Els neuroblastomes es caracteritzen per l’heterogeneïtat de les cèl•lules que els composen i la seva capacitat de transdiferenciar entre els diferents fenotips cel•lulars. La freqüència de mutacions en el gen de p53 és molt baixa en el moment de la diagnosi, manifestant-se, normalment, només després del tractament inicial. Aquestes característiques són les causes principals del fracàs dels tractaments actuals contra aquesta neoplàsia. L’objectiu d’aquesta tesi ha estat assajar noves estratègies terapèutiques que poguessin resultar efectives contra tots els tipus cel•lulars, per tal d’evitar l’aparició de recidives. Amb aquesta finalitat, hem decidit utilitzar dues drogues amb eficàcia clínica demostrada. D’una banda, s’ha escollit el SAHA, un inhibidor inespecífic de les HDACs que ha demostrat la seva eficàcia independentment del context de p53; i per l’altra, s’ha seleccionat l’inhibidor de la transcripció actinomicina D, que ha demostrat ser més eficaç contra les cèl•lules que expressen p53. A més, s’ha utilitzat la nutlina-3 com a control per verificar la repercussió de p53 en l’efecte de l’actinomicina D. Aquest treball demostra com aquests fàrmacs disminueixen la viabilitat de totes les línies cel•lulars de neuroblastoma analitzades. El mecanisme i la sensibilitat al tractament observats depenen, tant de la droga utilitzada, com de la línia cel•lular examinada. Així doncs, els resultats obtinguts demostren el potencial d’aquests compostos i de la seva combinació com a estratègia terapèutica per al neuroblastoma. / Neuroblastomas are characterized by the heterogeneity of their cell population and for their ability to transdifferentiate among the different cell phenotypes that are present in the tumor. The frequency of p53 mutations is sparingly low at the time of diagnosis, manifesting only after the initial treatment. These features are the main cause of failure of current treatments for this malignancy. The aim of this thesis was to test new therapeutic strategies that may be effective against all cell types present in the tumor, in order to avoid relapse. To this end, we decided to use two drugs with proven clinical efficacy. On one hand, the nonspecific HDAC inhibitor SAHA, which exerts its effect in a p53-independent manner, was chosen; on the other hand, the transcription inhibitor actinomycin D, which is more efficacious against cells expressing p53, was selected. In addition, we used nutlin-3 as a control to verify the impact of p53 on the effect of the actinomycin D. This work demonstrates how these drugs decrease the viability of all neuroblastoma cell lines analyzed. The mechanism and sensitivity to treatment depend on both drugs used and the cell line examined. Thus, the results suggest the potential of these compounds and their combination as a therapeutic strategy for neuroblastoma.

USP28 és un enzim de-ubiquitinasa (DUBs), homologa a USP25, que pertany a la família USPs. USP28 s’ha involucrat en apoptosis induïda per IR i en l’estabilitat de vari regulador de DDR (Reparació de Dany al DNA). D’altra banda, SENP5 és una proteasa especifica per Sentrin/SUMO de la família de SENP, que s’ha descrit que està involucrada en mitosi i citocinesi. En aquesta tesi, el principal objectiu ha estat la resolució de les seves estructures cristal·lines i la caracterització de la regulació de la seva activitat proteolítica. Respecte a la part de USP28, hem aconseguit produir diferent constructes del seu Domini Catalític (CD) i de la regió N-terminal (NT), i hem caracteritzat les seves activitats sobre diferent substrats poli-Ubiquitina. També hem identificat el lloc de SUMOilització primari de USP28 per Espectrometria de Masses (K99). També hem aconseguit obtenir cristalls del NT de USP28 i del CD de USP25. Desafortunadament, la difracció d’aquests cristalls és dèbil i la seva estructura no s’ha pogut resoldre. També hem identificat l’especificitat de cadena di-Ubiquitin en USP28 (K11, K48 i K63 cadenes). Els nostres assajos in vitro indiquen que l’activitat proteolítica de USP28 es pot regular per modificació covalent per SUMO a la regió N-terminal. De totes formes, la presencia de la regió N-terminal no és estrictament necessària per l’activitat USP28. Si considerem que tenim un domini SIM, un domini UBA i dos dominis UIMs a la regió N-terminal, fóra interessant estudiar aquest aspecte amb més detall en el futur. Respecte a la part de SENP, hem posat molts esforços en la producció d’una construcció soluble del Domini Catalític (CD) de SENP3 i SENP5. Finalment, hem aconseguit produir en grans quantitats un constructe soluble de SENP5-CD en E.coli. Hem caracteritzat in vitro les reaccions de processament de SUMO i de deconjugació de SUMO. També ham format complexes entre un mutant inactiu de SENP5-CD-C712S amb el precursor de SUMO2 (Sp5-S2p) i amb el substrat RanGAP1-SUMO2. Només hem aconseguit obtenir cristalls de Sp5-S2p, malauradament la difracció era tan dèbil que no hem pogut resoldre l’estructura a alta resolució. / USP28 is a member of a family of deubiquitinating enzymes (DUBs), homologous to USP25, belonging to the USP family. USP28 has been involved in IR-induced apoptosis and in the stability of numerous DDR regulators. On the other hand, SENP5 is a member of the Sentrin/SUMO-specific proteases (SENP) in humans, which is reported to be involved in mitosis and/or cytokinesis. In this thesis, the main goal has been to elucidate their crystal structures and to characterize the regulation of their proteolytic activities. With respect to the USP28, we have produced different constructs of their Catalytic Domain (CD) and N-terminal región (NT), and have characterized their activities against different poly-Ubiquitin substrates. We have also identified the USP28 SUMOylation primary site by Mass Spectrometry (K99). We have been able to obtain nice crystals of the NT of USP28 and of the CD of USP25. Unfortunately, the diffractions of these crystals were weak and the structure could not be solved. We have also identified the di-Ubiquitin chain specificity of USP28 (K11, K48 and K63 linkages). Our in vitro analysis indicates that the USP28 proteolytic activity can be regulated by covalent SUMO modification at the N-terminal region; however, the presence of this N-terminal region is not strictly necessary for the USP28 activity. Considering there are one SIM, one UBA and two UIMs in the N-terminal region, this issue would be interesting to be explored deeply in the future. Regarding to the SENP part, we have put many efforts on the protein expression of different constructs of the Catalytic Domains (CD) of SENP3 and SENP5. Finally we have been able to produce in high yields a soluble construct of SENP5-CD in E.coli. We have characterized the SUMO processing and SUMO deconjugation reactions of SENP5-CD. We also have formed complexes between the inactive mutant of the SENP5-CD-C712S with SUMO2 precursor (Sp5-S2p) and with RanGAP1-SUMO2 substrates. We could only get crystals of Sp5-S2p, however the diffraction was so weak that we could not solve the structure at high resolution.

Els adenovirus helper-depenents (HDAd) són vectors molt atractius per teràpia gènica perquè tenen una gran capacitat de clonatge, poden infectar una àmplia varietat de tipus cel·lulars, independentment del seu estat de proliferació, i indueixen una expressió prolongada del transgèn sense toxicitat crònica. La producció d´aquests vectors ha estat àmpliament optimitzada fins al punt en que produccions de nivell clínic poden ser obtingudes amb nivells reduïts de contaminació per adenovirus helper. Tot i això, aquests mètodes encara han de ser millorats, ja que la majoria d´aquests no són escalables i, per tant, requereixen una quantitat considerable de temps i esforç per obtenir preparacions a gran escala. Malgrat la constant optimització de la producció de HDAd, encara existeix preocupació per l´aplicació clínica d´aquests vectors a causa de que la resposta immune humoral contra la càpside viral limita la seva eficiència, mentre que la resposta immune innata limita la seva bioseguretat. En aquest aspecte, l´ús de HDAd no humans per tal d´evitar la resposta immune sembla una opció molt prometedora per la seva aplicació en assajos clínics. Tot i això, la producció d´aquests vectors encara no ha estat suficientment optimitzada, i normalment produeix baixos nivells de títols infecciosos amb un elevat grau de contaminació per adenovirus helper que impedeix el seu ús en assajos clínics. A més a més, per millorar la bioseguretat i eficàcia d´aquests vectors, diferents estratègies basades en la modulació de les interaccions entre les proteïnes fiber dels virus i els receptors cel·lulars s´estan testant. Els elevats nivells de transducció d´aquests vectors quimèrics permetria assolir nivells terapèutics del vector a dosis baixes, fent que siguin més segurs a la clínica. Per altra banda, la modificació de la càpside pot ser utilitzada per generar vectors capaços de transduïr un sol tipus de cèl·lula diana específica, permetent el control del tropisme i, per tant, evitant una distribució generalitzada del vector, resultant un gran avenc en termes de bioseguretat. En aquest aspecte, la generació de sistemes de produir HDAd quimèrics és molt interessant, ja que aquests vectors combinen les anomenades avantatges dels vectors quimèrics i la bioseguretat dels HDAds. / Helper-dependent adenovirus (HDAd) are very attractive vectors for gene therapy because they have a large cloning capacity and can infect a wide variety of cell types, regardless of their proliferation state, and result in long-term transgene expression without chronic toxicity. The production of these vectors has been widely optimized up to a level where clinical-grade productions can be achieved with very low helper-Ad contamination levels. However, this methods still need to be improved, as most of them are not scalable and therefore require an important amount of time and effort to achieve large-scale preparations. Despite the ongoing optimization of HDAd production, there is still concern for the clinical application of HDAd vectors because the humoral immune response against the viral capsid limits their efficiency, while the innate immune response limits their biosafety. In this regard, the use of non-human-derived HDAd vectors to avoid the immune response seems to be a very promising option for their application in clinical trials. However, the production of these vectors has not been sufficiently optimized yet, generally producing low infectious titers with levels of helper contamination that do not permit their use in clinical trials. Also, to improve the biosafety and efficacy of HDAd vectors, different strategies based on modulating the interaction between viral fiber proteins and the cellular receptors by capsid modification are currently being tested. The higher transduction efficiencies of these chimeric vectors would allow therapeutic levels of the vector using lower doses, making them safer in the clinic. Also, capsid modification could be performed to generate vectors capable of only transducing a specific target cell, allowing the control of vector tropism, and therefore avoiding a widespread distribution of the vector, which would be an important step forward in terms of biosafety. In this regard, the generation of systems to produce chimeric HDAd is very interesting, as these vectors combine the mentioned advantages of chimeric vectors and the biosafety of HDAds. In this thesis we developed and optimized HDAd production strategies for these vectors based on the use of helper-Ad with the attB sequence of ΦC31 recombinase, which causes a delay on the viral life cycle of these vectors, allowing a preferential amplification of HDAd without requiring the use of cell lines with Cre recombinase expression.

En la revisión de los resultados de medida de las magnitudes bioquímicas de laboratorio clínico se decide si estos pueden ser entregados al solicitante, es decir “validados”, o bien deben ser retenidos y sometidos a una revisión más detallada. Los resultados de medida que no pueden ser entregados durante este proceso se consideran resultados de medida sospechosos. El objetivo de esta tesis es el desarrollo de un sistema para la revisión de resultados de medida de algunas magnitudes bioquímicas de laboratorio clínico, con la finalidad de establecer una forma estandarizada para llevar a cabo esta revisión. El conjunto de procedimientos utilizados para realizar esta revisión se denomina control de la plausiblidad. En esta tesis se desarrollan las herramientas para el control de la plausibilidadque permiten detectar los resultados de medida que se consideran sospechosos debido a que: (a) quedan fuera de unos límites de alerta, que definen un intervalo dentro del que se espera encontrar una gran proporción de resultados de medida de pacientes, (b) no concuerdan con el resultado de medida previo del paciente en cuestión (límites de cambio o deltacheck) (c) o no concuerdan con los resultados de medida de otras magnitudes bioquímicas obtenidos en la misma muestra (límites de predicción). Las magnitudes bioquímicas estudiadas son la concentración en el plasma de: creatininio, urea, albúmina, proteína, alanina-aminotransferasa, aspartato-aminotransferasa, fosfatasa alcalina, γ-glutamiltransferasa, glucosa, ion potasio, ion sodio, tirotropina, tiroxina (libre), ferritina y hierro (II + III). Para la estimación de los límites de alerta, de cambio y de predicción se han utilizado todos los datos correspondientes a los resultados de medida, de las magnitudes bioquímicas seleccionadas, obtenidos en el laboratorio clínico durante un año. Los límites de alerta se han estimado a partir de los percentiles que corresponden a los resultados de medida que excluyen el 10 %, 1 % y el 0,1 % de los resultados de medida. Los límites de cambio se han estimado a partir de los percentiles que corresponden a las diferencias relativas entre dos resultados de medida de un mismo paciente que excluyen el 10 %, 1 % y el 0,1 % de las diferencias relativas calculadas. Los límites de predicción se han estimado a partir de ecuaciones de regresión por el método de mínimos cuadrados para los resultados de medida de las magnitudes bioquímicas relacionadas fisiopatológicamente, estableciendo diferentes intervalos de confianza (90 %, 99 % y 99,9 %). Para asegurar que el modelo de estimación de los límites de alerta, de cambio y de predicción es reproducible en el tiempo, se han aplicado los límites estimados a otro conjunto de datos (resultados de medida de otro año diferente) y se ha verificado que el porcentaje de resultados de medida sospechosos obtenido es similar al porcentaje esperado. Se ha realizado la separación de los límites de alerta y de cambio en dos subgrupos, según la procedencia de los resultados de media sea de pacientes ingresados o ambulatorios, permitiendo adecuar estos límites a cada población a la que se apliquen. Se ha realizado la aplicación simultánea de los límites de alerta, de cambio y de predicción para estudiar el porcentaje de resultados de medida que son considerados como sospechosos por cada límite, observándose que, en general, cada uno de estos límites es útil para detectar resultados de medida sospechosos. Al aplicar los límites de alerta, de cambio y de predicción a los resultados de medida de las magnitudes bioquímicas contenidas en los informes de laboratorio clínico, al aumentar el número de magnitudes bioquímicas incluidas en estos, aumenta la probabilidad de que el resultado de medida de alguna de las magnitudes bioquímicas supere alguno de los límites de alerta, de cambio y de predicción. La aplicación de cada una de las combinaciones de los límites de alerta, cambio y predicción, proporciona un porcentaje diferente de informes de laboratorio sospechosos, y para la selección de los percentiles utilizados en la estimación de estos límites, cada laboratorio clínico ha de establecer que carga de trabajo, derivada de la aplicación de este control de la plausibilidad, puede asumir. Se ha realizado también, un experimento de revisión por inspección visual de los resultados de medida por facultativos especialistas, que pone en evidencia la elevada variabilidad interindividual existente cuando se realiza este proceso de esta forma. / In the review of patients’ measured results of clinical laboratory quantities, specialists decide if measured results can be delivered to the petitioner, (commonly known validated) or by the contrary, measured results must be retained and reviewed in a more detailed way. The measured results that can not be delivered during this process are considered as doubtful measured results. The objective of this thesis is to develop a system to review measured results of some biochemical quantities commonly measured at clinical laboratories, in order to establish a standardized way to perform this review. The set of procedures used for this review is called plausibility control. In this thesis are developed the main tools in the plausibility control, which allows professionals to detect doubtful measured results because: (a) exceed some alert limits, which define an interval where a large proportion of such measured results can be expected to be found, (b) are not in agreement with the corresponding preceding one using a change limit (change limits or deltacheck), (c) are not in agreement with measured results of other quantities obtained in the same sample (prediction limits). The biochemical quantities studied in this work were the concentration in plasma of the following compounds: creatininium, urea, albumin, protein, alanine-aminotransferase, γ-glutamyltransferase, aspartate-aminotransferase, alkaline phosphatase, glucose, potassium ion, sodium ion, thyrotropin, thyroxine (free), ferritin and iron (II + III). To estimate the alert, change and prediction limits data corresponding to measured results of the biochemical quantities obtained in one year have been used. Alert limits have been estimated through the percentiles corresponding to the results that exclude the 10 %, 1 % and 0,1 % of the measured results. Change limits have been estimated based on the percentiles corresponding to the relative differences between two measured results from the same patient that exclude 10 %, 1 % and 0,1 % of relative differences calculated. Prediction limits have been estimated from regression equations adjusted by the least square method using the measured results of the biochemical quantities related pathophysiology, establishing different confidence intervals (90 %, 99 % and 99,9 %). To assure that the model performed to estimate alert, change and prediction limits was reproducible over time, these limits have been applied to another set of data (measured results of a different year) and it was verified that the percentage of doubtful measured results obtained was similar to the expected one. A separation of the alert and change limits in two subgroups was performed, according to the origin of the measured results: inpatient or outpatient. This separation allowed us to adjust these limits for each group in which they apply. Finally, a simultaneous application of the alert, change and prediction limits was performed in order to study the percentage of doubtful measured results for each limit; once it was performed, we could note that these limits were useful to detect doubtful measured results. The application of alert, change and prediction limits to the measured results of biochemical quantities that are usually included in the laboratory reports, provide an increase of the number of doubtful results, the greater is the number of biochemical quantities included in the report, since the probability of one measured result exceeds any of the these limits is higher. The application of each combination of the alert, change and prediction limits, provides a different percentage of doubtful laboratory reports; therefore, in order to select the percentiles used in the estimation of these limits, each clinical laboratory must decide what workload resulting from the application of the plausibility control, could assume. In addition, an experiment based on reviewing reports by visual inspection of the measured results was performed by laboratory specialists. The experiment demonstrated a high interindividual variability of the process.

En las últimas décadas, la incidencia de enfermedades autoinmunes ha aumentado notablemente, ya sea por el mayor conocimiento, por la mejora en las herramientas de diagnóstico, o por los cambios en los hábitos de vida. Así, el incremento de afectados por este tipo de enfermedades se ha convertido en un problema social grave, pues trastornos autoinmunes crónicos como la Esclerosis Múltiple (EM) o la Enfermedad de Crohn (EC) pueden aparecer en etapas tempranas de la vida, afectando gravemente a su calidad. Más aún, los tratamientos actuales contra estas enfermedades son paliativos y frenan levemente su desarrollo, sin lograr evitar su transcurso a largo plazo, y provocando efectos secundarios graves muchas veces. Por otro lado, el coste de los medicamentos y los cuidados multidisciplinares que los pacientes requieren a lo largo de su vida constituyen un problema económico-sanitario elevado, haciendo cada vez más importante la aparición de una cura eficaz. La EC es una enfermedad inflamatoria intestinal grave que afecta especialmente al colon y al íleo, además de tener otras complicaciones sistémicas y extraintestinales. Por su parte, la EM es una enfermedad desmielinizante que afecta al SNC provocando una pérdida progresiva de la movilidad y otras complicaciones secundarias. En ambas enfermedades juega un papel muy importante la vía Th17, y por consiguiente, la IL23. De hecho, algunos tratamientos experimentales para ambas tratan de inhibir la función de IL23 mediante el uso de anticuerpos, con resultados controvertidos. Así pues, en este trabajo nos propusimos estudiar una estrategia de terapia génica no basada en el uso de anticuerpos, sino en un vector viral portador de IL23R soluble (IL23Rs), que se uniera a IL23 y redujera su acción. En la primera parte, nos centramos en la EC y en la obtención del vector viral idóneo para terapia intestinal. El adenovirus quimera Ad5/40S, con un marcado tropismo intestinal cumple estos requisitos. Sin embargo, su producción in vitro era muy ineficiente, por lo que se desarrolló un método optimizado de producción, basado en el uso de células 211B en suspensión y polybrene durante las infecciones en el proceso de amplificación viral. Por otra parte, también se realizaron dos estudios de tropismo con diferentes vectores virales: in vitro en linfocitos T CD4+, demostrando que el Ad5/40S es el vector que mejor infecta, e in vivo, estudiando el tropismo celular en intestino y demostrando que ninguno de los vectores virales infecta eficientemente las stem cells de las criptas de Lieberkühn. Debido a que no obtuvimos un perfil Th17 en el modelo de colitis inducida por DSS, en la segunda parte del trabajo nos centramos en la EM. Primeramente, se diseñó el IL23Rs murino, que fue clonado en diferentes vectores virales. Seguidamente, se demostró que células infectadas con estos vectores secretaban IL23Rs al exterior celular y que IL23Rs se unía a IL23 in vitro. Finalmente, los vectores portadores de IL23Rs se probaron en un modelo murino de EM, la Encefalomielitis Autoinmune Experimental. Los resultados expuestos en este trabajo indican que la expresión de IL23Rs tiene un efecto beneficioso en la evolución clínica de la enfermedad, retrasando la aparición de los primeros síntomas y reduciendo la gravedad de los mismos hasta el final del seguimiento clínico. Asimismo, en concordancia con la mejora clínica observada, los ratones tratados no presentan evidencias de desmielinización, además de tener una menor inflamación y una respuesta astroglial y microglial significativamente menor en médula espinal. En resumen, nuestros resultados sugieren que el empleo de una terapia génica inmunomoduladora para EM basada en el uso de vectores virales portadores de IL23Rs podría tener un efecto terapéutico en el desarrollo de la enfermedad. / In the last decades, the incidence of autoimmune diseases has increased significantly, either by the greater knowledge we have of them, by the improvement of diagnostic tools, or by changes in lifestyle. Indeed, the increase of patients affected by these diseases has become a serious social problem since chronic autoimmune disorders like Multiple Sclerosis (MS) or Crohn's Disease (CD) appear early in the lives of patients, affecting seriously their quality of life. Moreover, current treatments for these diseases fail to prevent therapeutic effect at long term and cause serious side effects in many cases; despite they slightly alleviate the symptoms and delay the development of the disease. In addition, the cost of drugs and multidisciplinary care that patients require throughout their life are high economic-health problems. Thus, the development of an effective cure for these diseases has become very important. CD is a severe inflammatory bowel disease affecting colon and ileum, but also other systemic and non-intestinal complications. On the other hand, MS is a demyelinating disease of the central nervous system that causes a progressive loss of mobility and many other systemic symptoms and secondary complications. In both autoimmune diseases the Th17 pathway plays an important role, and therefore the IL23 as well. In fact, the rationale of some experimental treatments for both diseases is based on inhibiting the function of IL23 using antibodies, but unfortunately the reported results are controversial. Thus, in this work we have studied a gene therapy strategy not based on the use of antibodies, but on a viral vector carrying a soluble form of IL23R, which binds the IL23 in order to reduce its action. In the first part of this work we focused on CD and in the generation of an appropriate viral vector for intestinal therapy. The chimeric adenovirus Ad5/40S with marked intestinal tropism is a good candidate vector for this purpose. However, the in vitro production of the Ad5/40S was very inefficient, so an optimized production method was developed. The new method was based on the use of suspension cells 211BS and polybrene during infections in the viral amplification process. Moreover, a tropism study was conducted with CD4+ T lymphocytes, demonstrating that the Ad5/40S is the vector infecting these cells with the highest efficiency. A study of the intestinal cell tropism in vivo of different viral vectors was also performed, showing that none of them infects stem cells in the crypts of Lieberkühn. In the second part of this work we focused on MS. First, we designed the soluble form of murine IL23R (IL23Rs), which was cloned in different viral vectors. Subsequently, it was demonstrated that cells infected with these viruses secreted IL23Rs to the extracellular medium. It was also demonstrated that IL23Rs is able to bind to IL23 in vitro. Finally, vectors carrying IL23Rs were tested in the mouse model of MS, Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. After several approaches, we demonstrated that expression of IL23Rs has a positive effect on the clinical course of the disease, delaying the time of onset and reducing the severity of symptoms until the end of the experiment. In agreement with the clinical improvement observed, treated mice have a reduced inflammatory response, a significantly lower astroglial and microglial activation as well as an absence of demyelinating signs in spinal cord. In summary, our results suggest that the use of an immunomodulatory gene therapy for multiple sclerosis based on the use of viral vectors carrying IL23Rs could have a therapeutic effect in the development of the disease.

Las interacciones proteína-proteína (PPIs, por sus siglas en inglés) son contactos físicos intencionados que se dan entre dos o más proteínas. Estas interacciones forman la red de interacciones de proteínas y forman el núcleo del sistema interatómica de toda célula viva. Fallos en este sistema producidos por PPIs aberrantes están relacionados con fallos en la transducción de señales. Agregación proteica y una pérdida de regulación celular. De hecho, las PPIs anormales forman parte de las bases de enfermedades como el Alzheimer y el cáncer. La importancia del sistema interatómico hace que sea necesario investigar las PPIs, sus funciones y propiedades estructurales, en diferentes modelos. En este trabajo la cristalografía de rayos X es entre otras técnicas la principal para estudiar las PPIs. La investigación de PPIs se ha llevado a cabo a través de dos modelos experimentales diferentes: En el primero, hemos analizado el rol de la fosforilación en un péptido derivado de la Kinsasa mitótica Nek9 en la unión con LC8, una proteína asociada a Nek9; En el segundo modelo, hemos resuelto las estructuras de los tres enzimas que forman la vía de la arginina deiminasa en Mycoplasma penetrans. La proteína Nek9/Nercc1 de la familia de proteínas Kinasa NIMA juega un papel esencial en el control del huso mitótico. DYNLL/LC8 fue descrita con un complemento del complejo de la dyneina, sin embargo, actualmente se le conocen múltiples proteínas asociadas y de ha propuesto que LC8 tiene un rol general como núcleo de dimerización que dirige varias proteínas. Los últimos trabajos indican que la unión de LC9 con Nek9 está regulada por autofosforilación. En este trabajo proponemos un nuevo mecanismo regulatorio defosforilación que interfiere en la unión de LC8 con sus proteínas asociadas. El metabolismo de la arginina para producir ATP es considerado esencial para microorganismos como Mycoplasma penetrans en condiciones anaeróbicas. Además, esta vía ha sido asociada en los mecanismos de patogenicidad y virulencia en ciertos organismos, por ejemplo, protegiendo del estrés acídico en la infección. En este trabajo presentamos las estructuras de la vía de la arginina deiminasa de M.penetrans: arginina deiminasa (ADI), ornitina carbamoyltransferasa (OTC) and carbamato kinasa (CK). Las estructuras de M.penetrans ADI y CK revelan los cambios estructurales que se dan durante el mecanismo de reacción. En el caso de enzima OCT de M.penetrans comparamos su estructura cuaternaria con otros organismos, incluyendo termófilos, revelando la formación de esta estructura cuaternaria común organizada por unas interfaces con una baja homología de secuencia. Los resultados presentados en esta tesis enfatizan la importante contribución de la cristalografía de rayos X para estudiar las propiedades de las PPIs. La regulación de de las PPIs, sus diferencias estructurales y funcionales dependientes de su asociación, modificaciones posttraducionales y la adaptación a ambiental a través de la evolución son algunas de las propiedades y factores de dependencia de las PPIs estudiadas en este trabajo de tesis. / Protein-Protein Interactions (PPIs) are intentional physical contacts established between two or more proteins. These interactions form the large protein interaction network and are the core of the entire interatomic system of any living cell. Flaws in the interaction network by aberrant PPIs involve signal transduction fails, protein aggregation and a completely loss of cell's regulation. Indeed, missense PPIs are the basis of multiple diseases, such as Alzheimer's disease and cancer. The significance of the interatomic system makes worth to studying PPIs, their functions and structural properties, in different models. In the present work X-ray crystallography is the main technique used, in addition to other methods to study Protein-Protein interactions. The study of protein-protein interactions is performed through two different experimental models: In the first model, we analyzed the role of phosphorylation in the interaction of a peptide derived from the mitotic kinase Nek9 with its binding partner LC8; In the second model, we decipher the structures of the three enzymes composing the arginine deiminase pathway in Mycoplasma penetrans. The NIMA family protein kinase Nek9/Nercc1 plays a main role in the control of the mitotic spindle. DYNLL/LC8 was originally described as a component of the dynein complex, but the recent discovery of multiple interaction partners for LC8 has proposed that it has a general role as a dimerization hub that organizes different protein partners. Recent experiments suggested that LC8 binding to Nek9 was regulated by Nek9 autophosphorylation. The present work sheds light into a novel phosphorylation regulatory mechanism that interferes with LC8 protein-protein complex formation. The metabolism of arginine towards ATP synthesis has been considered a major source of energy for microorganisms such as Mycoplasma penetrans in anaerobic conditions. Additionally, this pathway has also been implicated in pathogenic and virulence mechanism of certain microorganisms, i.e. protection from acidic stress during infection. In this work we present the crystal structures of the three enzymes composing the gene cluster of the arginine deiminase pathway from M.penetrans: arginine deiminase (ADI), ornithine carbamoyltransferase (OTC) and carbamate kinase (CK). M.penetrans ADI and CK structures disclose the structural conformation shifts upon the reaction mechanism of these proteins. In the case of M.penetrans OCT its dodecameric quaternary structure is compared with other organisms (including some thermophiles), revealing the formation common quaternary structure arranged interfaces with a low sequence homology. The results collected in this thesis emphasize the important contribution of X-ray crystallography for studding PPIs properties. PPIs regulation, structural and functional differences depending on their association, posttranslational modifications and the environment adaptation thought evolution are some of the PPI properties and dependence factors studied in this thesis work.

L’ictus o accident cerebrovascular és la segona causa de mort en els països industrialitzats i constitueix la primera causa de discapacitat en adults. L’únic tractament aprovat en l’actualitat és el trombolític activador del plasminògen tissular (tPA), el qual només es pot aplicar en un nombre molt reduït de pacients i dintre d’una estreta finestra terapèutica. Els mecanismes de mort cel·lular en la isquèmia cerebral són amplis i venen provocats per l’interrupció del flux sanguini al cervell, el qual provoca una mort ràpida i eminentment necròtica en el nucli de la zona afectada i una mort de caràcter apoptòtic i més lenta al voltant, en la zona de penombra. El gran impacte socio-econòmic de la malaltia i l’existència d’una mort programada dil·latada en el temps han fet que es posin grans esforços en la búsqueda de mecanismes per salvar la zona de penombra. Tenint en compte aquests fets, el present treball s’ha centrat en l’estudi dels mecanismes de mort cel·lular involucrats en la isquèmia cerebral. Per fer-ho, s’ha utilitzat un model de privació d’oxigen i glucosa (OGD) en cultius corticals mixtes d’embrions de rata. Utilitzant aquest model d’isquèmia s’ha observat neuroprotecció pel bloqueig dels receptors NMDA, principal responsable de l’entrada massiva de calci, i l’activació de la caspasa-3, una proteasa encarregada del desmantellament cel·lular durant l’apoptosis. A més, s’ha estudiat el paper dels antagonistes dels receptors de mort en l’OGD. Aquests receptors són responsables de l’activació de la via apoptòtica extrínseca. S’ha observat que l’OGD indueix la degradació dels antagonistes FLIPL i IAP2 i modula l’expressió de FAIML a través de la via de les MAP cinases. Per altre banda, s’ha observat que el silenciament o la sobrexpressió de FAIML mitjançant vectors lentivirals no afecta la viabilitat dels cultius així com tampoc la morfologia nuclear apoptòtica ni els nivells de caspasa-3 activa en les neurones sotmeses a l’insult isquèmic. En conjunt aquests resultats han servit per aprofundir en els mecanismes moleculars implicats en la isquèmia cerebral i poden servir de base per futurs estudis que ajudin al disseny de noves estrategies terapèutiques. / Stroke is the second cause of death in industrialized countries and is the leading cause of disability in adults. The only currently approved treatment is the thrombolytic tissue plasminogen activator (tPA), which can be applied only in a very small number of patients and within a narrow therapeutic window. The mechanisms of cell death in brain ischemia are numerous and are caused by the interruption of the blood flow to the brain, which causes a quick necrotic death in the core of the affected area and a slow apoptotic-like death around, in the ischemic penumbra. The major socio-economic impact of the disease and the existence of a programmed cell death that stretches through time explain the effort that is being done to find new strategies to save the penumbra. Given these facts, the present work has focused on studying the mechanisms of cell death involved in brain ischemia. To do this, we used a model of oxygen and glucose deprivation (OGD) in mixed cortical cultures from rat embryos. Using this model of ischemia we observed neuroprotection by blocking NMDA receptor, the primarily responsible for the massive influx of calcium during ischemia, and activation of caspase-3, a protease responsible for dismantling the cell during apoptosis. In addition, we studied the role of death receptor antagonists in OGD. These receptors are responsible for the activation of the extrinsic apoptotic pathway. It has been observed that OGD induces degradation of the antagonists FLIPL and IAP2 and modulate the expression of FAIML through the MAP kinase pathway. On the other hand, we observed that the overexpression or silencing of FAIML using lentiviral vectors did not affect the viability of the cultures nor the apoptotic nuclear morphology or the levels of active caspase-3 in the neurons subjected to the ischemic insult. Together these results have served to study the molecular mechanisms involved in brain ischemia and may provide the basis for future studies that will help to design new therapeutic strategies.

En l’última dècada, s’ha posat en evidència que el càncer és tant una malaltia genètica com epigenètica. La desregulació epigenètica pot afectar molts processos cel·lulars, com són el silenciament de gens supressors de tumors, l’activació d’oncògens, l’inestabilitat genòmica i/o la desregulació d’expressió de gens impremtats. Aquesta última, és l’expressió monoal·lèlica parental dictada a través de regions de metilació diferencial, heretades de la línia germinal. Aquests gens, en càncer es troben pertorbats, contribuint a la iniciació i progressió del càncer. En neoplàsies hematològiques es desconeix la desregulació d’aquests transcrits. El gen WT1, segons els seu context cel·lular, pot actuar com un suppressor de tumors o com un oncogen, a més a més, presenta unes isoformes d’expressió paterna, el transcrit alternatiu AWT1 i l’antisense WT1-AS. Aquesta expressió al·lèlica es creu que és regulada per una regió diferencialment metilada (DMR), coneguda com la regió reguladora de WT1 antisense. Curiosament, l'expressió de WT1 està desregulada en neoplàsies hematològiques, i s'utilitza rutinàriament com un marcador residual de la malaltia en leucèmies mieloides agudes. S’ha caracteritzat l’epigenètica de les regions promotores de WT1 i AWT1, per identificar el mecanisme que condueix a l'expressió aberrant, i si la pèrdua d'empremta n’és la causa. Utilitzant diverses tècniques moleculars no es va ser capaç d'identificar la metilació al·lèlica dins de l'interval del promotor de WT1, però tot i això s’observa un augment temporal en la metilació, coherent amb resultats publicats prèviament. Malgrat no trobar aquesta regió impremtada, s’observa que aquesta regió s’hipermetila amb freqüència en leucèmies i limfomes, i que la hipermetilació del promotor AWT1 es produeix en el 100% de línies cel·lulars d’AML, malgrat els alts nivells d’expressió. A més a més, la hipermetilació s'associa amb un canvi concomitant en les modificacions d'histones, d’un estat permissiu a un estat d’heterocromatina. En l’anàlisi de metilació de DNA en mes de 169 mostres de leucèmia primària, es va observar una hipermetilació en un 89% de les mostres de AML, independentment de mutacions i/o translocacions/fusions, a més a més de ser un marcador molecular prometedor per a la AML, amb un valor predictiu positiu de 100% i valor predictiu negatiu de 87,6%. Malgrat aquest perfil epigenètic extens, tant a nivell de promotor com a nivell de miRNA, l'única correlació que s’observa amb l’expressió de WT1/AWT1 en AML és la co-expressió del factor de transcripció, GATA-2, que s'uneix a un enhancer situat al 3'UTR de WT1. Aquesta observació, porta a la hipòtesi que GATA-2 indueix l’expressió de WT1/AWT1, i aquest inicia un mecanisme autoregulador en què interactua WT1 i recluta les metiltransferases d'DNA als llocs d’unió de WT1/EGR-1 al promotor d’AWT1 hipermetilant-lo. / Intense research over the past decade has revealed that cancer is much an epigenetic as a genetic disease. The epigenetic deregulation can disrupt many cellular processes resulting in silencing of tumor suppressor genes, activation of oncogenes, genome instability and inappropriate imprinted gene expression. The latter process is the parental of origin monoallelic expression that is dictated by regions of differential methylation inherited from the germline, that when disrupted contributes to the initiation and progression of cancer. In hematological malignancies very little is known about the deregulation of imprinted transcripts. The WT1 gene has various transcripts that act as a tumor suppressor and an oncogene depending on the cellular context, and for which paternal expression of the alternative AWT1 and antisense isoforms has been reported. This allelic expression is postulated to be regulated by a tissue-specific differential methylation region (DMR), known as the WT1-antisense regulatory region. Interestingly, WT1 expression is aberrantly up regulated in hematological malignancies and is routinely used as a molecular marker for minimal residue of disease in acute myeloid leukemia. Herein, we have fully characterized the epigenetic landscape encompassing the WT1 and AWT1 promoter regions in an attempt to identify the mechanism leading to aberrant expression, and whether loss-of-imprinting is routinely observed. Using various molecular techniques we fail to identify allelic methylation within the WT1 promoter interval, but we observe a temporal increase in methylation that is consistent with previous reports. Despite conclusive evidences for lack of imprinting, we found that the region frequently becomes hypermethylated in leukemias and lymphomas, and that hypermethylation of the AWT1 promoter occurs in 100 % of AML cell lines despite the high expression levels. Further characterization of myeloid derived leukemia cell lines revealed that this cancer-associated hypermethylation is associated with a concomitant switch in histone modifications, from a permissive to a heterochromatic state. DNA methylation analysis in more than 169 primary leukemia samples revealed that this hypermethylated signature occurs in 89% of AML samples, independent of underlying mutations or translocation/fusion proteins, and is a promising molecular marker for AML, having a positive predictive value of 100% and a negative predictive value of 87.6%. Despite this extensive epigenetic profiling, both at the promoter and at the miRNA level, the only correlation we observe with WT1/AWT1 expression in AML is the co-expression of the transcription factor, GATA-2, which binds to the enhancer located in the 3’UTR of WT1. This observation, lead us to hypothesize that GATA-2 induced expression of WT1 initiating an auto-regulative mechanism in which WT1 interacts and recruits the DNA methyltransferases to degenerative WT1/EGR-1 binding sites within the AWT1 promoter, leading to its hypermethylation.

Tesi realitzada a l'Institut Català d'Oncologia (ICO - IDIBELL) / A la primera part d’aquesta tesi es van analitzar les bases genètiques i moleculars responsables d’un fenotip lleu observat en una pacient NF1. La pacient és portadora d’una mutació puntual de novo en el gen NF1 (c.3198-314G>A). Aquesta mutació es troba a l’intró 19a i provoca la creació d’un nou lloc acceptor d’splicing. Aquest utilitza dos llocs donadors críptics diferents preexistents a l’intró 19a (inactius quan no es troba la mutació) per generar dos transcrits aberrants diferents, cadascú dels quals presenten la inclusió d’un exó críptic diferent. Ambdós trànscrits aberrants codifiquen per a una proteïna truncada. La quantificació de les cèl•lules portadores de la mutació en diferents mostres derivades de les tres capes embrionàries van evidenciar que es tractava d’un cas de mosaicïsme generalitzat. A més a més, l’anàlisi de la inacitvació del cromosoma X en els mateixos teixits derivats de les tres capes embrionàries van suggerir un avantatge proliferatiu de les cèl•lules portadores de la mutació en el gen NF1. D’altra banda, l’anàlisi dels nivells de transcrits aberrant en teixits frescos i cultius curts de limfòcits i fibroblasts, així com la construcció d’un minigen amb la mutació del pacient (c.3198-314G>A), van confirmar una baixa expressió dels transcrits amb inclusió d’exó críptic, a causa de la generació de trànscrits normals per part de l’al•lel portador de la mutació. En conjunt es va concloure que la clínica lleu del pacient podia ser explicada per una combinació de mosaïcisme genètic i per la producció de trànscrits normals per part de l'al•lel mutat. Finalment, es va desenvolupar una teràpia personalitzada per a corregir aquesta mutació, i es va demostrar la correcció de l’splicing aberrant gràcies a la utilització de oligòmers mofolino antisentit específics contra els llocs críptics d’splicing (el generat per la mutació i els dos activats per la presència de la mutació). A la segona part de la tesis es van generar 5 models de ratolins xenògrafts ortotòpics derivats de 2 pacients NF1 (n=2), 2 casos esporàdics (n=2) i d’una línia cel•lular establerta a partir d'un tumor d'un pacient NF1 (línia S462). Els models ortotòpics generats van estar caracteritzats a diferents nivells, demostrant que recapitulaven les propietats histopatològiques i preservaven l’estat genòmic i transcriptòmic dels seus respectius tumors primaris. A més a més, es va veure, que els models de ratolí generats mimetizaven les capacitats metastàsiques observades en humans. D’altra banda, també es va demostrar, que l’estroma humà es reemplaçava ràpidament per estroma de ratolí després de la implantació dels tumors, la qual cosa va demostrar ésser molt útil per a la caracterització genòmica dels tumors. Els resultats obtinguts en la caracterització genòmica mitjançant l’SNP array, van mostrar com els MPNST contenien uns genomes molt alterats, que majoritàriament es mantenien estables un cop implantats al llarg dels diferents passatges en el model. L’anàlisi d’expressió va agrupar cada un dels tumors primaris amb els seus respectius ortoxenògrafts i també va diferenciar de forma molt clara els tumors esporàdics dels associats a la NF1. Els resultats obtinguts de la seqüenciació de l’exoma, van mostrar per un costat, que el nombre de mutacions adquirides en els tumors un cop implantats en el ratolí, era molt baixa en tots els models. D'altra banda els resultats van evidenciar que la freqüència de mutacions en els MPNST esporàdics era un ordre de magnitud més elevada que en els derivats de pacients NF1, amb una representació més alta de substitucions de bases C>T en els esporàdics. Finalment, els 5 models ortoxenògrafts validats, van ser utilitzats per provar l’eficàcia de diferents fàrmacs de manera sola i combinada. Aquests fàrmacs van ser el sorafenib (inhibidor de BRAF), la rapamicina (inhibidor de mTOR) i la doxorubicina (agent quimioterapèutic convencional). Els resultats més prometedors van mostrar que el tractament amb sorafenib s’associa a una major reducció del creixement tumoral, tant quan s’administra sol com en combinació amb els altres dos fàrmacs. Així mateix, l'administració intraperitoneal de la rapamicina va causar una reducció tumoral significativa en tots els models. D’altra banda també es va realitzar el tractament de dos models xenògrafs ortotòpics derivats de tumors MPNST primaris humans (un esporàdic i un de pacient afectat amb NF1) amb MLN8237 (inhibidor de aurora cinasa A).Els resultats per aquest fàrmac, van mostrar una estabilització del creixement tumoral, causant la parada del cicle cel•lular i una endoreduplicació de les cèl•lules tumorals. / In the present tesis we analyze the genetic and molecular basis responsible for a very benign phenotype observed in a NF1 patient. Quantification of cells carrying the NF1 mutation in different samples derived from the three embryonic layers revealed a generalized mosaicism that appeared to be more complex after obtaining evidence of proliferation advantages of mutated cells. Furthermore, the construction of a minigene reporter carrying the patient’s identified deep intronic mutation (g.3198-314G>A) confirmed the benign nature of this mutation due to the leakiness of the splicing mechanism that generated a proportion of correctly spliced transcripts. On the light of these data we concluded that the mild phenotype observed in this patient is the result of the presence of a complex mosaicism together with the benign nature of a leaky NF1-splice mutation. Finally, with the aim of developing a personalized therapeutic approach for this patient, we demonstrated correction of the splicing defect by using specific antisense morpholino oligomers. Our results provide an example of the molecular complexity behind disease phenotypes and highlight the importance of using comprehensive genetic approaches to better assess phenotype-genotype correlations. In the other hand we present the generation of five patient-derived MPNST orthoxenograft models for pre-clinical testing. MPNST orthoxenografts recapitulate the histopathological properties and preserve the genomic and transcriptomic status of their parental primary tumors, mimicking distal dissemination properties. MPNSTs contained highly altered genomes that remained remarkably stable in orthoxenografts and along passages. Although preliminary, the results presented here point to clear differences between NF1-associated and sporadic MPNSTs. In accordance, mutation frequency in sporadic MPNSTs was an order of magnitude higher than in NF1-associated MPNSTs and unsupervised cluster analysis and principal component analysis using a MPNST signature perfectly divided the samples between NF1 and sporadic MPNST. Finally, sorafenib in combination with doxorubicin or rapamycin, was found to be the most effective treatment for reducing MPNST growth. The development of these models laid the foundations for evaluating novel therapeutic strategies in the clinical setting.

Los esteroles vegetales son los análogos del colesterol en los vegetales. Comparten su misma estructura y se diferencian únicamente por sus cadenas laterales. Los estanoles vegetales proceden de la saturación del doble enlace en el anillo. Desde los años 90, tanto los esteroles como los estanoles vegetales están aprobados como alimentos funcionales para disminuir las concentraciones de colesterol total y de LDL. Aunque su mecanismo de acción no es aún del todo conocido, se estima que 2g/día de esteroles vegetales disminuyen el colesterol de LDL en aproximadamente un 10%. Sin embargo, se están desarrollando nuevas formas y combinaciones para aumentar esta eficacia. El primer trabajo de la presente tesis estudia el comportamiento y acción de una de ellas, el llamado FM-VP4. FM-VP4 es un compuesto sintético derivado del sitostanol y campestanol que ha mostrado una acción hipocolesterolemiante mayor que la de sus componentes aislados. Sin embargo, su mecanismo de acción es todavía desconocido. En este trabajo se estudió la capacidad de FM-VP4 para alterar la homeostasis del colesterol en ratones, fundamentalmente a nivel hepático e intestinal. Como conclusiones, se pudo establecer que FM-VP4 redujo con gran eficacia la absorción intestinal de colesterol, así como sus concentraciones plasmáticas y hepáticas. Además, alteró la homeostrasis de los ácidos biliares aumentando su reabsorción intestinal y cambió la expresión hepática de genes que juegan un papel principal en la homeostasis del colesterol. Se trata del primer esterol/estanol vegetal que altera el metabolismo de los ácidos biliares y que es capaz de disminuir las concentraciones plasmáticas de colesterol en ratones normocolesterolémicos. Por otro lado, existe cierta controversia sobre la seguridad de los esteroles vegetales. Los pacientes aquejados de una rara enfermedad autosómica recesiva, llamada sitosterolemia, acumulan grandes cantidades de esteroles vegetales en plasma y tejidos, y desarrollan una aterosclerosis masiva y precoz a pesar de que sus concentraciones de colesterol son normales. Entre los efectos de los esteroles vegetales está el activar al receptor nuclear LXR, capaz de producir un aumento en las concentraciones de triglicéridos. Este hecho podría contribuir al desarrollo de aterosclerosis por parte de los enfermos sitosterolémicos. En el segundo trabajo de esta tesis estudiamos el metabolismo de los triglicéridos en ratones deficientes en los transportadores ABCG5/G8, modelo de sitosterolemia. Como conclusiones, se pudo comprobar que la deficiencia de ABCG5/G8 aumenta efectivamente y de forma notoria las concentraciones plasmáticas de triglicéridos a través de múltiples vías. Aparte de observarse cierto grado de resistencia a la insulina, la acumulación masiva de esteroles vegetales aumentó la secreción hepática e intestinal de triglicéridos y redujo su catabolismo periférico. Además, muchos de estos efectos se aprecian también en ratones heterocigotos para la enfermedad, en los que la acumulación de esteroles vegetales es sensiblemente inferior. / Plant sterols are cholesterol analogs in plants. They share its same structure, only differing in their side chains. Plant stanols derive from the saturation of the double bond in the ring. Since the 90s, both sterols and plant stanols are approved as functional foods to lower total and LDL cholesterol. Although their mechanism of action is not yet fully known, it is estimated that 2g/day of plant sterols lower LDL cholesterol levels by approximately 10%. However, new forms and combinations are being developed in order to increase this effectiveness. The first work of this thesis studies the behavior and action of one of them, the so-called FM-VP4. FM-VP4 is a synthetic derivative of sitostanol and campestanol which showed greater hypocholesterolemic action than their isolated components. However, its mechanism of action is still unknown. In this work, the ability of FM-VP4 to alter cholesterol homeostasis in mice was studied. In conclusion, it was found that FM-VP4 effectively reduced the intestinal cholesterol absorption as well as plasma and liver cholesterol. FM-VP4 also affected bile acid homeostasis by inducing bile acid intestinal reabsorption and changed the liver expression of genes that play an essential role in cholesterol homeostasis. This is the first phytosterol or stanol that affects bile acid metabolism and lowers plasma cholesterol in normocholesterolaemic mice. On the other hand, the safety of plant sterols is still controversial. Patients suffering from a rare autosomal recessively inherited disease, called sitosterolemia, accumulate large amounts of plant sterols in plasma and tissues, and develop a massive and early atherosclerosis despite their cholesterol levels are usually normal. It has been proven that certain plant sterols can activate LXR, a nuclear receptor that regulates fatty acid metabolism and leads to increased plasma triglyceride levels. This action could contribute to the development of atherosclerosis by sitosterolemic patients. In the second paper of this thesis we studied the triglyceride metabolism in ABCG5/G8 deficient mice, an animal model of sitosterolemia. In conclusion, it was found that ABCG5/G8 deficiency markedly raises plasma triglyceride levels through multiple pathways. The massive accumulation of plant sterols increased liver and intestinal triglyceride secretion and decreased triglyceride peripheral catabolism. Moreover, it caused a degree of insulin resistance. Moreover, many of these effects are also seen in heterozygous mice, in which plant sterol accumulation is significantly lower.