Els anells de cohesina, formats per les proteïnes Smc1, Smc3, Scc1 i Scc3, s’uneixen topològicament al DNA, mantenint les parelles de cromàtides germanes unides des de la duplicació del DNA fins al començament de l’anafase. Aquesta funció, coneguda com a Cohesió entre Cromàtides Germanes, permet la biorientació dels cromosomes en el fus mitòtic i, posteriorment, la seva correcta segregació. Es tracta per tant d’una funció fonamental per a la vida. La cohesió entre cromàtides germanes també té altres funcions, com ara afavorir la reparació del dany en el DNA a través de recombinació homòloga. És per aquests motius que la cohesina està sotmesa a diferents nivells de regulació al llarg del cicle cel·lular, a través de diversos factors reguladors i modificacions post-traduccionals. Per exemple, l’acetilació de la subunitat Smc3 és necessària per a que els anells es mantinguin establement units a cromatina. Alteracions en la molècula de cohesina o en la seva regulació poden provocar el desenvolupament de patologies i contribuir en la progressió tumoral. En aquest estudi, descrivim la sumoilació de la cohesina com una nova modificació post-traduccional necessària per la cohesió en Saccharomyces cerevisiae. La sumoilació de la cohesina depèn, en part, de la SUMO lligasa Nse2 i d’un complex Smc5/6 plenament funcional. Totes les subunitats del complex cohesina es sumoilen in vivo durant la replicació del DNA, després de la formació dels anells de cohesina i del seu reclutament a cromatina, en un procés depenent de la unió d’ATP a les subunitats SMC, i independent de l’acetilació de Smc3. Per tal d’alterar l’estat de sumoilació dels anells de cohesina i identificar la rellevància funcional d’aquesta modificació, hem dissenyat un nou sistema experimental que permet eliminar SUMO de totes les proteïnes del complex, basat en la fusió del domini SUMO peptidasa de Ulp1 (UD) a la proteïna Scc1. Les fusions Scc1-UD s’incorporen als anells de cohesina, es carreguen en la cromatina i es localitzen adequadament sobre els cromosomes de llevat. Tanmateix, la desumoilació dels anells de cohesina bloqueja la cohesió entre les cromàtides germanes, aturant el cicle cel·lular en G2/M i provocant la pèrdua de viabilitat de les cèl·lules. Aquests efectes són deguts a l’activitat del domini SUMO peptidasa, i no a problemes estructurals en la proteïna de fusió Scc1-UD, ja que la mutació puntual del centre catalític de UD restaura la cohesió i la viabilitat cel·lular. Experiments en paral·lel suggereixen que la sumoilació de la cohesina podria tenir funcions similars en cèl·lules humanes. Sorprenentment, els anells de cohesina continuen acetilats en absència de sumoilació. Donat que els models actuals proposen que els anells es tanquen de forma estable en ser acetilats, és probable que en absència de sumoilació la cohesina encercli una sola cromàtida. Per tant, proposem que la sumoilació de la cohesina seria necessària durant la replicació del DNA per atrapar les dues cromàtides germanes de forma estable en l’interior de l’anell. / Los anillos de cohesina, formados por las proteínas Smc1, SMC3, Scc1 y Scc3, se unen topológicamente al DNA, manteniendo las parejas de cromátidas hermanas unidas desde la duplicación del DNA hasta el comienzo de la anafase. Esta función, conocida como Cohesión entre Cromátidas Hermanas, permite la biorientación de los cromosomas en el huso mitótico y, posteriormente, su correcta segregación. Se trata por lo tanto de una función fundamental para la vida. La cohesión entre cromátidas hermanas también tiene otras funciones, como favorecer la reparación del daño en el DNA a través de recombinación homóloga. Es por estos motivos que la cohesina está sometida a varios niveles de regulación a lo largo del ciclo celular, a través de diferentes factores reguladores y modificaciones post-traduccionales. Por ejemplo, la acetilación de la subunidad Smc3 es necesaria para que los anillos se mantengan establemente unidos a cromatina. Alteraciones en la molécula de cohesina y/o en su regulación pueden provocar el desarrollo de patologías y contribuir a la progresión tumoral. En este estudio, describimos la sumoilación de la cohesina como una nueva modificación post-traduccional necesaria para la cohesión en Saccharomyces cerevisiae. La sumoilación de la cohesina depende, en parte, de la SUMO ligasa Nse2 y de un complejo Smc5/6 plenamente funcional. Todas las subunidades del complejo cohesina se sumoilan in vivo durante la replicación del ADN, después de la formación de los anillos de cohesina y de su reclutamiento en cromatina, en un proceso dependiente de la unión de ATP a las subunidades SMC, e independiente de la acetilación de Smc3. Con el fin de alterar el estado de sumoilación de los anillos de cohesina e identificar la relevancia funcional de esta modificación, hemos diseñado una nueva aproximación experimental que permite eliminar SUMO de todas las proteínas del complejo, basado en la fusión del dominio SUMO peptidasa de Ulp1 (UD) a la proteína Scc1. Las fusiones Scc1-UD se incorporan a los anillos de cohesina, se cargan en la cromatina y se localizan adecuadamente sobre los cromosomas de levadura. Sin embargo, la desumoilación de los anillos de cohesina impide la cohesión entre las cromátidas hermanas, deteniendo el ciclo celular en G2/M y provocando la pérdida de viabilidad de las células. Estos efectos son debidos a la actividad del dominio SUMO peptidasa, y no a problemas estructurales en la proteína de fusión Scc1-UD, ya que la mutación puntual del centro catalítico de UD restaura la cohesión y la viabilidad celular. Experimentos en paralelo sugieren que la sumoilació de la cohesina podría tener funciones similares en células humanas. Sorprendentemente, los anillos de cohesina continúan acetilados en ausencia de sumoilación. Dado que los modelos actuales proponen que los anillos se cierran establemente al ser acetilados, es probable que en ausencia de sumoilación la cohesina se cierre en torno a una sola cromátida. En consecuencia, proponemos que la sumoilación de la cohesina sería necesaria durante la replicación del ADN para atrapar las dos cromátidas hermanas de forma estable en el interior del anillo. / Cohesin rings composed of the Smc1, Smc3, Scc1 and Scc3 proteins topologically bind to DNA, keeping pairs of sister chromatids together from the time of DNA replication until the onset of anaphase. This feature, known as Sister Chromatid Cohesion (SCC), allows the biorientation of chromosomes on the mitotic spindle, and their subsequent segregation. Sister Chromatid Cohesion also has other roles, such as enabling repair of DNA damage through homologous recombination. Thus, it is not surprising that cohesin is subjected to multiple levels of control during the cell cycle by different regulatory factors and post-translational modifications. For example, acetylation of the Smc3 subunit is required to prevent the opening of cohesin rings, keeping them stably bound to chromatin. Alterations in the cohesin molecule itself and/or its regulation may lead to the development of serious pathologies and can contribute to tumor progression. In this study, we describe the sumoylation of cohesin as a new post-translational modification required for Sister Chromatid Cohesion in Saccharomyces cerevisiae. Sumoylation of cohesin is partially dependent on the Nse2 SUMO ligase and the Smc5/6 complex. All subunits of the cohesin complex are sumoylated in vivo during DNA replication, after the formation of cohesin rings and their recruitment onto chromatin, in a process dependent on the binding of ATP to the SMC subunits, and independent of Smc3 acetylation. In order to alter the sumoylation status of cohesin rings and to identify its functional relevance, we designed a new approach to remove SUMO from all cohesin subunits, based on the fusion of the SUMO peptidase domain of Ulp1 (UD) to the Scc1 protein. Scc1-UD fusions are properly incorporated into cohesin rings, loaded onto chromatin and located along yeast chromosomes. However, desumoylation of cohesin rings prevents Sister Chromatid Cohesion, arresting cells in G2/M and causing the loss of cell viability. These effects are due to the activity of the SUMO peptidase domain rather than structural problems in the Scc1-UD fusion, since mutation of the catalytic site in the UD restores cohesion and cell viability. Parallel experiments suggest that sumoylation of cohesin might have similar functions in human cells. Surprisingly, cohesin rings remain acetylated in the absence of sumoylation. Current models propose that cohesin rings are stably locked once they are acetylated. Therefore, it is likely that in the absence of sumoylation cohesin encircles a single chromatid. Consequently, we propose that sumoylation of cohesin is required during DNA replication to entrap the two sister chromatids inside its ring structure.

El receptor del factor de creixement nerviós TrkA contribueix a la supervivència i a ladiferenciació de diferents poblacions neuronals. Tot i que les principals vies de senyalització imolècules adaptadores activades després de la unió del lligant al receptor estan benestudiades, recentment un creixent nombre de proteïnes que interaccionen amb TrkA hanestat descrites com a nous mecanismes de regulació del receptor. La trans-autofosforilaciódel receptor, a més d'activar les cascades de senyalització rellevants per la diferenciació isupervivència cel·lular, com són les vies de les MAPKs i PI3K-Akt, també indueix un augmenttransitori de la concentració de calci citoplasmàtic. En conseqüència la proteïna sensora deCa2+ calmodulina (CaM) també participa en la senyalització per TrkA. El nostre grup estavainteressat en discernir la relació entre CaM i TrkA, i vàrem descobrir que CaM interaccionadirectament i de manera Ca2+-dependent amb l'extrem carboxi-terminal de TrkA. A partird'aquests resultats ens vàrem plantejar de buscar la posició exacta del domini d'unió acalmodulina en la seqüencia de TrkA. Donat que els programes de predicció no van trobar unaseqüència candidata d'unió a CaM en el domini intracel·lular del TrkA, vàrem centrar-nos en elextrem COOH-terminal del receptor, un domini ric en aminoàcids hidrofòbics en posicionsconservades. Vàrem introduir mutacions en dos aminoàcids del domini candidat, Leu784 iVal790 substituint-los per Ala. Els assajos d'unió van mostrar que els mutants TrkA-L784A iTrkA-L784A-V790A no perdien la unió a CaM, per tant no formaven part del domini d'unió aCaM de TrkA. Tanmateix, vàrem demostrar que aquests aminoàcids hidrofòbics són importantsper a la unió i la regulació de la lligasa d'ubiquitina Nedd4-2. Vàrem observar una fortainteracció dels dos receptors mutants amb Nedd4-2, que es corroborava amb una augmentadaco-localització de les dues proteïnes detectada per immunofluorescència. Com a conseqüèncias'observà una intensa multimonoubiquitinització basal dels receptors mutants mitjançada perNedd4-2. Aquests resultats correlacionen amb un important descens en la quantitat dereceptor a causa d'un direccionament d'aquest cap als endosomes tardans/lisosomes. Totplegat resultava en un increment en la degradació dels receptors mutats. Malgrat la reduccióen la quantitat de receptors de membrana, els receptors TrkA mutats van ser capaçosd'activar vies de senyalització, i fins i tot eren més eficients en promoure l'extensió deneurites que els receptors TrkA normals. Els nostres resultats demostren que la composició del'extrem COOH-terminal de TrkA participa en la regulació de la unió i activitat de Nedd4-2.Així mateix, s'evidencia que la ubiquitinització de TrkA per Nedd4-2 promou el tràficendosomal de TrkA cap als endosomes tardans/lisosomes augmentant d'aquesta manera ladegradació del receptor. Per altra banda, s'observa que la multimonoubiquitinització de TrkAno interfereix en l'activació de les vies de senyalització, tanmateix potencia la senyalització delreceptor conduent a la diferenciació cel·lular. / El receptor del factor de crecimiento nervioso TrkA contribuye a la supervivencia ydiferenciación de varias poblaciones neuronales. A pesar del buen conocimiento de lasprincipales vías de señalización y las proteínas adaptadoras activadas después de la unión delligando al receptor, últimamente se ha descrito un número creciente de proteínas queinteraccionan con el receptor participando en su regulación. La trans-autofosforilación delreceptor, adicionalmente a la activación de vías de señalización relevantes para ladiferenciación y la supervivencia celular, como son las vías de las MAPKs y PI3K-Akt, tambiénconlleva un aumento transitorio del calcio citoplasmático. En consecuencia la proteína sensorade calcio calmodulina (CaM) también participa en la señalización por TrkA. Nuestro grupo teníainterés en estudiar la relación entre CaM y TrkA y descubrió que la CaM interacciona de formadirecta y calcio dependiente con el extremo COOH-terminal del receptor TrkA. A partir deestos resultados nos plantemaos buscar la posición exacta del sitio de unión a calmodulinadentro de la secuencia de TrkA. Puesto que los programas de predicción no encontraronninguna secuencia candidata de unión a calmodulina en el dominio intracelular de TrkA, noscentramos en el extremo COOH-terminal, dominio rico en ácidos hidrofóbicos en posicionesconservadas. Introducimos mutaciones puntuales en el sitio candidato de unión a CaMcambiando la L784 y la V790 por Ala. Los ensayos de unión a CaM realizados mostraron quelos mutantes TrkA-L784A y TrkAL784A-V790A no perdían la unión a CaM, por lo tanto noformaban parte del dominio de unión a CaM de TrkA. Sin embargo, hemos demostrado queestos aminoácidos son importantes para la unión y la regulación de la ligasa de ubiquitinaNedd4-2. . Observamos una mayor interacción de los dos mutantes del extremo COOHterminalcon Nedd4-2, resultado que era corroborado por una mayor colocalización de las dosproteínas detectada por immunofluorescencia. Como consecuencia observamos una intensamultimonoubiquitinización basal de los receptores mutados mediada por Nedd4-2. Estosresultados correlacionan con un importante descenso de la cantidad de receptor a causa deun direccionamiento de este hacia los endosomas tardíos/lisosomas. Todo ello resultaba en unincremento en la degradación de los receptors mutados. A pesar de la reducción en la cantidadde receptor en membrana, los mutantes de TrkA mostraron ser capaces de activar las vías deseñalización e incluso ser más eficientes promoviendo el crecimiento de neuritas comparandocon el receptor normal. Estos resultados demuestran que la composición del extremo COOHterminalde TrkA regula la unión y la actividad de la ligasa de ubiquitina Nedd4-2. Además, laubiquitinización de TrkA mediada por Nedd4-2 promueve el direccionamiento de los receptoresmutados hacia los endosomas tardíos/lysosomas dando lugar a una mayor degradación delreceptor. Por otro lado, se observa que la multimonoubiquitinización de TrkA no interfiere conla activación de las vías de señalización, sino más bien potencia la señalización del receptorque conduce a la diferenciación celular. / The nerve growth factor receptor TrkA contributes to the survival anddifferentiation of several neuronal populations. Although main signaling pathwaysand adaptor molecules activated after ligand binding to the receptor are well studied,recently a growing number of TrkA interacting proteins have been described as novelmechanisms of receptor regulation. Receptor trans-autophosphorylation, additionallyto activating signaling cascades relevant for cell differentiation and survival, such asMAPKs and PI3K-Akt, also induces a transient increase in intracellular calciumconcentration. Therefore, the Ca2+ sensor calmodulin (CaM) also participates in TrkAsignaling. Our group was interested in elucidating the relationship between CaM andTrkA, and discovered that CaM interacts directly with the C-terminal tail of TrkA in aCa2+ dependent manner. Consequently, we sought to find the exact position of thecalmodulin binding site on TrkA sequence. Since available prediction software wasunable to find a putative CaM binding site in TrkA intracellular domain, we focusedon the C-terminal tail, a domain rich in hydrophobic amino acids in conservedpositions. We introduced point mutations on Leu784 and Val790 by switching themto Ala, located on our predicted CaM binding site. However, TrkA-L784A and TrkAL784A/V790A mutants did not lose CaM binding, therefore they were not involved onCaM binding. Nonetheless, we demonstrated that these hydrophobic aminoacids areimportant for the binding and regulation of Nedd4-2 Ub ligase. We observed astronger interaction of both C-terminal mutant receptors with Nedd4-2, corroboratedwith a higher colocalization of both proteins by immunofluorescence. Consequently,we observed an enhanced basal multimonoubiquitination of mutant receptors byNedd4-2. These results correlated with a decrease in TrkA abundance due to a fasterlate endosome/lysosome targeting, leading to a higher degradation rate of mutantreceptors. Despite the reduction in the amount of membrane receptor caused by theC-terminal changes, TrkA mutants were able to activate signaling cascades and wereeven more efficient in promoting neurite outgrowth than the wild-type receptor. Ourresults demonstrate that the C-terminal tail conformation of TrkA regulates Nedd4-2binding and activity. Moreover, TrkA ubiquitination by Nedd4-2 promotes TrkAendosomal trafficking to late endosome/lysosome leading to receptor degradation. Inaddition, TrkA multimonoubiquitination does not interfere with the activation ofsignaling cascades, but rather potentiates receptor signaling leading todifferentiation.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-11T13:12:34Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1023168 bytes, checksum: 7610c4ff8f179f603533241473b5650d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-11T13:12:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1023168 bytes, checksum: 7610c4ff8f179f603533241473b5650d (MD5) Previous issue date: 2016-07-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O receptor LRR-RLK (Leucine-rich repeat receptor-like kinase), designado NIK1 (NSP-interacting kinases), está envolvido na resposta imunológica em plantas contra Germinivirus. NIK1 foi inicialmente descrito por interagir com a proteína viral NSP (nuclear shuttle protein), proteína que participa do transporte de DNA viral do núcleo para o citoplasma de células infectadas. Com alta similaridade estrutural a NIK1, BAK1 (Brassinosteroid Insensitive Associated Kinase1), também conhecida como SERK3 (Somatic Embryogenesis Receptor Kinase3), é um receptor LRR-RLK de membrana que desempenha um duplo papel em vias de sinalização, podendo atuar como um coreceptor de BRI1 na presença de BR ou mediar respostas de defesa contra patógenos. Na via de crescimento desencadeada por brassinosteróides (BRs), BAK1 interage com BRI1 (Brassinosteroid-insensitive1) na membrana plasmática e ativa a função de cinase desta proteína. Recentemente, através de dados de RNA-seq, foi demonstrado que inativação da função de NIK1 no nocaute nik1 (Salk_060808) induz a expressão de genes envolvidos na resposta a BRs e desenvolvimento, indicando uma possível comunicação cruzada entre a via de sinalização antiviral mediada por NIK1 e vias de sinalização de desenvolvimento. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo avaliar o papel de NIK1 na via de resposta a BRs. Arabidopissis thaliana, linhagem nik1 nocaute, foi transformada com as construções de DNA 35S:BAK-NIK1_GFP e 35S:NIK1-BAK1_GFP, sendo que a expressão dos transgenes e localização subcelular na membrana das proteínas quiméricas foram confirmadas por RT-PCR e microscopia confocal, respectivamente. Análises fenotípicas de plantas expressando as construções quiméricas BAK1-NIK1 e NIK1-BAK1 indicaram deficiência na via de desenvolvimento induzido por BR, uma vez que o fenótipo destas plantas transgênicas se assemelharam muito ao mutante bak1-4, deficiente na sinalização por BR. Além disso, a ativação da via de sinalização por BRs foi avaliada por meio de crescimento de hipocótilo e de análise da expressão de genes marcadores induzidos por brassinolídeo (BL). Em nik1, o tratamento com BL estimulou o crescimento do hipocótilo e induziu genes marcadores associados à sinalização por BR, embora em menor intensidade do que em Col-0, indicando funcionamento da via de desenvolvimento induzida por BR nesta linhagem nocaute. Expressão de ambas as proteínas quiméricas em nik1 mutante, que expressa os genes BAK1 e BRI1 normalmente, restaurou o fenótipo insensível a BL, típico do nocaute bak1-4. Claramente, a expressão dos genes quiméricos interferiu negativamente com a via de sinalização de BR, uma vez que nas linhagens transgênicas, BL não estimulou o alongamento do hipocótilo e tampouco a indução da expressão de genes marcadores associados à via de sinalização de BR. Estes resultados indicam que as proteínas quiméricas atuam como alelos mutantes transdominantes negativos na sinalização por BR. Esta hipótese foi fundamentada pela capacidade de NIK1 de interagir com BAK1, conforme previamente demonstrado, e com o domínio cinase de BRI1, demonstrado nesta investigação por meio de duplo híbrido em leveduras. Embora não se tenha observado uma ativação aumentada da resposta a BR no nocaute nik1, provavelmente devido a redundância funcional da subfamília NIK, os fenótipos resultantes da expressão das proteínas quiméricas, contendo ou o domínio LRR ou o domínio de cinase de NIK1, sugerem que NIK1 atue como um regulador negativo da sinalização por BR. / The LRR-RLK (Leucine-rich repeat receptor-like kinase) NIK1 (NSP-interacting kinase), is known to mediate immune response in plants against Germinivirus. NIK1 was initially described by interacting with the viral protein NSP (Nuclear shuttle protein), a protein that participates in viral DNA transport from the nucleus to the cytoplasm of infected cells. With high structural similarity with NIK1, BAK1 (Brassinosteroid Insensitive-Associated Kinase1), also known as SERK3 (Somatic embryogenesis receptor Kinase3), is a membrane LRR-RLK, which plays a dual role in signaling pathways and may act as a co-receptor of BRI1 in the presence of brassinosteroide (BR) or mediate defense responses against pathogens. In the BR- triggered growth pathway, BAK1 interacts with BRI1 (Brassinosteroid-Insensitive1) in the plasma membrane and activates the kinase function of this protein. Recently, RNA- seq data revealed that inactivation of NIK1 function in the nik1 mutant (Salk_060808), caused an up-regulation of genes involved in response to BRs and development, indicating a possible cross-talk between the NIK1-mediated antiviral signaling pathway and development signaling pathways. The goal of this investigation was to evaluate the role of NIK1 in the BR response pathway. Arabidopissis thaliana, nik1 line, was transformed with the DNA constructs 35S:BAK-NIK1_GFP and 35sNIK1-BAK1_GFP, and the expression of the transgenes and subcellular localization of the chimeric proteins were confirmed by RT-PCR and confocal microscopy, respectively. BAK1- NIK1- and NIK1-BAK1-expressing plants displayed a deficiency in the BR-induced growth pathway, as the phenotypes of these transgenic lines resemble the ones of the BR signaling deficient bak1-4 mutant. Furthermore, the activation of BR signaling was evaluated through brassinolide (BL)-induced hypocotyl growth and gene expression of BR signaling-associated marker genes. BL-induced stimulation of hypocotyl elongation and induction of marker genes were observed in nik1, although to a lesser extent than in Col-0, indicating a functional BR singling in this knockout line. Expression of both chimeric proteins in the nik1 mutant, which harbors BAK1 and BRI1 normal genes, mimicked the BL insensitive phenotype, typical of the bak1-4 knockout. Clearly, the expression of the chimeric genes impacted negatively the BR signaling, as in the transgenic lines, the BL treatment did not stimulated hypocotyl growth or the induction of BR signaling marker genes. These results indicate that the chimeric proteins function as transdominant negative mutant alleles in BR signaling. This hypothesis was substantiated by the capacity of NIK1 to interact with BAK1, as previously demonstrated, and with the BRI1 kinase domain, as demonstrated in the present investigation through a two-hybrid assay in yeast. Although nik1 did not display an enhancement of the BR-induced responses, most likely due to the functional redundancy of the NIK subfamily, the resulting phenotypes of the chimeric genes expression, harboring either the NIK1 LRR or kinase domain, implicate NIK1 as a negative regulator of BR signaling.

Fatty acid-binding protein 4 (FABP4) és una adipoquina secretada pel teixit adipós implicada en la regulació del metabolisme energètic i la inflamació. S'han detectat nivells elevats de FABP4 circulant en persones amb factors de risc cardiovascular i aterosclerosi, encara que no hi ha moltes dades sobre FABP4 i l'aterosclerosi en humans. Alguns estudis han demostrat que FABP4 té un efecte directe sobre els teixits perifèrics, concretament promovent la disfunció endotelial. La disfunció endotelial juga un paper clau en el desenvolupament de lesions ateroscleròtiques, així com la migració i proliferació de cèl·lules de múscul llis vascular. No obstant això, el mecanisme d'acció i funcions de FABP4 circulant són poc conegudes. La hipòtesi d'aquest treball és que FABP4 interacciona amb teixits perifèrics contribuint a la disfunció endotelial i remodelació vascular a partir de la interacció amb proteïnes de membrana plasmàtica, que actuarien com a elements d'ancoratge i/o receptors mitjançant rutes de senyalització intracel·lular, i/o internalització. Els nostres resultats indiquen que FABP4 exògena interactua específicament amb citoqueratina 1 (CK1) en les membranes cel·lulars endotelials i la seva inhibició farmacològica per BMS309403 disminueix lleugerament la formació d'aquests complexos. A més, FABP4 exògena travessa la membrana plasmàtica per entrar al citoplasma i nucli de cèl·lules endotelials (HUVECs). També hem demostrat que FABP4 exògena forma un complex amb CK1 en les cèl·lules del múscul llis vascular (HCASMCs) i que té un efecte directe induint la migració i proliferació de les HCASMCs a través de l'activació de la via de senyalització MAPK per la fosforilació de ERK1/2 i activació dels factors de transcripció nuclears c-myc i c-jun. Aquests resultats suggereixen que FABP4 circulant podria tenir un paper en el remodelat vascular i progressió de l'aterosclerosi. Aquestes dades contribueixen al nostre coneixement actual sobre el mecanisme d'acció de FABP4 circulant. / Fatty acid-binding protein 4 (FABP4) es una adipoquina secretada por el tejido adiposo implicada en la regulación del metabolismo energético y la inflamación. Se han detectado niveles elevados de FABP4 circulante en personas con factores de riesgo cardiovascular y aterosclerosis, aunque no hay muchos datos sobre FABP4 y aterosclerosis en humanos. Algunos estudios han demostrado que FABP4 tiene un efecto directo sobre los tejidos periféricos, concretamente promoviendo la disfunción endotelial. La disfunción endotelial juega un papel crucial en el desarrollo de lesiones ateroscleróticas, así como la migración y proliferación de células de músculo liso vascular. Sin embargo, el mecanismo de acción y las funciones de FABP4 circulante son desconocidos. La hipótesis de este trabajo es que FABP4 interacciona con tejidos periféricos contribuyendo a la disfunción endotelial y remodelación vascular a partir de la interacción con proteínas de membrana plasmática, que actuarían como elementos de anclaje y/o receptores mediando rutas de señalización intracelular, y/o internalización. Nuestros resultados indican que FABP4 exógena interactúa específicamente con citoqueratina 1 (CK1) en las membranas celulares endoteliales y su inhibición farmacológica por BMS309403 disminuye ligeramente la formación de estos complejos. Además, FABP4 exógena atraviesa la membrana plasmática para entrar en el citoplasma y núcleo de células endoteliales (HUVECs). También hemos demostrado que FABP4 exógena también forma un complejo con CK1 en las células del músculo liso vascular (HCASMCs) y que tiene un efecto directo sobre la migración y proliferación de HCASMCs a través de la activación de la vía de señalización MAPK por la fosforilación de ERK1/2 y activación los factores de transcripción nucleares c-myc y c-jun. Estos resultados sugieren que FABP4 circulante podría tener un papel en el remodelado vascular y en la progresión de la aterosclerosis. Estos datos contribuyen a nuestro conocimiento actual sobre el mecanismo de acción de FABP4 circulante. / Fatty acid-binding protein 4 (FABP4) is an adipose tissue-secreted adipokine that is involved in the regulation of energetic metabolism and inflammation. Increased levels of circulating FABP4 have been detected in individuals with cardiovascular risk factors and atherosclerosis, although there is not much data on FABP4 in human atherosclerosis. Some studies have demonstrated that FABP4 has a direct effect on peripheral tissues, specifically promoting endothelial dysfunction. Endothelial dysfunction plays crucial roles in the development of atherosclerotic lesions as well as migration and proliferation of vascular smooth muscle cells. However, the mechanism of action and functions of circulating FABP4 are unknown. The hypothesis of this study is that circulating FABP4 has a direct effect on peripheral tissues. In particular at vessel wall level, FABP4 contributes to endothelial dysfunction and artery wall remodelling through interaction with endothelial plasma membrane proteins that act as anchoring elements and/or receptors mediating intracellular signalling, and/or FABP4 internalization. FABP4 acts on smooth muscle cells influencing cell migration and proliferation as well. Our results indicate that exogenous FABP4 interacts with specifically CK1 on endothelial cell membranes and the pharmacological FABP4 inhibition by BMS309403 decreases the formation of these complexes slightly. Furthermore, exogenous FABP4 crosses the plasma membrane to enter the cytoplasm and nucleus in HUVECs. In addition, we also demonstrated that exogenous FABP4 forms a complex with CK1 on vascular smooth muscle cells (HCASMCs) and has a direct effect of FABP4 on the migration and proliferation of HCASMCs through the activation of the ERK1/2 MAPK signalling pathway and activating the nuclear transcription factors c-myc and c-jun. Taking all these results together, it suggests that circulating FABP4 could have a role in vascular remodelling and atherosclerosis progression. These data contribute to our current knowledge regarding the mechanism of action of circulating FABP4.

Understanding how receptor-ligand interactions occur is a first step towards designing new drugs. The complete reconstruction of the binding process in a drug-receptor system provides all the physical-chemistry variables for rational design of inhibitors of a chosen target, an important step in drug discovery. Although very powerful, direct experimental observation of full binding processes is very hard to perform. In this thesis, by using high-throughput molecular dynamics in the distributed computing project GPUGRID.net and analysing the resulting data by Markov state models (MSM), we successfully estimated kinetics, thermodynamics and binding modes for different molecular systems. In the initial works, we focused on estimating the potency of inhibitor-protein complexes. In subsequent studies, we described more complex pictures of binding, taking into account the receptor dynamics or other binding molecules. The results are promising and establish the methodology as a very powerful tool in the first stages of the drug discovery pipeline. / Comprender las interacciones entre proteína y ligando es el primer paso para diseñar nuevos medicamentos. Llegar a reconstruir completamente este proceso de unión proporciona todas las variables físico-químicas para una optimización racional, un paso muy importante en el descubrimiento de fármacos. Pese a que esto ofrece muchas ventajas, todavía es complicado observar estos procesos experimentalmente. En esta tesis, utilizando simulaciones moleculares de alto rendimiento (HTMD) mediante el proyecto distribuido GPUGRID.net y análisis por Markov state models (MSM), hemos obtenido datos cinéticos, termodinámicos y modos de unión para varios sistemas. En los primeros trabajos nos centramos en estimar la afinidad entre complejos inhibidor-proteína. En trabajos posteriores, logramos caracterizar completamente rutas de unión del ligando teniendo en cuenta los confórmeros de la proteína u otros ligandos presentes. Los resultados son prometedores y establecen la utilidad de HTMD en las primeras fases de descubrimiento de fármacos

Mitochondrial dysfunction arising from aberrant mitochondrial nucleic acid homeostasis has been associated with various pathologies. In this thesis, we aim to characterize a putative mitochondrial exonuclease, EXD2, and the consequences of its loss in cell metabolism. For that purpose we use three approaches: 1) Biochemical assays with bacterially purified EXD2 to study its enzymatic activity, 2) In vitro experiments with cell lines to study the phenotype of cells with altered EXD2-levels, and, 3) In vivo experiments with a mouse xenograft model and D.melanogaster to study the consequences of EXD2-loss in tumors and at the organismal level. Our work shows, that EXD2 is a uniquely versatile mammalian exonuclease able to bind and degrade various DNA and RNA substrates. We demonstrate that loss of EXD2 in cancer cells leads to alterations in mtDNA, various metabolic changes and aberrant hypoxia signaling. We also describe how, in vivo, this leads to inhibition of breast tumor growth and increased lifespan in fruitflies. Taken together, our observations provide a link between mitochondrial nucleic acid maintenance and large-scale metabolic alterations influencing tumor growth and aging. / La disfunción mitocondrial que surge de la homeostasis de ácido nucleico mitocondrial aberrante se ha asociado con varias patologías. En esta tesis, se pretende caracterizar una exonucleasa putativo mitocondrial, EXD2, y las consecuencias de su pérdida en el metabolismo celular. Para ello utilizamos tres enfoques: 1) ensayos bioquímicos con EXD2 purificado de bacterias para estudiar su actividad enzimática, 2) los experimentos in vitro con líneas celulares para estudiar el fenotipo de las células con niveles de EXD2 alterados, y, 3) experimentos in vivo con modelo de xenotrasplante de ratón y D.melanogaster para estudiar las consecuencias de perdida de EXD2 en los tumores y en el nivel del organismo. Nuestro trabajo muestra que EXD2 es una exonucleasa mamíferos excepcionalmente versátil capaz de unirse y degradar diversos sustratos de ADN y ARN. Se demuestra que la pérdida de EXD2 en las células del cáncer conduce a alteraciones en el ADN mitocondrial, diversas alteraciones metabólicas y de señalización hipoxia aberrante. También describimos cómo, in vivo, esto conduce a la inhibición del crecimiento del tumor de mama y aumento de la vida útil en moscas de la fruta. En conjunto, nuestras observaciones proporcionan un enlace entre el mantenimiento de ácidos nucleicos mitocondriales y de gran escala alteraciones metabólicas que influyen en el crecimiento del tumor y el envejecimiento.

In response to fluctuations in the environment, all living organisms have the ability to sense, respond and adapt to the new conditions. In budding yeast (Saccharomyces cerevisiae) there is a massive and rapid reorganization of the transcriptional program in response to a stressful situation, which is governed by different signaling pathways, transcription factors, chromatin remodelers and histone modifiers. Many examples of histone posttranslational modifications (PTM) have been associated with transcriptional activation or repression under normal growth conditions, however little is known about the role of histones in the cellular adaptive response upon stress. In this study, we systematically analyze by high throughput screens cellular growth and transcription initiation of stress-responsive genes in 569 histone point mutants upon heat and osmostress. These screens provide a novel global map of the histone residues required for cellular survival and transcriptional regulation in response to heat and osmostress. Moreover, we show that the histone residues required in response to stress depend on the type of gene and/or the type of stress. Furthermore we characterized some examples of newly identified histone marks from histones H3 and H4 involved in the transcriptional regulation upon different stress conditions. / Todos los organismos vivos tienen la capacidad de adaptarse a condiciones adversas en el medio en el que viven para sobrevivir. En la levadura Saccharomyces cerevisiae se produce una rápida reorganización en el patrón transcripcional en respuesta a una situación de estrés. Esta reorganización transcripcional está regulada por diferentes vías de señalización, factores de transcripción, complejos remodeladores de cromatina y enzimas modificadoras de histonas. Numerosos ejemplos de modificaciones postraduccionales en histonas han sido asociados con la activación o la represión génica en condiciones normales de crecimiento. Sin embargo, se conoce muy poco sobre el papel de las histonas en la adaptación celular frente a una situación de estrés. En este trabajo, hemos analizado de forma sistemática el crecimiento celular y el inicio de la transcripción de genes que se inducen en respuesta a estrés en 569 mutantes puntuales de histonas en condiciones de estrés térmico y osmótico. Nuestros resultados proporcionan un mapa global de los residuos de las histonas esenciales para la supervivencia celular y la activación transcripcional en respuesta a estrés térmico y osmótico. Asimismo, estos análisis revelan que existe una especificidad respecto a los residuos de las histonas que son necesarios en respuesta a estrés dependiendo del tipo de gen y/o del tipo de estrés. Además, en este trabajo hemos caracterizado algunos ejemplos de residuos en las histonas H3 y H4 que tienen un papel importante en la regulación transcripcional en respuesta a estrés.

Reactive oxygen species (ROS) are a variety of molecules derived from molecular oxygen during different metabolic processes. ROS can react with different cellular components resulting in lipid peroxidation, protein oxidation and DNA damage. Single-cell organisms have to cope with a wide range of environmental changes and exposition to toxic compounds. In response to hydrogen peroxide (H2O2), S. pombe activates different signalling pathways depending on the severity of the stress exerted, mediate at least by two transcriptional factors (TFs), the AP-1 like Pap1 and the bZIP Atf1 controlled by the mitogen-activated protein kinase. In fission yeast, the Pap1 and Sty1 pathways constitute the key protective responses to oxidative stress. The MAPK Sty1 is activated upon several stress situations, like osmotic and oxidative stress. Since the modulation of gene expression is one of the main outputs of this response, we focused this work on the characterization of Sty1 pathway as a sensor of oxidative stress and the different molecular events leading to its transcriptional program activation. We have also, studied the role of translation by Elongator in the induction of the stress response / Els radicals lliures d’oxigen (ROS) són unes molècules derivades de l’oxigen provinents de diferents processos metabòlics. ROS poden reaccionar amb diferent components cel•lulars, resultant en peroxidació d’àcids grassos, oxidació de proteïnes i danys al DNA. Els organismes unicel•lulars estan sotmesos a una àmplia varietat de canvis ambientals i a l’exposició de compostos tòxics. En resposta a l’estrés oxidatiu provocat pel peròxid d’hidrogen, S. pombe activa diferent vies de senyalització segons la severitat de l’estrés sofert, dut a terme per dos factors de transcripció, Pap1 i el bZIP Atf1 sota el control aquest últim de la MAPK. En el llevat S. pombe, Pap1 i Sty1 constitueixen un paper clau per lat resposta a l’estrés oxidatiu. La MAPK Sty1 s’activa sota l’efecte de diferent estressos, aixi com l’estrés oxidatiu o l’osmòtic. La modulació de la resposta gènica és un dels principals punts en aquesta resposta, hem centrat el treball d’aquesta tesis en la caracterització de la ruta de Sty1 com a sensor de l’estrés oxidatiu així com els diferents events moleculars que activen el programa transcripcional. També hem estudiat el paper de la traducció per l’Elongato en la inducció de la resposta a estrés.

La función, forma e identidad de los orgánulos celulares es determinada, en gran medida, por su composición lipídica y proteica. Para mantener el equilibrio celular, las tasas de síntesis y degradación tanto de proteínas como de lípidos deben controlarse con exactitud. La proteólisis mediante el sistema ubiquitino-proteosómico cumple un papel importante en la regulación del tiempo de vida media de una variedad de proteínas. El normal funcionamiento de numerosos procesos celulares requiere degradación selectiva de proteínas en forma precisa y oportuna; entre estos procesos algunos ejemplos prominentes son: tráfico intracelular y secreción, eliminación de polipéptidos dañados y reparación de ADN. Valga resaltar que anomalías en el sistema ubiquitino-proteosómico han sido asociadas a varias patologías humanas. Durante la proteosíntesis algunas proteínas mal plegadas se generan, de forma constitutiva, en la membrana y en el lumen del retículo endoplasmático (RE). Estas especies, potencialmente tóxicas, son eliminadas mediante el sistema ubiquitino-proteosómico por una ruta de control de calidad denominada degradación asociada al retículo endoplasmático (DARE). Más allá de esta bien conocida y estudiada función, DARE controla también la abundancia de algunas proteínas del RE correctamente plegadas y funcionales, pero de vida media corta. En este caso la selección y degradación de substratos responde a condiciones fisiológicas específicas y constituye un proceso regulado. De particular relevancia, la síntesis de esteroles se ajusta a los requerimientos celulares a través del control de la estabilidad de la enzima HMGR mediante un mecanismo de retroalimentación. A pesar de su importancia en la homeostasis del RE, hasta el momento sólo se conocen algunos pocos ejemplos de degradación regulada mediada por DARE. En el RE de S.cerevisiae tres enzimas ligasas de ubiquitina, entre ellas Doa10, participan en la degradación de proteínas mal plegadas. Con el propósito de encontrar sustratos regulados de Doa10 llevamos a cabo un examen proteómico. Encontramos varios candidatos, involucrados en diversas funciones celulares, y caracterizamos algunos de ellos en mayor profundidad. Demostramos que la degradación dependiente de Doa10 tiene un impacto crucial en la homeostasis de lípidos por medio de la eliminación regulada de Erg1, una enzima del anabolismo de esteroles. Más aún, encontramos que Doa10 lleva a la degradación de proteínas pertenecientes a los cuerpos lipídicos, un orgánulo derivado del RE; este descubrimiento resalta el rol que DARE juega en el control espacial de proteínas y el mantenimiento de la identidad del RE. / The function, shape and identity of cellular organelles are too a large extent determined by their lipid and protein composition. In order to maintain cellular homeostasis, the rate of synthesis and degradation of proteins and lipids must be accurately controlled. Proteolysis by the ubiquitin-proteasome system plays a major role in regulating the half-lives of a range of proteins. A multitude of cellular processes depends on timely controlled and selective protein degradation; just to mention a few, these include intracellular trafficking and secretion, elimination of damaged polypeptides and DNA repair. Remarkably, anomalies in the ubiquitin-proteasome system have been linked to several human pathologies. Misfolded proteins in the membrane and lumen of the endoplasmic reticulum (ER) are constitutively generated during protein biosynthesis. These species are potentially toxic and are eliminated by the ubiquitin-proteasome system through a quality control pathway called ER-associated protein degradation (ERAD). Beyond this well-studied role, ERAD controls the levels of some folded, functional but short-lived ER proteins by eliminating them under a specific physiological condition, thereby in a regulated fashion. Of note, sterol production is adjusted to cell needs through feedback control of the HMGR enzyme stability. Despite its importance in ER homeostasis, regulated degradation through ERAD still accounts for only few examples. Yeast Doa10 is one of three ER ubiquitin ligase enzymes implicated in the degradation of misfolded proteins. To seek for regulated Doa10 clients, we pursued a proteomics screening. We identified potential targets involved in diverse cellular functions and further characterized some of them. We demonstrate that Doa10-dependent degradation critically impacts lipid homeostasis through regulated disposal of the sterol pathway enzyme Erg1. Moreover, we show that Doa10 mediates degradation of proteins belonging to lipid droplets, an ER-derived organelle; this finding highlights a role for ERAD in protein spatial control and maintenance of ER identity.

This thesis has been about the use of a simulation technique, known as molecular dynamics simulations, to study biophysics in proteins that have historically been difficult to study with other methods. We have studied numerous systems, namely binding to the membrane proteins Fatty acid amide hydrolase (FAAH) and the sphingosine-1-phosphate receptor 1 (S1P1R), and folding in the disordered protein kinase inducible domain (KID). In each case we have been able to analyze processes and uncover behaviors that are difficult or impossible to view by other means. / Esta tesis se trata del uso de un técnica de simulación, llamado simulación de dinámica molecular, para estudiar la biofísica de proteínas que históricamente han estado difícil estudiar por otros métodos. Hemos estudiado numerosas sistemas, en particular la encuadernación de ligandos en sistemas de membranas como Fatty acid amide hydrolase (FAAH) y el receptor Sphingosine-1-phosphate (S1P1R), y cómo se pliegue una proteína desordenada llamado Kinase inducible domain (KID). En cada caso hemos sido capaz de analizar procesos y detapar comportamientos que sean difícil o imposible ver por otros métodos.