L’única subunitat catalítica de PP1 en S. cereivisiae, Glc7, interacciona amb un mínim de 31 subunitats reguladores que li permeten regular tot el ventall de funcions. En aquesta tesis, hem estudiat les soques delecionades per cadascuna de les 21 subunitats reguladores no essencials de Glc7 realitzant-ne tant l’anàlisi fenotípic com transcripcional. Aquest estudi a gran escala ens ha permès determinar nous fenotips i perfils transcripcionals desconeguts, a més, ens ha permès focalitzar en dues subunitats reguladores: Ref2 i Reg1. En aquesta tesi, demostrem que Ref2, una subunitat reguladora necessària pel processament i maduració dels mRNA i/o dels snoRNAs, és necessària pel correcte funcionament de la homeòstasis iònica. Les cèl·lules delecionades per REF2 presenten un fenotip de sensibilitat a cations que és depenent de la unió de Glc7 implicant una nova funció del complex Glc7-Ref2. Ref2 forma part del complex holo-CPF (Cleavage Poly(A)denylation Factor), on la majoria de components són essencials per la supervivència cel·lular. Per aquesta raó, es van estudiar cèl·lules que contenien al·lels termo-sensibles dels components del holo-CPF a temperatures semi-restrictives ens ha permès determinar que aquest complex no està involucrat en la l’homeòstasi iònica. Malgrat aquesta funció separada entre el complex holo-CPF i Ref2, mutants en ambdós presenta sensibilitat a agents d’estrès en la integritat de la paret cel·lular. Tant la deleció de REF2 com els mutants en els components de la via de la integritat de la paret cel·lular presenten una sensibilitat additiva implicant una sinèrgia en l’adaptació a agents estressors de la paret cel·lular. Les cèl·lules ref2 presenten una aneuploïdia, implicant una duplicació en diversos cromosomes, amb una duplicació en el cromosoma XII comuna en el fons genètic BY4741. Aquesta aneuploïdia és deguda a la no unió de Glc7 en el holo-CPF. Diploides homozigots delecionats pel gen REF2 no són capaços d’esporular, possiblement per una mala segregació dels cromosomes en la meiosi, perquè aquestes cèl·lules no són defectives en els primers passos de la meiosi. L’altre fenotip estudiat en el mutant ref2 és la resposta a proteïnes mal plegades (UPR). Les cèl·lules ref2 són tolerants a tunicamicina possiblement degut a l’aneuploïdia. L’estudi evolutiu d’una soca salvatge al llarg de 120 generacions amb la presència continua de tunicamicina va demostrar que com a primer pas adaptatiu implica la duplicació del cromosoma II i; la resposta a llarg termini implica la pèrdua de la duplicació en el cromosoma II i la inducció específica de certs gens, entre ells les bombes de resistència a drogues pleiotròpiques. Reg1, la subunitat reguladora de Glc7 implicada en la regulació negativa dels gens repressor de glucosa defosforilant Snf1, presenta un fenotip de sensibilitat a agents que provoquen l’acumulació de proteïnes mal plegades, com la tunicamicina. Aquest fenotip coincideix amb l’al·lel glc7-109, que no permet la unió de les subunitats reguladores a Glc7, relacionant l’UPR i la regulació de la cinasa Ire1. Els nostres resultats indiquen que tant la hiperactivació de Snf1 com la sobreexpressió de proteïnes SNf1 constitutivament hiperactivades en el mutant reg1 inclús incrementen la seva sensibilitat a tunicamicina. Finalment, l’anàlisi dels mutants en els components de la via Snf1 ens ha permès determinar que la falta de RIM101 provoca una sensibilitat a tunicamicina, possiblement a la impossibilitat d’expressió de PMR1, una bomba d’alta afinitat necessària pel transport de Ca2+/Mn2+ al Golgi essencial per la UPR. En resum, els nostres resultats ens han permès descriure noves funcions per Ref2, incloent l’homeòstasi iònica i la regulació de la integritat de la paret cel·lular. Per l’altre costat, hem destapat una nova funció de Reg1 en la regulació a proteïnes mal plegades. / The only catalytic subunit of PP1 in S. cereivisiae, Glc7, interacts with at least 31 regulatory subunits that regulate the myriad of Glc7 functions. Among those subunits we performed in this thesis both transcriptional and phenotypic analysis of 21 yeast strains lacking one of the non-essential regulatory subunit of Glc7. With these high-throughput technologies we have determined theirs transcriptional profiles and new phenotypes which allowed us to focus on two regulatory subunits: Ref2 and Reg1. We demonstrate in this thesis that Ref2, a regulatory subunit necessary for the processing and maturation of mRNA and/or snoRNAs is also required for the proper functioning of ionic homeostasis under conditions of cation stress. Cells lacking REF2 display hypersensitivity to cation stress which is dependent on the binding to Glc7 involving a new function of the complex Glc7-Ref2. Ref2 is integrated in the holo-CPF (Cleavage Poly(A)denylation factor), where most components are essential for cell survival. For this reason, the study of cells carrying thermo-sensitive alleles of the holo-CPF components in semi-restrictive temperatures allowed us to conclude that this complex is not involved in ionic homeostasis. Despite this unrelated function between holo-CPF and Ref2, the holo-CPF mutants display sensitivity to cell wall stressors agents, as ref2 cells do. Deletions of REF2 and mutants in components of the cell wall integrity pathway have synergistic effects under cell wall stressors. Cells lacking REF2 display an aneuploidy, implying duplication of chromosomes, being the chromosome XII duplicated in all analysed cases of the BY4741 genetic background. This aneuploidy is due to the inability of Glc7 to bind to the holo-CPF. Furthermore, homozygous diploids lacking the REF2 genes are unable to sporulate, possibly due to a chromosome missegregation in meiosis, since cells are not defective in the early events of meiosis. Another phenotype studied in ref2 cells was the unfolded protein response (UPR). ref2 cells are hypertolerant to tunicamycin, possible due to its aneuploidy. The evolutionary study of a wild-type strain grown in tunicamycin for 120 generations showed, as an early adaptive step, duplication of chromosome II. Long-term adaptive step involves the loss of the chromosome duplication and the specific induction of certain genes, including those involved in the pleiotropic drug resistance phenomenon. Reg1, the Glc7 subunit involved in the negative regulation of glucose-repressible genes by dephosphorylating Snf1 kinase, displays hypersensitivity to agents that trigger the accumulation of unfolded proteins, such as tunicamycin. This phenotype is shared by the glc7-109, which prevents the binding of the regulatory subunits to Glc7, linking the UPR to a possible regulation of the Ire1 kinase. Our results indicate that hyperactivation of Snf1 or overexpression of constitutively activated Snf1 in reg1 mutant cells even increases the sensitivity to tunicamycin. Finally, the analysis of mutants of the components of the Snf1 pathway allowed us to conclude that the lack of RIM101 causes sensitivity to tunicamycin, possibly due to the impossibility of expressing PMR1, a high affinity Ca2+/Mn2+ P-type ATPase required for Ca2+ and Mn2+ transport into Golgi and essential for UPR. In summary, results of this thesis allow us to describe new functions for Ref2, including the ionic homeostasis and regulation of the cell wall integrity. On the other hand, we have uncovered that Reg1 is required for the correct response to unfolded proteins.

La trombocitopènia fetal/neonatal al·loimmune (TFNA) és la causa més comú de trombocitopènia greu en el nounat. Aquest quadre clínic es produeix per l’acció d’un al·loanticòs matern de tipus IgG que reacciona contra un antigen plaquetar específic (HPA), heretat del pare, que està present en les plaquetes fetals provocant la destrucció d’aquestes. En la població caucàsica, l’al·loimmunització enfront l’antigen HPA-1a és la causa del 85% dels casos de TFNA diagnosticats. Tot i que es tracta d’un quadre relativament poc freqüent (1 afecte de cada 1000-2000 naixements), la TFNA presenta complicacions greus en un percentatge significatiu de casos, sent la complicació més greu l’hemorràgia intracranial. Les gestants de risc s’identifiquen majoritàriament quan ja han tingut complicacions en l’embaràs i/o un fill afecte anterior, ja que de rutina no es realitza un control antenatal per detectar anticossos antiplaquetars ni per tipificar els sistemes antigènics de plaquetes en les gestants. En el cas de dones HPA-1a negatiu sensibilitzades per aquest antigen, el coneixement del genotip HPA-1 fetal en gestacions subsegüents és molt important per determinar si el fetus es troba en risc de TFNA i per fer un bon maneig adequat d’aquestes gestacions. En aquest treball s’ha posat a punt una estratègia per la determinació del genotip HPA-1 fetal en gestants HPA-1a negatiu mitjançant una aproximació no invasiva, que permetria evitar l’ús de les actuals tècniques invasives disponibles pel genotipatge HPA-1a fetal i els riscos associats que comporten, tant pel fetus com pel possible increment de la sensibilització materna. Aquesta estratègia consisteix en la detecció d’un únic SNP responsable del polimorfisme HPA-1a/1b a partir de l’ADN fetal circulant en plasma matern, tenint en compte les dificultats tècniques que això suposa per la baixa proporció d’ADN fetal present en plasma matern. Per complementar aquesta estratègia i evidenciar la presència d’ADN fetal s’ha utilitzat l’amplificació d’una seqüència corresponent al promotor d’un gen supressor de tumors (RASSF1A) que conté diferències epigenètiques entre l’ADN matern i l’ADN fetal proporcionant així un possible marcador d’ADN fetal universal. Atesos als avenços tecnològics dels darrers anys que permeten detectar mutacions, fins i tot puntuals, a partir d’una sola cèl·lula i la consegüent aplicació d’aquestes tècniques en el context del diagnòstic preimplantacional de malalties monogèniques s’ha abordat també en aquest treball el disseny d’un protocol de DGP aplicat a la prevenció de la TFNA. El desenvolupament d’aquest protocol i la seva validació permet oferir una alternativa més a les parelles amb antecedents de TFNA greu i un alt risc de recurrència d’aquest quadre clínic, tot i que només en els casos en que el pare sigui heterozigot HPA-1a1b. En aquest context, s’ha posat a punt un protocol pel genotipatge HPA-1 a partir d’un únic blastòmer biopsiat d’embrions obtinguts per fecundació in vitro amb la finalitat de detectar i transferir només aquells que siguin HPA-1a negatiu, evitant així la incompatibilitat fetomaterna per l’antigen HPA-1a. / Fetal / neonatal alloimmune thrombocytopenia (FNAIT) is the most common cause of severe thrombocytopenia in the newborn. This clinical picture is produced by the action of a maternal IgG alloantibody, which is directed against specific platelet antigen (HPA), inherited from the father, and present in the fetal platelets causing its destruction. In the Caucasian population, the alloimmunization against the HPA-1a antigen is the cause of the 85% diagnosed FNAIT cases. Although FNAIT is relatively rare (one every 1000-2000 births), it presents serious complications in significant percentage of cases, being the most serious complication the intracranial haemorrhage. Pregnant women at risk are mainly identified when they have had already pregnancy complications and/or a previous thrombocytopenic child, as there is neither routine antenatal monitoring to detect antiplatelet antibodies nor platelet antigen systems typing in pregnant women. In the cases of HPA -1a negative women sensitized to this antigen, the knowledge of fetal HPA-1 genotype in subsequent pregnancies is very important to determine whether the fetus is at risk and have a proper management of these pregnancies. In this work we set up a strategy for the platelet HPA-1a fetal typing in HPA-1a negative pregnant women using a non-invasive approach, which avoids the use of existing invasive techniques available for fetal HPA-1a genotyping and the associated risks involving both the fetus and the possible increase in maternal sensitization. This strategy is based on the detection of a single SNP responsible of the HPA-1a/1b polymorphism from circulating fetal DNA in maternal plasma, taking into account the technical difficulties this poses to the low proportion of fetal DNA present in maternal plasma. To complement this strategy and demonstrate the presence of fetal DNA, it has been used an amplification of a sequence corresponding to the promoter of a tumor suppressor gene ( RASSF1A ) containing epigenetic differences between maternal and fetal DNA providing, thus, a possible universal fetal DNA marker. Given the technological advances of recent years that allow detecting mutations from a single cell and the subsequent application of these techniques in the context of preimplantation genetic diagnosis of monogenic diseases, it has also been addressed in this work the design of a protocol for PGD applied to the prevention of FNAIT. The development of this protocol and its validation can offer an alternative to couples with history of severe FNAIT and a high risk of recurrence of the clinical picture, but only in cases where the father is heterozygous HPA-1a1b. In this context, we set up a HPA-1 genotyping protocol from a single blastomere biopsy of embryos obtained by in vitro fertilization with the aim to detect and transfer only those which are HPA-1a negative, avoiding thus the fetomaternal incompatibility for the HPA -1a antigen.

Les Brain Specific Kinase 1 i 2 (BRSK1 i 2), també conegudes com a SAD quinases, són proteïnes Ser/Thr quinases de la família de les AMPK-related kinases. Les BRSKs són activades per fosforilació directa de la quinasa màster LKB1 en un residu conservat del loop d’activació o T-loop (Thr189 per BRSK1 i Thr174 per BRSK2). Les BRSKs presenten un domini quinasa a l’extrem N-terminal seguit d’un domini d’unió a ubiquitines (UBA) i una cua a l’extrem Cterminal sense dominis funcionals identificables. Aquestes quinases s’expressen majoritàriament al sistema nerviós, on regulen la polarització neuronal, la sinaptogènesis i l’alliberament de neurotransmissors. Malgrat això, els mecanismes implicats en la regulació d’aquestes quinases no han estat descrits. En aquest treball, mitjançant fraccionament subcel·lular i tinció immunocitoquímica, demostrem en diferents tipus cel·lulars que una fracció de BRSK1 localitza en membranes i que és resistent a l’extracció pel detergent Triton X-100. A més, utilitzant sinaptosomes de cervell de rata, demostrem la presència de BRSK1, però no de BRSK2, en microdominis de membrana lipid raft. Amb l’objectiu de determinar el mecanisme d’associació a la membrana, s’ha observat en extractes de cervell de rata que BRSK1, a diferència de BRSK2, està palmitoilada. La palmitoilació és una modificació post-traduccional en la que un residu de cisteïna es modifica covalentment per palmitat. Malgrat que s’han generat diferents els mutants individuals i combinacions de tots els residus de cisteïna, no s’ha identificat el/s residu/s modificats per palmitoilació. Estudis previs d’activitat quinasa realitzats al laboratori mostren que la incubació de BRSK1 amb vesícules generades amb els lípids dels lipid rafts resulta en un augment de l’activitat quinasa, el que suggereix que BRSK1 podria interaccionar amb algun dels lípids presents a lipid rafts. Mitjançant assajos de lipid-protein overlay assay i d’unió a liposomes, hem observat que BRSK1 uneix específicament la sulfogalactosilceramida sulfàtid. A més, liposomes que contenen sulfàtid activen a la BRSK1 in vitro, el que representa un nou mecanisme d’activació de BRSK1, possiblement al·lostèric. La generació de mutants de deleció de BRSK1 que codifiquen per diferents dominis i regions, ha permès la identificació de la regió de la cua C-terminal anomenada short conserved region 2 (SCR2, responsable de la localització puntuada de BRSK1 en neurones), com la principal regió d’unió al sulfàtid. D’altra banda, hem observat que BRSK1 està ubiquitinada in vivo en assajos en cèl·lules tractades amb l’inhibidor del proteosoma MG-132. Després de considerar diferents E3 ubiquitina lligases implicades en la polarització neuronal (Trim2 i Smurf1/2), hem determinat en cèl·lules en cultiu que Smurf1 interacciona amb BRSK1 i la ubiquitina. Aquesta observació ha estat corroborada mitjançant estudis d’ubiquitinació in vitro amb les proteïnes purificades, on també s’ha comprovat que la poliubiquitinació de BRSK1 per Smurf1 no genera ramificacions d’ubiquitina a través de les Lys 48 i 63. D’altra banda, la ubiquitinació de BRSK1 per Smurf1 és de tipus degradatiu, ja que la sobreexpressió de la lligasa salvatge, però no la inactiva, resulta en una disminució dels nivells de la BRSK1 cel·lular. Smurf1 indueix la degradació específica de proteïnes implicades el establiment de la polaritat neuronal. En neurones no diferenciades Smurf1 ubiquitina i promou la degradació de proteïnes pro-polaritzants, com Par6. En resposta a augments de AMPc, la proteïna kinasa A (PKA) fosforila Smurf1 a la Thr306, promovent la degradació de proteïnes que inhibeixen el creixement axonal a la neurita que esdevindrà axó. En aquest treball demostrem que la forma no fosforilada d’Smurf1 ubiquitina BRSK1 i en promou la seva degradació, mentre que la fosforilació d’Smurf1 per PKA impedeix aquesta degradació. Ja que hem descrit un augment en els nivells de BRSK1 als primers estadis de la diferenciació neuronal, els nostres resultats suggereixen un mecanisme de regulació de la expressió BRSK1 controlat per Smurf1 durant l’establiment de l’eix axó-dendrita, com el descrit per Par6. / Brain Specific Kinases 1 and 2 (BRSK1 and 2, also known as SAD kinases) are members of the family of AMPK-related Ser/Thr protein kinases. BRSKs are activated by the master kinase LKB1, thorough the phosphorylation of a threonine residue (T189 for BRSK1, T174 for BRSK2) within the activation loop of the kinase domain. BRSKs have a kinase domain located at the N-terminal, followed by an ubiquitin-binding domain (UBA) and a C-terminal tail with no identifiable functional domains. The BRSKs are mainly expressed at the nervous system, where regulate neuronal polarization, synaptogenesis and neurotransmitter release. However, the mechanisms remain to be described. Here, using subcellular fractionation and immunocytochemical staining of different cultured cells, we show a pool of cellular BRSK1 that localizes at the membrane, which is resistant to Triton X-100 solubilization. We also show that BRSK1, but not BRSK2, a) associates to lipid rafts microdomains; and b) is palmitoylated. Palmitoylation is the post-translational modification in which the palmitic acid is covalently attached to a cysteine residue. In spite of generating different BRSK1 mutants in which single or several cysteines were mutated, we have not been able to identify primary Cys residue/s palmitoylated. Previous studies carried out in our laboratory showed that liposomes generated with lipids extracted from raft fractions enhance BRSK1 kinase activity, suggesting that BRSK1 could interact with any of the lipids present in lipid rafts. Using lipid-protein overlay and liposomebinding assays, we show that BRSK specifically interacts with the galactosylceramide sulfatide. Furthermore, sulfatide-containing liposomes specifically enhance BRSK1 activity in vitro, underpinning that interaction with sulfatide represents a new, allosteric mechanism of BRSK1 activity modulation, additional to T-loop phosphorylation. Generation of BRSK1 deletion mutants of different regions and domains allowed the identification of the short conserved region 2 (SCR2, located at the C-tem tail and responsible for the punctuate pattern of neuronal BRSK1) as the main region involved in the binding of sulfatide to BRSK1. We found that BRSK1 is ubiquitylated in cells treated with the proteasome inhibitor MG-132. After studying the E3 ubiquitin ligases which regulate neuronal polarization (Trim2 and Smurf1/2), we show in cultured cells that Smurf1 interacts with and ubiquitylates BRSK1. This observation was confirmed by in vitro ubiquitylation assays, using purified proteins, and allowed to determine that Smurf1-mediated ubiquitylation of BRSK1 does not results in Lys-48 or Lys-63 polyubiquitin branches. On the other hand, Smurf1-mediated BRSK1 ubiquitylation leads to BRSK1 degradation, since over-expression of wild type Smurf, but not of the inactive protein, results in a drastic reduction of cellular BRSK1 expression levels. Smurf1 induces specific degradation of proteins which control neuronal polarization. In undifferentiated neurons, Smurf1 ubiquitylates and promotes degradation of pro-polarization proteins, such Par6. In response to an increase on cAMP, protein kinase A (PKA) phosphorylates Smurf1 at Thr306, inducing the degradation of the proteins that inhibit axonal growth in the neurite that will become an axon. Here we show that a non-phosphorylatable form of Smurf1 ubiquitylates and promotes BRSK1 degradation, while PKA-mediated Smurf1 phosphorylation prevents BRSK1 degradation. Since we have shown increasing BRSK1 expression levels during the early stages of neuronal differentiation, our results suggest that Smurf1 might control BRSK1 expression during neuronal polarization, as it does for Par6.

This thesis is focused on the study of molecular interactions at the atomistic detail and is divided into one introductory chapter and four chapters referencing different problems and methodological approaches. All of them are focused on the development and improvement of computational Monte Carlo algorithms to study, in an efficient manner, the behavior of these systems at a classical molecular mechanics level. The four biophysical problems studied in this thesis are: induced fit docking between protein-ligand and between DNA-ligand to understand the binding mechanism, protein stretching response, and generation/ scoring of protein-protein docking poses. The thesis is organized as follows: First chapter corresponds to the state of the art in computational methods to study biophysical interactions, which is the starting point of this thesis. Our in-house PELE algorithm and the main standard methods such as molecular dynamics will be explained in detail. Chapter two is focused on the main PELE modifications to add new features, such as the addition of a new force field, implicit solvent and an anisotropic network specific for DNA simulation studies. We study, compare and validate the conformations generated by six representative DNA fragments with the new PELE features using molecular dynamics as a reference. Chapter three is devoted to applying the new methods implemented and tested in PELE to study protein-ligand interactions and DNA-ligand interactions using four systems. First, we study the porphyrin binding to Gun4 protein combining PELE and molecular dynamics simulations. Besides, we provide a docking pose that has been corroborated by a new crystal structure published during the revision process of the submitted study showing the accuracy of our predictions. In the second project, we use our improved version of PELE to generate the first structural model of an alpha glucose 1,6-bisphosphate substrate bound to the human Phosphomannomutase 2 demonstrating that this ligand can adopt two low-energy orientations. The third project is the study of DNA-ligand interactions for three cisplatin drugs where we evaluate the binding free energy using Markov state models. We show excellent results respect another free energy methods studied with molecular dynamics. The last project is the study of the daunomycin DNA intercalator where we simulate and study the binding process with PELE. Chapter four is focused on the computational study of force extension profiles during the protein unfolding. We added a dynamic harmonic constraint following a similar procedure applied in steered molecular dynamics to our Monte Carlo approach to fix or pull some selected atoms forcing the protein unfolding in a defined direction. We implement and compare with steered molecular dynamics this technique with Ubiquitin and Azurin proteins. Moreover, we add this feature to a well-known algorithm called MCPRO from William Jorgensen¿s group at YALE University to evaluate the free energy associated to the unfolding of the deca-alanine system. Chapter five corresponds to the introduction of a multiscale approach to study protein-protein docking. A coarse-grained model will be combined with a Monte Carlo exploration reducing the degrees of freedom to generate thousands of protein-protein poses in a quick way. Poses produced by this procedure will be refined and ranked through a protonation, hydrogen bond optimization, and minimization protocol at the all-atom representation to identify the best poses. I present two test cases where this procedure has been applied showing a good accuracy in the predictions: tryptogalinin and ferredoxin/flavodoxin systems. / Aquesta tesi es centra en l'estudi de les interaccions moleculars amb detall atomic i es divideix en un capítol d'introducció i quatre capítols que fan referència a diferents problemes i enfocaments metodològics. Tots ells se centren en el desenvolupament i millora dels algoritmes computacionals de Monte Carlo per estudiar, de manera eficient, el comportament d'aquests sistemes a un nivell mecànica molecular clàssica. Els quatre problemes biofísics estudiats en aquesta tesi són: acoblament induït entre la proteïna-lligand i entre DNA-lligant per comprendre el mecanisme d'unió, resposta de les proteïnes a l'estirament, i la generació/puntuació d'acoblament entre poses proteïna-proteïna. La tesi s'organitza de la següent manera: El primer capítol correspon a l'estat de l'art en mètodes computacionals per estudiar les interaccions biofísiques, que és el punt de partida d'aquesta tesi. El nostre PELE algoritme i els principals mètodes estàndard com ara la dinàmica molecular s'explicaran en detall. El capítol dos es centra en les principals modificacions PELE per afegir noves característiques, com ara l'addició d'un nou camp de força, solvent implícit i modes normals per aquests estudis de simulació d'ADN. Es fa un estudi, comparació i validació de les conformacions generades per sis fragments d'ADN representatius amb PELE utilitzant dinàmica molecular com a referència. El tercer capítol està dedicat a l'aplicació dels nous mètodes implementats i provats en PELE per estudiar les interaccions proteïna-lligand i la interacció lligand-DNA utilitzant quatre sistemes. En primer lloc, se estudia la unió a proteïnes GUN4 combinant PELE i simulacions de dinàmica molecular. A més, es proposa un acoblament que ha sigut corroborat per una nova estructura cristal·lina publicada durant el procés de revisió de l'estudi mostrant l'exactitud de les nostres prediccions. En el segon projecte, hem utilitzat la nostra versió millorada de PELE per generar el primer model estructural d'una glucosa alfa substrat 1,6-bisfosfat unit a la fosfomanomutasa humana 2, que demostra que aquest lligant pot adoptar dues orientacions de baiza energia. El tercer projecte és l'estudi de les interaccions d'ADN lligant per tres medicaments cisplatí on se avalua l'energia lliure d'unió utilitzant Markov States Models. Es mostren excel·lents resultats respecte d'altres mètodes d'energia lliure estudiats amb dinàmica molecular. L'últim projecte és l'estudi de l'intercalador d'ADN anomenat daunomicina on es simula i estudia el procés d'unió amb PELE. El capítol 4 es centra en l'estudi computacional dels perfils d'extensió de la força durant el desplegament de la proteïna. Hem afegit una restricció harmònica dinàmica seguint un procediment similar al aplicat en dinàmica molecular en el nostre algoritme Monte Carlo per fixar o moure alguns àtoms seleccionats obligant a desplegar la proteïna en una direcció definida. Aquesta tècnica s'ha implementat i comparat amb dinàmica molecular per les proteïnes ubiquitina i azurin. D'altra banda, hem afegit aquesta modificació a un algoritme ben conegut anomenat MCPRO del grup de William Jorgensen a la Universitat de Yale per avaluar l'energia lliure associada al desplegament del sistema deca alanina. El capítol cinc correspon a la introducció d'un enfocament multiescala per estudiar l'acoblament proteïna-proteïna. Un model de gra gruixut es combinat amb una exploració Monte Carlo per reduir els graus de llibertat i generar milers de poses proteïna-proteïna d'una manera ràpida. Les poses produides per aquest procediment es perfeccionan i evaluan a través d'una protonació, optimització d'enllaços d'hidrogen, i minimització a escala atòmica per identificar les millors poses. Es presenten dos casos de prova on s'ha aplicat aquest procediment que mostra una bona precisió en les prediccions: tryptogalinin i ferredoxina / flavodoxina systems.

Tesi realitzada a l'Institut de Química Avançada de Catalunya (IQAC-CSIC) / Las enzimas son importantes aliados en la síntesis de complejas moléculas orgánicas. Estos biocatalizadores ofrecen una elevada quimio, regio y estereoselectividad. Debido a esto se minimiza la formación de subproductos por reacciones competitivas no deseadas y se obtienen, por lo general, productos con una elevada pureza estereoquímica. Una especial atención, por sus aplicaciones en Química Orgánica, han recibido las enzimas que median la formación de enlaces C-C. Estas liasas catalizan la síntesis de moléculas complejas muchas de las cuales poseen variadas actividades biológicas. En el trabajo titulado: Nuevas Aplicaciones de la L-Serina Hidroximetiltransferasa y la Benzaldehído Liasa en Síntesis Orgánica se estudia las potencialidades de estos biocatalizadores en la síntesis de alfa,alfa-diarquía-alfa-aminoácidos, C-arilmonosacáridos y moléculas cíclicas derivadas del 7,8,14,15-tetrahidro-6H-dibenzo[f,j][1,5]dioxacicloundeceno a través de reacciones de carboligación. Para ello este estudio se ha dividido en 3 apartados: APARTADO 3.1. Se muestra el diseño de nuevas variantes de la L-serina hidroximetiltransferasa de Streptococcus thermophilus (SHMTSth) que catalizan la síntesis de beta-hidroxi- alfa,alfa -dialquil-alfa-aminoácidos. Utilizando la ingeniería de proteínas y un diseño semirracional se incrementó la selectividad de la SHMTSth nativa hacia otros sustratos diferentes de la Gly. Por medio de esta metodología se encontraron tres variantes de la enzima, Y55T, Y55C y Y55S que catalizaron la adición aldólica de D-Ala y D-Ser a diferentes aldehídos. La SHMTSth Y55T resultó ser el biocatalizador más activo y permitió sintetizar beta-hidroxi- alfa,alfa -dialquil-alfa-aminoácidos con una elevada estereoselectividad (> 95 %). APARTADO 3.2. En este apartado se describe como se acoplan las potencialidades sintéticas de una enzima tiamin dependiente con dos aldolasas a través de dos etapas químicas sencillas en la síntesis de C-arilmonosacáridos. La primera reacción enzimática consistió en la adición benzoínica cruzada de varios aldehídos aromáticos a dimetoxiacetaldehído, catalizado por benzaldehído liasa de Pseudomonas fluorescens biovar I (BAL). Esta reacción alcanzó conversiones superiores al 95 % y se realizó en un sistema tampón:MTBE (1:1 v/v) donde el producto se separó en la fase orgánica y se utilizó directamente en la siguiente etapa de síntesis. Posteriormente se redujeron las (R)-1-aril-2-hidroxi-3,3-dimetoxipropan-1-onas, utilizando NaBH4, con una elevada diastereoselectividad hacia la formación del diol anti (= 90 %). A continuación se hidrolizó el grupo acetal en medio ácido (H2SO4 2 M) y los (2S,3S) 3-aril-2,3-dihidroxipropanal obtenidos fueron utilizados en reacciones de adición aldólicas con diferentes sustratos dadores: dihidroxiacetona (DHA), hidroxiacetona (HA) y glicolaldehído (GO), catalizadas por D-fructosa-6-fosfato aldolasa (FSA) y sus variantes A129S y A129T respectivamente. Esto permitió sintetizar derivados de L-sorbosa (DHA), 1-desoxi-L-sorbosa (HA) y L-xilosa (GO). También se realizó la reacción de adición aldólica de DHA a los dihidroxialdehídos en tampón borato catalizado por L-ramnulosa-1-fosfato aldolasa (RhuA). Por medio de esta reacción se obtuvieron análogos de L-fructosa y L-tagatosa. APARTADO 3.3 En esta sección se describe la adición benzoínica intramolecular catalizada por BAL. Con la síntesis de varios dialdehídos aromáticos se encontraron los requerimientos estructurales del sustrato para que la enzima catalizara la reacción de carboligación intramolecular. De los posibles sustratos ensayados, el 2,2'-(propano-1,3-diilbis(oxi))dibenzaldehído permitió obtener el ciclo (R)-15-hidroxi-7,8-dihidro-6H-dibenzo[f,j][1,5]dioxacicloundecen-14(15H)-ona como único productos en la reacción enzimática con conversiones superiores al 75 %. A partir de aquí se sintetizaron otros dialdehídos con los que sintetizaron análogos de 7,8,14,15-tetrahidro-6H-dibenzo[f,j][1,5]dioxacicloundeceno. De este estudio se determinó que la BAL cataliza reacciones de adición benzoínica intramolecular de aldehídos aromáticos unidos por una cadena espaciadora, propano-1,3-oxi, en posición 2,2´. La enzima también toleró sustituciones en posición 3,3´y 5,5´ del anillo aromático así como dialdehídos derivados de la piridina. / Alpha,alpha-Disubstituted alpha-amino acids are central to biotechnological and biomedical chemical processes as their own sake and as substructures of biologically active molecules for diverse biomedical applications. Structurally, these compounds contain a quaternary stereocenter, which is particularly challenging for stereoselective synthesis. The pyridoxal 5’-phosphate (PLP)-dependent L-serine hydroxymethyltransferase from Streptococcus thermophilus (SHMTSth; EC 2.1.2.1) catalyzes the aldol addition reaction of Gly to aldehydes. We have developed by structure-based engineering a versatile SHMTSth biocatalyst with a wide spectrum of donor and acceptor selectivity overcoming the limitation of the native enzyme for Gly. We have constructed a SHMTSth variant that effectively accomplishes the stereoselective formation of quaternary stereocenters via aldol addition of D-Ala and D-Ser to a wide acceptor scope including aromatic, aliphatic aldehydes as well as hydroxy and nitrogen containing aldehydes to obtain a broad structural variety of alpha-methyl or alpha-hydroxymethyl,alpha-substituted alpha-amino acids. The “de novo” synthesis of carbohydrates and their derivatives (e.g. deoxysugars) is challenging due to the lengthy and time consuming cumbersome protective group strategies. Here, a highly expedient asymmetric synthetic route based on benzoin and aldol biocatalytic reactions for the preparation of new aryl carbohydrate derivatives is presented. The benzoin condensation of aromatic aldehydes to dimethoxyacetaldehyde catalyzed by benzaldehyde lyase from Psedomonas fluorescens biovar I, stereoselective reduction of the carbonyl group and acetal hydrolysis was then followed by the aldol addition of dihydroxyacetone, hydroxyacetone or glycolaldehyde catalyzed D-fructose 6-phosphate aldolase and L-rhannulose-1-phosphate aldolase. New intramolecular benzoin reaction was described using benzaldehyde lyase from Psedomonas fluorescens biovar I as biocatalyst. Different aromatic dialdehydes were tested and the 2,2'-(propane-1,3-diylbis(oxy))dibenzaldehydo yield cycle (R)-15-hydroxy-7,8-dihydro-6H-dibenzo[f,j][1,5]dioxacicloundecen-14(15H)-one as a single products (75 % conversion). Other dialdehydes analogs of A were synthesized and were obtained cycles derivate of 7,8,14,15-tetrahydro-6H-dibenzo[f,j][1,5]dioxaciclo undecene.

Los tumores cerebrales afectan a 9 de cada 100.000 adultos en España, observándose una mayor frecuencia de tumores de tipo glial. Estos tumores presentan un importante impacto en la calidad de vida de los pacientes afectados y un mal pronóstico, sobre todo en los tumores de grado alto. La monitorización no invasiva de los tumores cerebrales es muy importante para el diagnóstico y seguimiento de la enfermedad y se hace sobre todo por técnicas de Imagen por Resonancia Magnética (IRM), la cual aporta información morfológica. La Espectroscopía de Resonancia Magnética (ERM), tanto en su modalidad voxel único como imagen espectroscópica (IERM) son técnicas complementarias de gran utilidad, por aportar información del entorno metabólico, que no puede conseguirse mediante la IRM. Las dificultades éticas para desarrollar mejoras en los protocolos de IRM/ERM, así como para la prueba de nuevos agentes de contraste en pacientes humanos han llevado al desarrollo de los modelos murinos de cáncer cerebral. Los modelos más utilizados son los creados por inyección estereotáxica, aunque también se han desarrollado modelos transgénicos (GEM, genetically engineered mice) que desarrollan tumores cerebrales espontáneamente y reproducen las características infiltrativas de tumores humanos. En esta tesis, se llevó a cabo en el capítulo 2 un amplio estudio de caracterización de diferentes colonias GEM. Se comprobó la baja penetrancia de tumores en estos modelos (16,7% en la colonia que mejores resultados produjo), lo que plantea dificultades para realizar estudios con grupos homogéneos. Este hecho, sumado a la escasez de modelos preclínicos de tumores cerebrales de bajo grado actualmente disponibles, motivaron a su vez el estudio que se llevó a cabo en el capítulo 3 de ésta tesis. Dicho capítulo trata del establecimiento de una línea transplantable de tumor cerebral murino de bajo grado a partir de un tumor desarrollado por un animal de la colonia GEM. El objetivo de éste capítulo consistía en generar un tumor inducible mediante inyección estereotáctica intracraneal de gliosferas generadas en cultivo a partir de la disgregación del tumor glial de origen. Se llevó a cabo una puesta a punto con tumores murinos de tipo GL261 y en un siguiente paso, se continúo con el establecimiento y caracterización de la línea transplantable a partir de un oligodendroglioma anaplásico desarrollado por un especimen de la colonia GEM. Esta línea transplantable ha sido ampliamente caracterizada de manera no invasiva mediante IRM/ERM y también mediante estudios de imagen espectroscópica con perturbación del patrón espectral (PE-IERM).Se obtuvieron resultados prometedores, con un 60% de penetrancia del fenotipo tumoral, y manteniendo en la mayoria (1 de 12 analizados por histopatologia) de los casos la misma patología del tumor de origen. Paralelamente, en el último capítulo se realizaron estudios con nuevos agentes de contraste (AC) que actualmente se están desarrollando para IRM con potencial interés para tumores cerebrales y que permitirán superponer información funcional a la información anatómica. Para ello, se ha desarrollado un método de análisis postmortem de estos AC. Dicho método permite no sólo reducir el número de animales utilizados en la experimentación, sino también reducir en 800 veces la cantidad de agente necesaria para estudios preliminares en IRM preclínica. Nuestros resultados preliminares apuntan a que este método es más preciso que los análisis de relajatividad in vitro, debido a una mejor simulación del entorno in vivo y de la posible interacción del AC con tejidos, moléculas y receptores presentes en el entorno de utilización. Los resultados obtenidos con el mejor agente analizado (GNP(E), con un incremento de contraste relativo, IRC, 330% en comparación con contralateral) se han corroborado en un análisis de IRM in vivo en el modelo preclínico de tumor glial GL261 (IRC 122% en comparación con contralateral), siendo a su vez sensiblemente más eficiente que el AC comercial de tipo comparable actualmente disponible y en uso en clínica. / Brain tumors affect 9 out of every 100,000 adults in Spain, being the glial type tumors the most prevalent. These tumors have a significant impact on the quality of life of affected patients and have a poor prognosis, especially the high grade ones. The noninvasive monitoring of brain tumors is important for the diagnosis and follow-up of this disease and it is carried out mainly through magnetic resonance imaging (MRI), which provides morphological information. Magnetic resonance spectroscopy (MRS), both in its single voxel or spectroscopic imaging (MRSI) modalities, is a useful complementary technique for gathering information about the metabolic environment, which is impossible to obtain by MRI. The ethical restraints for the development of improvements in MRI/MRS protocols, as well as for testing new contrast agents (CA) in human patients, have led to the development of preclinical murine models of brain tumors. The ortothopic models (obtained by stereotactic injection) are the most commonly used, although transgenic models (GEM, genetically engineered mice), that spontaneously develop brain tumors which reproduce infiltrative characteristics of human tumors, have also been developed. In this thesis, a comprehensive study of different GEM colonies characterization was carried out in chapter 2. We have found a low penetrance of brain tumours in those models (16.7% in the best colony), and this makes it difficult to perform studies with homogeneous groups. This fact, coupled with the scarcity of low grade preclinical models of brain tumours currently available, motivated us to perform the study which can be seen in chapter 3 of this Thesis. This chapter describes the development of a transplantable low grade murine brain tumour line originating from a spontaneous tumour developed from a single GEM specimen. The objective for this chapter was to induce a tumour through the intracranial injection of gliospheres which had been cultured after the disaggregation of the originating glial tumour. This procedure was set up using GL261 murine tumours, and the next step was to establish and characterise the transplantable line obtained from an anaplastic oligodendroglioma from the GEM colony. This transplantable line was widely characterized using noninvasive MRI/MRS methods, as well perturbation-enhanced spectroscopic imaging (PE-MRSI). Promising results were obtained, with 60% of tumor phenotype penetrance. In addition, most of the cases (12 out of 12 analyzed by histopathology) retained the same histopathological diagnosis of the original tumour. Finally, in the last chapter, we performed studies with novel contrast agents (CA) which are currently being developed for MRI and which may be of potential interest for brain tumor studies, and which could allow to gather functional information in addition to the anatomical one. To achieve this goal, a new method using post-mortem analysis was developed for testing the new CA. This method not only allows us to reduce the number of animals used in the experiments, but also reduces (ca. 800 times) the amount of agent required for preliminary studies with preclinical MRI. Our preliminary results suggest that this method is more accurate than in vitro relaxativity analysis, due to a better simulation of the in vivo environment and of the possible interaction of the CA with tissues, molecules and receptors present in the environment studied. The results obtained with the best CA (GNP (E), relative contrast enhancement RCE, 330% in comparison with contralateral brain parenchyma) have been confirmed by in vivo MRI analysis with a preclinical model of GL261 glial tumour (RCE 122% in comparison with contralateral brain parenchyma). This CA was slightly better than a commercially available T1 agent currently being used in clinics.

Tesi realitzada a l'Institut de Biologia Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC) / The balance between proteolytic and antiproteolytic activity is crucial in many biological processes such as nutrition, immune defence, virulence and tissue remodelling. Therefore, it is controlled by several mechanisms, among which by peptidic peptidase inhibitors that are encoded in the genomes of many organisms, representing up to 1% of genes in metazoa but being scarce and sketchy in bacteria. However, among bacterial peptidase inhibitors, some proteins with homology to the highly abundant metazoan a2-macroglobulins (a2Ms) have been described, which may have been acquired by bacteria from metazoa by horizontal gene transfer. Although a 2Ms have been extensively characterised in metazoa, where they play important roles in innate immunity, the biological role, mechanism of action and molecular structure of bacterial a2Ms (ba2Ms) remained largely unknown. In this thesis, the characterisation of the Escherichia coli a2M, ECAM, was undertaken in order to elucidate its role in the bacterial cell. The results unveiled a novel mechanism of peptidase inhibition, called the snap-trap mechanism, that is probably shared by other monomeric a2Ms, both from bacteria and metazoa. In this, attacking endopeptidases cleave the native inhibitor in an accessible bait region, thus causing a major conformational rearrangement and producing induced species that covalently traps peptidases through a highly reactive thioester bond. The rearrangement, involving most of the 13 domains of ECAM, but also key structural elements of the mechanism, were described by producing the first atomic models of ECAM in both conformations, by using X-ray crystallography and cryo-electron microscopy. Through a covalent trap, ECAM prevents peptidases from cleaving large substrates, such as components of the bacterial cell wall, thus protecting E. coli cells against potentially damaging proteolytic activity. Therefore, it seems that ECAM participates in defence mechanisms in bacteria that thrive in the presence of peptidases, for which this thesis provides the first experimental evidence by in vivo functional assays. In summary, through a multifaceted approach that combined structural, biochemical and functional characterisation, this thesis yielded a mechanistic model for ECAM, significantly enriching our understanding of ba2Ms and providing new insights into bacterial defence mechanisms. / La regulació de l'activitat proteolítica és crucial per al bon funcionament dels organismes, ja que afecta processos biològics com la nutrició, la defensa immunològica, la virulència de determinats microorganismes o la remodelació de teixits. Per això, en el genoma de pràcticament tots els éssers vius s'hi troben gens que codifiquen per inhibidors de peptidases que permeten el control dels enzims proteolítcs mitjançant la reducció de la seva activitat. Els inhibidors de peptidases són molt abundants en el genoma dels animals, on poden arribar a representar fins a un 1% dels gens, però la seva presència en bacteris és limitada. Malgrat això, alguns bacteris necessiten sobreviure en ambients rics en peptidases, com per exemple l'intestí humà, i per tant els inhibidors de peptidases son importants mecanismes de defensa en aquests microorganismes. Entre els inhibidors de peptidases codificats en els genomes bacterians, se n'han trobat que presenten homologia amb les a2 -macroglobulines (a2Ms) de metazoa, proteïnes altament abundants que participen, entre altres, en la immunitat innata dels animals. Tot i que s'ha postulat que les a2Ms bacterianes provenen de la transferència gènica horitzontal de gens de metazoa, la funció biològica, el mecanisme d'acció i l'estructura molecular d'aquestes proteïnes s'ha mantingut desconeguda. En aquesta tesi s'ha caracteritzat la a2M bacteriana de Escherichia coli, anomenada ECAM, per tal de definir la seva funció en la cèl•lula bacteriana. Els resultats obtinguts han permès descriure un nou mecanisme d'inhibició de peptidases, el qual s'ha anomenat mecanisme "snap-trap". En aquest, les peptidases que aconsegueixen accedir al periplasma de E. coli tallen la forma nativa d'ECAM en una regió anomenada esquer (bait region). Això causa un canvi conformacional i produeix la forma activada de la proteïna, la qual pot unir covalentment la peptidasa a través d'un enllaç tioèster molt reactiu. Aquest canvi conformacional i els elements estructurals implicats en el mecanisme d'acció d'ECAM s'han pogut descriure mitjançant l'obtenció de models atòmics de la proteïna en les dues conformacions, tant per cristal•lografia de raigs X com per criomicroscòpia electrònica. Un cop atrapades, les peptidases romanen inhibides i no poden tallar substrats d' alts pesos mol•leculars com podrien ser els components proteics de la paret bacteriana, explicant així la funció protectora que ECAM exerceix en la cèl•lula bacteriana i que ha sigut demostrada experimentalment per primer cop en aquesta tesi. En resum, a través de la combinació d'estudis estructurals, bioquímics i funcionals, s'ha obtingut un model del mecanisme d'acció d'ECAM a la cèl•lula bacteriana. Així, es contribueix a enriquir el coneixement sobre les a2Ms bacterianes i s'aporta informació sobre els mecanismes de defensa que presenten determinats bacteris.

El estudio de la agregación proteica representa un campo de investigación desafiante que abarca tanto el área biomédica como la biotecnológica. El creciente número de enfermedades humanas asociadas a la acumulación de agregados amiloides, así como la formación de depósitos intracelulares durante la producción recombinante de proteínas terapéuticas en modelos celulares ha impulsado la investigación para comprender y desarrollar estrategias contra la agregación de proteínas. Hasta la última década, se pensaba que la agregación amiloide estaba únicamente asociada a estados patológicos o a un plegamiento erróneo durante la producción de proteínas heterólogas. Esta idea fue cambiada radicalmente con el descubrimiento de fibras amiloides utilizadas con fines funcionales en bacterias, hongos, insectos, invertebrados y seres humanos. Esto sugiere que la tendencia a formar estructuras amiloides no se limita exclusivamente a amiloidosis de tipo tóxico si no que puede ser considerada como una propiedad intrínseca de cada cadena polipéptidica que permite la acumulación de agregados macromoleculares con propiedades estructurales excepcionales. En la presente tesis se ha utilizado un conjunto de herramientas biofísicas y computacionales combinadas con modelos in vitro e in vivo para caracterizar la agregación funcional y no funcional. Por un lado, hemos analizado el papel específico de péptidos bacterianos en la formación de biofilms de tipo amiloide así como en la virulencia de S. aureus. Por otro lado, modelos de proteínas estructuralmente distintas se han utilizado para estudiar el papel de los determinantes moleculares tales como la restricción conformacional aportada por puentes disulfuros, condiciones ambientales críticas y propiedades amiloidogénicas intrínsecas en la formación de agregados no funcionales. En general, los datos aquí presentados resaltan el estricto control ejercido por la Naturaleza que permite el ensamblaje amiloide funcional contrarrestando factores intrínsecos y extrínsecos que pueden conducir a la agregación toxica de tipo amiloide. / The study of protein aggregation represents a challenging research field which embraces from biomedical to biotechnological areas. The growing number of human diseases associated to the deposition of amyloid aggregates as well as the formation of intracellular protein deposits during the recombinant production of therapeutic proteins in cell factories has pushed the research to understand and develop strategies against protein aggregation. Until the past decade, amyloid aggregation was thought to be only associated with pathological amyloid states or unsuccessful folding during heterologous protein production. This idea was radically changed with the discovery of amyloid fibers being used for functional purposes in bacteria, fungi, insects, invertebrates and humans This suggests that the amyloid propensity is not confined to toxic amyloidosis but it may be considered as an intrinsic property of the polypeptide chain that allows the build up of macromolecular assemblies with exceptional structural properties. In the present thesis we have used a set of biophysical and computational tools combined with in vitro and in vivo models to characterize both functional and non-functional aggregation. On one side, we have analysed the specific role of bacterial peptides in biofilm amyloid formation and virulence in S. aureus. On other side, structurally distinct protein models have been used to study the role of molecular determinants such as disulfide bond crosslinking, harsh environmental conditions and intrinsic amyloidogenic propensities in the formation of non-functional aggregates. Overall, the data reported here underline the tight control exerted by Nature to allow functional amyloid assembly while counterbalancing intrinsic and extrinsic factors that might lead to toxic amyloid aggregation.

En els darrers 15 anys, l'estudi de l'agregació de proteïnes ha evolucionat de ser una part de la química de proteïnes que tradicionalment generava poc interès, a convertir-se en una àrea d'investigació dinàmica que ha ampliat el seu abast a diferents camps de recerca incloenthi la bioquímica, la biotecnologia, la nanotecnologia y la biomedicina. Dins d'aquests camps, l'anàlisi de l'agregació de proteïnes un interès particularment rellevant en les àrees biomèdica i biotecnològica. Això es degut, per una banda, a que la aparició de depòsits proteics insolubles está relacionada amb un nombre creixent de malalties humanes, moltes d'elles amb conseqüències fatals per als malalts. Per l'altre costat, l'agregació proteica es una complicació habitual en la expresió recombinant de proteïnes a nivell industrial, com ara a la producció d'agents terapèutics de naturalessa proteica, com els anticossos. Conseqüentment, l'exploració de mecanismes que permetin prevenir l'agregació proteica es subjecte actualment d'una intensa tasca d'investigació adreçada a desenvolupar métodes per a la prevenció i l'intervenció terapèutiques d'aquestes malalties greus; i també amb l'objectiu d'incrementar els rendiments en la producció biotechnològica de proteïnes. La gran capacitat de les eines computacionals desenvolupades per tal de predir l'agregació proteica ha donat un gran impuls als esforços destinats a identificar els determinants de l'agregació de polipèptids, i també ha permès investigar com la pressió selectiva contra l'agregació ha moldeat els proteomes cel·lulars al llarg de l'evolució. A partir d’aquests anàlisis, s’han pogut identificar diferents mecanismes evolucionats per prevenir l’agregació proteica que van des de estratègies de disseny negatiu que s’han detectat en seqüències i estructures de proteïnes, fins a la caracterització dels factors que governen la maquinària cel•lular encarregada del control de qualitat proteic. En aquesta tesi es proporciona un anàlisis des de diferents perspectives per assolir una caracterització detallada de diversos d’aquests mecanismes que han sorgit al llarg de l’evolució per fer front al risc d’agregació. Amb aquest objectiu, s’han fet servir tant models proteics d’agregació específics com diferents conjunts de proteïnes amb propietats relacionades, que han permès analitzar en profunditat estratègies contra l’agregació. Al mateix temps, l’aproximació basada en l’estudi de conjunts de proteïnes íntimament relacionats també ha permès identificar limitacions funcionals que limiten la selecció a nivell evolutiu contra l’agregació. De manera més específica, el treball que es presenta aquí aborda l’efecte de la restricció de la llibertat conformacional de la cadena polipeptídica, causada per l’establiment d’un pont disulfur, sobre el procés d’agregació; també s’ha analitzat l’impacte de regions intrínsicament desestructurades en aquest mateix fenomen d’agregació. A més també s’ha investigat la regulació de l’abundància proteica dins la cèl·lula en funció de la tendència a agregar específica de les proteïnes. Per altra banda, l’anàlisi centrat en l’estudi de proteïnes relacionades ha revelat com els requeriments per assolir un plegament eficient i per mantenir l’activitat catalítica limiten la disminució de la càrrega d’agregació de les proteïnes. Aquests anàlisis posen especialment en relleu el balanç entre plegament funcional i agregació, de manera que la caracterització de les propietats aggregatives de determinats polipèptids permet predir el seus mecanismes de plegament. / In the last 15 years, the study of protein aggregation has evolved from a mostly neglected topic of protein chemistry to a highly dynamic research area which has expanded its implications through different fields including biochemistry, biotechnology, nanotechnology and biomedicine. The analysis of protein aggregation has attracted a particular interest in the biomedical and biotechnological areas. Because, on one side, the formation of insoluble protein deposits is associated to an increasing number of human disorders, many of which present fatal pathological consequences. And on the other hand, aggregation is a frequent shortcoming in the recombinant expression of proteins at the industrial level, such as in the production of proteinaceous therapeutic agents like antibodies. Consequently, the survey of mechanisms to prevent protein aggregation is currently the focus of deep investigation with the aim to develop preventive or therapeutic methods for the intervention of these depositional disorders and to enhance the yield in the biotechnological production of proteins. The power of the computational tools developed to predict protein aggregation has fostered the identification of the determinants influencing the aggregation of polypeptides and has allowed to investigate how the selective pressure to avoid aggregation has shaped the cellular proteomes along evolution. From these analyses, different mechanisms to prevent protein aggregation have emerged ranging from negative design strategies found in polypeptide sequences and structures, to the characterization of the factors governing the cellular machinery in charge of the protein quality control. The present thesis provides a multiperspective analysis for the detailed characterization of several of these mechanisms evolved to confront the risk of protein aggregation. In this sense, the use of a variety of specific proteic models of aggregation or different sets of proteins with related properties has allowed to analyze particular strategies to avoid aggregation in depth. At the same time, the approach based on the study of closely related ensembles of proteins has allowed to identify functional constraints that limit the evolutionary selection against aggregation. More specifically, the work presented here addresses the effect of restricting the configurational freedom of the polypeptide chain by disulfide cross-linking on the aggregation process, as well as the impact over this phenomenon exerted by the presence of intrinsically disordered protein regions. Additionally, the regulation of cellular protein abundance as a function of protein aggregation propensity has also been surveyed. On the other hand the analysis centered on the study of closely related proteins has revealed how the requirements to fold efficiently and to maintain the catalytic activity constrain the minimization of the aggregation propensity of proteins. These analyses highlight particularly the interplay between folding and aggregation, in such a way that the analysis of the aggregational properties of polypeptides allows to forecast the mechanism of folding of certain kind of proteins.

Aquesta tesi doctoral es basa en dos estudis en els que s’analitzen les variants genètiques de la quasiespècies del virus de la hepatitis B (VHB) en una regió de la pauta oberta de lectura (ORF) de la polimerasa viral (P) on poden acumular-se mutacions relacionades amb la resistència a certs tractaments de la família dels anàlegs de nucleòsids/nucleòtids (NUCs). Aquesta anàlisi s’ha realitzat per seqüenciació massiva basada en tècniques d’“Ultra-deep pyrosequencing” (UDPS). Les mutacions seleccionades a causa del tractament antiviral a l’ORF P també poden produir canvis d’aminoàcid (aa) a l’ORF de les proteïnes de superfície (S) [tots dos ORF estan solapats a la mateixa seqüència de nucleòtids (nt)]. Alguns d’aquests canvis poden donar lloc a la pèrdua de l’acció protectora de la vacunació i/o les immunoglobulines contra el VHB (HBIg) i també a falsos negatius en els mètodes diagnòstics del VHB. En el primer estudi s’han analitzat la quasiespècies del VHB en quatre pacients amb hepatitis B crònica abans de rebre qualsevol tractament amb NUCs. Un d’aquests pacients va rebre tractament seqüencial amb diferents NUCs i es va analitzar una mostra obtinguda en finalitzar cada un d’ells. Aquestes quasiespècies virals van ser estudiades amb la primera versió de la tecnologia d’UDPS, que permetia lectures de seqüència fins a 250 nt. La metodologia desenvolupada en aquest estudi va permetre determinar la composició de variants genètiques en proporcions fins al 0,1% de la quasiespècies. Es va analitzar la variabilitat i conservació dels ORFs P i S en la quasiespècies viral abans del primer tractament amb NUCs dels quatre pacients inclosos a l’estudi [lamivudina (LAM)]. En general, la freqüència de les mutacions relacionades amb resistència a LAM no va permetre preveure la seva selecció durant aquest tractament. En el pacient analitzat longitudinalment, al llarg dels diferents tractaments es van analitzar les divergències globals de les seqüències de nt i aa i la desviació estàndard (SD) de les freqüències de les mutacions a l’ORF P. La SD va permetre identificar les més rellevants per explicar la fallada a cada un d’aquests (per tant aquests resultats tenen un valor potencialment fenotípic). L’anàlisi del lligament d’aquestes mutacions va evidenciar l’acumulació de varies d’elles en una sola variant genètica (per exemple rtL180M-rtS202G-rtM204V-rtV207I), a excepció de rtA181T/sW172stop que sol ser la única mutació en les variants que la contenen. En totes les mostres analitzades es van observar proporcions relativament elevades de variants defectives amb codons stop prematurs a l’ORF S. En el segon estudi es va analitzar la quasiespècies viral en quatre pacients amb recurrència de la infecció per VHB després del trasplantament hepàtic ortotòpic (OLT) a pesar de la profilaxi amb LAM o HBIg+LAM. En aquest estudi es va utilitzar una nova metodologia descrita prèviament pel grup del doctorand, que va permetre estudiar les variants presents en proporcions fins al 0,25% de la quasiespècies del VHB. Aquest procediment està basat en una versió de la tecnologia d’UDPS que permet obtenir seqüències fins a 400 nt, cosa que va fer possible explorar la seqüència sencera del principal epítop de l’antigen de superfície del VHB (HBsAg), el determinant “a”. Així en els quatre casos estudiats es va observar un efecte coll d’ampolla de l’OLT sobre les poblacions de variants que formen la quasiespècies del VHB, que va donar lloc a diferències rellevants entre les quasiespècies d’abans i després de l’OLT: a nivell de mutacions individuals dels ORFs P i S, que en alguns casos van donar lloc a la recurrència de la infecció sense HBsAg detectable, i a través de canvis en el genotip del VHB i en diferents índexs de diversitat de la quasiespècies viral. / This doctoral thesis is based on two studies in which the genetic variant composition of the hepatitis B virus (HBV) quasispecies was analysed in a region of the viral polymerase (P) open reading (ORF) where mutations associated with resistance to certain treatments from the nucleoside/nucleotide analogues (NUCs) family can accumulate. This analysis was performed by massive sequencing techniques based on Ultra-deep pyrosequencing (UDPS). Mutations selected in the P ORF due to antiviral treatment can also cause amino acid (aa) changes in the surface proteins (S) ORF (both ORF are overlapping in the same nucleotide [nt] sequence). Some of these changes may result in the loss of the protective action of vaccination and immunoglobulins against HBV (HBIg), and also to false negative results in HBV diagnostic methods. In the first study, the HBV quasispecies was analysed in four chronic hepatitis B patients prior to receiving any treatment with NUCs. One of these patients received sequential treatment with different NUCs and a sample obtained at the end of each of them was analysed. These viral quasispecies were studied using the first version of the UDPS technology, which made it possible to obtain sequence reads up to 250 nt. The methodology developed in this study enabled us to determine the genetic variant composition in proportions up to 0.1% of the quasispecies. In the viral quasispecies from the four patients included in this study the variability and conservation of P and S ORF was analysed before they received the first NUCs treatment (lamivudine [LAM]). Overall, the frequency of mutations associated with LAM resistance did not make it possible to predict their selection during this treatment. Throughout the different treatments of the longitudinally analysed patient, the global divergences of nt and aa sequences and the standard deviation (SD) of the frequencies of mutations in the P ORF were analysed. The SD identified the most relevant of them to explain failure in each of these treatments (therefore these results have a potential phenotypic value). The linkage analysis of these mutations showed the accumulation of several of them in a single genetic variant (e.g. rtL180M-rtS202G-rtM204V-rtV207I); except for rtA181T/sW172stop which is usually the only mutation in variants that contain it. All the samples showed relatively high proportions of defective variants with premature stop codons in the S ORF. In the second study the viral quasispecies was analysed in four patients who showed recurrence of HBV infection after orthotopic liver transplantation (OLT) despite the prophylaxis with LAM or HBIg+LAM. In this study a new methodology previously described by the candidate’s group was used, which allowed for the study of the variants present in proportions up to 0.25% of the HBV quasispecies. This procedure is based on a version of the UDPS technology which made it possible to obtain sequences of up to 400 nt in length, which allowed for the exploration of the whole sequence of the main epitope of HBV surface antigen (HBsAg), the “a” determinant. In the four cases studied a bottleneck effect was observed over the variant populations that form the HBV quasispecies due to the OLT, which resulted in significant differences between the quasispecies from before and after OLT: at the level of individual mutations in P and S ORFs, which in some cases resulted in recurrence of infection without detectable HBsAg, and through changes in the HBV genotype and in different indices of viral quasispecies diversity.