Spelling suggestions: "subject:"angiologia molecular"" "subject:"algiologia molecular""
541 |
Caracterització de l'estructura i funció del transportador de melibiosa d'Escherichia coli per espectroscòpia d'infraroigDave Coll, Natàlia 18 July 2004 (has links)
La MelB és una proteïna integral de membrana d'Escherichia coli (473 amino àcids) que transporta - o -galactòsids a l'interior de la cèl·lula, gràcies a l'energia obtinguda dels cations Na+, H+ o Li+ que cotransporta de forma simport. Cada catió competeix pel mateix lloc d'unió, essent el Na+ i el Li+ millors activadors. El model topològic d'estructura secundària acceptat actualment consta de 12 hèlixs transmembrana, amb el costat N- i C-terminal a la cara citoplasmàtica de la membrana. En aquest treball, s'ha estudiat la proteïna solubilitzada i reconstituïda en lípids d'E.coli en quatre condicions diferents de substrats: Na+, H+, Na+ i melibiosa i H+ i melibiosa. Primerament, es va estudiar i quantificar l'estructura secundària de la MelB per espectroscòpia d'infraroig de transmissió. L'estudi revelà l'existència de dos tipus d'hèlixs alfa que sofreixen canvis conformacionals deguts a la unió a diferents substrats, essent la unió del catió Na+ el que produeix canvis majors. Aquest resultat, és coherent els canvis conformacionals a nivell dels triptòfans intrínsecs de la proteïna trobats per espectroscòpia de fluorescència. La solubilització de la MelB en detergents desnaturalitzants o bé, l'escalfament d'aquesta en detergent dodecil maltòsid, estats en que la proteïna no és funcional, provoca que els dos tipus d'hèlixs alfa es converteixen en un de sol. Això indicaria que l'existència d'aquests dos tipus d'hèlixs alfa són molt importants pel funcionament de la proteïna. La quantificació de l'estructura secundària donà un 50% d'hèlixs, 20% de làmina beta, 17% de girs reversos i un 11% assignat a hèlixs 310, llaços oberts o bé hèlixs alfa. Assignació que concorda amb el model topològic de 12 hèlixs transmembrana. La quantificació obtinguda en D2O va reforçar aquests resultats. En segon lloc, es va aplicar la tècnica del bescanvi H/D per ATR-FTIR a la MelB, particularment útil per a estudiar les propietats dinàmiques de les proteïnes de membrana que són en general, àmpliament desconegudes. Els resultats ens mostren que la MelB és una proteïna relativament accessible, amb un bescanvi H/D a les 24h del 60%. La comparació dels nivells de bescanvi de la MelB en diferents condicions de substrats ens suggereix que l'addició de melibiosa redueix significativament l'accessibilitat al solvent aquós. Un anàlisi més profund del bescanvi H/D a nivell d'estructura secundària, revelà diferències en diferents condicions de substrats. En particular, a nivell d'estructura làmina beta i en menys grau a nivell d'estructura hèlix alfa. La unió de melibiosa confereix més protecció a ambdós tipus d'estructura. Aquesta tècnica també es va aplicar al mutant de la MelB, el R141C, en les mateixes condicions de substrats. El R141C és capaç d'unir els substrats de la MelB però no els transloca a l'altra cara de la membrana. Els resultats indiquen que el mutant unit al H+ és un 10% més accessible al solvent aquós que la MelB salvatge en la mateixa condició. L'addició de substrats també comporta canvis conformacionals, en aquest cas a nivell d'estructura làmina beta, alfa hèlix i girs reversos. L'addició de melibiosa també protegeix l'estructura làmina beta envers el bescanvi H/D, encara que en la condició Na+/melibiosa és la més protegida.Finalment, es va aplicar la tècnica de polarització per ATR-FTIR per estudiar si la unió de diferents substrats també resultava en canvis d'orientació de les hèlixs transmembrana. Mitjançant els espectres de polarització paral·lel i perpendicular es calcula el paràmetre d'ordre, necessari pel càlcul de l'angle d'orientació. Els resultats demostren que la proteïna reconstituïda en liposomes està orientada. Les dues bandes principals corresponen a segments transmembrana helicoïdals. La MelB sense substrats (H+/MelB) mostra un angle de 26º respecte la normal a la bicapa i no sofreix cap canvi en afegir melibiosa. Tot al contrari, quan afegim Na+ a la MelB l'angle d'orientació és de 36º i la posterior addició de melibiosa el disminueix de l'ordre de 5º. / MelB is an integral membrane of Escherichia coli (473 amino acids) that couples uphill transport of alpha- or beta-galactosides to the downhill inward movement of Na+, Li+, or H+. The coupling ions compete for the same binding site and enhanced the affinity of the co-transported sugar, with Na+ and Li+ as better activators than H+. The secondary structure topological model consist in 12 transmembrane segments with the N and C termini located in the cytoplasm. In this work, solubilized and reconstituted MelB in four different substrate conditions have been studied: Na+, H+, Na+ with melibiose and H+ with melibiose.Firstly, MelB secondary structure analysis and quantification were performed by transmission infrared spectroscopy. Results revealed the existence of two type of alpha-helices which suffer conformational changes by different substrate binding, being Na+ the one who produces major changes. This result is coherent with the intrinsic triptophan conformational changes studied by fluorescence spectroscopy. MelB solubilized in denaturating detergents or warmed up in dodecil maltosid, states where the protein is not functional, outcome one only alpha helical band instead of two. This would indicate that the two alpha helical existence is very important for the normal protein function. The secondary structure quantification gave a 50% of alpha helices, 20% beta sheet, 17% reverse turns and 11% assigned to 310 helices, open loops or alpha helices. This assignation agrees with the 12 transmembrane helices topological model. The obtained D2O quantification reinforces these results.Secondly, the H/D exchange technique by ATR-FTIR was applied, particularly useful to study membrane proteins dynamics properties widely unknown. Results shown that MelB is a relatively accessible protein, with and H/D exchange of 60% after 24 hours. The MelB H/D exchange in different substrate conditions comparison, suggested that melibiose addition significantly reduces its aqueous solvent accessibility. A deeper H/D exchange analysis at a secondary structure level, revealed conformational changes in different substrate conditions. Particularly, at the beta sheet and in less amount at the alpha helical level. Melibiose binding gives more protection to both types of structures. This technique was also applied to the MelB mutant, the R141C, in the same substrate conditions. The R141C mutant is capable of binding substrate but not of trasnlocating them on the other membrane site. The results indicate the mutant bind to H+ is about 10% more accessible to the aqueous solvent than the wild type MelB in the same condition. Substrates addition also produces conformational changes, in this case at the beta sheet, alpha helical and reverse turns level. Incubation with melibiose protects beta sheet against the aqueous solvent, too, although the Na/melibiose conditions is the most protected state. Finally, the polarization technique by ATR-FTIR was applied to study if the different substrate binding also resulted into orientation changes of the transmembrane helices. By means of parallel and perpendicular polarized spectra the order parameter can be calculated, a necessary tool to calculate the orientation angle of the protein structures. The results demonstrate that the reconstituted protein is oriented. The two main bands principally correspond to helicoidal transmembrane segments. MelB without asubstrates (H+/MelB) shows an orientation angle of 26º and doesn't suffer any significant change by melibiose addition. On the contrary, when Na+ is bind to MelB the orientation angle is of 36º and the posterior melibiose addition reduces it about 5º.
|
542 |
Dynamic Factors of Bacteriorhodopsin: Regulation Key Points in Helices B, C and FPerálvarez Marín, Alejandro 07 July 2005 (has links)
The main objective of this work is the analysis of the structural and functional role of some amino acids in Bacteriorhodopsin.- Characterization of the motif Thr90-Pro91 in the centre of Helix C of Bacteriorhodopsin. Because Thr90 interacts with Asp115 through a hydrogen bond and with the retinal through hydrophobic interaction, the mutants T90V and D115A were taken into account. The following objectives were settled:Design and construct the Bacteriorhodopsin mutants P91A, T90A,T90V and D115A by site directed mutagenesis.Express the mutants in the purple membrane of Halobacterium salinarum.Analyze the role of Thr90 and Pro91 in the properties of the protein and in the proton pumping function in particular through the study of the mutants.Infer a role to the motif Thr90-Pro91 in Bacteriorhodopsin.- Analyze the role of the other two Prolines located in transmembrane helices in BR, and to extend this role to other Transmembrane Proteins. The subsequent objectives were proposed:Design and construct the Bacteriorhodopsin mutants P50A and P186A by site directed mutagenesis.Express the mutants in the purple membrane of Halobacterium salinarum.Characterize the role of Pro50, and Pro186 in Bacteriorhodopsin properties and proton pumping through the analysis of the mutants.Infer a role to Helix-embedded prolines of Bacteriorhodopsin in particular and to transmembrane helices of proteins in general.
|
543 |
Estudi dels canvis estructurals de la permeasa de melibiosa d'Escherichia coli induïts per la unió dels substratsLeón Madrenas, Xavier 10 May 2006 (has links)
La permeasa de melibiosa (MelB) és un cotransportador de la membrana d'E. coli que permet l'acumulació d'α- i β-galactòsids gràcies a l'energia d'un gradient transmembrana de Na+, Li+ o H+. Es prediu una estructura secundària de 12 hèlixs transmembrana amb l'extrem N- i C-terminal en el cantó citoplasmàtic.L'objectiu d'aquest treball és l'obtenció d'informació estructural mitjançant espectres de diferència d'ATR-FTIR (infraroig per transformada de Fourier, reflexió total atenuada) on es resten dos espectres d'absorció en presència de diferents substrats de la MelB (Na+, Li+, H+ i melibiosa). La tècnica espectroscòpica de FTIR ens permet obtenir informació de l'estructura secundària i terciària de la MelB. A més, una característica important de la tècnica d'ATR-FTIR és que ens permet modificar el medi en que es troba la proteïna sense la necessitat de canviar de mostra.Els espectres de diferència indiquen canvis en estructures secundàries com: hèlix α (probablement canvis en la inclinació de les hèlixs transmembrana), làmines β, hèlixs 310, girs reversos i estructures desordenades. A més dels pics assignats a estructura secundària també s'observen una varietat de pics que poden correspondre a cadenes laterals com Asp, Glu, Asn, Trp i Tyr.La comparació dels espectres de diferència en D2O amb els obtinguts en H2O permet una millor assignació de l'estructura secundaria i, el que és molt interessant, la identificació de pics de residus com Asp i Glu. A partir d'aquests espectres es proposa que: 1) Les estructures involucrades en la unió de Na+ són més accessibles al solvent que aquelles que intervenen en la interacció amb la melibiosa en presència de Na+. 2) La unió de Na+ indueix uns canvis en la zona de vibració dels àcids carboxílics que deuen indicar una interacció d'aquests cations amb cadenes laterals d'Asp, que s'han proposat que formen part del lloc d'unió dels cations. En el següent pas, la interacció de melibiosa torna a induir uns canvis en la zona dels àcids carboxílics, on en aquest cas es poden assignar a un trencament de ponts salins entre les cadenes laterals d'Asp/Glu i Arg/Lys.Per tal d'aprofundir en l'estudi dels canvis conformacionals involucrats en les diferents etapes del transport es van realitzar els espectres de diferència del mutant R141C i de la MelB reaccionada amb el reactiu NEM (N-etilmaleimida). Aquestes dues permeases uneixen però no transporten els substrats, però fins a dia d'avui encara no està clar en quin pas bloquegen el transport dels substrats. El mutant R141C a més de la mutació de l'Arg consta de 4 mutacions més que corresponen a la substitució de les 4 Cys natives de la MelB per 3 Ser i una Val. Per tant, els espectres de diferència del mutant R141C es comparen amb els del mutant 3SV (permeasa sense Cys), que conserva aproximadament les mateixes propietats que la MelB salvatge a l'hora d'unir i transportar els substrats. Els espectres de diferència del mutant R141C són diferents que els espectres de diferència del mutant 3SV. En canvi, els espectres de diferència de la MelB reaccionada amb NEM són molt semblants als espectres de la MelB salvatge. Per tant, es dedueix que el mutant R141C té el seu transport bloquejat en un estat anterior del transport en comparació amb la MelB reaccionada amb NEM. En concret, és probable que el mutant R141C només uneixi els substrats, mentre que la MelB-NEM probablement queda bloquejada en l'estat que s'anomena "tancat" proposat pel transport simport. / Melibiose permease (MelB) is a co-transporter of Escherichia Coli that transports α- and β-galactosides to the cell interior coupled to the downhill electrochemical ion gradient of Na+, Li+, or H+. MelB secondary structure is predicted to consist of 12 transmembrane helices with the N- and C-terminal in the cytoplasmatic side.The objective of this work is to obtain structural information by means of difference spectra by ATR-FTIR (attenuated total reflection, Fourier transform infrared). This difference spectra result from subtraction of two consecutive absorbance spectra in the presence of different MelB substrates (Na+, Li+, H+ or melibiose). FTIR gives information about the secondary and tertiary structure of proteins. Furthermore, ATR-FTIR allows exchanging the external medium without changing the sample.Difference spectra show changes in secondary structures such as: α-helix (likely due to changes in tilting), β-sheet, helix 310, reverse turns and unordered structure. Furthermore, other peaks can be assigned to residues side chains such as Asp, Glu, Asn, Trp and Tyr.Difference spectra recorded in the presence of D2O, compared to those recorded in the presence if H2O, are useful to improve assignations of secondary structure and Asp and Glu residues. From these spectra it can be concluded that: 1) structures involved in Na+ binding are more accessible to the solvent than those involved in melibiose interaction in the presence of Na+. 2) Na+ binding induce changes in peaks in the carboxylic acids absorption region. These peaks may arise from the interaction of this cation with Asp, which have been proposed to form the cation binding site. In the next step of the transport mechanism, melibiose interaction also induces changes in carboxylic absorption region. These peaks can be assigned to the carboxylic side chains interacting with Arg and/or Lys residues in the resting state that become free upon melibiose binding.To get further understanding of the structural changes involved in the different steps of substrate transport, difference spectra of the R141C mutant and the MelB reacted with NEM (N-etylmaleimide) were recorded. Both permeases bind the substrates but do not translocate them. However, it is not clear where these permeases block the transport. The R141C mutant has in addition 4 other mutations. These mutations correspond to the 4 native Cys mutated to 3 Ser and 1 Val. For this reason R141C difference spectra are compared to those corresponding to the mutant 3SV (Cys-less), which has similar properties than the WT. R141C difference spectra are different than those corresponding to 3SV. On the other hand, difference spectra of MelB-NEM are quite similar to those recorded for the WT. Hence, R141C mutant has its transport blocked in an early step than the MelB-NEM. Particularly, it is proposed that R141C mutant only binds the substrate whereas MelB-NEM is blocked in the "closed" state proposed for the symport transport.
|
544 |
Estudi del lloc d'unió del sodi de la permeasa de melibiosa d'Escherichia coliGranell Puig, Meritxell 29 July 2009 (has links)
La permeasa de melibiosa (MelB) és un cotransportador de la membrana d'Escherichia coli que transporta activament disacàrids (ex. melibiosa) utilitzant com a font d'energia un gradient transmembrana de Na +, Li + o H +. S'ha proposat una estructura de 12 α-hèlix transmembrana amb el costat N- i C-terminal a la cara citoplasmàtica. Estudis anteriors han proposat que el lloc d'unió dels cations dins la permeasa estaria formant per els quatre residus aspàrtics: D19, D55, D59 i D124. S'ha observat que la mutació de qualsevol d'aquests aspàrtics a cisteïna impedeix el transport de sucre acoblat a sodi. No obstant això, no s'ha realitzat estudis de la interacció d'aquests mutants amb el sodi i per tant la participació d'aquest aspàrtics en el lloc d'unió del catió és encara provisional. En aquest treball s'ha estudiat la implicació d'aquest residus aspàrtics en el lloc d'unió dels cations. S'ha expressat, purificat i reconstituït en liposomes els mutants D19C, D55C, D59C, D124C, i D59E. El mutant N58C també s'ha preparat i estudiat, ja que d'acord amb altres estudis de l'asparagina 58 també pot estar implicada en la unió del catió. S'ha utilitzat la tècnica d'espectroscòpia infraroja amb reflexió total atenuada que permet obtenir informació sobre l'efecte de la mutació en la interacció dels cations i/o la melibiosa amb la MelB.S'han realitzat espectres de diferència que s'han obtingut al fer passar una solució amortidora amb o sense substrat alternativament (per exemple, Na + i / o melibiosa), el procés s'ha realitzat repetidament. Els canvis en els espectres de diferència seran deguts a la interacció de la MelB amb el substrat. A causa del gran nombre de vibracions d'una proteïna que es poden observar per espectroscòpia d'infraroig, gairebé qualsevol interacció del substrat amb la MelB serà detectada per aquesta tècnica. Hem demostrat que els mutants D55C, D59C, D59E i N58C no interactuen amb Na+, ni en absència ni en presència de melibiosa. Per aquesta raó, proposem que aquests residus són lligands del Na+. D'altra banda, els mutants D19C i D124C preserven la capacitat d'interactuar amb el Na+, encara que el D124C presenta una menor intensitat en l'espectre de diferència degut a la interacció del sodi amb aquest mutant. Per tant, D19 no està involucrat en el lloc d'unió de Na+, en contrast amb els models anteriors, mentre D124 podria ser un lligand secundari responsable de l'acoblament catió-sucre. Finalment, dels mutants estudiats només D55C i D59C conserven la capacitat d'interaccionar amb la melibiosa, encara que amb algunes diferències respecte WT. Hem integrat tots aquests resultats experimentals en un model molecular de MelB, proposant un nou lloc d'unió del catió. / The melibiose permease (MelB) is a bacterial membrane protein that functions as an active secondary transporter. It couples the uphill transport of disaccharides (e.g., melibiose) with the co-transport of either H+, Na+, or Li+ down their electrochemical gradient. Evidence was obtained that this integral membrane protein consists of 12 transmembrane helices with the carboxyl- and amino-terminal located in the cytoplasm. Previous studies proposed a cation binding site consisting on four aspartic acid residues: D19, D55, D59 i D124. It was reported that mutation of any of these aspartics to cysteine prevents sodium-coupled sugar transport. Nevertheless, actual confirmation that mutation of these aspartic residues prevents cation binding has been lacking so far, and therefore their involvement in the cation binding site is still tentative. In the present study we sought to examine the implication of these aspartic acid residues in the cation binding site. We expressed, purified, and reconstituted in liposomes the MelB mutants D19C, D55C, D59C, D124C, and D59E. The mutant N58C was prepared and studied as well, since accordingly to some reports the asparagine 58 may be also implicated in the cation binding site. We applied attenuated total reflection Fourier transform infrared (ATR-FTIR) difference spectroscopy to detect and characterize the interaction of MelB mutants with the cation Na+ and the sugar melibiose. In this technique buffers without and with the substrate of interest (i.e., Na+ and/or melibiose) are repetitively cycled over the sample, and the changes in the protein vibrations emerging from the interaction with the substrate are measured. Due to the large number of IR active vibrations in a protein almost any interaction will be detectable by this technique. It is shown that the D55C, D59C, D59E and N58C mutants don't interact with Na+, neither in the absence nor in the presence of melibiose, and therefore these residues are most likely ligands of the Na+. On the other hand the D19C and D124C mutants preserve the ability to interact with Na+, although the later with significantly reduced spectral changes associated with this binding. Therefore, D19 is not involved in the Na+ binding site, in contrast to previous models, while D124 could be a secondary ligand responsible for the cation/sugar affinity coupling. Finally, from the studied mutants only D55C and D59C retained the ability to bind melibiose,, even though with some spectral differences to respect WT. We integrated all these experimental results in a molecular model of MelB, proposing a new cation binding site.
|
545 |
Influencia de la movilidad de las hélices en la función de la bacteriorodopsinaSimón Vázquez, Rosana 24 February 2009 (has links)
La bacteriorodopsina (BR) es una proteína transportadora de protones que se encuentra en la membrana de la arqueobacteria H. salinarum. Consta de siete hélices α y un cromóforo, el retinal, unido covalentemente a la hélice G. Ha sido muy estudiada debido a su similitud con la rodopsina visual y otras proteínas de la familia de las GPCRs, además de formar parte de uno de los sistemas fotosintéticos más sencillos que se conocen. La BR se activa mediante la absorción de un fotón por parte del retinal, lo que proporciona la energía necesaria para realizar el fotociclo. El resultado final es el transporte neto de un protón desde el lado citoplasmático al lado extracelular. A pesar de que su estructura y función son bien conocidas, todavía hay aspectos funcionales que no han sido suficientemente caracterizados. En este sentido, la existencia de un posible movimiento de las hélices E, F y G en el lado citoplasmático durante el proceso de reprotonación ha sido ampliamente debatida. El hecho de que estos movimientos hayan sido detectados solamente en estructuras cristalográficas de mutantes ha llevado a pensar que podría tratarse de un artefacto. Asimismo, los trabajos de Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR) en proteína marcada con una sonda de spin han dado valores muy diversos para la magnitud de estos movimientos, creando también dudas sobre su existencia y su implicación en la función. Este trabajo ha tenido como objetivo estudiar la influencia de la flexibilidad de las hélices E-F y F-G en la función de la BR. Para ello se ha expresado una quimera de la BR, denominada Loop5, donde se ha ampliado la longitud, y por tanto la flexibilidad, del bucle E-F mediante la sustitución del bucle nativo por su homólogo en la rodopsina. Por otro lado se ha restringido la flexibilidad de las hélices E-F y F-G mediante la expresión de dos dobles mutantes cisteína y la formación de un puente disulfuro interhélice: F153C(E)/R175C(F) y E166C(F)/A228C(G). Tanto el aumento de la flexibilidad del bucle E-F como la restricción de la movilidad de estas hélices y de las hélices F-G provocan una profunda alteración en la función de transporte. Asimismo el estudio de estos mutantes sitúa este cambio entre los intermediarios M y N y demuestra que es imprescindible para que pueda darse el cambio de accesibilidad desde el lado extracelular al lado citoplasmático, mecanismo que asegura que el transporte sea unidireccional. El aumento de flexibilidad del bucle E-F tiene como consecuencia el aceleramiento del intermediario M. El intermediario N aparece más temprano y tiene un mayor tiempo de vida media. Durante este intermediario sería cuando la proteína tiene una apertura hacia el lado citoplasmático. Al restringir la flexibilidad de las hélices E-F en el mutante F153C/R175C los cambios en el fotociclo no parecen tan relevantes, sin embargo el estudio del intermediario N mediante FTIR muestra cambios estructurales importantes respecto a la proteína nativa. La restricción de la flexibilidad de las hélices F-G en el mutante E166C/A228C provoca profundas alteraciones en el fotociclo favoreciendo la acumulación del intermediario M. Los intermediarios N y O (durante los cuales se reprotona la BR) no se forman y el fotociclo sigue otro camino alternativo para volver al estado basal. Además, el hecho de que el proceso de expulsión del protón (que tiene lugar en el lado extracelular) esté afectado indica la existencia de un mecanismo de cuerpo rígido durante el fotociclo. Por tanto, la flexibilidad de las hélices E, F y G tiene un papel muy relevante en la función de la BR, sugiriendo que este mecanismo es importante en proteínas que constan de 7 hélices transmembrana (7TM). La estrategia de formar un puente disulfuro interhélice en la BR, mediante la introducción de dos cisteínas por mutagénesis dirigida, ha demostrado ser un buen método de estudio para determinar la relevancia de la flexibilidad de las hélices en la función de la proteína. Este método podría extrapolarse a otras proteínas 7TM. / Bacteriorhodopsin (BR) is a proton pump protein found in the membrane of the archaebacterium H. salinarum. It comprises seven α helices and a retinal chromophore covalently bound to the helix G. It has been widely studied because of its similarity to visual rhodopsin and other GPCR proteins as well as being part of one of the simplest photosynthetic systems known. BR is activated by absorption of a photon by the retinal, which provides the energy needed to perform the photocycle. As a result there is a net transport of a proton from the cytoplasmic to the extracellular side. Although its structure and function are well known, there are still functional aspects that have not been sufficiently characterized. In this sense, the existence of some movements on the cytoplasmic side of helices E, F and G during the reprotonation pathway has been widely debated. The fact that these movements have been detected only in crystallographic structures of mutants has questioned their existence in the native protein. Likewise, Electronic Paramagnetic Resonance studies (EPR) in spin labeled protein have shown different values for the magnitude of these movements, creating doubts about their relevance in protein function. This work has been aimed at studying the influence of the flexibility of helices E-F and F-G in the function of BR. For this propose, a BR chimera has been expressed replacing the native E-F loop by its homologous in rhodopsin. This chimera, called Loop5, has an extended length and flexibility of the E-F loop. On the other hand the flexibility of the E-F and F-G helices has been restricted by the expression of two double-cysteine mutants and the formation of an interhelix disulfide bond: F153C (E)/ R175C (F) and E166C (F)/ A228C (G). Both the increased flexibility of the E-F loop as the restriction of mobility of E-F and F-G helices causes a deep alteration in the proton pumping activity. The study of these mutants has also shown that helix movements happen between M and N intermediates and prove to be essential to enable the change of accessibility from the extracellular to the cytoplasmic side. This mechanism ensures that the transport is unidirectional. The increased flexibility of the E-F loop in Loop5 mutant leads to M intermediate acceleration. The N intermediate appears earlier and has a longer half-life. During this intermediate the protein has already changed its accessibility form the extracellular to the cytoplasmic side. By restricting the flexibility of helices E-F in F153C/R175C mutant the photocycle has not been significantly altered. However, the study of the N intermediate by means of FTIR has showed significant structural changes compared to the native protein. Restricting the flexibility of the F-G helices in E166C/A228C mutant causes a deep alteration in the photocycle favouring M intermediate accumulation. The N and O intermediates (BR reprotonation) do not form and the photocycle follows an alternative pathway to return to the ground state. Moreover, the fact that the process of proton release (which takes place on the extracellular side) is concerned points to the presence of a rigid-body mechanism during BR photocycle. Therefore, the flexibility of the helix E, F and G has a major role in the function of BR, suggesting that this mechanism is important in 7 transmembrane helices proteins (7TM). The strategy of cross-linking two helices by means of an engineered disulphide bond in BR has proved to be a good method to determine the relevance of the flexibility of some helices in protein function. This method could be extrapolated to other 7TM protein family.
|
546 |
New roles for ancient interactions: functional analysis of the conserved interactions between the clathrin heavy and light chains and calmodulinRobles García, Virginia 05 December 2014 (has links)
Tesi realitzada a l'Institut de Biologia Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC) / Clathrin is an evolutionary conserved molecule that coats membranes endocytosed from the plasma membrane and those that move between the trans-Golgi network (TGN) and endosomes of eukaryotic cells. It also plays roles in early stages of mitosis, cytokinesis, chromosome alignment and in certain phagocytic events. At the cellular level, clathrin is required for major regulated secretory and endocytic pathways, which transport proteins, lipids, soluble factors, and extracellular ligands between the plasma membrane and the intracellular compartments. In multicellular organisms clathrin is involved in numerous specialized pathways of physiological relevance, such as the production of morphogen gradients, the formation of secretory granule, antigen presentation by the immune system, virus maturation, the control of glucose homeostasis, or synaptic vesicle generation. Many proteins that interact with clathrin have been identified. In some cases the functional relevance of these molecular interactions remains unknown. Among those, the clathrin-calmodulin interaction is probably one of the most striking examples since it involves two evolutionary conserved essential proteins and it was detected in vitro decades ago. However, it was not clarified whether clathrin and calmodulin interacted in vivo and what was the functional significance of this interaction. The calcium sensor calmodulin plays an important role regulating a wide variety of proteins and important signaling pathways in all eukaryotes. It modulates the activity of key regulatory enzymes, ion pumps and proteins implicated in motility and it has essential roles in mitosis. Importantly, it has also been found to be implicated in endocytosis, membrane traffic and endosome fusion. Nevertheless, most targets of calmodulin and the mechanisms by which calmodulin regulates specific membrane transport events are mainly unknown.
The objective of this Thesis is to address the study of the clathrin-calmodulin interaction, whose functional significance has not been studied thus far, using the yeast Saccharomyces cerevisiae as a model system. S. cerevisiae has proven to be an extremely versatile organism for studying many cellular processes, because of the ease of combining biochemical analyses with genetic studies and live imaging in this organism and the evolutionary conservation of most essential eukaryotic cellular processes and proteins involved.
In this study, we reveal that the clathhrin heavy and light chains bind calmodulin not only in vitro but also in yeast, most likely in a calcium-dependent manner. Further, we describe a not-previouslycharacterized calmodulin binding site at the C-terminus of the clathrin heavy chain, and identify calmodulin point mutations that specifically disrupt their interaction with clathrin. Finally, we provide evidence supporting a specific role of the clathrin-calmodulin interaction in the retrograde transport from endosomes to the TGN. / La clatrina es una molécula evolutivamente conservada que envuelve las membranas que se endocitan desde la membrana plasmática y aquellas que se mueven entre la red trans-Golgi (TGN) y los endosomas de las células eucariotas, en las principales vías celulares reguladas secretoras y endocíticas. Muchas proteínas que interactúan con clatrina han sido identificadas, pero en algunos casos se desconoce la relevancia funcional de estas interacciones. Entre ellas, la interacción de la clatrina con la calmodulina, dos proteínas esenciales evolutivamente conservadas, fue detectada in vitro hace décadas pero no se sabe si interactúan in vivo y cuál es el significado funcional de esta interacción. La calmodulina es un sensor de calcio que juega un papel importante la regulación de una amplia variedad de proteínas y rutas de señalización importantes en todos los organismos eucariotas. Es importante destacar que también se ha visto implicada en la endocitosis, el tráfico de membranas y la fusión de endosomas. Sin embargo, muchas de las dianas de calmodulina y los mecanismos por los que la calmodulina regula eventos específicos de transporte de membranas son desconocidos.
En esta Tesis se aborda el estudio de la interacción clatrina-calmodulina, cuyo significado funcional no se ha estudiado hasta el momento, utilizando la levadura Saccharomyces cerevisiae como sistema modelo. En el estudio, revelamos que las cadenas pesada y ligera de clatrina se unen a calmodulina no sólo in vitro sino también en levadura, probablemente de una forma dependiente de calcio. Además, describimos un sitio de unión a calmodulina que no estaba previamente caracterizado, en el extremo C-terminal de la cadena pesada de clatrina, e identificamos mutaciones puntuales en calmodulina que alteran específicamente su interacción con la clatrina. Por último, aportamos pruebas que respaldan una función específica de la interacción clatrina-calmodulina en el transporte retrógrado desde los endosomas al TGN.
|
547 |
Anàlisi funcional de dominis de proteïnes implicades en la motilitat de Mycoplasma genitaliumBroto Hernández, Alícia 10 December 2014 (has links)
Mycoplasma genitalium és un patogen emergent de transmissió sexual. Aquest microorganisme sense paret cel·lular conté un dels genoma més petit que es coneix entre els organismes autoreplicatius i això el converteix en un model atractiu de cèl·lula mínima. Tot i l’aparent simplicitat, M. genitalium presenta un complex citoesquelet intern que polaritza la cèl·lula i li atorga la característica forma de pera, deguda a la formació d’un apèndix a un extrem de la mateixa. Aquest apèndix es coneix com organela terminal (OT) i està implicat en processos clau de la seva vida parasitària. L’OT té un paper central en la motilitat per lliscament del micoplasma. Aquest mecanisme únic i encara poc caracteritzat està relacionat amb molts aspectes de la seva biologia, amb especial rellevància en la patogènesi. L'objectiu general d'aquest treball és aprofundir en la comprensió d'aquest mecanisme mitjançant l'estudi de la contribució específica de diferents dominis de proteïnes prèviament relacionats amb l'OT o la motilitat.
L’OT s'organitza al voltant del citoesquelet intern. La proteïna MG218 és un dels elements principals del citoesquelet i té un paper central en la formació de l’OT. Recentment, s’ha identificat una nova proteïna que comparteix la seqüència C-terminal de MG218. Aquesta proteïna (MG218-s) és producte d’una traducció interna del gen MG218 però el seu inici de traducció exacte encara no està definit. Per entendre millor la funció d'aquesta proteïna, en el primer capítol, s’ha dissenyat una nova estratègia per introduir mutacions puntuals en el genoma de M. genitalium. Aquesta estratègia ha permès la identificació de la Met inicial de la proteïna MG218-s i s’ha obtingut i caracteritzat un mutant defectiu en MG218-s, però que segueix expressant la proteïna MG218.
El segon i tercer capítol se centren en l'estudi de la proteïna MG200, que és un element important de la maquinària de la motilitat. Les proteïnes MG200 i MG386 són els primers elements que s’han relacionat exclusivament amb la motilitat de M. genitalium. Aquestes proteïnes comparteixen diferents característiques, essent destacable la presència d'un domini ric en glicina i residus aromàtics (caixa EAGR), que es troba exclusivament en micoplasmes, aparentment sempre en proteïnes relacionades amb la motilitat i/o l'arquitectura de l’OT, com la MG312. L'anàlisi de l'estructura cristal·lina del domini de la caixa EAGR de MG200 suggereix un rol en interaccions proteïna-proteïna, on aquest domini podria servir de plataforma per interaccions macromoleculars. Ara bé, no s’han descrit defectes estructurals en l’OT de cèl·lules mutants amb delecions en proteïnes que contenen caixes EAGR. Per comprendre millor el paper d'aquest domini, en el segon capítol s'analitza el fenotip de mutants que expressen la proteïna MG200ΔE, que té delecionat específicament el domini de la caixa EAGR.
És interessant que la MG200 és una proteïna multidomini amb homologia amb co-xaperones Hsp40. La interrupció del locus MG_200 per la inserció de transposó dóna lloc a mutants adherents amb un fenotip no mòtil. Una anàlisi recent d'aquests mutants ha evidenciat la presència d'un fragment animo-terminal de MG200, que conté un domini J i una regió rica en glicina i fenilalanina característics de les proteïnes DnaJ. En el tercer capítol, s'ha estudiat la contribució d’aquests dominis amino-terminals de MG200 en la funció general de la proteïna. / Mycoplasma genitalium is an emerging sexually transmitted pathogen. This wall-less microorganism is among the smallest, self-replicating cell known. Its streamlined genome is an appealing model of a minimal cell. Behind this apparent simplicity, its cell membrane hides a complex cytoskeleton that shapes and polarizes the cell. In this way, cells show a differentiated tip structure, known as terminal organelle (TO), which is involved in key processes of its parasitic way of life. Moreover, TO is involved in gliding motility. This unique motility mechanism is related in many aspects of the biology of this microorganism, with especial relevance in pathogenesis. Nevertheless, the mechanics behind it is still poorly characterized. The general aim of the present work is to deepen the understanding of this mechanism by studying the specific contribution of different domains of proteins previously related with the TO or motility.
TO is organized around an internal cytoskeletal structure. MG218 protein is one of the main proteins of the cytoskeleton and has a central role in the TO formation. Recently, a novel protein that shares the C-terminal sequence of MG218 has been identified. This new protein (MG218-s) is translated from a specific mRNA transcribed from a promoter located inside mg218 gene but the precise translation start remains undefined. To gain insight into the function of this protein, in the first chapter we have addressed the construction of a MG218-s null strain still expressing the MG218 full-length protein. In order to obtain this mutant, a new strategy to introduce point mutations in the M. genitalium genome has been designed. This strategy allowed the identification of the starting Met of the MG218-s protein and the generation of an MG218-s null mutant that helped to understand the role of this new protein.
The second and third chapters are focused on the study of the MG200 protein, which is an important element of the motility machinery. MG200 and MG386 protein are the first elements to be related exclusively to motility in M. genitalium. These proteins share common features, being remarkable the presence of a well conserved Enriched in Aromatic and Glycine Residues domain (EAGR box). This domain is exclusively found in mycoplasmas, apparently always in proteins related with motility and/or with the terminal organelle architecture, as MG312. The analysis of the crystal structure of the MG200 EAGR box supported a role in protein-protein interactions, indicating that it can be a platform for interactions with other macromolecules. However, no apparent structural defects in the TO architecture have been shown by mutant cells bearing deletions in proteins containing EAGR boxes. To further understand the role of this domain, the second chapter analyzes the phenotype of mutants that express the MG200 protein bearing a deletion of the EAGR box domain. The observations made suggest that the EAGR boxes would play a relevant and specific role in motility.
Interestingly, MG200 is a multi-domain protein that has homology to the Hsp40 co-chaperones. Transposon disruption of MG_200 locus led to adherent strains with a non-motile phenotype. A recent analysis of these mutants has evidenced the presence of an N-terminus MG200 fragment, which contains a J-domain and a glycine and phenylalanine rich region (G/F) characteristic of DnaJ proteins. In the third chapter, we have studied the contribution of the amino-terminal domains of MG200 in its general function.
|
548 |
Initiation, progression and extension of parkinson’s disease: role of α-synucleinRecasens Ibabe, Ariadna 16 June 2014 (has links)
La malaltia de Parkinson és un trastorn neurodegeneratiu freqüent d’origen desconegut que es caracteritza principalment per la pèrdua de neurones dopaminèrgiques de la substància nigra pars compacta (SNpc) i la presencia d’inclusions proteiques intacitoplasmàtiques anomenades cossos de Lewy (CL), en diverses regions cerebrals afectades. Tot i que els CL es van descriure per primera vegada fa una dècada, encara es desconeix la seva rellevància en el procés patològic de la MP.
Recentment s’ha suggerit que l’ α-synucleina, el principal component dels CL, pot iniciar i extendre el procés patològic de la MP. Reforçant aquesta idea, la injecció intracerebral de fibrilles sintètiques d’α-synucleina recombinant poden iniciar una patologia de l’ α-synucleina en ratolins. Tot i així, encara es desconeix si aquest efecte patogènic de l’ α-synucleina recombinant sintètica es pot aplicar també a l’α-synuclein humana associada a la MP i ocórrer en especies més properes als humans. En aquesta tesis em tractat aquesta qüestió avaluant el possible efecte patogènic d’inocular extractes de CL nigrals que contenen α-synucleina i que han sigut obtinguts de pacients amb MP, en el cervell de ratolins i macacs. Aquests CL nigrals van ser purificats de cervells postmortem de pacients amb MP mitjançant un fraccionament de gradient de sucrosa i posteriorment es van inocular en la SNpc o estriat de ratolins i macacs. En ambdues espècies, les inoculacions intranigrals o intraestriatals dels extractes de CL derivats de pacients amb MP van provocar una neurodegeneració nigrostriatal progressiva que va començar als terminals dopaminèrgics de l’estriat. En animals injectats amb CL, l’α-synucleina humana exògena va ser ràpidament internalitzada per les neurones de l’hoste i va iniciar la conversió patològica de l’α-synucleina endògena. Al principi del procés neurodegenetiu induït pels CL, l’α-synucleina patològica del hoste es va acumular de manera difusa en les neurones de la SNpc i de regions cerebrals interconectades anatòmicament. Els efectes patogènics induïts pels CL van requerir tant l’α-synucleina present als CL com l’expressió d’α-synucleina endògena del hoste. Aquests resultats indiquen que les espècies humanes d’ α-synucleina presents en els CL derivats de pacients amb MP són patogènics i tenen la capacitat d’iniciar un procés patològic semblant a la MP.
Reforçant el rol patogènic de l’α-synucleina en la MP, s’ha descrit que els pacients amb MP contenen nivells incrementats d’aquesta proteina. En aquest sentit, la utilització d’eines molecular capaces de revertir l’expressió anormal d’α-synucleina a nivells fisiològics podria ser beneficiosa per la MP. Basant-nos en aquesta hipòtesis, el segon objectiu d’aquesta tesis era determinar la viabilitat i seguretat de disminuir l’expressió d’α-synucleina in vivo específicament en poblacions neuronals vulnerables en la MP mitjançant l’administració intranasal de small interferring RNA (siRNA. Per aconseguir-ho, primer de tot vam fer un screening in vitro de diferents siRNA per seleccionar aquells siRNA capaços de disminuir els nivells basals o sobreexpressats d’α-synuclein sense disminuir els nivells de β- ni γ-synucleina. A continuació, vam confirmar que la molècula seleccionada (SNCA499-siRNA) era capaç de disminuir els nivells de mRNA de la SN in vivo després de la infusió local en la SN de ratolins. Aquesta molècula es va modificar químicament per incrementar la seva bioestabilitat i es va conjugar al lligand indaltralina (IND) per promoure la seva entrada en neurones aminèrgiques, sent aquest últim validat en cultius primaris de mesencèfal de rata. Finalment, l’administració intranasal de IND-SNCA499-siRNA en ratolins va disminuir específicament l’expressió α-synucleina en la SNpc, tant a nivell de mRNA com de proteïna, sense afectar la integritat de la via nigrostriatal dopaminèrgica. Aquests resultats estableixen l’escenari per estudis futurs dirigits a determinar l’efecte beneficiós d’administrar intranasalment el IND-SNCA499-siRNA en models experimentals de la MP associats amb nivells incrementats d’α-synucleina. / Parkinson’s disease (PD) is a common neurodegenerative disorder of unknown origin mainly characterized by the loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta (SNpc) and the presence of intraneuronal proteinaceous cytoplasmic inclusions, called Lewy bodies (LB), in several affected brain areas. Although LB were identified a century ago, their significance to the pathogenic process in PD remains unknown.
Mounting evidence suggest that α-synuclein, a major protein component of LB, may be responsible for initiating and spreading the pathological process in PD. Supporting this concept, intracerebral inoculation of synthetic recombinant α-synuclein fibrils can trigger α-synuclein pathology in mice. However, it remains uncertain whether the observed pathogenic effects of recombinant synthetic α-synuclein can actually apply to PD-linked human α-synuclein and occur in species closer to humans. In this thesis, we addressed this question by assessing the potential pathogenic effects of inoculating α-synuclein-containing nigral LB extracts from PD patients into the brains of wild-type mice and macaque monkeys. Nigral LB containing pathological α-synuclein were purified from post-mortem PD brains by sucrose gradient fractionation and subsequently inoculated into the SNpc or striatum of wild-type mice and macaque monkeys. In both mice and monkeys, intranigral or intrastriatal inoculations of PD-derived LB extracts resulted in progressive nigrostriatal neurodegeneration starting at striatal dopaminergic terminals. In LB-injected animals, exogenous human α-synuclein was quickly internalized within host neurons and triggered the pathological conversion of endogenous α-synuclein. At the onset of LB-induced neurodegeneration, host pathological α-synuclein diffusely accumulated within nigral neurons and anatomically interconnected brain regions. LB-induced pathogenic effects required both human α-synuclein present in LB extracts and host expression of α-synuclein. These results indicate that human α-synuclein species contained in PD-derived LB are pathogenic and have the capacity to initiate a PD-like pathological process.
Further supporting a pathogenic role of α-synuclein in PD, increased levels of this protein have been described in PD patients. Therefore, molecular tools able to reverse abnormal α-synuclein expression back to physiological levels might provide therapeutic benefit in PD. Based on this hypothesis, in the second aim of this thesis we assessed the feasibility and safety of downregulating α-synuclein expression in vivo specifically in PD-vulnerable neuronal populations by intransal administration of cell-targeted small interfering RNA (siRNA) directed against α-synuclein. To achieve this goal, we performed first an in vitro screening of various siRNA sequences to select those able to downregulate basal or overexpressed α-synuclein without decreasing β- or γ-synuclein levels. Once identified, the selected molecule (SNCA499-siRNA) was then confirmed to be able to downregulate nigral α-synuclein mRNA in vivo by its local infusion in the SN of mice. This molecule was then chemically modified to enhance its biostability and conjugated to the cell-specific ligand indatraline (IND) to promote its selective delivery into aminergic neurons, the latter being validated in rat ventral midbrain primary cultures. Finally, intranasal administration of IND-SNCA499-siRNA to mice was able to selectively downregulate α-synuclein SNpc expression, both at mRNA and protein levels, without affecting the integrity of the dopaminergic nigrostriatal pathway. These results set the stage for future studies aimed at assessing the disease-modifying potential of intranasally delivered IND-SNCA499-siRNA in experimental PD models associated with increased α-synuclein levels.
|
549 |
The role of the PDK1/PKB kinases in regulating neuronal survival and differentiation: characterization of the PDK1 K465E knock-in miceZurashvili, Tinatin 25 April 2013 (has links)
Neuronal cell death programmes are counteracted by survival signals during development in
order to maintain the tissue homeostasis. Neuronal differentiation is a mechanism generating
functionally integrated neuronal cells from their progenitors. These processes appear to be
mediated via activation of the Ras/Raf/MAPK and the PI3K/PDK1/PKB signaling pathways
and are associated with a selective increase in protein translation. Protein kinase B (PKB/Akt)
is a serine/threonine protein kinase which is claimed to be the critical transducer for several
extracellular signals provided by different neurotransmitters, growth factors and hormones
that promote phosphoinositide 3-kinase (PI3K) activation. PI3K is a lipid kinase characterized
by its ability to phosphorylate the 3-OH group in the inositol ring of phospholipids at the inner
side of the plasma membrane to generate phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate
(PtdIns(3,4,5)P3 or PIP3), which is a potent second messenger. PKB regulation by its
activator PDK1 precisely relies on a PtdIns(3,4,5)P3 binding domain, named Pleckstrin
Homology domain (PH-domain). Both PDK1 and PKB are protein kinases of the AGC family
containing PH-domains which mediate their recruitment to the plasma membrane, where PKB
is activated by phosphorylation at two regulatory residues, namely Thr308 at the T-loop by
PDK1, and Ser473 at the hydrophobic motif by mTORC2. In fact, PDK1 was shown to be a
master kinase also playing an essential role in the activation of a number of AGC family
members by phosphorylating their T-loops by means of a PH domain-independent
mechanism. Activated PKB modulates the function of numerous substrates involved in the
regulation of cell metabolism, survival, proliferation and growth, which deregulation has
consequences in pathologies such as diabetes, cancer and neurodegeneration.
The crystal structure high resolution of the PDK1 PH domain revealed that the positivelycharged
lateral chain of Lysine at position 465 within the PH domain crystal establishes
fundamental interactions with the negatively-charged phosphate groups of PIP3. Targeted
mutagenesis of Lysine 465 to the negatively-charged aminoacid Glutamic acid abolished
binding of PDK1 to PIP3 by disrupting the phosphoinositide binding pocket. Therefore, it was
thought that this mutation could be instrumental in ablating this part of the PDK1 signaling
pathway. In order to analyze the role of the PDK1-PIP3 interaction in vivo, PDK1K465E/K465E
knock-in mice were generated which physiologically express from the endogenous locus a
mutant form of PDK1 incapable of phosphoinositide binding. This knock-in mice model was
shown to be a good tool to analyse the contributory role of the PKB signaling pathway to glucose metabolism. The PDK1K465E/K465E mice were shown to be viable but smaller, with a
modest reduction in PKB activity compared with the wild type littermates, and prone to
diabetes. The importance of this pathway in tumourogenesis has been highlighted by
introducing the PDK1 PH domain knock-in mutation into cancer-prone PTEN+/- mice, which
resulted in the delayed tumour onset, suggesting that even moderate reduction of PKB activity
can significantly delay tumour initiation and development. This makes the PDK1K465E/K465E
mutant mouse model an excellent tool to explore the contribution of PKB to different human
pathologies and to identify downstream substrates that could provide targets for therapeutic
intervention. In particular, I aimed to use this genetic model to unravel the role of PKB on
different aspects of brain development and function.
Stereological analysis of embryonic brain sections showed that the PDK1K465E/K465E mice
displayed reduced brain size due to a reduction in neuronal cell size rather than cell number,
since the number of cortical and hippocampal neuronal populations between PDK1K465E/K465E
and PDK1+/+ mice was not significantly different, whereas the volume of the mutant neuronal
soma was approximately 80% of the volume of the wild type neuronal soma.
Stimulation of cortical neurons with BDNF induced a robust phosphorylation of Trk receptors
followed by the phosphorylation of PKB at Thr308 in the PDK1+/+ cells, which is blunted in
the PDK1K465E/K465E neurons, whereas PKB phosphorylation at the mTORC2 site (Ser473)
proceeded normally in both type of cells. The moderate reduction of PKB activation was not
rate-limiting for the phosphorylation of those PKB substrates governing neuronal survival and
apoptosis such as FOXO and GSK3. Then, it was questioned whether such mutation could
affect survival responses in primary neuronal cultures. The findings from this study illustrate
that the integrity of the PDK1 PH domain is not essential to support the survival of different
embryonic neuronal populations analyzed. Cell viability is compromised after trophic factor
deprivation, whilst BDNF treatment rescues cells from death to the same extent in both
PDK1+/+ and PDK1K465E/K465E neurons.
In contrast, the moderate reduction of PKB activity in the PDK1K465E/K465E neurons markedly
reduced phosphorylation of the PRAS40 and TSC2 substrates, leading to decreased
mTORC1/S6K activation and also reduced BRSK protein synthesis. The PDK1K465E/K465E
neurons in culture showed reduced neurite outgrowth, delayed polarization and deficient
axonogenesis. To establish the possible causal relation between the PKB pathway defects and
axon formation, the impact of specific pharmacological treatments with PKB and mTORC1
inhibitors on neuronal differentiation were assessed, which provided strong evidence that the differentiation defects were due to reduced PKB activity and inefficient activation of the
mTORC1 signaling. Moreover, the overexpression of BRSK isoforms rescued the
axonogenesis defects of the PDK1K465E/K465E hippocampal cells. Altogether, these findings
illustrate how the binding of PDK1 to PIP3 creates a PKB signaling threshold which is
sufficient to support survival, but not differentiation of neuronal cells. In this regard, there is
increasing evidence that PI3K/PDK1 dependent, PKB independent pathways might be
responsible for the control of essential cellular processes, for example cell survival, which rely
on other members of the AGC family activated by PDK1.
These other PDK1-regulated members of the AGC family include SGK1, S6K and RSK. The
activation of these kinases is not dependent on PDK1 binding to PIP3 and therefore they
should be normally phosphorylated in the PDK1K465E/K465E knock-in mice neurons. However, I
observed decreased phosphorylation of the SGK substrate NDRG1. This study clearly states
for the first time, that NDRG1 is regulated by PKB, at least in neurons. Activation of S6K was
found also incomplete in the PDK1K465E/K465E neurons due to reduced mTORC1 PKBdependent
activation, which could be overcome by nutrients. In fact, the only PDK1 substrate
analyzed that appears to not to be affected by the PDK1 K465E mutation is RSK, which
serves as a control of the specificity of this knock-in mutation.
In summary, the data allow to conclude that full activation of PKB is not essential in
controlling neuronal survival. In marked contrast, reduced PKB-mediated, mTORC1-
dependent, BRSK expression resulting from lack of PDK1-phosphoinositide binding prevents
neuronal differentiation.
|
550 |
Structural Insights into Substrate Binding and Regulation of E3 Ubiquitin Ligases in the Nedd4 Family using NMR SpectroscopyEscobedo Pascual, Albert 06 November 2014 (has links)
Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / Nedd4L is a HECT-type E3 ubiquitin ligase (it covalently binds ubiquitin molecules before transferring them to the final substrate). Ubiquitination is a posttranslational modification (PTM) that labels proteins for a variety of fates, the most relevant one being proteasome-mediated degradation. Nedd4L is responsible for the regulation of the turnover of the sodium channel ß-ENaC as well as Smad2/3, mediator proteins of the signalling pathway activated by TGF-ß-like cytokines. It also targets the TGF-ß receptor itself. Defects in its function have been related to hereditary hypertension (Liddle’s syndrome), and could be relevant in certain sorts of cancer and metastasis.
CDK8/9 and GSK3-ß are two kinases that regulate the phosphorylation of the Smads, enabling them to carry out their function in cooperation with transcription factors and other partner proteins. At the same time, they label the Smads for their recognition by ubiquitin ligases. This provides the cell with a mechanism to give a transient response to the cytokines of the TGF-ß type. In order to identify the residues and the phosphorylation patterns that are relevant for the interactions of the Smads with both the transcription factors and the ubiquitin ligases, we have prepared a set of phosphopeptides corresponding to the sequences of Smad1 and Smad3.
Like all other members of the Nedd4 family, Nedd4L has a multi-domain architecture of the type C2-WW-HECT. Several ligases of the family exist in a latent conformation established through inter-domain contacts that occlude the catalytic site in the HECT domain, involving either the C2 domain (Smurf1, Smurf2, WWP2, Nedd4, Nedd4L) or the central segment where the WW domains are located (Itch). Certain cellular events displace these contacts, inducing the transition to the active conformation. In the case of Nedd4L, increases of the intracellular levels of Ca2+ activate the ligase. The hydrolysis of the membrane phospholipid phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) delivers into the cytosol the inositol 1,4,5-triphosphate (IP3), a second messenger that mobilizes the intracellular Ca2+ reserves. The C2 domain of Nedd4L interacts both with Ca2+ ions and with IP3. Using a structural and biophysical approach based on Nuclear Magnetic Resonance (NMR) we have described the specific interactions between the HECT and C2 domains that inhibit the catalytic function. Ca2+ binds the C2 domain with high affinity using the same binding surface and compromises these contacts. In addition, it mediates the interaction with IP3. These results provide the structural fundament for the activation and the relocation to the plasma membrane of Nedd4L mediated by Ca2+.
The HECT domain has a highly conserved PY site (HECT-PY). The PY motifs are the sequences recognized by WW domains. Central to this recognition is the coordination of the tyrosine residue in the PY motif by the WW domain. In the crystallographic structure of the Nedd4L HECT domain the tyrosine residue of the HECT-PY motif appears buried in the hydrophobic core and not accessible for binding. It has been shown that the WW domains of Nedd4L recognize the HECT-PY motif of the ligase only after the unfolding of the HECT domain. We raised the hypothesis that the recognition of the HECT-PY motif by one of Nedd4L WW domains may play a role in the auto-ubiquitination mechanism of the ligase. Our data confirm that only when the fold of the HECT domain is partially damaged, the PY site is accessible for being recognized by the WW domains. We present the NMR solution structure of the complex between the WW3 domain and the HECT-PY motif. The site is protected in functional Nedd4L molecules, which are able to recognize it in damaged molecules and label them with ubiquitin for degradation. / Nedd4L és una E3 ubiquitín lligasa responsable de la regulació de la vida mitja del canal de sodi ß-ENaC i de Smad2/3, proteïnes mediadores de la ruta de senyalització activada per citocines TGF-ß. Defectes en la seva funció han estat relacionats amb la hipertensió hereditària (Síndrome de Liddle), i podrien ser rellevants en determinats tipus de càncer i metàstasi.
CDK8/9 i GSK3-ß són dues quinases que regulen l’estat de fosforilació de les Smads, habilitant-les per dur a terme llur funció en cooperació amb factors de transcripció al mateix temps que les marquen per ser reconegudes per ubiquitín lligases. Amb l’objectiu d’identificar els residus i els patrons de fosforilació rellevants hem preparat un set de fosfopèptids que corresponen a les seqüències de Smad1/3.
Nedd4L presenta una arquitectura multi-domini C2-WW-HECT. Diverses lligases de la família de Nedd4 existeixen en una conformació latent en què contactes inter-domini oclouen el lloc catalític en el domini HECT, involucrant bé el domini C2 (Smurf1/2, WWP2, Nedd4, Nedd4L) o la zona central amb els dominis WW (Itch). Certs esdeveniments cel•lulars desplacen aquests contactes, induint la transició a la conformació activa. L’increment dels nivells intracel•lulars de Ca2+ activa Nedd4L. La hidròlisi del fosfolípid de membrana PIP2 allibera l’IP3 provocant aquest increment. El domini C2 de Nedd4L interacciona tant amb el Ca2+ com amb l’IP3. Utilitzant l’RMN hem descrit els contactes HECT-C2 en la conformació latent i hem observat que el Ca2+ s’uneix al domini C2 amb alta afinitat utilitzant el mateix lloc d’unió, a més d’afavorir la interacció amb l’IP3. Així, hem aportat el fonament estructural per a l’activació i relocalització a la membrana cel•lular de Nedd4L.
El domini HECT presenta un lloc PY altament conservat (HECT-PY). Els motius PY són reconeguts pels dominis WW. Proposem que el reconeixement del motiu HECT-PY per part d’un dels dominis WW de Nedd4L estigui implicat en l’auto-ubiquitinació. Hem observat que només quan el plegament del domini HECT està compromès, el lloc PY és accessible. Presentem l’estructura per RMN del complex WW3-HECT-PY. El motiu està protegit en molècules funcionals de Nedd4L, capaces de reconèixer-lo en molècules danyades i ubiquitinar-les.
|
Page generated in 0.0579 seconds