Tesi realitzada a l'Institut de Biologia Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC) / The transcription factor SOX2 is a key determinant of stem cell properties, also involved in the initiation, maintenance and progression of several human cancers. By studying the in vitro phenotypic consequences of SOX2 overexpression and knock down in a panel of cell lines, we have found that high levels of SOX2 leads to DNA damage and accumulation of reactive oxygen species, accompanied with cell cycle arrest and apoptosis in colorectal cancer cell lines, SW620 and SW480. We have also found that knock down of SOX2 in the metastatic colorectal cancer cell line SW620, led to G1 cell cycle arrest partially dependent on the cyclin-dependent kinase inhibitors p21 and p27, as well as abrogation of anchorage-independent growth in vitro and tumor growth in vivo. Knock down of SOX2 caused the upregulation of p27 and reporter assays combining knock down and overexpression of this transcription factor suggest that SOX2 may act as a negative transcriptional regulator of p27. Knock down of p27 partially reverted the cell-cycle arrest induced by SOX2 repression but was insufficient to restore anchorage-independent growth in vitro. In addition, it also led to downregulation of LGR5 transcript levels, a known intestinal stem cell marker, but it is unknown whether this regulation is mediated directly by SOX2 or by other mechanisms. Knock down of LGR5 partially phenocopied the repression of SOX2 in SW620 cells; it abrogated their anchorage-independent growth in vitro and tumor growth in vivo, in spite of a strong induction of β-catenin transcriptional activity. Activation of β-catenin transcriptional activity upon LGR5 knock down was paralleled by decreased membrane association and enhanced nuclear translocation but not by β-catenin protein accumulation or downregulation of the Wnt/β-catenin negative regulators ZNRF3 or RNF43. These results indicate that LGR5 is a negative regulator of canonical Wnt signaling in the absence of their cognate ligands (R-spondins) and that high β-catenin/TCF/LEF transcriptional activity does not involve necessarily increase of self-renewal potential in these colorectal cancer cell models studied. / El factor de transcripción SOX2 es una proteína clave implicada en las propiedades adscritas a células madre y también está implicado en la iniciación, mantenimiento y progresión tumoral en distintos tipos de cáncer. Mediante estudio in vitro de las consecuencias fenotípicas de la sobreexpresión y represión de SOX2 en un grupo de líneas celulares, nos hemos centrado en el estudio de dos lineas celulares isogénicas de cáncer colorectal (SW620 y SW480) que presentan una marcada expresión diferencial de SOX2 que correlaciona positivamente con su agresividad. En conjunto, hemos encontrado que altos niveles de SOX2 induce daño al DNA e inducción de especies reactivas de oxígeno, arresto en ciclo celular y apoptosis. También hemos determinado que la represión de SOX2 en la línea metastásica de cáncer colorrectal SW620, induce arresto en G1 y que éste depende parcialmente en los inhibidores de ciclina dependiente de kinasa p21 y p27, junto a una drástica reducción en la formación de esferoides en condiciones independientes de anclaje a sustrato y de tumorigenicidad in vivo. Además, los análisis con plásmidos reporteros combinando represión y sobreexpresión de SOX2 sugieren que este factor de transcripción podría actuar como un regulador transcripcional negativo de p27. A su vez, la represión de p27 es capaz de revertir parcialmente el arresto en ciclo celular en G1 inducido por la represión de SOX2 pero no restablece el crecimiento de esferoides en condiciones independientes de anclaje a sustrato. De manera destacable, el silenciamiento de SOX2 induce la bajada de expresión de los niveles de LGR5, un conocido marcador de células madre adultas intestinales, aunque no se ha podido determinar en este estudio si esta regulación está mediada directamente por SOX2 o por otros mecanismos. De igual modo, la represión de LGR5 en la línea SW620 también produce una reducción significativa en la capacidad de formar esferoides in vitro y de crecer tumores in vivo, a pesar de incrementar de manera relevante la actividad transcripcional de la β-catenina. El incremento de la actividad transcripcional de la β-catenina al reprimir LGR5, es concomitante a la reducción de la fracción de esta proteína unida a membrana y al aumento de su translocación nuclear pero no a la acumulación de ésta o a la bajada de expresión de los reguladores negativos de la ruta canónica de Wnt, ZNRF3 o RNF43. Estos resultados indican que LGR5 es un regulador negativo de la ruta canónica de la señalización Wnt en ausencia de sus ligandos conocidos (R-spondinas), y que la elevada actividad transcripcional del complejo formado por β-catenina/TCF/LEF no implica necesariamente el incremento del potencial de auto-renovación en los modelos celulares de cáncer colorrectal estudiados.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:03:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000430225-Texto+Completo-0.pdf: 4266902 bytes, checksum: 4436e37d2d21598e8ed023afd34398a2 (MD5) Previous issue date: 2011 / Tuberculosis (TB) still remains as one of main cause of mortality worldwide due to a single infectious agent, Mycobacterium tuberculosis. The aroK-encoded M. tuberculosis Shikimate Kinase (MtSK), the fifth enzyme of the shikimate pathway, catalyzes phosphate transfer from ATP to the carbon-3 hydroxyl group of shikimate, yielding shikimate 3-phosphate and ADP. Disruption of aroK gene has demonstrated that MtSK is essential for the viability of M. tuberculosis. Here we present purification of MtSK to homogeneity, mass spectrometry analysis, N-terminal amino acid sequencing, and oligomeric state determination of the recombinant protein. Steadystate kinetics, and studies on ligand binding by fluorescence spectroscopy and isothermal titration calorimetry (ITC) suggest that the chemical reaction catalyzed by monomeric MtSK follows a rapid-equilibrium random order of substrate binding, and ordered product release in which shikimate-3-phosphate release is followed by ADP dissociation to yield free enzyme. ITC results showed significant heat changes upon ligand binding to free MtSK enzyme, thereby providing thermodynamic signatures of non-covalent interactions to each binding process. These results provide a better understanding of the mode of action of MtSK that should be useful to guide the rational design of inhibitors of this enzyme that can be further be evaluated as antiTB drugs. / A tuberculose prevalece como uma das principais causas de morte no mundo ocasionadas por um único agente infeccioso, o Mycobacterium tuberculosis. A enzima Chiquimato Quinase (MtSK) codificada pelo gene aroK de M. tuberculosis, quinta enzima da via do chiquimato. catalisa a transferência de um grupo fosfato do ATP para o carbono 3 do grupo hidroxila do chiquimato, formando chiquimato-3-fosfato e ADP. A interrupção do gene aroK demonstrou que a enzima MfSK é essencial para a viabilidade do M. tuberculosis. Neste trabalho, apresentamos a purificação da enzima MtSK até a homogeneidade, análise por espectrometria de massa, sequenciamento de aminoácidos da porção N-Terminal, determinação do estado oligomérico da enzima em solução, cinética em estado estacionário, espectroscopia de fluorescência e calorimetria de titulação isotérmica. Os resultados encontrados sugerem que a reação catalisada pela enzima monomérica MtSK segue um mecanismo em equilíbrio-rápido aleatório para a adição dos substratos e uma liberação ordenada dos produtos, onde a liberação do chiquimato-3-fosfato é seguida pela liberação do ADP, resultando na enzima na sua forma livre. Os resultados de calorimetria demonstraram uma grande diferença de calor gerada na associação da enzima livre aos seus ligantes, revelando assinaturas termodinãmicas de interações não-covalentes para cada processo de ligação. Estes resultados ajudaram a compreender melhor o modo de ação da enzima MtSK e podem subsequentemente serem úteis para guiar o desenho racional de inibidores relacionados a esta enzima e que possam ser avaliados posteriormente como drogas anti-TB.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:05:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000439097-Texto+Completo-0.pdf: 7980733 bytes, checksum: af8f6a7fa6a599651957ad5f12054783 (MD5) Previous issue date: 2012 / Tuberculosis continues to be one of the deadliest diseases in the world. The emergence of drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis, the unbearable side effects of the available drugs and the frequent patient non-compliance in completing the therapy have increased the need for development of new effective agents. We have previously demonstrated a potent in vitro inhibitory activity for two pentacyano(isoniazid)ferrate(II) compounds, namely IQG-607 and IQG-639 against the M. tuberculosis enoyl-ACP reductase enzyme. Importantly, IQG- 607 and IQG-639 were active against cultures of M. tuberculosis H37Rv and two isoniazid-resistant clinical isolates in vitro. In the present study, the activity of these compounds was evaluated by using an in vivo murine model of tuberculosis. Swiss mice were infected with M. tuberculosis H37Rv strain, and IQG-607 and IQG-639 (250 mg/kg) were administered during 28 or 56 days. As well, a dose-response study was performed with IQG-607 (at 5, 10, 25, 50, 100, 200 and 250 mg/kg). The activity of test compounds was compared with that of the positive control drug isoniazid at 25 mg/kg. After 28 or 56 days of treatment, either IQG-607 or isoniazid significantly reduced M. tuberculosis-induced splenomegaly, and also significantly diminished the colony-forming units in both spleens and lungs. IQG-607 or isoniazid ameliorated the lung macroscopic aspect, reducing the lung lesions to a similar extent. However, IQG-639 was not capable of significantly modifying any evaluated parameter. IQG-607 did not display a classical dose-dependent profile in our murine model of tuberculosis, and 10 mg/kg was the lowest dose able to show significant activity, which was similar to the inhibition observed for higher doses. In addition, experiments using early and late controls of infection revealed a bactericidal activity for IQG-607 in our model. The promising activity of IQG-607 in M. tuberculosis-infected mice suggests that this compound might represent a good candidate for clinical development as a new antimycobacterial agent. / A tuberculose é uma das principais causas de morte no mundo. O surgimento e disseminação de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistentes a fármacos, os efeitos indesejáveis dos fármacos atualmente disponíveis e a falta de adesão dos pacientes ao tratamento têm aumentado a necessidade do desenvolvimento de novos agentes anti-tuberculose. Estudos prévios revelaram uma potente atividade inibitória in vitro de dois compostos pentaciano(isoniazida)ferrato(II), denominados IQG-607 e IQG- 639, frente a enzima enoil-ACP redutase de M. tuberculosis. Ainda, o IQG- 607 e o IQG-639 foram ativos quando testados em culturas de M. tuberculosis H37Rv e sobre dois isolados clínicos resistentes à isoniazida in vitro. Neste trabalho, a atividade destes dois compostos foi avaliada in vivo, utilizando um modelo murino de infecção por M. tuberculosis. Camundongos suíços foram infectados com a cepa de M. tuberculosis H37Rv e o IQG-607 ou o IQG-639 (250 mg/kg) foram administrados aos animais durante 28 ou 56 dias. Adicionalmente, um estudo de dose-resposta foi realizado com o composto IQG-607, empregando as doses de 5, 10, 25, 50, 100, 200 e 250 mg/kg. As atividades dos compostos-teste foram comparadas à atividade da isoniazida (25 mg/kg), o controle positivo do tratamento. Após 28 ou 56 dias de tratamento, tanto o IQG-607 quanto a isoniazida reduziram significativamente a esplenomegalia induzida pela infecção e, também, diminuíram as unidades formadoras de colônia, tanto nos pulmões quanto nos baços dos animais tratados. O IQG-607 e a isoniazida melhoraram o aspecto macroscópico dos pulmões, reduzindo as lesões pulmonares de maneira semelhante. Por sua vez, o IQG-639 não foi capaz de modificar significativamente nenhum parâmetro avaliado neste estudo. O IQG-607 não apresentou um perfil clássico de dose dependência, sendo observada atividade inibitória significativa similar, entre as doses de 10 mg/kg e 250 mg/kg. Além disto, um experimento utilizando um “controle pré-tratamento” demonstrou que o IQG-607 possui atividade bactericida no nosso modelo. A atividade satisfatória do IQG-607 em camundongos infectados com M. tuberculosis sugere que este composto pode ser um candidato promissor no desenvolvimento clínico de um novo agente antimicobacteriano.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431159-Texto+Completo-0.pdf: 8354772 bytes, checksum: 8abf5160038abef327a3d35aa522175e (MD5) Previous issue date: 2011 / Tuberculosis is a chronic infectious disease mainly caused by Mycobacterium tuberculosis that requires urgent new efforts towards its treatment and cure face the emergence of drug-resistant strains, its world spreading, the increasing number of infected patients among immune compromised populations, and the large number of latent infected individuals that are reservoir to the disease. Nucleotides metabolism pathways provide promising molecular targets for the development of novel drugs against active tuberculosis and might also target its latent forms. The orotate phosphoribosyltransferase (OPRT) enzyme of the de novo pyrimidine synthesis pathway catalyzes the reversible phosphoribosyl transfer from 5'-phospho-α-D-ribose 1'-diphosphate (PRPP) to orotic acid (OA), forming orotidine 5’-monophosphate (OMP), precursor of remaining pyrimidine nucleotides. This work describes cloning, amplification and characterization of M. tuberculosis H37Rv pyrE gene as encoding a functional OPRT, its apparent and true kinetic constants for forward and reverse reactions, product inhibition profile, and kinetic mechanism assignment as Mono-Iso Ordered Bi Bi, not previously described for an enzyme member of type I phosphoribosyltransferase family. Thermodynamic constants and discrimination profile allowed natural enzyme’s substrates binding patterns identification. Characterization of the reaction catalyzed by mycobacterial OPRT is essential to structure-based drug development, aiming to advance towards tuberculosis control. Resulting data from enzyme’s characterization were the starting point for OPRT specific inhibitors planning, selection and testing.A starting compound was identified as promising lead molecule, with values in nanomolar range, and was further submitted to several chemical replacement experiments, leading to a derived molecule with lower inhibitory constants and improved thermodynamic discrimination profile. Both compounds identified were characterized as competitive and uncompetitive inhibitors towards OPRT substrates OA and PRPP, respectively. Advantage of M. tuberculosis unique kinetic mechanism among homologues OPRTs was taken in order to plan a specific molecule that might trap the enzyme in a noncatalytic ternary complex E ∙ PRPP ∙ I, both inhibiting pyrimidine synthesis and sequestering PRPP from cellular pool, thereby affecting other metabolic pathways. M. tuberculosis OPRT characterization and results on primary inhibitors identification are crucial step towards a potential novel drug development for tuberculosis treatment and prophylaxis. Results from this work are believed to enhance the understanding of mycobacterial nucleotide metabolism and provide pertinent data to advance towards specific molecular targets inhibitors development, aiming tuberculosis control. / A tuberculose é uma doença infecciosa crônica, causada principalmente pelo Mycobacterium tuberculosis, e requer novas iniciativas urgentes para o seu tratamento e cura em decorrência do surgimento de cepas resistentes a drogas, sua abrangência global, e o significativo aumento de pessoas infectadas entre pacientes imunodeprimidos; além do grande número de pessoas infectadas com a forma latente da tuberculose, que atuam como reservatório da doença. As enzimas que constituem as vias de metabolismo de nucleotídeos são alvos promissores para o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da tuberculose, tanto na sua forma ativa quanto latente. A enzima orotato fosforibosiltransferase (OPRT), pertencente à via de síntese de novo de nucleotídeos de pirimidina, catalisa a transferência reversível do grupamento fosforibosil da molécula de 5’-fosfo-α-Dribose 1’-difosfato (PRPP) para o ácido orótico (OA), formando orotidina 5’- monofosfato (OMP), molécula precursora dos demais nucleotídeo de pirimidina. Este trabalho descreve a clonagem, amplificação e caracterização do produto do gene pyrE de M. tuberculosis H37Rv como uma enzima OPRT funcional; a determinação de suas constantes cinéticas aparentes e verdadeiras para as reações direta e inversa; ensaio de inibição pelos produtos; e a determinação do mecanismo cinético da reação como sendo Mono-Iso Ordenado Bi Bi, mecanismo que até então não havia sido descrito para uma enzima pertencente à família das fosforibosiltransferases do tipo I. As constantes termodinâmicas e o perfil de discriminação termodinâmica permitiram a identificação dos modos de interação dos substratos naturais da enzima com seu sítio de ligação.A caracterização da reação catalisada pela enzima OPRT micobacteriana é uma etapa essencial para o desenvolvimento de novas drogas de ação específica que permitam o melhor controle da tuberculose. Os dados resultantes da caracterização da enzima foram utilizados como ponto de partida para o planejamento, seleção e teste de inibidores seletivos contra a OPRT de M. tuberculosis. Um composto inicial, com valores de na faixa de concentração de nanomolar, foi identificado como potencial composto líder, sendo submetido a diferentes protocolos de derivatizaçao química, permitindo a obtenção de uma molécula derivada com valores de constantes inibitórias e perfil de discriminação termodinâmica aprimorados. Estes dois compostos foram caracterizados como inibidores competitivos e incompetitivos em relação aos substratos naturais da OPRT, OA e PRPP, respectivamente; onde o conhecimento do singular mecanismo cinético de reação da enzima de M. tuberculosis foi utilizado para o planejamento de moléculas capazes de formar um complexo ternário não catalítico (E ∙ PRPP ∙ I), inibindo a síntese de nucleotídeos de pirimidina e sequestrando moléculas de PRPP do meio celular, afetando ainda, outros processos metabólicos essenciais. Os resultados deste trabalho colaboram ainda para uma melhor compreensão do metabolismo de nucleotídeos de micobactérias e fornecem informações relevantes para o avanço do desenvolvimento de inibidores de ação seletiva sobre alvos moleculares específicos para o tratamento e profilaxia da tuberculose.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431160-Texto+Completo-0.pdf: 3328131 bytes, checksum: 1424b077ac248005607b13af54a688e0 (MD5) Previous issue date: 2011 / The increasing incidence of resistant strains of Mycobacterium tuberculosis, combined with co-infection of the human immunodeficiency virus and the absence of new anti-tuberculosis therapy in recent years highlight the need for discovery of new therapeutic agents for the treatment of tuberculosis. Seeing from previous studies that shikimate pathway of Mycobacterium tuberculosis is essential for survival of the organism, the prediction of inhibitors for chorismate synthase, the seventh enzyme of this route, open up the possibility of development of new anti-mycobacterial chemotherapy. In this work, using computational techniques of molecular modeling, virtual screening, and molecular dynamics, was possible to elucidate the molecular interaction of chorismate synthase with its substrate and cofactor, and propose three potential inhibitors for this enzyme, contributing to early research on compounds with potential anti-tuberculosis. / O aumento da incidência de cepas resistentes de Mycobacterium tuberculosis, aliados a co-infecção com o vírus da imunodeficiência humana e a ausência de novas terapias anti-tuberculose nos últimos anos, evidenciam a necessidade da descoberta de novos agentes terapêuticos para o tratamento da tuberculose. Considerando, a partir estudos anteriores, que a via metabólica do ácido chiquímico do Mycobacterium tuberculosis é essencial para sobrevivência do organismo, a predição de inibidores para corismato sintase, sétima enzima desta rota, abre a possibilidade de desenvolvimento de novas quimioterapias anti-micobacterianas. Neste trabalho, através de técnicas computacionais de modelagem molecular, virtual screening e dinâmica molecular, foi possível elucidar aspectos moleculares importantes da interação da corismato sintase com seu substrato e cofator, bem como, propor três potenciais inibidores para esta enzima, contribuíndo como início de uma pesquisa sobre compostos com potencial farmacológico anti-tuberculose.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000411825-Texto+Completo-0.pdf: 1068093 bytes, checksum: 29a9720f1c8599bf5e5b990d17e4dcb6 (MD5) Previous issue date: 2009 / The two main species in the genus Angiostrongylus that cause human disease are A. cantonensis and A. costaricensis. These parasites have different tissue tropism, A. cantonesis is neurotropic and causes eosinophilic meningoencephalitis, A. costaricensis is located in the mesentery causing abdominal angiostrongyliasis. Immunological tests currently used for angiostrongyliasis diagnosis are limited by low especificity. Otherwise, specialized functional proteins, such as enzymes, may lead to more specific reactivity. The aim of the present work is to identify hemoglobinotytic activity in A. cantonensis. Digestive organs from the female worms were homogenized in lyses buffer. The protein extract (AcPE) was incubated whit bovine hemoglobin (BHh) at different pH range. Zymography assay was carried out by copolimerized SDS-PAGE with either 0. 4% BHb or 0. 1% gelatin. Hemoglobin degradation was well demonstrated at an extensive pH range, from 3. 0 to 7. 0. No degradation bands were detected by zymography either with gelatin or hemoglobin as substrate. These limited data from zymography and those from pH titration may suggest that AcPE contains not a single component but a low abundance enzyme complex. The identification, characterization and clonning of molecules with hemoglobinolytic activity stays as a prioritary aim. / Angiostrongylus costaricensis e A. cantonensis são as principais espécies patogênicas para o homem no gênero Angiostrongylus. Esses parasitos tem tropismo tecidual diferentes, A. cantonensis é um parasito neurotrópico que causa a angiostrongilíase meningoencefálica e A. costaricensis localiza-se no mesentério sendo o agente etiológico da angiostrongilíase abdominal. Os testes imunológicos utilizados ultimamente para o diagnóstico das Angiostrongilíases são limitados pela baixa especificidade. Entretanto, proteínas funcionais especializadas, tais como enzimas, podem ser fontes de reatividade imunológica específica. O objetivo do presente trabalho é identificar atividade hemoglobinolítica nesses parasitos. Tubos digestivos de fêmeas foram homogeneizadas em tampão de lise. As proteínas do extrato (ExAca) foram incubadas com hemoglobina bovina (HbB) em diferentes pHs. Zimografia foi realizado em géis copolimerizados com 0,4% gelatina ou 0,1% BHb. Degradação da hemoglobina foi bem demonstrada em uma ampla faixa de pH, de 3,0 para 7,0. Não foram detectadas bandas de degradação na zimografia com gelatina ou hemoglobina como substrato. Os dados limitados da zimografia e os resultados de atividade hemoglobinolítica, com ou sem a titulação de pH, pode sugerir um complexo de proteases em pequena quantidade. Exploração de diversas estratégias de concentração do extrato protéico, sem perda da atividade da enzima, constitue a perspectiva desse trabalho, visando à identificação, caracterização e produção em larga escala de moléculas com atividade hemoglobinolítica.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000424566-Texto+Completo-0.pdf: 2168714 bytes, checksum: 2f865a2656e725b28201a2b328378a5c (MD5) Previous issue date: 2010 / Molecular docking is one of the main stages of Rational Drug Design (RDD). This is a method that provides a better orientation and conformation in which a molecule will bind to another to form a stable complex. Most docking algorithms consider flexible ligands, due to their usually small size. On the other hand, because the receptor is generally a molecule consisting of a larger number of atoms, it is treated as rigid. However, protein molecules are naturally flexible, and to consider such flexibility throughout the docking process is still not an easy task. The motivation for developing this work came from the need to perform molecular docking simulations in a more realistic manner, considering the dynamics and plasticity of a receptor molecule. Among the various ways to consider the receptor flexibility, our approach was to use a molecular dynamics simulation (MD) to generate the different conformations of the receptor. In this study we have investigated the effect of the explicit flexibility of the InhA enzyme of Mycobacterium tuberculosis by performing molecular docking simulations in each of the different conformations of the enzyme (wild-type, and I16T and I21V mutants), produced by MD, with the inhibitors ethionamide (ETH), triclosan (TCL) and isoniazid-pentacyanoferrate II (PIF).With the flexible model of the receptor, the experiments produced a series of snapshots of InhA inhibitors used in this study, showing different modes of ligand binding, which could not be evaluated using a single conformation of the crystal structure (PDB ID: 1ENY). Our analysis showed that for the InhA-ETH complex, only 5 residues interacted with the ligand in the crystal structure, whereas 80 residues along the trajectory made contacts with the ETH in the flexible model. Similarly, for the InhA-TCL complex only 2 residues of the crystal structure interacted with the ligand, while in the flexible receptor model, we found 46 residues interacting with the TCL. Finally, for the complex InhA-PIF, we found that 2 residues of the receptor interacted with the ligand in the crystal structure, and on the other hand, 35 residues interacted with PIF in the flexible model. This suggests that the flexible receptor model can accommodate a more diverse set of conformations of the ligand. When considering the plasticity of the receptor to perform a docking simulation, it means that the amino acid residues, loops and turns of the receptor can move slightly in different directions, allowing the ligand to explore spaces in the binding site that would have not been possible before. We believe that this work is helping to build knowlege of the importance of receptor flexibility in molecular docking process, and paves the way for further investigation. / A docagem molecular é uma das principais etapas do processo de Rational Drug Design (RDD). Este é um método que prevê a melhor orientação e conformação na qual uma molécula se ligará à outra, de modo a formar um complexo estável. Os algoritmos de docagem atuais consideram o ligante flexível, devido ao seu tamanho geralmente pequeno. Já o receptor, por ser uma molécula composta por um número maior de átomos, é tratado como rígido. Porém, proteínas são moléculas naturalmente flexíveis, e considerar esta flexibilidade durante um processo de docagem ainda não é uma tarefa fácil. A motivação para desenvolver este trabalho surgiu da necessidade de realizar simulações de docagem molecular mais realísticas, que considerem a dinâmica e a plasticidade de uma molécula receptora. Dentre as diversas formas de considerar a flexibilidade do receptor, usamos uma simulação de dinâmica molecular (DM) para gerar as diferentes conformações do receptor. Investigamos o efeito da flexibilidade explícita da enzima InhA de Mycobacterium tuberculosis através da realização de simulações de docagem molecular em cada uma das diferentes conformações da mesma (tipo selvagem e mutantes I16T e I21V) obtidas por DM, com os inibidores etionamida (ETH), triclosan (TCL) e isoniazidapentacianoferrato II (PIF). Com o modelo flexível do receptor, os experimentos produziram um conjunto de snapshots dos inibidores da InhA utilizados neste estudo, mostrando diferentes modos de ligação do ligante, que não poderiam ser avaliados com base em uma única conformação da estrutura cristalina (PDB ID: 1ENY). Nossa análise revelou que para o complexo InhA-ETH, apenas 5 resíduos interagiram com o ligante, na estrutura cristalina, enquanto que 80 resíduos ao longo da trajetória fizeram contatos com a ETH no modelo flexível. Para o complexo InhATCL apenas 2 resíduos da estrutura cristalina interagem com o ligante, e no modelo de receptor flexível, encontramos 46 resíduos interagindo com o TCL. Finalmente, para o complexo InhAPIF, verificamos que 2 resíduos do receptor interagiram com o ligante na estrutura cristalina, enquanto que para o modelo flexível encontramos 35 resíduos interagindo com PIF. Isto sugere que o modelo de receptor flexível pode acomodar um conjunto mais diversificado de conformações do ligante. Considerar a plasticidade do receptor ao realizarmos uma simulação de docagem significa que os resíduos de aminoácidos, alças e voltas do receptor, podem mover-se ligeiramente em diferentes direções permitindo que o ligante possa então explorar espaços no sítio de ligação que antes não seria possível. Acreditamos que este trabalho está ajudando a construir o conhecimento sobre a importância da flexibilidade do receptor no processo de docagem molecular, e possibilita uma investigação mais aprofundada no futuro.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:33Z (GMT). No. of bitstreams: 3 000399964-Texto+Completo+Parte+A-0.pdf: 18391919 bytes, checksum: af1c2f20c95ef9a171c3d3fc299fe1e4 (MD5) 000399964-Texto+Completo+Parte+B-1.pdf: 11500816 bytes, checksum: 2d0b16c2a821b4adbb77c7b4d4f28602 (MD5) 000399964-Texto+Completo+Parte+C-2.pdf: 17810555 bytes, checksum: f216fc25091f70f4980a1f7a25ffde6b (MD5) Previous issue date: 2007 / Tuberculosis (TB) remains the leading cause of mortality due to a single bacterial pathogen, Mycobacterium tuberculosis. The reemergence of tuberculosis as a potential public health threat, the high susceptibility of human immunodeficiency virus-infected persons to the disease, the proliferation of multi-drug-resistant strains (MDR-TB) and, more recently, of extensively drug resistant isolates (XDR-TB) have created a need for the development of new antimycobacterial agents. There is an ongoing need for innovation in proposing new structural scaffolds for chemotherapeutic agent development to control TB. Mycolic acids, the hallmark of mycobacteria, are high-molecular-weight α-alkyl, β-hidroxy fatty acids, which appear mostly as bound esters in the mycobacterial envelope. Isoniazid (INH) is the most prescribed chemotherapeutic agent for active TB and prophylaxis and requires activation by the catalase-peroxidase activity of KatG. The product of the M. tuberculosis inhA structural gene (InhA) has been shown to be the primary target for INH. InhA was identified as an NADH-dependent enoyl-ACP reductase specific for long chain enoyl thioesters. InhA is a member of the mycobacterial Type II fatty acid biosynthesis system, which elongates acyl fatty acid precursors of mycolic acids. The main focus of our contribution is on data describing the mode of action of an inorganic complex, pentacyano (isoniazid) ferrateII that requires no KatG-activation and is an in vitro slow-onset inhibitor of WT and INH-resistant M. tuberculosis enoyl reductases. This inorganic complex represents a new class of lead compounds to the development of anti-tubercular agents aiming the inhibition of a validated target. We also describe the recent developments in the search for inorganic complexes with anti-tubercular activity. / A tuberculose (TB) continua sendo a principal causa de mortalidade devido a um único patógeno bacteriano, Mycobacterium tuberculosis. A reemergência da tuberculose como uma ameaça potencial à saúde pública, a alta suscetibilidade de pessoas infectadas com o vírus da imunodeficiência humana à doença, a proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas (MDR-TB) e, mais recentemente, de cepas extensivamente resistentes às drogas (XDR-TB) criaram a necessidade do desenvolvimento de novos agentes antimicobacterianos. Existe uma necessidade contínua de inovação em propor novas estruturas para o desenvolvimento de agentes quimioterápicos para o controle da TB. Os ácidos micólicos, característicos de micobactérias, são ácidos graxos α-alquil, β-hidróxi de alto peso molecular que aparecem, principalmente, como ésteres ligados ao envelope micobacteriano. A isoniazida (INH) é o agente quimioterápico mais prescrito para a TB ativa e para a profilaxia e necessita de ativação pela atividade de catalase-peroxidase da KatG. O produto do gene estrutural M. tuberculosis inhA (InhA) demonstrou ser o alvo primário da INH. A InhA foi identificada como uma enoil-ACP redutase dependente de NADH, possuindo especificidade por enoil tioésteres de cadeia longa. InhA é um membro do sistema de biossíntese de ácidos graxos micobacterianos do tipo II que elonga ácidos graxos acilados, precursores dos ácidos micólicos. O foco principal de nossa contribuição são dados descrevendo o modo de ação de um complexo inorgânico, pentaciano (isoniazida) ferrato II que não necessita de ativação pela KatG. Ademais é um inibidor do tipo ligação lenta da enoil redutase WT e resistente à INH de M. tuberculosis. Este complexo inorgânico representa uma nova classe de compostos líderes para o desenvolvimento de agentes antituberculose objetivando a inibição de um alvo validado.Nós também descrevemos os avanços recentes na busca por complexos inorgânicos com atividade antituberculose.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000394311-Texto+Completo-0.pdf: 1832578 bytes, checksum: 91146fdf9a4b7bd5db10cdc2e07c965f (MD5) Previous issue date: 2007 / Striae distensae represent a cosmetically undesirable and very common problem present in most healthy women. They are frequently seen over the thighs, buttocks and breasts as a consequence of progressive and sustained stretching of the skin. Striae distensae are classified as striae rubra in the earliest stage and striae alba in the latest stage. The treatment of striae distensae has included many therapeutic modalities. However, successful treatment has been disappointing for striae alba. The present study describes the use of microamperage stimulation as an alternative for striae alba improvement. This method induces a local inflammatory process, which stimulates cell proliferation and collagen synthesis. Local inflammation may be accompanied by systemic response. There are significant relationships among inflammation, oxidative stress and serum level of lipids. Therefore, the aim of this study was to investigate the systemic inflammatory effects of microamperage stimulation on striae alba treatment and examine whether this method induced oxidative stress or changes in lipid profile. Thirty-two women between ages of 20 to 30, with striae alba present on the buttocks were selected for the study. All subjects received treatment once a week over a period of ten weeks. Plasma concentrations of CRP, TNF-a, NO, TBARS, oxidized LDL-C, HDL-C, total cholesterol, CAT and uric acid were analyzed. Biochemical analysis of blood samples showed that microamperage stimulation induced no systemic inflammatory process, substantial decrease of oxidative stress and improvement of lipid profile. Microamperage stimulation seems to be a promising method of treatment for striae alba. / As estrias representam um problema muito comum e desagradável na maioria das mulheres saudáveis. Essa lesão dérmica é freqüentemente encontrada em regiões que sofrem estiramento excessivo e progressivo da pele como coxas, glúteos e seios. As estrias são classificadas inicialmente como estrias rubras e posteriormente como estrias albas. O tratamento das estrias inclui muitas modalidades, porém os resultados têm sido frustrantes para estrias albas. O presente estudo descreve o uso da galvanopuntura como uma alternativa para o tratamento da estria alba. Este método provoca uma inflamação local, que estimula a proliferação celular e a síntese de colágeno. Inflamações locais podem ser acompanhadas de uma resposta sistêmica. Sabe-se que há uma relação significativa entre a inflamação, estresse oxidativo e o perfil lipídico. Por isso, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos inflamatórios sistêmicos da galvanopuntura no tratamento da estria alba; e examinar se o método aumenta o estresse oxidativo ou altera o perfil lipídico. Trinta e duas mulheres, entre 20 e 30 anos, com estrias albas em glúteos foram selecionadas para o estudo. Todas as pacientes receberam o tratamento uma vez por semana durante dez semanas. Foram analisadas as concentrações plasmáticas de PCR, TNF-α, NO, TBARS, LDL-C oxidada, HDL-C, colesterol total, CAT e ácido úrico. As análises bioquímicas das amostras de sangue mostraram que a galvanopuntura não induz nenhum processo inflamatório sistêmico, diminui consideravelmente o estresse oxidativo e melhora o perfil lipídico. A galvanopuntura parece ser uma técnica promissora no tratamento de estrias albas.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000407067-Texto+Completo-0.pdf: 3459051 bytes, checksum: d1b647d03a940c703ad0b5b801bad1d2 (MD5) Previous issue date: 2008 / Tuberculosis (TB), caused by Mycobacterium tuberculosis, remains the leading cause of mortality due to a bacterial pathogen. The proliferation rate of multidrugand extensively drug-resistant strains of M. tuberculosis is increasing worldwide. There is a continuous requirement for studies on mycobacterial metabolism to identify promising targets for the development of new anti-TB agents. In bacteria, pyrimidine nucleotide interconversion pathways are important in a number of essential processes, including DNA, RNA, and phospholipid biosynthesis. The gene (cmk, Rv1712) encoding cytidine monophosphate kinase (CMK) enzyme has been proposed by sequence homology to be present in the genome of M. tuberculosis. Here we describe PCR amplification and cloning of cmk gene, expression and purification of its product to homogeneity, and N-terminal sequencing and mass spectrometry analyses of the recombinant protein. Results of steady-state kinetics showed that M. tuberculosis cmk gene encodes a monomeric CMK that phosphorylates preferentially CMP and dCMP, and that UMP is a poor substrate. These results reinforce the presence of a nucleoside monosphosphate kinase specific for UMP in M. tuberculosis. Double-reciprocal plots of steady-state kinetic results were consistent with ternary complex formation and sequential mechanism for M. tuberculosis CMK reaction. A plausible role for CMK in M. tuberculosis is discussed. / A tuberculose (TB), doença infecto contagiosa, causada pelo Mycobacterium tuberculosis, é a maior causa de morte por agente infeccioso do mundo. O aumento da incidência de cepas multi-resistentes (MDR-TB) e extensivamente resistentes (XDR-TB) tem contribuído para o aumento do número de mortes. Por este motivo, há a necessidade de estudos para identificarmos, no metabolismo da micobactéria, possíveis alvos para o desenvolvimento de drogas capazes de combater estas novas cepas. Em bactérias, as rotas de interconversão de nucleotídeos pirimidínicos são importantes em inúmeros processos essenciais, incluindo a biosíntese de DNA, RNA e fosfolipídios. O gene (cmk, Rv1712) que codifica a enzima citidina monofosfato quinase (CMK) foi descrito, por homologia de seqüência, no genoma de M. tuberculosis. Neste trabalho o gene cmk foi amplificado por PCR e clonado em vetor de expressão. A proteína CMK foi expressa em grande escala e purificada. O produto homogêneo desta purificação sofreu seqüenciamento N-terminal e espectrometria de massa. Os resultados da cinética em estado estacionário mostraram que o gene cmk de M. tuberculosis codifica a proteína monomérica CMK, que fosforila preferencialmente CMP e dCMP, e que UMP é um substrato pobre. Estes resultados reforçam a presença de uma nucleotídeo monofosfato quinase específica para UMP em M. tuberculosis. Os parâmetros cinéticos fornecidos pelo ensaio e análise dos gráficos de duplo-recíproco mostraram que a enzima forma um complexo ternário e que seu mecanismo é seqüencial. Um possível papel para a enzima CMK é discutido.