Tesi realitzada al Centre de Recerca en Agrigenòmica (CRAG) / La enzima FPS ocupa una posición clave en la vía del MVA, ya que a partir de sus sustratos, IPP y DAMPP, y del producto de la reacción que cataliza, FPP, se sintetizan compuestos isoprenoides imprescindibles para el crecimiento y desarrollo de las plantas, y para su relación con el entorno. A. thaliana posee dos genes FPS, AtFPS1 y AtFPS2, que codifican tres isoenzimas, FPS1L, FPS1S y FPS2. La caracterización de mutantes de A. thaliana con pérdida de función de los genes AtFPS1 y AtFPS2 demostró que la actividad FPS es esencial para el desarrollo de las plantas, ya que el doble mutante Atfps1:Atfps2 presenta letalidad embrionaria. La letalidad embrionaria del doble mutante hizo imposible estudiar en profundidad la función y los mecanismos de regulación en los que se encuentran implicadas las isoenzimas FPS en las plantas adultas. En el Capítulo de esta tesis doctoral se atenuó la expresión de los genes AtFPS empleando una estrategia de silenciamiento inducible basada en el uso de microRNAs artificiales (amiRNA). Se obtuvieron líneas mutantes de fps condicionales en donde se observó una importante reducción en los niveles de mRNA, proteína y actividad FPS, un fenotipo de clorosis y una reducción importante del tamaño especialmente en la raíz, una reducción significativa en los niveles de los esteroles mayoritarios, un aumento de la actividad HMGR, una disminución en el número, el tamaño de los cloroplastos, en conjunto con una dramática alteración en la organización de los cloroplastos y una reducción en los niveles de clorofilas y carotenoides. Además el estudio de la expresión génica global mediante RNA‐seq identificó importantes grupos de genes desregulados asociados a la homeostasis de Fe, al metabolismos antioxidante GST y a la vía de señalización del JA. Todos estos antecedentes sugieren que el bloqueo en la síntesis de FPP, además de la reducción de los niveles de isoprenoides citosólico, desencadena a través de mecanismos aún desconocidos, una respuesta que interconectan la vía de isoprenoides, ubicada en el citosol, con el cloroplasto. Este trabajo representa la primera aproximación transcriptómica sobre la función de los genes AtFPS, la cual entrega datos relevantes acerca de su efecto sobre la expresión génica global y por lo tanto, sobre su interacción en otros procesos esenciales para la planta hasta completamente desconocidos. Por otro lado, en el Capítulo II se abordó una serie de estrategias para la producción en el citosol de nerolidol, componente de la HIVPs considerado uno de los volátiles de interés ecológico y económico, por su capacidad para atraer insectos carnívoros. Trabajos previos apuntaban a que la limitante para incrementar la producción de este compuesto en el citosol atendía a la disponibilidad del sustrato FPP. Esto puede explicar el bajo rendimiento obtenido en diversos intentos realizados para producir sesquiterpenos en el citosol mediante la expresión de diferentes sesquiterpeno sintasas. En cambio, la expresión de sesquiterpenos sintasas en otros compartimientos celulares, como el cloroplasto y la mitocondria, ha permitido superar los mecanismos homeostáticos que limitan la disponibilidad del FPP citosólico, a pesar de que las sesquiterpeno sintasas son enzimas que habitualmente se encuentran en el citosol. En este contexto, mediante la expresión transitoria en hojas de N. benthamiana de las diferentes versiones de la sesquiterpeno sintasa FaNES1 anclada a las membranas del RE, se observó un incremento de la producción de nerolidol en el compartimento citosólico. Además se utilizaron enzimas bifuncionales FPS1/FaNES1 que permitieron la producción de nerolidol en el citosol. Todos estos resultados sugieren que la síntesis de nerolidol depende esencialmente de los niveles de proteína FaNES1, lo que indica que la limitación para la producción de sesquiterpenos en este compartimento es un problema de estabilidad de la proteína y no de disponibilidad de sustrato. / "Study of gene silencing synthase and farnesyl Metabolic engineering for production of sesquiterpenes in Arabidopsis" In the first chapter of this thesis, the expression of AtFPS genes was attenuated using an inducible silencing strategy based on the use of artificial microRNAs (amiRNA). fps conditional mutant lines showed a significant reduction in the levels of mRNA, protein and FPS activity. Silenced plants displayed a chlorotic phenotype and a significant reduction in the size especially in the root. A significant reduction in the levels of the major sterols was observed unless HMGR activity was significantly induced. Mutant plants showed a reduction in chloroplasts number and size which in conjunction resulted in a dramatic alteration in chloroplasts organization and a reduction of chlorophylls and carotenoids levels. Furthermore, the study of global gene expression by RNA‐seq led us to the identification of groups of deregulated genes involved in Fe homeostasis, GST metabolism and JA signaling pathway. Our data suggests that blocking the synthesis of FPP, through yet unknown mechanisms, generates a response that connect isoprenoid production in both the cytosol and the chloroplast. In Chapter II we have developed several strategies for the production of nerolidol in the cytosol, a typical sesquiterpene produced by HIPVs. We have achieved an increased production of nerolidol in the cytosol when overexpressing different versions of FaNES1 sesquiterpene synthase anchored to the ER membranes in N. benthamiana leaves. Furthermore, FPS1/FaNES1 bifunctional enzyme also enabled the efficiently production of nerolidol in the cytosol. Both FaNES1 anchored in the ER membranes as well as the cytosolic expression of a fusion protein with GFP or FPS1S isoform tremendously increase the enzyme stability and gave rise to the production of nerolidol. Our results indicate that the production of nerolidol in the cytosol essentially depends on FaNES1 protein levels, suggesting that the limitation for the production of sesquiterpenes in this compartment is a problem of stability of the protein rather than substrate availability.

El intestino de los mamíferos es uno de los ecosistemas más densamente poblados. Los microorganismos que lo habitan constituyen la denominada microbiota, que cumple importantes funciones para el huésped. Alteraciones en la composición de la microbiota pueden ser la base de diversas patologías, por ello la administración de probióticos se contempla como una estrategia preventiva o terapéutica. Con la finalidad de profundizar en aspectos moleculares de la comunicación microbiota-epitelio intestinal, hemos abordado estudios sobre las proteínas secretadas por la cepa probiótica E. coli Nissle 1917 (EcN). El objetivo de este trabajo fue abordar estudios encaminados a caracterizar el secretoma de la cepa EcN, establecer qué proteínas son secretadas a través de OMVs y proceder a la caracterización funcional de una de ellas. El análisis in silico del proteoma de OMVs, así como del secretoma global de la cepa EcN indican que las proteínas identificadas desempeñan funciones relacionadas con la adhesión, modulación del sistema inmune o supervivencia de la bacteria en nichos del huésped. El análisis protéomico de OMVs obtenidas en diferentes medios evidenciaron que el medio de crecimiento influye en la composición de las proteínas exportadas a través de vesículas, lo que puede repercutir en el tipo y diversidad de funciones asociadas a estas estructuras. Una de las proteínas identificada en el sobrenadante de cultivos de la cepa EcN en medio LB fue la proteína Sat (serin protease autotransporter toxin), codificada por un gen presente en la isla genómica II de esta cepa. Estudios previos habían descrito esta proteína sólo en cepas patógenas, no existiendo referencias sobre la función de Sat en la cepa probiótica. Por tanto, nuestro objetivo fue analizar si Sat es expresada en el tracto intestinal y secretada en forma activa por la cepa EcN. Con este análisis se pretendía establecer si Sat ha de ser considerada un factor de virulencia o, por el contrario, un factor fitness que contribuye a una mejor colonización a nivel intestinal. Los resultados obtenidos en este trabajo nos permitieron afirmar que Sat, no debe ser considerada un factor de virulencia. La proteína es secretada y expresada en forma funcional. Sin embargo, a pesar de poseer actividad serin proteasa y actuar sobre la permeabilidad paracelular, este último efecto es compensado por otros componentes secretados por la cepa probiótica. La proteína Sat, no parece estar implicada en la formación de biofilms, ni posee actividad citotóxica sobre células Caco-2 polarizadas. Estudios de colonización en modelos murinos permitieron establecer además que Sat no es requerida para la colonización intestinal. Sin embargo quedó demostrado tanto en modelos in vivo como en modelos de competición in vitro en crecimiento planctónico, que la cepa EcNsat::cm es capaz de desplazar a la EcN wild type, además de desplazar más eficientemente a una cepa enteropatógena como EPEC. / Microorganisms that inhabit the mammalian intestine are called microbiota, which performs important functions for the host. Changes in microbiota composition are the basis of various pathologies. Thus, probiotic administration is seen as a preventive or therapeutic strategy. To deep in molecular aspects of probiotic/ intestinal epithelium cross-talk, we addressed studies to characterize proteins secreted by the probiotic E. coli Nissle 1917 (EcN). Proteomic analysis of outer membrane vesicles (OMVs) and the global secretome of EcN indicated that the identified proteins perform functions related to adhesion, immune system modulation or bacterial survival in host niches. Proteomic analysis of OMVs showed that the growth medium influences the protein composition of these vesicles, which can affect the type and variety of functions associated with these structures. One protein identified in the EcN secretome was Sat (serine protease autotransporter toxin). This protein has been proposed to act as a virulence factor in pathogens but its role in probiotic strains has not been addressed so far. Our aim was to characterize Sat from EcN to establish whether it is a virulence or a fitness factor that contribute to better colonization of gut. Our results show that Sat is expressed and secreted as an active serine protease. Its effect on paracellular permeability seems to be compensated by other factors secreted by this probiotic. Moreover, Sat does not display cytotoxic activity on polarized Caco-2 cells. Analysis of biofilm formation and studies using murine models allowed us to establish that Sat is not required for intestinal colonization. However, in vivo colonization competition experiments showed that the EcNsat::cm outcompete the wild type strain. In vitro experiments confirmed that EcNsat::cm is able to displace in planktonic growth wild type EcN as well as enteropathogenic E. coli (EPEC). Results presented rule out that Sat is a virulence factor in strain EcN.

En este trabajo, el objetivo principal ha sido el estudio del mecanismo del co-transporte de la permeasa de melibiosa (MelB) de Escherichia coli. Este proteina de membrana realiza co-transporte activo de varios oligosacáridos utilizando la fuerza electroquímica de cationes. Una característica remarcable de este transportador es el hecho que permite utilizar tres diferentes cationes, el protón, el sodio y el litio. Los sustratos con mayor afinidad a la proteína son el sodio y la melibiosa. Para cumplir nuestro objetivo principal se llevó a cabo el estudio de los dominios C-terminales de la proteína reconstituida como proteoliposomas. El bucle existente entre las hélices 10 y 11 así como la hélice XI del transportador se revelaron como dominios fundamentales para el funcionamiento del transporte activo. Estudios previos indican que la substitución de diversos amino ácidos por una cisteína impide el transporte. Con la técnica de mutagénesis dirigida se obtuvieron substituciones de amino ácidos en la proteína MelB, generando así múltiples mutantes con diferentes propiedades de unión, de translocación y de liberación de los sustratos. La solubilizacion de los mutantes generados se realizó con los detergentes LAPAO y DDM. Después de varios pasos de purificación, los mutantes de la MelB se reconstituyeron en liposomas de Escherichia coli para simular así el hábitat natural del transportador. Con técnicas espectroscópicas (infrarrojo y fluorescencia) se analizaron la unión de diferentes mutantes de MelB a los sustratos. Este estudio puso de manifiesto el papel crucial del amino ácido Lys-377 en el transportador MelB. Substituciones de dicho amino ácido por cisteína, valina, histidina, arginina y ácido aspártico mostraron como el transportador perdía completamente la unión a sodio y pasaba a acoplar el azúcar sólo en presencia del protón pero de manera disminuida. La carga en posición 377 de la MelB destaca por mantener el acoplamiento a los sustratos. Otra característica importante de la MelB es el volumen de cadena lateral que influye en la unión a sodio y melibiosa. La búsqueda de revertantes se realizó a través de un fenotipo diferente de la cepa, haciéndola crecer en placas de agar suplementadas de melibiosa. Los mutantes con un defecto de transporte, como es el caso de los mutantes de Lys-377, eran reconocidos al formar éstos colonias blancas, a diferencia de los revertantes, que generaban colonias rojas, indicando este color un pH dentro de la célula distinto en ambos casos. El cambio rojo en los revertantes es debido a la hidrólisis de la melibiosa en dos monosacáridos, glucosa y galactosa. La hidrólisis disminuye el pH que es detectado por el indicador suplementado en la placa. La secuenciación de estas subcolonias rojas reveló substituciones de los amino ácidos Ile-22 por serina y Leu-236 por fenilalanina. La mutación I22S ocurre en todos mutantes singulares de Lys-377, pero el desplazamiento de Leu-236 por fenialalanina sólo se detectó en el mutante K377R. Ninguno de los revertantes de K377/I22S recuperó la unión al azúcar en proteoliposomas y únicamente K377C/I22S fue capaz de unir el sodio pero con una afinidad menor. Los espectros de absorbancia de los revertantes indicaron que existe una cierta correlación entre cambios conformacionales de la MelB y la ausencia de señales en espectros de diferencia provocada por sodio. Como controles se usaron los mutantes singulares I22S y I22A que como revelan los espectros de diferencia, mantienen la capacidad de unión a el sodio pero no al azúcar. La isoleucina en posición 22 podría formar parte del sitio de unión de la melibiosa en MelB. Solubilizando el revertante K377R/L236F con LAPAO, detergente común para la purificación de MelB, demostró que dicho mutante tiene una afinidad disminuida a sus sustratos, tal y como demuestran los espectros de diferencia y fluorescencia. Sin embargo, las vesículas del mutante K377R/L236F tienen la capacidad de unir un análogo fluorescente de azúcar similar al C-less, la wild-type permeasa sin cisteínas. La solubilización del mutante con DDM unía los sustratos con mucha más afinidad que el mismo mutante solubilizado con LAPAO y mantienía la estructura similar a C-less. La prueba con K377C/L236F, un doble mutante generado por PCR, no reveló interacciones con los sustratos. Este resultado indica la importancia de la carga positiva conservada de la arginina en combinación con cambios estructurales para mantener la capacidad de unión de los sustratos. En la segunda parte se examinaron mutaciones con cisteínas de varios amino acidos cargados colocados en el bucle entre las hélices transmembranales X y XI. Estudios previos del transporte activo indican que tres amino ácidos perdían la capacidad de acumular melibiosa contra el gradiente. Los residuos Asp-351, Asp-354 y Arg-363 estudiados a través de IRdiff y fluorescencia, demuestraron la persistencia de unión a sodio aunque reducida. Los tres mutantes de MelB unían el azúcar también pero de una forma drásticamente reducida. Sólo en un revertante se descubrió un desplazamiento también en Ile-22 por una serina como en el caso de Lys-377. El revertante D354C/I22S demostró un incremento de la unión a sodio, pero una pérdida total de la unión a melibiosa. En el parte final de la tesis, se generaron ocho mutantes. Cada mutante con una mutación en un amino ácido diferente colocados todos ellos en la hélice XI de la MelB. Q372C, G379C, F385C, L391C y G395C mantuvieron la unión de sodio de manera equivalente a C-less. A383C y Y396C mostraron una cierta reducción de la señal mediada por sodio. El mutante G379V fue el único mutante que perdió totalmente la interacción con el catión. Los espectros de IRdiff inducido por melibiosa demostraron en A383C, L391C y Y396C una afinidad muy baja al azúcar. G379V tampoco fue capaz de unir la melibiosa. / This doctoral thesis was dedicated to the study of the secondary transporter, the melibiose permase (MelB) from Escherichia coli with biochemical and biophysical methodologies. The main objective was to obtain insights of the symport mechanism of MelB. This prokaryotic transporter uses the downhill translocation of a cation to transport the disaccharide melibiose against its concentration gradient into the cell. Although MelB possess the highest affinity for Na+ cations, the transporter can couple the transport process also to the smaller Li+ and H+ ions. Apart from melibiose, MelB transports a variety of α- and β-galactosides making it versatile carrier. The transporter comprise 70% of hydrophobic amino acids and is organized in 12 transmembrane spanning helices connected by hydrophilic loops. As preliminary studies already reveal, the C-terminal domains of MelB has been proven to play a crucial role in the active transport mechanism. The focus in this doctoral thesis lies especially on the helices X and XI as well as the interconnecting cytoplasmic loop 10-11. Site-directed mutagenesis delivered valuable information about important amino acids which might participate in the active transport by forming part of the binding sites or taking part in the translocation and release of the substrates. During our study, numerous MelB mutants have been extracted from the membrane by using the detergents LAPAO and β-DDM. Subsequently, the solubilized transporter was reconstituted into liposomes composed of lipids from E. coli mimicking MelB’s original habitat. As the only charged residue residing in the transmembrane segment XI, Lys-377 was replaced by cysteine, valine, arginine, histidine and aspartic acid. None of these MelB mutants interacts with sodium concluded from infrared difference spectra (IRdiff) induced by the cation Na+. The melibiose binding is only remotely detectable in K377R, K377H and K377C in the presence of the proton. K377V and K377D lost the interaction with the sugar molecule. The charge in the particular position in MelB is important but not sufficient to conserve the substrate binding. The amino acid substitutions of Lys-377 appear as white colonies on a MacConkey agar plate. This color indicates the absence of hydrolysis of the melibiose into the monosaccharides, glucose and galactose. A metabolisation of the sugar is indicated by a red colony. In these colored bacteria, the sugar hydrolysis causes an acidification of the medium indicated by the MacConkey agar which stains the bacterial colonies. The screening of potential revertants, second site mutations which allow sugar influx, demonstrate the appearance of a unique second site mutation I22S which turn the former white colonies of the Lys-377 mutants into a red phenotype. Another red-colored phenotype appeared only for the mutant K377R, in which Leu-236 is replaced by a phenylalanine. All K377/I22S revertants are not able to restore the melibiose binding in proteoliposomes and only the revertant K377C/I22S recovered a partial sodium binding. The absorbance spectra of the single Lys-mutants as well as the corresponding revertants indicate a correlation between the absence of sodium binding and conformational changes of the MelB transporter. These structural changes are identical to previously examined MelB mutants D55C, D59C and D124C which also demonstrated a detrimental impact on the Na+ binding. The single mutants I22S and I22A exhibit a clear response of the structure in the presence of Na+. The interaction with melibiose on the contrary is lost in these MelB mutants. This outlines Ile-22 as a potential amino acid participating in the binding process of the melibiose molecule in MelB. The second revertant K377R/L236F demonstrates only minor interaction with the Na+ as well with the melibiose in proteoliposomes. Measurements using membrane vesicles of this mutant demonstrate however a large Förster energy transfer (FRET) signal mediated by the fluorescent sugar analog, D2G. By extracting the mutant K377R/L236F with β-DDM instead of LAPAO, the solubilised and then reconstituted transporter exhibits a clear improvement considering the conservation of the MelB structure. IRdiff spectroscopy results concluded that the K377R/L236F mutant binds melibiose and Na+, although the cation-induced difference spectra differs from the C-less reference. The PCR-generated double mutant K377C/L236F failed to demonstrate similar interactions with the substrates in proteoliposomes as well as in membrane vesicles. The positive charge in position 377 is essential for the MelB transporter, but the sole charge is not sufficient for the substrate binding. The charge requires also structural arrangement to interact with the sugar and the co-ion. In the second part of the PhD thesis, cysteine mutants replacing charged residue in the cytoplasmic loop 10-11 were characterized for their ability of substrate binding. The transport-defective mutants D351C, D354C and R363C couple sodium with reduced affinity indicated by their low intense IRdiff spectra. The melibiose binding is even further reduced in these MelB mutants. Appearing as white colonies on MacConkey agar plate, the screening of potential revertants only revealed a second site mutation for D354C. Interestingly, Ile-22 was substituted for a serine like in the Lys-377 mutants. Congruent results with the K377/I22S mutants indicate for D354C/I22S the loss of sugar binding. However, the sodium triggers a difference spectrum similar to C-less and much more intense than in the D354C single mutant. This indicates a tight interaction of the cation with the MelB mutant D354C/I22S. In the third part of this thesis, eight mutants were generated by replacing crucial residues in the C-terminal helix XI of MelB with cysteine. The mutants Q372C, G379C, F385C, L391C and G395C show an almost normal interaction with Na+. A383C and Y396C on the other side display a Na+-induced IRdiff with low intensity indicating their impaired cation binding. Considering the interaction with melibiose, all helix XI mutants bind the sugar in the presence of either the proton or Na+. The MelB mutants A383C, L391C and Y396C exhibit a melibiose-induced difference spectrum with very low intensity indicating their importance for the binding process. Tested in vesicles and proteoliposomes, G379V is the only characterised mutant which lacks sodium and sugar binding making this mutant a potential candidate for crystallography trials to obtain the structure of the empty MelB transporter.

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) has a biased nucleotide composition different from human genes. This raises the question of how evolution has chosen the nucleotide sequence HIV-1 observed today, or to what extent the actual encoding contributes to virus replication capacity, evolvability and pathogenesis. Prior work has documented the effectiveness of making changes to the codon-pair bias of viral genomes in order to generate attenuated poliovirus and influenza virus. In this thesis, we applied the previously described synthetic attenuated virus engineering (SAVE) approach to HIV-1. Using synonymous codon pairs, we rationally recoded and codon pair–reoptimized and deoptimized different moieties of the HIV-1 gag and pol genes. RNA structures and codon usage of new recoded fragments were not affected by recoding. Deoptimized viruses had significantly lower viral replication capacity in MT-4 cells and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Various degrees of ex vivo attenuation were obtained depending upon the specific deoptimized region and the number of deoptimized codons. After restricting viral replication to a single cycle by using a single-cycle HIV-1 vector, a significant reduction in protein production was observed in the vector carrying an attenuated virus variant. This reduction in protein synthesis was not accompanied by a reduction in the targeted transcript copy number, which strongly suggests that translation, and not transcription, is implicated in the generation of the attenuated phenotype by SAVE technology. A protease reoptimized virus carrying 38 synonymous mutations was not attenuated and displayed a replication capacity similar to that of the wild type virus in MT-4 cells and PBMCs. Although attenuation is based on several tens of nucleotide changes, after serial passages in MT-4 cells, both gag and protease deoptimized HIV-1 reverted to wild-type virulence in MT-4 cells while some maintain a certain attenuation degree in PBMCs. Quasispecies analysis of viral passaged sequences showed that attenuated viruses accumulated either synonymous mutations (reversions to wild-type sequences or novel mutations) or non-synonymous mutations. Recoded viruses explored different space sequences. Remarkably, no important reversion was observed in the reoptimized virus. Thus, these data demonstrate that SAVE is a useful strategy to gradually affect the replicative properties of HIV-1 by a mechanism that involves translation. HIV-1 with different degrees of attenuation can be a useful tool for the development of a safe and effective vaccine as well as the development of safer gene-therapy lentiviral vectors. / El virus de la immunodeficiència humana 1 (VIH-1) conté una composició de nucleòtids diferent de la existent en el gens humans. Aquest fet planteja les qüestions de com la evolució ha triat la seqüència nucleotídica del VIH1 observada avui en dia, i de fins a quin punt aquesta seqüència actual contribueix a la capacitat replicativa, evolució i patogènesis virals. S’ha descrit que canvis en el ús de parelles de codons són eficaços per tal de generar virus atenuats de Poliovirus i Influenza. En aquesta tesi, hem aplicat la tecnologia prèviament descrita, “synthetic attenuated virus engineering” (SAVE) al VIH-1. Emprant parelles de codó sinònimes de manera racional, hem recodificat reoptimizant i desoptimizant per parelles de codó diferents fragments dels gens gag i pol del VIH-1. Les estructures de ARN i el us de codó dels nous fragments recodificats no es van veure afectades per la recodificació. Els virus desoptimizats van mostrar una replicació viral significativament inferior al virus control en cèl·lules MT-4 i en cèl·lules mononuclears de sang perifèrica (PBMCs). Depenent de la regió específica desoptimizada i del número de codons desoptimizats, es van obtenir diversos nivells d’atenuació ex vivo. Una reducció significant en la producció proteica es va observar quan la replicació viral va ser restringida a un sol cicle de replicació emprant un vector VIH-1 d’un sol cicle de replicació. La menor producció proteica no va correlacionar amb una reducció en el número de còpies del transcrit diana. Aquest fet suggereix que la transcripció, i no la traducció, es troba implicada en la generació dels fenotips atenuats produïts per la tecnologia de SAVE. El virus de proteasa reoptimizat que contenia 38 mutacions sinònimes, no es va mostrar atenuat, ans el contrari, mostrava una capacitat replicativa similar a la del virus control en cèl·lules MT-4 i en PBMCs. Encara que l’atenuació dels virus desoptimizats es basava en varies desenes de canvis nucleotídics, després de varis passis seriats en cèl·lules MT-4s, els virus desoptimizats de les regions de gag i proteasa van revertir a la virulència del virus control en cèl·lules MT-4. Alguns virus desoptimizats passats encara van mantenir un cert grau d’atenuació en PBMCs. Els anàlisis de quasiespècies de les seqüències dels virus passats en cultiu van mostrar que els virus atenuats acumulaven o bé mutacions sinònimes (reversions a la seqüència control o noves mutacions) o bé mutacions no-sinònimes. Els virus recodificats per la tecnologia de SAVE exploren diferents espais de seqüència. Singularment, no es va observar cap reversió important al virus reoptimizat passat en cultiu. Per tant, totes aquestes dades demostren que la tecnologia de SAVE és una estratègia útil per a afectar gradualment fenotípicament la capacitat replicativa del VIH-1, mitjançant un mecanisme que implica la traducció. El VIH-1 amb diferents nivells d’atenuació pot ser una eina utilitzable per al desenvolupament d’una vacuna segura i efectiva, així com pel desenvolupament de vectors lenvirals per a teràpia gènica més segurs.

El text del capítol 4 i el de les pàgines 172 a 174 han estat retirats seguint instruccions de l’autora de la tesi, en existir participació d’empreses, existir conveni de confidencialitat o existeix la possibilitat de generar patents / El texto del capítulo 4 y las páginas 172 a 174 han sido retiradas siguiendo instrucciones de la autora, al existir participación de empresas, convenio de confidencialidad o la posibilidad de generar patentes / The text of chapter 4 and pages from 172 to 174 have been withdrawn on the instructions of the author, as there is participation of undertakings, confidentiality agreement or the ability to generate patent // Tesi realitzada a l'Institut de Bioenginyeria de Catalunya / Optical tools to control neuronal activity include synthetic photoswitchable ligands of receptors and ion channels. Photoswitches can act either as soluble molecules (photochromic ligands, PCLs) or tethered to the protein (photoswitchable tethered ligands, PTLs), and they have been used to photocontrol many ion channels and receptors such as voltage-gated potassium channels, acetylcholine or glutamate receptors. Recognizing both the need for new optical tools in neuroscience and the opportunities offered by photoswitches, this work is focused on the use of light gated glutamate receptors to control neuronal activity and neurotransmission. In the first chapter of results of the thesis, we demonstrate that the Ca2+-permeable LiGluR can be used as a tool to reversibly control neurosecretion by directly affecting the intracellular [Ca2+]. To achieve this goal, LiGluR was expressed in cultured bovine chromaffin cells and cultured hippocampal neurons. We measured secretion in chromaffin cells using two techniques, amperometry and membrane capacitance, and current-clamp recordings to assess neurotransmission in cultured neurons. The results indicated that the magnitude of LiGluR-mediated Ca2+ influx is sufficiently large to trigger regulated exocytosis in chromaffin cells and neurons. In addition, LiGluR induced secretion can be modulated with the wavelength of illumination. This new application of LiGluR opens the possibility to reversibly control the activity of individual synapses, which might help to understand the computational properties of neurons and to unravel how brain circuits work. To use LiGluR as an effective method to interrogate the neuronal function it should support high-spatial 3D resolution and tissue penetration. Multiphoton excitation with near-infrared light enables stimulation in intact tissue with cellular and subcellular resolution, and it has been extensively applied to optical actuators such as caged compounds and more recently to optogenetics. However, two-photon stimulation of synthetic photoswitches had not been explored before. In the second section of the results, the two-photon stimulation of LiGluR is investigated. Two new photoswitches were designed (MAG2p and MAGA2p) based on the structure of the original photoswitch (MAG) and intended to enhance the two-photon absorption ability of the azobenzene switch. The three PTLs, including MAG, successfully activate LiGluR under two-photon stimulation, suggesting that multiphoton excitation can be applied to other azobenzene-based molecules. Interestingly, the rationally designed photoswitches were more efficient in opening LiGluR as lower power and shorter simulation time were required. Finally we validated MAG2p and MAG as new tools to control the activation of neurons and astrocytes with cellular and subcellular resolution. In the last chapter, a new method based on the affinity labeling approach is presented in order to confer light sensitivity to endogenous receptors. Glutamate-azobenzene-reactive PTLs with different lengths and reactive groups were tested on kainate receptors. These reactive PTLs successfully and functionally conjugate to the ionotropic glutamate receptor subunit GluK1, thus enabling to photoswitch its activity, as evidenced from photocurrent recordings of mammalian cells overexpressing the non-mutated receptor. These results are also supported by the photocontrol of GluK1 currents in dorsal root ganglion neurons, where GluK1 is the main glutamate subunit that is endogenously expressed. The new strategy proposed is versatile and we suggest that it can be extended to label other endogenous receptors, giving rise to novel optpharmacological therapies. The new methods here developed improve the LiGluR performance, and address photoswitches to use endogenous neuronal receptors to optically control neuronal activity, being able to stimulate them in small volumes corresponding to the neuronal functional unit (i.e. synaptic terminals). In this way, light would emerge as a unique tool to dissect neuronal physiology and to understand the function of neuronal circuits. / L’estudi de la neurotransmissió requereix noves eines moleculars, i els fotocommutadors ofereixen grans possibilitats. Aquesta tesi està centrada en l’ús de receptors de glutamat activables per llum (LiGluRs) pel control de l’activitat neuronal i dels processos de neurosecreció. Al primer bloc de resultats, la permeabilitat a Ca2+ dels receptors de glutamat s’aprofita per manipular de manera directa -independentment del voltatge de membrana- i reversible la concentració intracel•lular de Ca2+ amb llum. Així, és possible desencadenar els processos de secreció en cèl•lules cromafins i de neurotransmissió en neurones hipocampals. A la segona part dels resultats de la tesi, s’investiga l’estimulacio multifotó del receptor de glutamat modificat químicament amb fotocommutadors basats en l’azobenzè. Els resultats mostren l’estimulació per dos fotons del LiGluR, incloent-hi dos fotocommutadors nous, que milloren l’absorció multifotó del commutador azobenzè. Finalment, s’aplica aquesta tècnica per estimular neurones i astròcits amb una resolució a l’escala d’una cèl•lula o de compartiment subcel•lular. Al tercer capítol dels resultats, es descriu un nou mètode per aconseguir el fotocontrol de receptors neuronals endògens, utilitzant lligands covalents. Amb l’aplicació d’aquest mètode es pot fotocommutar l’activitat del receptor de kainat subtipus 1 (GluK1) no mutant, quan se sobreexpressa el receptor en cèl•lules de mamífer. Aquesta estratègia també permet obtenir fotocorrents en cultius de neurones dels ganglis de l’arrel dorsal, on GluK1 és la subunitat de glutamat endògenament més expressada. Els nous mètodes desenvolupats en aquesta tesi milloren la utilització dels LiGluRs, encaminant l’ús dels fotocommutadors cap al control òptic dels receptors endògens, amb la possibilitat d’estimular cèl•lules individuals o estructures subneuronals, fet que situaria els fotocomutados com a eines indispensables per l’estudi del cervell, des de la fisiologia fins als circuits neuronals.

El presente trabajo describe la identificación cinética de actividad inhibidora de carboxipeptidasa A (CPA), carboxipeptidasa B (CPB), pepsina, papaína, tripsina y subtilisina en 30 extractos de invertebrados marinos del Caribe. Los resultados cualitativos mostraron catorce extractos con actividad inhibidora de tripsina, nueve extractos con actividad inhibidora de CPA, CPB, papaína y subtilisina, y sólo cuatro extractos con actividad inhibidora de pepsina. Los extractos más prometedores fueron seleccionados en términos de actividad inhibidora específica, relación dosis-respuesta, IC50 y biodisponibilidad de la especie. Por otra parte, Intensity Fading MALDI-TOF MS, un método proteómico utilizado en este trabajo para completar la estrategia de identificación de inhibidores de proteasas en extractos marinos, resultó ser muy útil para detectar moléculas, capaces de interactuar selectivamente con enzimas diana inmovilizadas, como fue el caso de N. versicolor frente a CPA y CPB, H. carunculata con pepsina, S. helianthus con papaína, N. peloronta y S. helianthus con tripsina y L. isodyctialis con subtilisina. Este trabajo también describe la aplicación de la fragmentación mediante MALDI-TOF MS en una estrategia de caracterización utilizando moléculas resueltas obtenidas en la fracción de elución de IF MALDI-TOF MS. Dos ejemplos son descritos: el primero es con el pico mayoritario obtenido de la interacción entre H. carunculata y pepsina-NHS Sepharose™, fragmentado mediante CID MALDI-TOF/TOF y analizado mediante secuenciación de novo. Otro ejemplo emplea la fragmentación ISD MALDI-TOF MS con la fracción de elución de S. helianthus y tripsina-glioxal Sepharose®. Otro objetivo de este trabajo fue la purificación y caracterización estructural – funcional de NVCI, un inhibidor proteico de carboxipeptidasa aislado del caracol marino N. versicolor. La combinación de técnicas tales como la degradación automatizada de Edman y secuenciación de novo por MALDI-TOF MS permitió el establecimiento de su estructura primaria. La síntesis y clonación del ADNc de NVCI permitió confirmar su secuencia de aminoácido. NVCI es una proteína con 53 residuos de aminoácidos, una masa molecular de 5944 Da y tres puentes disulfuro (código UniProt: P86912). NVCI recombinante fue producido en Pichia pastoris con un alto rendimiento en términos de proteína y actividad. NvCI natural y recombinante mostraron valores de Ki en el intervalo picomolar frente a carboxipeptidasas, tales como bCPA1, hCPA1 y hCPA4. Otros valores de Ki estuvieron en el orden de 1x10-10 M (hCPB1, pCPB1, hTAFI y bTAFI), con excepción de hCPA2 (1x10-9 M). NVCI es un inhibidor competitivo reversible de unión fuerte que representa el inhibidor de carboxipeptidasa más potente de naturaleza proteica descrito actualmente. La estructura de rayos X del complejo NvCI-hCPA4 (código PDB: 4A94) mostró que el inhibidor está formado básicamente por dos hojas β centrales antiparalelas conectadas por tres bucles principales. Las hojas β son estabilizadas mediante tres puentes disulfuro, un pequeño núcleo hidrofóbico situado junto al extremo C-terminal de NvCI y algunos residuos hidrófobos voluminosos expuestos al disolvente. NVCI tiene un área total de contacto de 1875,1 Å2 con la hCPA4. El mecanismo de inhibición de NVCI se debe a una interacción competitiva con el sitio activo de la carboxipeptidasa, por oclusión de los subsitios S1', S1, S2 y S3, tal como se ha observado para la mayoría de los inhibidores proteicos de carboxipeptidasa reportados anteriormente. Estos sitios están ocupados por el extremo C-terminal de NVCI y constituyen la región de contacto primaria del inhibidor. La zona de contacto secundaria está más extendida y cubre casi una cara del inhibidor. Los valores de Ki inferiores observados para NVCI en comparación con otros inhibidores se pueden atribuir tanto a las regiones de interacción "primaria" y "secundaria", que crean una interfaz extendida con la carboxipeptidasa que minimiza la liberación de producto de la reacción catalítica. / The present work described the kinetic identification of carboxypeptidase A (CPA), carboxypeptidase B (CPB), pepsin, papain, trypsin and subtilisin inhibitory activities in 30 Caribbean marine invertebrate extracts. The qualitative results showed fourteen extracts with trypsin inhibitory activity, nine extracts with CPA, CPB, papain and subtilisin inhibitory activities, whilst only four extracts with pepsin inhibitory activity. The most promising extracts were selected in terms of specific inhibitory activity, dose-response relationships, IC50 values and bioavailability of the species On the other hand, Intensity Fading MALDI-TOF MS, a proteomic method used in this work to complete the strategy of identification of inhibitors in marine extracts, was very useful to detect molecules, able to selectively interact with immobilized target enzymes, such as in N. versicolor against CPA and CPB, H. carunculata with pepsin, S. helianthus with papain, N. peloronta and S. helianthus with trypsin and L. isodyctialis with subtilisin. This work also describes the application of MALDI-TOF MS fragmentation in a characterization approach using the resolved molecular species obtained in the elution fraction of IF MALDI-TOF MS. Two examples are described: The first one is the major peak resulting of the interaction between H. carunculata and pepsin-NHS Sepharose™, which was fragmented by CID MALDI-TOF/TOF and analyzed by de novo sequencing. Another example uses the ISD MALDI-TOF MS fragmentation with the elution fraction of S. helianthus and trypsin-glyoxal Sepharose®. Another goal of this work was the purification and structural – functional characterization of NvCI, a proteinaceous carboxypeptidase inhibitor isolated from the marine snail N. versicolor. The combination of techniques such as automated Edman degradation and de novo sequencing by MALDI-TOF MS allowed the establishment of its primary structure. The synthesis and cloning of cDNA encoding NVCI allowed to confirm its amino acid sequence. NvCI is a protein with 53 amino acid residues, a molecular mass of 5944 Da and three intrachain disulfide bridges (UniProt code: P86912). Recombinant NvCI was produced in Pichia pastoris system with a high yield in terms of protein and activity. The kinetic characterization of natural and recombinant NvCI was performed according to the strategy described for tight-binding inhibitors. Natural and recombinant NvCI displayed Ki values in the picomolar range against carboxypeptidases such as bCPA1, hCPA1 and hCPA4. Other Ki values are in the order of 1x10-10 M (hCPB1, pCPB1, hTAFI and bTAFI), except for hCPA2 (1x10-9 M). NvCI is a competitive reversible tight binding inhibitor which represents the most potent carboxypeptidase inhibitor from proteinaceous nature so far described. The X-ray structure of NvCI-hCPA4 complex (PDB code: 4A94) showed that the inhibitor is basically formed by a central anti-parallel β-two-stranded sheet connected by three major loops. The β-strands are stabilized by three disulfide bridges, a small hydrophobic core located next to the C-terminus of NvCI and a few bulky exposed hydrophobic residues to the solvent. NvCI displays a total contact area of 1875.1 Å2 with hCPA4. The inhibition mechanism of NvCI is due to a competitive interaction with the active site of the carboxypeptidase, by occlusion of the subsites S1’, S1, S2 and S3, as it has been observed for most of the reported proteinaceous carboxypeptidase inhibitors. These sites are occupied by the C-terminal tail of NvCI and constitute the primary contact region of the inhibitor. The secondary contact region is more extended and covers almost one face of the inhibitor. The lower Ki values observed for NvCI in comparison to the other inhibitors can be attributed to both, the “primary” and “secondary” interaction regions, which create an extended interface with the carboxypeptidase that minimizes the product release from the catalytic reaction.

La trombocitèmia essencial (TE) és una neoplasia mieloproliferativa que es caracteritza per una hiperplàsia megacariocítica medul·lar, un increment persistent de la xifra de plaquetes circulants i, clínicament, per episodis de trombosi i/o hemorràgia. No presenta un marcador diagnòstic específic ja que només es coneixen les alteracions moleculars causants de la malaltia en un 50% dels pacients, sent la mutació JAK2V617F l’alteració més comú. En aquesta tesi doctoral s’ha analitzat el perfil d’expressió gènica de granulòcits de sang perifèrica de la TE i de pacients amb policitèmia vera (PV) i trombocitosis reactives, utilitzant la tècnica de microarrays d’expressió i de RT-PCR quantitativa a temps real amb la plataforma de Taqman® Low density Arrays (TLDA). S’han inclòs un total de 98 pacients (57 TE i 41 PV), sis trombocitosis reactives i 10 individus sans com a control. L’anàlisi d’expressió en els pacients amb TE ha mostrat un perfil proinflamatori que caracteritza aquesta malaltia. També s’han detectat gens diferencialment expressats entre els pacients JAK2V617Fpositius i JAK2V617F-negatius que han permès identificar vies de senyalització afectades per la mutació JAK2V617F i d’altres independents de la mutació, que podrien estar afectades per alteracions moleculars encara desconegudes. A més, aquest perfil d’expressió s’ha comparat amb el de la PV, neoplàsia mieloproliferativa en la que el 95% dels pacients presenten la mutació JAK2V617F, i amb les trombocitosis reactives. Com a resultat, s’han definit gens l’expressió dels quals podrien tenir una implicació en la patogènesi de la TE, especialment en les TE JAK2V617F-negatives. / Essential thrombocythemia (ET) is a myeloproliferative neoplasm characterized by increased bone marrow megakaryocytes, persistent thrombocytosis and an increased risk of thrombohemorragic complications. ET does not have specific biological markers as in only in 50% of patients specific molecular abnormalities have been described, being JAK2V617F mutation the most frequent. In polycythemia vera (PV), another myeloproliferative neoplasm, JAK2V617F mutation is detected in about 95% of patients. In this project we characterized the gene expression profile of peripheral blood granulocytes in ET, in polycythemia vera (PV) and in reactive thrombocytosis, using whole genome oligonucleotide microarray technology and real-time quantitative RT-PCR (using Taqman® Low density Arrays (TLDA)). A total of 98 patients (57 ET and 41 PV), six reactive thrombocytosis and 10 healthy individual used as controls, were included in the study. Gene expression analysis defined a proinflammatory pattern in ET. Moreover, genes differentially expressed between JAK2V617F-negative and JAK2V617F-positive ET patients were detected. Those set of genes identified JAK2V617F dependent and JAK2V617F independent signaling pathways. Those signalling pathways altered in JAK2V617F-negative patients could highlight molecular abnormalities which are still unknown. ET results were compared to PV and secondary thrombocytosis gene expression profiles. As a result, a set of genes that could provide insight into ET pathogenesis, specially in JAK2V617F-negative patients, was detected.

Tesi vinculada a l'Institut de Biologia Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC) i l'Institut de Recerca in Biomedicina (IRB-Barcelona) / La presente tesis consta de dos proyectos, que detallo a continuación: - Estudio de las proteínas de la partícula regulatoria del proteosoma y del ensamblaje de la lid El sistema ubiquitina-proteosoma es la mayor ruta proteolítica citosólica en eucariotas, controla casi todos los procesos celulares básicos degradando las proteínas unidas a una cadena de ubiquitinas. El sistema se compone de una cascada de ligasas de ubiquitina que conjugan la ubiquitina a las proteínas diana y el proteosoma responsable de la degradación de dichas proteínas. El proteosoma 26S presente en eucariotas se puede dividir en dos complejos: la partícula central (20S) y la partícula regulatoria (19S), a su vez la partícula regulatoria puedo dividirse en dos subcomplejos: la base y la lid. En este proyecto se realizó el clonaje, expresión heteróloga y purificación de todas las proteínas Rpn de la lid y tres de la base (Rpn1, 2 y 10) de Saccharomyces cerevisiae en Escherichia coli. Las proteínas se expresaron individualmente y en conjunto (mediante la co-expresión y/o co-lisis). Estos experimentos resultaron en una amplia variedad de subcomplejos, desde complejos de dos proteínas hasta cinco y el reemplazo de algunas subunidades por versiones truncadas proporcionó información sobre áreas discretas de interacción entre proteínas, permitiendo crear un modelo de interacciones intermoleculares dentro del complejo de la lid. Además tres de los complejos obtenidos (Rpn5/8/9, Rpn5/8/9/11 y Rpn5/6/8/9/11) se analizaron mediante microscopia electrónica (EM) proporcionando una visión de los eventos biogénicos de la lid, ya que representan la adición consecutiva de subunidades. - Análisis estructural del dominio OBD de RepB y su unión al ADN El plásmido de amplio espectro pMV158 se replica mediante el mecanismo de círculo rodante. Su proteína de iniciación de la replicación es RepB, la cual reconoce y corta el ADN en un sitio específico. En un trabajo previo realizado en nuestro laboratorio se resolvió la estructura tridimensional de esta proteína full length, demostrando su naturaleza hexamérica. Cada monómero de RepB se compone de dos dominios: el OBD (origin-binding domain) responsable del reconocimiento del sitio de corte y el OD (oligomerization domain) que se unen entre si formando el hexámero. En este trabajo se cristalizó y resolvió mediante reemplazo molecular la estructura del OBD de RepB unido a su ADN diana, un oligonucleótido de 23bp que aloja parte de la secuencia del sitio de unión al ADN. La estructura nos permitió analizar la interacción específica proteína/ADN, la cual se establece en el surco mayor, pudiendo identificar los aminoácidos que interaccionan con áreas discretas en el ADN, siendo estos resultados comparables con aquellos descritos con anterioridad en la literatura mediante otras técnicas como mutaciones puntuales o estudios de fingerprinting. A su vez generamos un modelo que explica el modo de acción de RepB a la hora de reconocer el sitio de corte en su condición hexamérica. / This PhD thesis is composed of two different projects: •Study of the proteasome regulatory particle proteins and the assembly of the lid complex. The 26S proteasome, the main protein-degradation machine in the eukaryotic cell, is composed of two discrete complexes: core and regulatory particle (RP), which can be sub-divided into the base and lid sub-complexes. By combining biochemical and structural methods, we have analyzed the interactions that hold the RP. Expressing individually or in complex the full length or truncated proteins we were able to construct a detail map of interaction within the lid complex. Three stable subcomplexes of the lid (trimeric, tetrameric and pentameric) have been solved by electron microscopy, providing a vision of lid assembly events, as they represent the consecutive addition of subunits. •Structural analysis of the RepB OBD domain and its DNA interaction. RepB initiates plasmid rolling-circle replication by binding to a triple 11-bp direct repeat (bind locus) and cleaving the DNA at a specific distant site located in a hairpin loop within the nic locus of the origin. This protein acts as a hexameric ring complex, where each protomer has two domains: the origin-binding domain (OBD) and the oligomerization domain (OD). The OBD shows a three-layer a–b–a sandwich fold, the active site is located at one of the faces of the bsheet and coordinates a metal ion at a short distance from the essential nucleophilic Y99. The OBD is also responsible for the recognition of the specific binding sequences. In this work we describe the structural characterization by X-ray crystallography of the OBD bound to its target DNA and we propose a model for the mechanism of action of the hexameric complex.

Las vías glutamatérgicas representan el sistema de neurotransmisión excitador más abundante en el sistema nervioso central (SNC) de vertebrados, así su importancia se hace evidente en los procesos cognitivos. Dentro del SNC, las células más abundantes son las células gliales y su acople bioquímico con las neuronas es indispensable para la fisiología del SNC. Una característica de todos los sistemas biológicos es que estos oscilan a través de dos tipos de variables, las controladas y las reguladas, cuyas asas de retro o anteroalimentación se encuentran reguladas o controladas por la actividad del sistema, así dentro del SNC encontramos que una de las moléculas principales que inicia estos cambios biológicos es el glutamato. Se ha demostrado que la activación glutamatárgica cambia diferentes aspectos de respuesta tanto glial como neuronal, sin embargo no se ha caracterizado por completo la regulación de los componentes del sistema glutamatárgico. En el presente trabajo nos interesamos por elucidar la respuesta de dos componentes gliales indispensables en el acople bioquímico neurona glia, la glutamina sintetasa (GS) y el transportador de glutamato de alta afinidad GLAST. En el presente trabajo demostramos que la actividad de GS es regulada por la actividad glutamatérgica únicamente bajo condiciones muy especiales de cultivo, las cuales semejan las etapas tempranas del desarrollo del SNC y ésto solo sucede bajo una estimulación glutamatérgica crónica. GLAST es el principal transportador de glutamato que se expresa en cerebelo por lo que el modelo de cultivo primario de células gliales de Bergmann nos permitió elucidar el efecto de una exposición aguda de glutamato sobre la actividad del transportador GLAST a largo plazo, encontrando que la exposición a glutamato aguda disminuye la actividad de GLAST a largo plazo por un mecanismo muy probablemente postraduccional. / Glutamatergic pathway are the most abundant excitatory neurotrassmiter system in the central nervous system ( CNS ) of vertebrates, hence its importance is evident in cognitive processes. Glial cells are the most abundant cells within the CNS and its biochemical coupling with neurons is essential for CNS physiology. A feature of all biological systems is that they oscillate through two types of variables, the controlled and regulated variables, whose feedforward or feedback handles are regulated or controlled by the activity necessities of the system, within the CNS one of the main molecules that initiates these biological changes is glutamate. It has been shown that activation of glutamatergic pathways modulate different aspects of both glial and neuronal responses, however, the regulation of glutamatergic components regulated by gluatamte activity have not been fully characterized. In this work we are interested in elucidate the response of two biochemical glial components whose are essential for neuron-glia coupling, glutamine synthetase ( GS ) and high affinity glutamate transporter GLAST. In this work we show that GS activity is regulated by glutamatergic activity only under very special conditions, which resemble the early stages in the development of the CNS and this regulation only is present under chronic glutamatergic stimulation. GLAST glutamate transporter is the most abundant glutamate transporter expressed in glia cerebellum, in this context Bergmann glial cells primary culture allowed us to elucidate the effects of acute exposure on GLAST glutamate transporter activity in the long term, we found that acute glutamate exposure decreases GLAST activity in the long term by a mechanism which seems to be posttranslational.

La subunidad reguladora β1 de la proteína quinasa de CK2 de maíz fue usada como anzuelo para realizar un cribado mediante doble híbrido de una librería de cDNA, construida a partir de mRNA de hoja de maíz joven sometida a tres horas de deshidratación. Entre las proteínas que interaccionaron con CK2, fue identificado un factor de transcripción putativo llamado ZmZIM91 (Tipo GATA/Zinc Finger). La proteína ZmZIM91 no había sido anteriormente caracterizada en maíz y la información conocida de sus homólogos en Arabidopsis era muy escasa y no proporcionaban datos acerca de las funciones específicas de este grupo de proteínas. Estudios filogenéticos permitieron demostrar que ZmZIM91 pertenecía a la familia TIFY, más concretamente a la subfamilia ZML, a esta gran familia también pertenecen las proteínas JAZ, las cuales han sido muy estudiadas tanto en Arabidopsis como en otras especies. Con el fin de realizar una caracterización molecular de ZmZIM91, en primer lugar, se estableció que esta proteína era sustrato de la proteína quinasa CK2 de maíz, la cual regula a este factor de transcripción a través de fosforilación tanto bajo tratamientos de sequía como de Metil Jasmonato (MeJA). Por otra parte, fueron llevados a cabo experimentos de pull-down, doble híbrido y complementación Bimolecular, los cuales arrojaron resultados como la interacción de ZmZIM91 con la subunidad reguladora β1 de la proteína quinasa CK2, la dimerización de dicho factor y la interacción con las proteína JAZ, sin embargo se estableció que a diferencia de los JAZ, ZmZIM91 no puede interaccionar con COI1. Por otra parte, se realizaron experimentos de western de hojas de maíz silvestres usando el anticuerpo contra la proteína endógena ZmZIM91 y de sobreexpresión en protoplastos de maíz con aplicación de la hormona MeJA, al igual que MeJA y MG132, donde se observó que ZmZIM91 era degradada en presencia de MeJA a una hora y que su degradación era a través de la vía del proteasoma 26S. Mediante un ensayo de Protein-Array, se logró establecer que ZmZIM91 se podía unir a ADN directamente a través de los motivos GATA y GATC. Ensayos de Inmunoprecipitación de la Cromatina y secuenciación masiva paralela (ChIP-Seq) en planta, permitieron determinar genes diana del factor de transcripción ZmZIM91, siendo dos de ellos el maize caffeic acid O-methyltransferase (COMT) implicado en la biosíntesis de lignina y el gen de la DFR (A1) involucrado en la biosíntesis de los flavonoides, estos resultados fueron confirmados a través de ChIP-QPCR, donde fueron detectados como altamente enriquecidos, además mediante un experimento de expresión transciente en protoplastos de maíz, se pudo determinar que el factor de transcripción ZmZIM91 es un represor de COMT y A1, sugiriendo que ZmZIM91 tiene un papel extendido en la ruta de los fenilpropanoides y que además es un regulador negativo de dicha ruta. Experimentos de inmunoprecipitación de la Cromatina (ChIP) con aplicación de tratamiento con MeJA a una hora, confirmaron que en presencia de esta hormona, ZmZIM91 pierde capacidad de unión a los promotores de COMT y A1. Por otra parte, a través de ensayos de complementación Bimolecular se estableció la interacción del factor de transcripción ZmZIM91 con los factores ZmMYB31 y ZmMYB42 implicados en la regulación negativa de genes de la ruta de los fenilpropanoides, con los cuales podría estar actuando como un módulo regulador sobre promotores de genes como ZmCOMT y ZmA1. / The regulatory subunit of protein kinase CK2β1 was used as a bait to perform a yeast two-hybrid screening against a cDNA library of drought-stressed maize leaves. Between the interacting partners a putative transcription factor named ZmZIM91 (GATA/Zinc Finger type) was identified. The protein ZmZIM91 has not been previously characterized in maize and there was little information about their homologous in Arabidopsis thus, no fuctional data regarding this group of proteins was available. Sequence analysis and phylogenetic studies show that ZmZIM91 belong to the TIFY family, more specifically at the ZML subfamily. JAZ proteins, which have been widely characterized in Arabidopsis and in other species, also belong to the TIFY family. To make a molecular characterization of ZmZIM91, first of all, it was demonstrated that this protein was an in vitro substrate of the maize protein kinase CK2. In addition, in vivo gel kinase assays suggest that phosphorylation regulates this protein under different treatments as drought or methyl jasmonate (MeJA). Furthermore, were carried out a set of experiments as pull-down, yeast two-hybrid assay and Bimolecular fluorescence complementation, which yielded results as the interaction between ZmZIM91 with the regulatory subunits of the protein kinase ZmCK2, the dimerization of ZmZIM91 and the interaction with JAZ protein, however, it was established that unlike JAZ, ZmZIM91 cannot interact with the E3 ubiquitin ligase COI1. Furthermore, were performed western blot experiments using wild-type maize leaves and the endogenous antibody against ZmZIM91 (produced in this work), also assays of overexpression in maize protoplasts in both using the MeJA hormone, as MeJA and MG132, where it was observed that ZmZIM91 was degraded in the presence of MeJA in one hour and its degradation it is probably through the 26S proteasome pathway. Using a Protein-Array assay, it was established that ZmZIM91 could bind to DNA directly through GATA and GATC motifs. Finally, experiments of chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing (ChIP-Seq), allowed to determine target genes of the transcription factor ZmZIM91. Between the targets identified, one correspond to the caffeic acid O-methyltransferase (COMT) gene, involved in the biosynthesis of lignin and another is the DFR gene (A1) involved in the biosynthesis of flavonoids. These results were confirmed by ChIP-QPCR, and by transient expression experiments in maize protoplasts where they were identified as highly enriched, It was determined that the ZmZIM91 transcription factor is a repressor of COMT and A1 genes, suggesting a regulatory role of ZmZIM91 in the phenylpropanoid pathway and also as a negative regulator of this pathway. Experiments Chromatin immunoprecipitation (ChIP) with MeJA treatment application at one hour, confirmed that in the presence of this hormone ZmZIM91 loses binding capacity to the COMT and A1 promoters. Moreover, through Bimolecular complementation assays was established the interaction between the transcription factor ZmZIM91 and the ZmMYB31 and ZmMYB42 factors involved in the negative regulation of genes of the phenylpropanoid pathway, which may be acting as a regulatory module to regulate genes such as COMT.