated in our mutated fibroblasts of Costello Syndrome patients which is agree with recent reports that have correlated the misregulation of miR-206 with the development of rhabdomyosarcoma in these patients. In other hand, overexpression of p21 (G12S) protein in HeLa cells showed the highest rate of invasion, followed by p21, p19 (G12S) and p19 proteins; in further cotransfection assays (p19/p21 (G12S) proteins); p19 was able to diminished the invasion and in mutated fibroblasts of Costello Syndrome patients, the highest invasion capacity rate was conferred by G12S mutation. P19 protein showed a low rate proliferation in double knock-out H-Ras (-/-), N-Ras (-/-) MEFs, further analyses of cytometry revealed that p19 induces a quiescent arrest in G0/G1 phase cell cycle. The capacity of forming colonies was also evaluated in clonogenic anchorage agar assays in which the presence of (G12S) mutation in p19 and p21 proteins contributed to the formation of bigger and more number of colonies. Additionally, overexpression of p19 protein (pRK5-p19 vector) in HeLa cells also conferred protection against reactive oxygen species emission overexpressing NM23H1 protein, this effect was also detected in high ROS emission environment. REFERENCES: 1. Lowy D.R., and Willumsen B.M. (1993). Function and regulation of Ras. Ann. Rev. Biochem. 62:851-891. 2. Wennerber K., Rossman K.L., and Der C.L. (2005).The Ras superfamily at glance. J. Cell Sci.118:843-846. 3. Mori K., Hata M., Neya S., Hoshino T. (2002) A study on the role of Mg+” in a Ras protein by MD simulation. CBIJ. 2 (4): 147-155 4. Cullen P. J., and Lockyer P.J. (2006) Integration of calcium and Ras signalling. Nat. Rev. 3: 339-344. 5. Rehman H., and Bos J. (2004) Thumbs up for inactivation. Nature. 249: 138-139 Ricarte-Filho JC, Fuziwara CS, Yamashita AS, Rezende E, da-Silva MJ, Kimura ET.(2009). Effects of let-7 microRNA on Cell Growth and Differentiation of Papillary Thyroid Cancer. Transl Oncol. 200. (4):236-41. 6. Campbel S.L., Khosravi-Far R., Rossman K.L., Clark G.J. and Der C.J. (1998). Increasing complexity of Ras signaling. Oncogene. 17:1395-1413. Cancer Lett. 2008 Oct 18;270(1):10-8. doi: 10.1016/j.canlet.2008.03.035. Epub 2008 May 23. Review. 7. Malumbres M., and Barbacid M. (2003). Ras oncogenes: the first 30 years. Nature Reviews 3,7-13. 8. Rodriguez-Viciana P., Sabatier C., and McCormick F. (2004) Signalling specificity by Ras family GTPases is determined by the full spectrum of effectors they regulated. Mol. Cell. Biol. 24(11):4943-4954. 9. Mitin N., Rossman L. K., and Der C. J. (2005). Signaling interplay in Ras superfamily function. Current Biology15 (14): R563 - R574. 10. Malaney S., and Daly R.J. (2001). The Ras signalling pathway in mammary tumorigenesis and metastasis. J. Mammary Gland Biol Neoplasia. 6(1):101-113 11. Downward, J. (2002). Targeting Ras signalling pathways in cancer therapy. Nat. Rev. Cancer 3: 11-22 12. Colicelli J. (2004). Human Ras superfamily proteins and related GTPases. Sci.Signal 250: re13 13. Castro P., Soares P., Gusmao L., Seruca R., Sobrinho-Simoes. (2006). H-RAS 81 polymorphism is significantly associated with aneuploidy in follicular tumors of the thyroid. Oncogene. 25: 4620-4627 14. Castellano E, Santos E.(2011). Functional specificity of ras isoforms: so similar but so different.Genes Cancer. 2011 Mar;2(3):216-31. doi: 10.1177/1947601911408081. 15. Cohen J.B., Broz S.D., and Levinson A.D. (1989). Expression of the H-Ras proto-oncogene is controlled by alternative splicing. Cell. 58: 461-472 16. Guil S, de La Iglesia N, Fernández-Larrea J, Cifuentes D, Ferrer JC, Guinovart JJ, Bach-Elias M. (2003a). Alternative splicing of the human proto-oncogene c-H-ras renders a new Ras family protein that trafficks to cytoplasm and nucleus.Cancer Res. (2003 a) 1;63(17):5178-87 17. Jeong MH., Bae J., Kim WH., Yoo SM., Kim JW., Son PI, Choi KH. (2006). P19 ras interacts with and activates p73 by involving the MDM2 protein. The Journal of Biological Chemistry. 281(13):8707-8715 18. Camats-Malet., Calin G.A., Heesom, K.J., Liu cG., Volinia S., Croce M., Ladomery M., and Bach-Elias M. (2008b). P19 activates telomerase, regulates expression of proteins of the tuberous sclerosis (TSC) pathway and upregulate miRNA’s expression. Submitted to Plos One. 19. Camats-Malet M. (2008a). Mecanismes de Senyalitzacio intracellular regulats per la proteina p19 H Ras. Tesis de Doctorat. Departament de Bioquimica I Biologia Molecular. Unitat de Ciencies.Universitat Autonoma de Barcelona. 20. Costello, J.M. (1977). A new syndrome: mental subnormality and nasal papillomata. Aust Paediat J. 13: 114-118. 21. Gripp K.W., Innes A.M., Axelrad M.E., Gillan T.L., Parboosingh J.S., Davies C., Leonard N.J., Doyle D., Catalano S., Nicholson l., Stabley D., and Sol-Church K. (2008). Costello syndrome associated with novel germline H-Ras mutations: An attenuated phenotype? American Journal of Medical Genetics Part A. 146 A:683-690 22. Gripp KW, Lin A.E, Stabley D., Nicholson L., Scott Jr. C.I., Doyle D., Aoki Y., Matsubara Y., Zachai E.H., Lapunzina P., Gonzalez-Meneses, A., Holbrook J., Agresta C.A., Gonzalesz I.L and Sol-Church K. (2006). HRAS mutation analysis in Costello Syndrome: Genotype and Phenotype correlation. Am J. Med. Genet.A 140 (1):1-7

Current lifestyle with high-energy diets and little exercise is triggering an alarming growth in obesity. Excess of adiposity is leading to severe increase in associated pathologies, such as insulin resistance, type 2 diabetes (T2DM), atherosclerosis, cancer, arthritis, asthma, and hypertension. This, together with the lack of efficient anticobesity drugs, is the driving force behind much research. Obesity is associated with adipocyte dysfunction, macrophage infiltration, inflammation and decreased fatty acid oxidation (FAO) levels. Recent results suggest that enhancing cellular energy expenditure may be an attractive alternative therapy. In this study, we propose that an increase in adipocytes and macrophages FAO rate could protect from obesity and insulin resistance by a decrease in the lipid content and inflammatory levels. Thus, we expressed carnitine palmitoyltransferase 1AM (CPT1AM), a permanently active mutant form of CPT1A (the rateclimiting enzyme in mitochondrial FAO) in 3T3cL1 CAR-Delta1 adipocytes and RAW 264.7 macrophages by adenovirus infection. Visceral and subcutaneous adipose tissue (VAT and SAT, respectively) samples from lean, overweight, obese and diabetic patients were studied. CPT1AM-expressing adipocytes and macrophages had increased FAO and showed a reduction in palmitatecinduced increase in triglyceride content, inflammation, endoplasmic reticulum (ER) stress and reactive oxygen species (ROS) levels compared to GFP control cells. CPT1AM expression was able to restore palmitate-induced impairment in adipocyte insulin signaling.

With the recent advent of various waves of technological advances, the amount of biological data being generated has exploded. As a consequence of this data deluge, new challenges have emerged in the field of biological data management. In order to maximize the knowledge extracted from the huge amount of biological data produced it is of great importance for the research community that data dissemination and visualisation challenges are tackled. Opening and sharing our data and working collaboratively will benefit the scientific community as a whole and to move towards that end, new developements, tools and techniques are needed. Nowadays, many small research groups are capable of producing important and interesting datasets. The release of those datasets can greatly increase their scientific value. In addition, the development of new data analysis algorithms greatly benefits from the availability of a big corpus of annotated datasets for training and testing purposes, giving new and better algorithms to biomedical sciences in return. None of these would be feasible without large amounts of biological data made freely and publicly available. Dissemination The Distributed Annotation System (DAS) is a protocol designed to publish and integrate annotations on biological entities in a distributed way. DAS is structured as a client-server system where the client retrieves data from one or more servers and to further process and visualise. Nowadays, setting up a DAS server imposes some requirements not met by many research groups. With the aim of removing the hassle of setting up a DAS server, a new software platform has been developed: easyDAS. easyDAS is a hosted platform to automatically create DAS servers. Using a simple web interface the user can upload a data file, describe its contents and a new DAS server will be automatically created and data will be publicly available to DAS clients. Visualisation One of the most broadly used visualization paradigms for genomic data are genomic browsers. A genomic browser is capable of displaying different sets of features positioned relative to a sequence. It is possible to explore the sequence and the features by moving around and zooming in and out. When this project was started, in 2007, all major genome browsers offered quite an static experience. It was possible to browse and explore data, but is was done through a set of buttons to the genome a certain amount of bases to left or right or zooming in and out. From an architectural point of view, all web-based genome browsers were very similar: they all had a relatively thin clien-side part in charge of showing images and big backend servers taking care of everything else. Every change in the display parameters made by the user triggered a request to the server, impacting the perceived responsiveness. We created a new prototype genome browser called GenExp, an interactive web-based browser with canvas based client side data rendering. It offers fluid direct interaction with the genome representation and it's possible to use the mouse drag it and use the mouse wheel to change the zoom level. GenExp offers also some quite unique features, such as its multi-window capabilities that allow a user to create an arbitrary number of independent or linked genome windows and its ability to save and share browsing sessions. GenExp is a DAS client and all data is retrieved from DAS sources. It is possible to add any available DAS data source including all data in Ensembl, UCSC and even the custom ones created with easyDAS. In addition, we developed a javascript DAS client library, jsDAS. jsDAS is a complete DAS client library that will take care of everything DAS related in a javascript application. jsDAS is javascript library agnostic and can be used to add DAS capabilities to any web application. All software developed in this thesis is freely available under an open source license. / Les recents millores tecnològiques han portat a una explosió en la quantitat de dades biològiques que es generen i a l'aparició de nous reptes en el camp de la gestió de les dades biològiques. Per a maximitzar el coneixement que podem extreure d'aquestes ingents quantitats de dades cal que solucionem el problemes associats al seu anàlisis, i en particular a la seva disseminació i visualització. La compartició d'aquestes dades de manera lliure i gratuïta pot beneficiar en gran mesura a la comunitat científica i a la societat en general, però per a fer-ho calen noves eines i tècniques. Actualment, molts grups són capaços de generar grans conjunts de dades i la seva publicació en pot incrementar molt el valor científic. A més, la disponibilitat de grans conjunts de dades és necessària per al desenvolupament de nous algorismes d'anàlisis. És important, doncs, que les dades biològiques que es generen siguin accessibles de manera senzilla, estandaritzada i lliure. Disseminació El Sistema d'Anotació Distribuïda (DAS) és un protocol dissenyat per a la publicació i integració d'anotacions sobre entitats biològiques de manera distribuïda. DAS segueix una esquema de client-servidor, on el client obté dades d'un o més servidors per a combinar-les, processar-les o visualitzar-les. Avui dia, però, crear un servidor DAS necessita uns coneixements i infraestructures que van més enllà dels recursos de molts grups de recerca. Per això, hem creat easyDAS, una plataforma per a la creació automàtica de servidors DAS. Amb easyDAS un usuari pot crear un servidor DAS a través d'una senzilla interfície web i amb només alguns clics. Visualització Els navegadors genomics són un dels paradigmes de de visualització de dades genòmiques més usats i permet veure conjunts de dades posicionades al llarg d'una seqüència. Movent-se al llarg d'aquesta seqüència és possibles explorar aquestes dades. Quan aquest projecte va començar, l'any 2007, tots els grans navegadors genomics oferien una interactivitat limitada basada en l'ús de botons. Des d'un punt de vista d'arquitectura tots els navegadors basats en web eren molt semblants: un client senzill encarregat d'ensenyar les imatges i un servidor complex encarregat d'obtenir les dades, processar-les i generar les imatges. Així, cada canvi en els paràmetres de visualització requeria una nova petició al servidor, impactant molt negativament en la velocitat de resposta percebuda. Vam crear un prototip de navegador genòmic anomenat GenExp. És un navegador interactiu basat en web que fa servir canvas per a dibuixar en client i que ofereix la possibilitatd e manipulació directa de la respresentació del genoma. GenExp té a més algunes característiques úniques com la possibilitat de crear multiples finestres de visualització o la possibilitat de guardar i compartir sessions de navegació. A més, com que és un client DAS pot integrar les dades de qualsevol servidor DAS com els d'Ensembl, UCSC o fins i tot aquells creats amb easyDAS. A més, hem desenvolupat jsDAS, la primera llibreria de client DAS completa escrita en javascript. jsDAS es pot integrar en qualsevol aplicació DAS per a dotar-la de la possibilitat d'accedir a dades de servidors DAS. Tot el programari desenvolupat en el marc d'aquesta tesis està lliurement disponible i sota una llicència de codi lliure.

La tuberculosi, la malaltia infecciosa causada per Mycobacterium tuberculosis, es un problema de salut global que provoca aproximadament 2 milions de morts anuals. Un terç de la població mundial es troba crònicament infectada amb Mycobacterium tuberculosis però no mostra símptomes clínics encara que té un risc d’un 10% de desenvolupar la malaltia, la qual cosa representa un reservori incontrolable de tuberculosi. En aquesta condició asimptomàtica, coneguda com a tuberculosi latent, Mycobacterium tuberculosis es localitza en lesions granulomatoses a l’hoste i és resistent als medicaments antimicobacterians existents en l’actualitat. En bacteris, els sistemes reguladors de dos components son un conjunt de proteïnes implicades en l’adaptació a canvis en l’entorn del microorganisme. Un sistema de dos components típic consta d’una histidina quinasa unida a membrana que té un paper essencial com a sensor dels canvis ambientals i un regulador transcripcional citosòlic que exerceix la seva funció controlant l’expressió de gens diana. Aquest parell de proteïnes funciona com un interruptor molecular que controla diferents respostes adaptatives a canvis a l’ambient cel•lular. Mycobacterium tuberculosis té 11 sistemes de dos components complets. El sistema DosRST, composat per un regulador transcripcional, DosR, i dues histidines quinases, DosS i DosT, té un paper estel•lar en l’adaptació de Mycobacterium tuberculosis a la tuberculosi latent. DosS i DosT s’autofosforilen en residus conservats d’histidina i ambdues proteïnes transfereixen aquesta un unitat de fosfat al residu d’àcid aspàrtic en posició 54 del regulador DosR. La fosforilació d’Asp54 és un interruptor que activa DosR i incrementa la seva afinitat per als promotors dels gens que regula. Les treonines 198 i 205 de DosR tenen un paper crucial en la dimerització de DosR i en la seva unió al DNA. Les dinàmiques moleculars realitzades amb la proteïna salvatge DosR i amb versions mutants mostren diferències notables en la formació del dímer actiu. També mostren una reducció o abolició completa de les interaccions proteïna-DNA a causa de les repulsions generades pels residus mutants carregats negativament. Encara més, les substitucions en Thr198 i Thr205 tenen un important efecte en la fosforilació química i enzimàtica de DosR així com també en la seva defosforilació catalitzada per DosS. El sistema de dos components DosRST és una bona diana per al desenvolupament de nous compostos amb activitat antimicobacteriana contra formes dorments de Mycobacterium tuberculosis. S’ha iniciat un programa de recerca dirigit al desenvolupament d’inhibidors específics de la proteïna reguladors DosR, usant com a punt de partida compostos comercials estructuralment relacionats amb un derivat fenilcumarínic que ha estat descrit com a molècula que interfereix en la interacció DosR-DNA. / La tuberculosis, la enfermedad infecciosa causada por Mycobacterium tuberculosis, es un problema de salud global que provoca aproximadamente 2 millones de muertes anuales. Un tercio de la población mundial se encuentra crónicamente infectada con Mycobacterium tuberculosis pero no muestra síntomas clínicos aunque tiene un riesgo de un 10% de desarrollar la enfermedad, lo que representa un reservorio incontrolable de tuberculosis. En esta condición asintomática, conocida como tuberculosis latente, Mycobacterium tuberculosis se localiza en lesiones granulomatosas en el huésped y es resistente a los medicamentos antimicobacterianos existentes en la actualidad. En bacterias, los sistemas regulatorios de dos componentes son un conjunto de proteínas implicadas en la adaptación a cambios en el entorno del microorganismo. Un sistema de dos componentes típico consta de una histidina quinasa unida a membrana que tiene un papel esencial como sensor de los cambios ambientales y un regulador transcripcional citosólico que ejerce su función controlando la expresión de genes diana. Este par de proteínas funciona como un interruptor molecular que controla distintas respuestas adaptativas a cambios en el ambiente celular. Mycobacterium tuberculosis tiene 11 sistemas de dos componentes completos. El sistema DosRST, compuesto por un regulador transcripcional, DosR, y dos histidinas quinasas, DosS y DosT, juega un papel estelar en la adaptación de Mycobacterium tuberculosis a la tuberculosis latente. DosS y DosT se autofosforilan en residuos conservados de histidina y ambas proteínas transfieren esta unidad de fosfato al residuo de ácido aspártico en posición 54 del regulador DosR. La fosforilación de Asp54 es un interruptor que activa a DosR e incrementa su afinidad por los promotores de los genes que regula. Las treoninas 198 y 205 de DosR juegan un papel crucial en la dimerización de DosR y en su unión al DNA. Las dinámicas moleculares realizadas con la proteína salvaje DosR y con versiones mutantes muestran diferencias notables en la formación del dímero activo. También muestran una reducción o abolición completa de las interacciones proteína-DNA a causa de las repulsiones generadas por los residuos mutantes cargados negativamente. Más aún, las sustituciones en Thr198 y Thr205 tienen un importante efecto en la fosforilación química y enzimática de DosR así como también en su defosforilaición catalizada por DosS. El sistema de dos componentes DosRST es una buena diana para el desarrollo de nuevos compuestos con actividad antimicobacteriana contra formas durmientes de Mycobacterium tuberculosis. Se ha iniciado un programa de investigación dirigido al desarrollo de inhibidores específicos de la proteína reguladora DosR, usando como punto de partida compuestos comerciales estructuralmente relacionados con un derivado fenilcumarínico que ha sido descrito como molécula que interfiere en la interacción DosR-DNA. / Tuberculosis, the infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis, is a global health problem with approximately two million deaths annually. One-third of the world population is chronically infected with Mycobacterium tuberculosis but do not show clinical symptoms although there is a 10% risk to development active disease, representing an uncontrollable reservoir of tuberculosis. In this asymptomatic condition, referred to as latent tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis is located within granulomatous lesions in the host and is resistant to currently available antimycobacterial drugs. Two-component regulatory systems in bacteria are a major class of signal transduction proteins involved in adaptation to environmental changes. Typical system contains a membrane-bound histidine kinase that plays a crucial role in sensing environmental stimuli, and a cytosolic response regulator. This pair of proteins functions as a molecular switch that controls diverse adaptive environmental responses. Mycobacterium tuberculosis has eleven complete two-component systems. The DosRST system, composed of a response regulator, DosR, and two histidine kinases, DosS and DosT, plays a key role in Mycobacterium tuberculosis adaptation to latent tuberculosis. DosS and DosT autophosphorylate at conserved histidine residues and both proteins transfer this phosphor moiety to aspartic acid residue 54 of DosR. The phosphorylation of Asp54 serves as a switch to activate DosR and to increase the affinity for its cognate DNA promoters. Threonines 198 and 205 of DosR play a crucial role in DosR dimerization and DNA binding. The molecular dynamics with wild type and mutant version of DosR show different stability in the formation of the active DosR dimer. They also show the reduction or the abolishment of protein-DNA interactions because of the repulsions generated by negatively charged mutated residues. Moreover, substitutions in threonines 198 and 205 of DosR have a relevant effect on the chemical and enzymatic phosphorylation of DosR and on its DosS-catalysed dephosphorylation. The DosRST two-component system is a good target for the development of novel antimycobacterial drugs against dormant forms of M. tuberculosis. A structure-based discovery programme of inhibitors of DosR response regulator has been initiated with commercially available compounds showing a certain degree of similarity with a phenylcoumarin derivative previously described as DosR-DNA interfering molecule.

Tesi realitzada al Centre de Recerca en Agrigenòmica (CRAG) / Este proyecto se enfoca en el estudio del desarrollo vascular, analizando la regulación de los receptores de brasinoesteroides y el papel de los factores de transcripción R2R3-MYB en la modulación de la pared celular secundaria. Los brasinoesteroides (BRs) son hormonas vegetales cuya percepción ocurre en la membrana plasmática por el receptor BRI1 y que presentan roles esenciales en el crecimiento y desarrollo de la planta. Los receptores AtBRL3 y AtBRL1, han sido identificados como homólogos a BRI1, capaces de unir con alta afinidad brasinolido (BL), que es el compuesto más activo de los BRs. En este estudio se demostró que los brasinoesteroides regulan el patrón de expresión en el tejido vascular de AtBRL3 y que dicha regulación es dosis dependiente. En la región 5' de AtBRL3 fue identificado un elemento de respuesta a BRs (BRRE) y seguidamente, se estableció que la proteína BES1 que tiene afinidad por las cajas BRRE se une in vivo a la zona donde se encuentra. Los resultados genéticos y moleculares muestran que la expresión de AtBRL3 es promovida a concentraciones bajas de BRs o de la proteína BES1 y reprimida y/o alterada a concentraciones altas de la proteína BES1. De otra parte, esta investigación se orientó también al análisis de la modulación de la biosíntesis de lignina, que es un polímero que se localiza en la pared celular secundaria. La lignina es el segundo polímero más abundante de la biomasa vegetal, después de la celulosa, sin embargo es un componente no deseable para el uso de la biomasa para la alimentación animal y para la producción de bioetanol celulósico, ya que dificulta la destrucción de los polímeros de la pared celular y por tanto, la obtención de los azúcares que la integran (Zhong and Ye, 2009). Este hecho ha aumentado la relevancia de estudiar la ruta de la síntesis de lignina. Una de las familias de factores de trascripción que se ha descrito que son importantes en la ruta de la síntesis de lignina, son los R2R3-MYB. Los R2R3-MYB forman una familia multigénica muy amplia, dentro de la cual se encuentra el subgrupo 4, que se ha descrito que es importante en la represión de la biosíntesis de lignina. En este proyecto se estudio la regulación de la ruta de la síntesis de lignina por parte de los factores de transcripción R2R3-MYB del subgrupo cuatro ZmMYB11, ZmMYB31 y ZmMYB42, identificando in vivo sus dianas y generando con dichos resultados un perfil de unión a ADN, que indica que probablemente cada uno hace parte de un mecanismos de modulación de la producción de diferentes monolignoles. Posteriormente, con el fin de profundizar en el análisis de los mecanismo de modulación en los que están involucrados estos factores de transcripción se identificó y caracterizo un modulo regulatorio presente en el promotor de ZmCOMT, en cuya regulación está involucrado ZmMYB11 y ZmZIM91 que es un miembro de la familia TIFY que ha sido involucrada en respuestas a diversas hormonas como JA y ABA. Los resultado obtenidos permitieron establecer que ZmMYB11 y ZmZIM91 pueden formar un heterodímero que interactúa con el modulo regulatorio en cis AC-GATA/C de ZmCOMT con el fin de reprimir su expresión pero en presencia de metil jasmonato reducen su capacidad de unión al promotor de esta diana. / This project is focusing in the study of the vascular development, analyzed the regulation of brassinosteroid receptors and the role of the transcription factors R2R3-MYB in modulating secondary cell wall. Brassinosteroids (BRs) are plant hormones, perceived by the plasma membrane receptor BRI1 and exhibiting essential roles in plant growth and development. Two BR receptor like kinases AtBRL3 and AtBRL1, have been identified as BRI1 homologous, capable to bind BL, the most active BR, with high affinity and expressed in the plant vascular tissue. Analysing the 5’ flanking region of AtBRL3 revealed one BRRE and one E-box, both putative BES1 and BZR1 binding sites. Additional investigations uncovered BES1 as the important factor in the AtBRL3 regulation, exhibiting its function by directly binding to the BRRE in the 5’ flanking region of AtBRL3. In addition, the molecular and genetics results of this study show for AtBRL3 a BR regulated expression pattern in the plant vascular tissue. Moreover, the BR regulated expression of AtBRL3 in the root vascular tissue has been shown to be dose dependent, promoting its expression at low BR levels or BES1 protein and repressing and/or altering its spatial distribution with increasing concentrations of BRs or BES1 protein. In this research, also was analyzed the regulation of lignin biosynthesis, which is a polymer located in the secondary cell wall. Lignin is an undesirable component for the use of biomass for animal feed and for the production of cellulosic ethanol. The R2R3-MYB is one family of transcription factors that have been reported to be important in the regulation of the synthesis lignin pathway. In this project we studied the members of the R2R3-MYB family, subgroup 4: ZmMYB11, ZmMYB42 and ZmMYB31, identifying their targets in vivo and generating a profile of DNA binding with these results. Furthermore, we identified and characterized a cis regulatory module on the ZmCOMT promoter. In this regulatory module are involved ZmMYB11 and ZmZIM91 which is a member of TIFY family implicated in responses to various hormones such as jasmonic acid.

Tesi realitzada a l'Institut de Química Avançada de Catalunya (CSIC) - Bioglane S.L.N.E. / Los iminociclitoles son compuestos polihidroxilados de origen natural análogos de carbohidratos con extraordinario interés como inhibidores de glicosidasas y glicosiltransferasas. Estas enzimas están implicadas en multitud de procesos biológicos (e.g. digestión de carbohidratos en el intestino, biosíntesis de la pared bacteriana y el reconocimiento celular), por esta razón, sus inhibidores tienen interés para el desarrollo de fármacos o coadyuvantes para el tratamiento de diferentes enfermedades como diabetes, infecciones bacterianas o víricas, y cáncer. El objetivo de la presente tesis doctoral es el estudio de las propiedades biológicas y las posibles dianas terapéuticas de una colección de iminociclitoles sintetizados mediante técnicas quimio enzimáticas en nuestro grupo de investigación: piperidinas (D‐fagomina y L‐fagomina), pirrolidinas (1,4‐dideoxi‐1,4‐imino‐D‐arabinitol DAB, 1,4‐ dideoxi‐1,4‐imino‐L‐arabinitol LAB y sus derivados conjugados con aminas aromáticas, aminoalcoholes, aminoácidos y 2‐oxopiperazina), pirrolizidinas, indolizidinas y quinolizidinas. En una primera aproximación para establecer la actividad de estos compuestos, se estudiaron sus efectos in vitro sobre diferentes glicosidasas comerciales como modelos de diferentes dianas terapéuticas: α‐D‐glucosidasa de S. cerevisiae y de arroz, β‐Dglucosidasa de almendra dulce, β‐D‐galactosidasa de hígado bovino, α‐L‐rhamnosidasa de Penicillium decumbens, α‐D‐manosidasa de judía (Genus canavalia) y α‐L‐fucosidasa de riñón bovino. DAB y LAB resultaron ser los compuestos más potentes frente a las enzimas estudiadas, pero fueron menos selectivos que el resto de iminociclitoles estudiados. Los derivados de LAB conjugados con aminas aromáticas, así como algunas de las piperazinas e indolizidinas y quinolizidinas presentaron selectividad frente a α Lrhamnosidasa de P. decumbens. Los derivados de DAB y LAB conjugados con aminoalcoholes, con aminoácidos y del tipo 2‐oxopiperazina, así como otros iminociclitoles del tipo piperazina fueron selectivos frente a α‐glucosidasas. Para evaluar su posible aplicación como nuevos agentes terapéuticos o coadyuvantes para el tratamiento de trastornos relacionados con la digestión y metabolismo de carbohidratos como la diabetes o el síndrome metabólico, se estudiaron sus propiedades inhibitorias in vitro frente a disacaridasas intestinales y su efecto en la hidrolisis de almidón utilizando como modelo experimental la mucosa intestinal de ratas de la cepa Sprague‐Dawley. D‐Fagomina, DAB y LAB presentaron actividad de moderada a potente sobre estas enzimas. Los estudios se continuaron in vivo para establecer sus efectos sobre la digestión de sacarosa y almidón y su capacidad de modular la glicemia postprandial. Para ello se realizó un estudio a corto plazo en ratas. D‐fagomina, DAB y LAB ingeridos junto a sacarosa y almidón redujeron la concentración de glucosa en sangre de forma dosis dependiente sin estimular la secreción de insulina. La eficiencia de la D‐fagomina fue comparable la de Miglitol, un compuesto comercial disponible en el mercado como antidiabético oral para el tratamiento de la diabetes mellitus. Estos resultados sugieren la posible aplicación de estos compuestos como ingredientes dietéticos o alimentos funcionales para reducir los riesgos para la salud asociados a dietas ricas en carbohidratos o como fármacos o coadyuvantes para el tratamiento de enfermedades como la diabetes mellitus tipo 2. Finalmente se ha sugerido que los iminociclitoles con actividad inhibidora de α Lrhamnosidasa de P. decumbens podían poseer también la capacidad de inhibir la biosíntesis de dTDP‐L‐rhamonsa en Mycobacterium tuberculosis, constituyendo por ello potenciales agentes quimioterapeuticos para el tratamiento de la tuberculosis. Con el objetivo de determinar si los compuestos de este trabajo, activos frente a α Lrhamnosidasa de P. decumbens, presentaban esta propiedad, se estudiaron sus propiedades inhibitorias frente al crecimiento de M. tuberculosis en cultivos de micobacterias de la cepa de laboratorio H37Rv. De entre los compuestos evaluados los derivados aromáticos de LAB resultaron activos aunque menos potentes que el antibiótico isoniazida. / Iminocyclitols are naturally occurring polyhydroxylated compounds analogues of carbohydrates with a substantial interest as inhibitors of glycosidases and glycosiltransferases. As these enzymes are involved in many biological processes (e.g. carbohydrate digestion in mammals, cell wall biosynthesis in microorganisms and cellular recognition processes) iminocyclitols may lead to potential therapeutic drugs or adjuvants for the treatment of various diseases such as diabetes, bacterial infections and cancer. The aim of the present work was to study the biological properties of a library of iminocyclitols synthetized in our research group: D‐fagomine, L‐fagomine; DAB, LAB their aromatic, aminoalcohol and 2‐oxopiperazine derivatives, and new piperazines, indolizidines and pirrolizidines. Thus, we explored in vitro their inhibitory activity against a panel of commercial glycosidases. Although DAB and LAB were the most effective compounds, the rest of the iminocyclitols tested were shown to be more selective, against α‐D‐glucosidases and α‐L‐rhamnosidase. Moreover, these compounds, were assayed against intestinal disacharidases and starch digestion enzymes. D‐Fagomine, DAB and LAB showed moderate to potent in vitro activity against these enzymes and were also studied in vivo as modulators of the postprandial glycaemia using Sprague‐Dawley rats. After ingestion together with sucrose or starch they lowered blood glucose in a dose‐dependent manner without stimulating insulin secretion, suggesting that they may be used as dietary ingredients to reduce health risks associated with excessive intake of carbohydrates or as drugs for the treatment of type 2 diabetes mellitus. Iminocyclitol derivatives which are inhibitors of α‐L‐rhamnosidase, could also have the ability to inhibit dTDP‐L‐rhamnose biosynthesis on M. tuberculosis, and therefore constitute potential chemotherapeutic agents for tuberculosis. For this reason, the α Lrhamnosidase inhibitors found in this work, were assayed on mycobacterial systems and their Minimum Inhibitory Activities (MIC) values were determined. Although some of the new products were able to inhibit the growth of M. tuberculosis, they were less effective than the antibiotic isoniazid. However, we could not establish a correlation between α‐L‐rhamnosidase and dTDP‐L‐rhmnose biosynthesis inhibitory activities because DAB and its aromatic derivatives, which did not inhibit α‐L‐rhamnosidase were actives against M. tuberculosis. This might indicate that the products are not acting on the target rhramnosidase processing enzymes of the cell wall.

Tesi realitzada al Centre de Recerca en Agrigenòmica (CRAG) / La sequía es el factor más limitante para el crecimiento de las plantas y el acido abscísico (ABA) es la principal fito-hormona involucrada en la respuesta al estrés hídrico. El núcleo de señalización está formado por: los receptores de ABA PYR/PYL/RCAR, las proteínas fosfatasas de tipo C grupo A (PP2Cs) y las proteínas quinasas de tipo SnRK2 /OST1. Trabajos realizados en nuestro laboratorio permitieron caracterizar una proteína quinasa SnRK2 en maíz, la ZmOST1, que complementa el mutante de pérdida de función de Arabidopsis (ost1-2) en la respuesta a sequía. Realizando un cribado de doble híbrido en levadura, en el que se utilizó ZmOST1 como anzuelo frente a una librería de cDNAs de hoja joven de maíz deshidratada, se identificó un factor de transcripción (TF) de tipo bHLH entre los posibles interactores de la quinasa. En este trabajo se detallan los resultados obtenidos en la caracterización molecular y funcional de este TF denominado ZmKS (kinase substrate) y las diferencias funcionales de sus dos isoformas que se han denominado ZmKS1 y ZmKS2. El estudio del patrón de transcripción muestra que ZmKS se expresa en hoja y raíz de maíz así como en embrión y radícula en plantas transgénicas de Arabidopsis portadoras del promotor ZmKS fusionado a GUS. El patrón de expresión de las dos isoformas indica que los niveles de transcritos de ZmKS2 son más elevados que los detectados para ZmKS1 y que responden de forma similar a distintos tratamientos de estrés: para ambos, con ABA la cantidad de RNA aumenta en hoja y también en raíz con NaCl. Hemos averiguado que ZmKS es una proteína nuclear capaz de homo- y hetero-dimerizár y que interacciona preferentemente con una secuencia de DNA E-box like de 7 bp, como corresponde a un factor de transcripción del tipo bHLH. ZmKS1 y ZmKS2 presentan residuos fosforilables por la quinasa OST1 que son específicos de cada isoforma y ambas son directamente fosforiladas por ZmOST1 in vivo e in vitro. Las dos isoformas interaccionan en planta con ZmOST1 a través del dominio osmótico y/o ABA de la kinasa, esta interacción es nuclear para ZmKS1 mientras para ZmKS2 se localiza en núcleo y citoplasma. Análisis funcionales han revelado que la sobre-expresión de ZmKS en Arabidopsis determina un retraso en la germinación que es dependiente de fosforilación y del tratamiento con ABA. Las plantas transgénicas de ambas isoformas presentan una mayor apertura estomática y una respuesta mayor a la fusicoccina. Sin embargo la regulación estomática en estas plantas no depende de fosforilación. Los ensayos de tolerancia a la desecación tanto en plantas transgénicas de maíz como de Arabidopsis sobre-expresando ZmKS2 presentan una tasa mayor de pérdida de agua: este efecto diferencial de las dos isoformas en las plantas transgénicas sugiere un importante papel regulador del gen ZmKS en la tolerancia a la desecación. ZmKS se autoregularía tanto por splicing diferencial alterando las cantidades relativas de cada isoforma ZmKS1y ZmKS2 como mediante la fosforilación/defosforilación de las mismas. / Drought is the most limiting factor for plant growth worldwide and abscisic acid (ABA) is the major phytohormone mediating drought responses in plants. SnRK2/OST1 proteins are plant specific kinases that together with the ABA ligands PYR/PYL/RCAR and the type 2C protein phosphatases constitute the central core of ABA perception and signal transduction. Previous work in our group characterized the OST1 from Zea mays and established its role on ABA signaling. Previous work identified a bHLH transcription factor as a new ZmOST1 interactor. In the present work we have functionally characterized this bHLH, named ZmKS (kinase substrate) and its two isoforms, ZmKS1 and ZmKS2. ZmKS is expressed in leaves and roots of maize, as well as in embryos and roots of Arabidopsis transgenic lines expressing GUS under the control of its promoter. The comparison between the expression levels of the two factor’s isoforms revealed that the ZmKS2’s transcript amount is higher than that of ZmKS1. However, they both respond similarly to different stress treatments such as ABA and NaCl .We established that ZmKS is a nuclear protein capable of homo- and hetero-dimerization and that it can bind to an E-box like nucleotide sequence of 7 bp. The two isoforms present common and specific amino acid residues that can be phosphorylated by the ZmOST1 and we figured out that they interact with and are substrate of ZmOST1 in vivo and in vitro. Functional analysis revealed that in transgenic Arabidopsis plants over-expressing the two isoforms the germination process is delayed and that it is dependent on both phosphorylation and ABA treatment. These transgenic lines show an increased stomatal aperture not depending on the phosphorylation. During dehydration, transgenic lines of Arabidopsis and maize show that over-expression of ZmKS2 leads to an increase in water loss. Our results established ZmKS as a novel cognate substrate of ZmOST1 and suggest that ZmKS could play an important role in regulating desiccation tolerance by two mechanisms: by differential splicing altering the relative amounts of each isoform and by phosphorylation/de-phosphorylation of ZmKS1 and ZmKS2 by ZmOST1, revealing a novel OST1/ZmKS regulatory pathway during osmotic stress signaling.

Durant els primers estadis del desenvolupament embrionari dels metazous els teixits embrionaris son progressivament regionalitzats fins que adquireixen destins específics. En els vertebrats, el tub neural, que és el primordi del sistema nerviós central, es tempranament regionalitzat en el seu eix antero-posterior i queda dividit en les tres vesícules cerebrals i la medul·la espinal. La vesícula cerebral més posterior rep el nom de rombencèfal. En el rombencèfal un següent estadi de regionalització condueix cap a una organització en una serie de segments anomenats rombomers. Aquesta organització primària serveix de patró per les estructures que es van generant en el rombencèfal. A part d'unitats morfològiques els rombomers també son compartiments que observen restricció del llinatge cel·lular i expressen combinacions específiques de gens que els hi confereixen una identitat posicional. L'assoliment d'una identitat posicional per part de cadascun dels rombomers implica un procés jeràrquic i gradual en el qual intervenen tota una serie de factors de transcripció de tipus Hox i no Hox així com diferents molècules de senyalitzacióvHnf1 es un dels primers factors de transcripció expressats en el rombencèfal. En aquest projecte s'ha estudiat el paper de vHnf1 així com la implicació de la senyalització FGF en la regionalització del rombencèfal caudal del embrió de pollet. Els resultats mostren que vHnf1 s'expressa tempranament en el rombencèfal amb un límit rostral d'expressió coincident amb la frontera prospectiva entre els rombomers 4 i 5. Experiments de sobrexpressió mostren que vHnf1 es capaç de conferir caràcter caudal a rombomers rostrals tot induint Krox20 in MafB i reprimint Hoxb1 a r4. Les induccions de Krox20 i MafB resultaren ésser dependents de la senyalització per FGFs. Sorprenentment, els nostres resultats també mostren que vHnf1 indueix fortament la expressió de Fgf3. És més, anàlisis per RT-PCRs semiquantitatives demostraren que aquesta inducció es molt ràpida suggerint que Fgf3 és directament regulat per vHnf1. En aquest projecte també es presenta l'anàlisi dels perfils d'expressió d'alguns gens del grup de "sinexpressió" dels FGFs en el rombencéfal caudal. Finalment es determina que la senyalització FGF funciona a través de la via intracel·lular Ras-MAPK en el procés de regionalització del rombencéfal caudal sense implicació de la via PI3K-Akt. Aquests resultats ofereixen nova informació sobre els mecanismes moleculars implicats en la regionalització del rombencèfal caudal en vertebrats. De manera interessant aquests resultats posen de manifest certes diferencies en els mecanismes de regulació que operen en la regionalització del rombencéfal de diferents especies. / During early embryonic development of chordates, the hindbrain, which is the caudalmost brain vesicle, is transiently organized along the AP axis in a series of segments called rhombomeres (r). This segmental organization serves as scaffold for several structures that develop within the hindbrain in repeated patterns. Each rhombomere has a molecular identity given by a specific combination of gene expression. Rhombomeric identity is the result of a progressively refined patterning that involves the interplay of different cell signaling pathways and rhombomere-specific transcription factors. In the present project the role of vHnf1, one of the earliest transcription factors expressed in the hindbrain, and its interplay with FGF signaling has been analyzed during the chick embryo development. The results show that vHnf1 is very early expressed in the chick neuroepithelium with a sharp boundary of expression coinciding with the presumptive r4/r5 interrhombomeric boundary. Gain-of-function experiments demonstrated that vHnf1 is able to confer partial caudal character to rostral rhombomeres through the mediation of FGF signaling. We also analyzed the expression of genes of the FGF synexpression group in the caudal hindbrain. Finally, we determined that the role of FGF signaling in regulating the caudal rhombomeric markers Krox20 and MafB is mediated through the Ras-ERK1/2 intracellular pathway.The results of this project provide new information about the molecular mechanisms involved in patterning the vertebrate caudal hindbrain. Interestingly, while requirement of vHnf1 and FGF signaling for caudal hindbrain patterning is an evolutionary conserved feature, the ways by which FGF signals are regulated during this process differ across species.

El rápido desarrollo de la Nanotecnología durante las últimas décadas ofrece amplias perspectivas en el uso de materiales a micro- y nanoescala en diferentes áreas de la industria, tecnología y medicina. Sin embargo, su uso y aplicación segura y eficaz en estas áreas requieren un control mucho mayor sobre sus propiedades físico-químicas y sus interacciones moleculares relacionadas con los seres vivos. El conocimiento actual de la comunidad científica está de acuerdo en que existe una brecha considerable en la comprensión de este tipo de interfaz "Nano-Bio". Dando un paso adelante en esta dirección, este trabajo de Tesis ha tenido como objetivo proporcionar conocimientos sobre la formación racional de bioconjugados de nanopartículas de oro para modular y comprender sus interacciones y los procesos celulares. En este contexto, la primera parte de esta Tesis se centra en la síntesis de nanopartículas de oro catiónicas y sus interacciones con células. La primera estrategia desarrollada para la síntesis de nanopartículas de oro cargadas positivamente se llevó a cabo mediante el uso simultáneo de un reductor débil y uno fuerte. Se ha demostrado que los dos reductores actúan de forma secuencial en el proceso sintético para producir nanopartículas de oro catiónicas monodispersas, con tamaños comprendidos entre 10.3 nm y 19.7 nm. Se describe también un método de crecimiento de nanopartículas de oro, en el que se obtienen nanopartículas monodispersas de mayor tamaño (de hasta ~ 28 nm) a partir de nanopartículas de oro previamente sintetizadas, mediante la adición de precursor y un reductor débil. La segunda estrategia desarrollada hace frente a la creciente demanda de nanopartículas de oro catiónicas de diferentes tamaños y ligandos, mediante el empleo de una metodología de transferencia de fase de medio orgánico a acuoso. Esta combinación de métodos de síntesis orgánica y acuosa da como resultado importantes beneficios. Esta estrategia se ha optimizado para preparar nanopartículas de oro catiónicas de 4.6, 8.9 y 13.4 nm de diámetro, usando un ligando alquílico tiolado con carga positiva. Además, su aplicación práctica se demostró mediante la producción de bioconjugados de oro de 13 nm con un péptido catiónico y otro aniónico. Las propiedades físico-químicas de estos bioconjugados en medios de cultivo celular, así como su internalización y toxicidad en fibroblastos humanos han sido estudiados. La segunda parte de esta Tesis se centra en la funcionalización racional de nanopartículas de oro con anticuerpos y la investigación de su interacción específica con receptores celulares. La formación de bioconjugados de oro con anticuerpos se ha estudiado utilizando una química selectiva, que ha permitido controlar el número de anticuerpos y su orientación en la nanopartícula. La obtención de bioconjugados bien definidos hizo posible la creación de nuevos autoensamblajes de nanopartículas mediante reconocimiento anticuerpo-antígeno. Esta estrategia también se exploró para la conjugación de un anticuerpo biológicamente relevante (Cetuximab) con nanopartículas de oro. Bioconjugados de oro con Cetuximab de configuración y multivalencia controlada se han utilizado para examinar su interacción con el receptor de superficie celular EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico), un receptor de tirosina quinasa que es sobreexpresado en un gran número de cánceres. / The rapid development in Nanotechnology during the past few decades offers wide prospects in using micro- and nanoscale materials in different areas of industry, technology and medicine. However, their safe and efficient use and implementation in such areas require much greater control over their physicochemical properties and their related molecular interactions in living systems. Current knowledge in the scientific community agrees that a considerable gap exists in our understanding of such “Nano-Bio” interface. As a step forward in this direction, this Thesis work aimed to provide insights into the formation of rationally designed gold nanoparticle (Au NP) bioconjugate architectures to modulate and understand cellular interactions and processes. In such a context, the first part of this Thesis is focused on the synthesis of cationic Au NPs and their interactions with cells. A first strategy was developed in which the synthesis of positively charged Au NPs was performed by using simultaneously a weak and a strong reducer. It is shown that both reducers act sequentially in a one-pot synthesis to yield monodisperse cationic Au NPs with sizes comprised between 10.3 nm and 19.7 nm. A two-step seeding growth method is also described in which preformed Au NPs are grown larger (up to ~28 nm in size) by addition of fresh precursor solution and a weak reducer. A second strategy faces the rising demand of cationic Au NPs of different sizes and ligands by employing an organic-aqueous phase transfer methodology. Important benefits resulted from the combination of organic and aqueous synthetic methods. This strategy was optimized to prepare cationic Au NPs of 4.6, 8.9 and 13.4 nm in diameter using a positively charged alkanethiolate ligand. In addition, its practical application was demonstrated by producing ~ 13-nm-in-size cationic and anionic peptide-Au NP bioconjugates. The physicochemical properties of these bioconjugates in cell culture media as well as their uptake and toxicity on human fibroblast cells are discussed. The second part of this Thesis is focused on the rational functionalization of Au NPs with antibodies and investigating their interactions with cellular receptors. A site-directed chemistry was explored to prepare Antibody-Au NP bioconjugates with controlled ratio and orientation of bioconjugation. The formation of well-defined bioconjugates made possible the creation of novel NP-based assemblies using antibody-antigen cross-links. This strategy was also explored for the conjugation of a biologically relevant antibody (Cetuximab) with Au NPs. Cetuximab-Au NP bioconjugates of controlled configuration and multivalency were used to examine their interaction with the cell surface receptor EGFR (epidermal growth factor receptor), a receptor tyrosine kinase overexpressed in a large number of cancers.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) / The oncogenic properties of E2F1 have been traditionally associated with the role of the oncogene in proliferation, but during the last few years many other functions associated with this family of transcription factors have been emerging. We focused on the study of the oncogenic properties of E2F1 not related to the cell cycle progression. In particular, previous results of our research group demonstrated that the overexpression of mammal E2F1 induces cellular growth by activating the mTORC1 pathway. Taking into account the well known implication of the mTOR pathway in cancer, the general aim of the Thesis is to elucidate the molecular mechanism by which E2F1 regulates mTORC1. This led us to novel observations concerning the ability of E2F1 in regulating V-ATPase activity, intracellular trafficking and autophagy repression. Specifically, we demonstrated that E2F1 enhances the activity of V-ATPase, the major regulator of lysosomal pH. By modulating this activity, E2F1 is capable of regulating lysosomal biology. This leads to the activation of mTORC1, to the relocalization of lysosomes to the cell periphery and to the repression of the autophagy flux. We showed that, similarly to the amino acids signaling, E2F1 activation pro- motes the translocation of mTOR to lysosomes and also induces an increase in the binding of mTORC1 to the lysosomal protein RagB. Our immunofluorescence analysis revealed that mTORC1 activity is not necessary for the peripheral movement of lysosomes regulated by E2F1. However, the depletion of Raptor totally abrogates this response. The ability of E2F1 to act as an autophagy repressor is due to its capacity in driving lysosomes to cell periphery and also in activating mTORC1. Moreover, we identified kinesin KIF2A as a novel transcriptional target of E2F1. Although KIF2A basal levels are required for E2F1-induced mTORC1 activation, the increase in KIF2A levels triggered by E2F1 does not contribute to mTORC1 activation. E2F1 enhances V-ATPase activity, and this modulation is required for E2F1-induced lysosomal trafficking and mTORC1 activation. E2F1 promotes an increase in the binding of the C1 subunit of the V1 domain, ATP6V1C1, to the V-ATPase/RagB lysosomal complex, suggesting that such binding could be the mechanism through which E2F1 enhances V-ATPase activity. Finally, we showed that E2F1 activation leads to a general re-arrangement of the cytoskeleton and that, moreover, is required to promote cell migration. Several studies indicated a high correlation between E2F1 overexpression and metastasis. Our data showing that E2F1 is required for cell migration are in agreement with the theory of E2F1 being a promotor of invasiveness. Taking into account the implication of V-ATPase in cancer, our novel observations concerning the ability of E2F1 to regulate the peripheral movement of lysosomes and to enhance V-ATPase activity help us to better understand the role of E2F1 in invasion and metastasis. / Además de controlar la proliferación celular, E2F1 regula otros procesos biológicos asociados con la progresión del cáncer. En particular, resultados previos de nuestro grupo han demostrado que E2F1 induce el crecimiento celular mediante la activación de la vía de transducción de mTORC1. Teniendo en cuenta el papel central de esta vía en el cáncer, el objetivo de la Tesis ha sido estudiar los mecanismos moleculares que regulan la activación de mTORC1 inducida por E2F1. Este estudio nos ha permitido demostrar que E2F1 es un regulador del tráfico endosomal, de la actividad de la V-ATPase, el principal regulador del pH lisosomal, y de la autofagia. Mediante la activación de la V-ATPase, E2F1 induce la activación de mTORC1, el movimiento de los lisosomas hacia la periferia de la célula y la represión de la autofagia. Nuestros resultados en concreto han demostrado que la sobre-expresión de E2F1 induce la translocación de mTORC1 a los lisosomas y promueve su asociación con la proteína lisosomal RagB. El movimiento periférico de los lisosomas regulado por E2F1 no depende de la actividad de mTORC1, pero requiere la presencia de Raptor. La capacidad de E2F1 de reprimir la autofagia está mediada probablemente por la activación de mTORC1 y el movimiento de los lisosomas hacia la periferia celular. También hemos identificado la kinesina KIF2A cómo una nueva diana transcripcional de E2F1. Aunque esta kinesina es necesaria para la activación de mTORC1, el aumento de los niveles de KIF2A no es responsable de la activación de mTORC1 inducida por E2F1. En paralelo, E2F1 aumenta la actividad de V-ATPasa, y esta modulación es necesaria para la activación de mTORC1 y el tráfico lisosomal inducido por E2F1. E2F1 induce la asociación de RagB con la subunidad C1 V1 de la V-ATPasa (ATP6V1C1). Esta unión podría ser el mecanismo a través del cual E2F1 activa la V-ATPasa y mTORC1. Por último, E2F1 regula el ensamblaje del citoesqueleto y es necesario para la migración celular. Nuestros datos sobre el papel de E2F1 en la migración celular concuerdan con la propiedad ya descrita de E2F1 como un promotor de invasividad. Teniendo en cuenta el rol de la V-ATPase en la invasividad, nuestras observaciones relativas a la capacidad de E2F1 de regular el movimiento periférico de lisosomas y de activar la V-ATPasa nos ayudan a entender el papel de E2F1 en la invasión y metástasis.