Hoy en día, el cáncer sigue siendo la segunda causa de muerte en el mundo. Por lo tanto, existe una gran necesidad de encontrar nuevas terapias que resulten más efectivas para su tratamiento. Las terapias actuales, lejos de ser efectivas, producen una gran toxicidad sistémica y ofrecen un bajo porcentaje de supervivencia a los pacientes, siendo la principal causa de muerte la aparición de focos metastáticos, especialmente en el cáncer de colon. Por lo tanto, mejorar la especificidad celular y evitar la aparición de focos metastaticos son los mayores retos a los que se enfrentan las futuras terapias contra el cáncer. En este contexto, la terapia génica aparece como una alternativa muy prometedora ya que ofrece la posibilidad de personalizar las terapias además de disminuir su toxicidad. Dado que la bioseguridad es uno de los parámetros que más preocupa en este tipo de terapias, las proteínas multifuncionales aparecen como uno de los vectores de terapia génica más prometedores no solo por su alta biocompatibilidad y su baja toxicidad, sino también por su gran plasticidad. Por otro lado, la necesidad de controlar el tamaño de las partículas generadas para conseguir una adecuada biodistribucion in vivo ha sido ampliamente descrita en la literatura. En este trabajo, hemos explorado la posibilidad de modular el autoensamblaje de proteínas multifuncionales en nanoparticulas de un tamaño predefinido con tal de obtener el máximo potencial de su capacidad de entrega de ácidos nucleicos o drogas terapéuticas. En este contexto, hemos descrito parejas de tags arquitectónicos (de los cuales uno de ellos es una poli-histidina) que son capaces de inducir el autoensamblaje de las proteínas que las contienen en nanoparticulas con propiedades estructurales predefinidas. También hemos estudiado la interacción y el traffiking intracelular de estas nanoparticulas cuando las ponemos en contacto con células en cultivo, donde hemos visto que su internalización no resulta toxico para las células de mamíferos. Además, también hemos estudiado la estabilidad estructural que presentan estas nanoparticulas cuando se administra por vía intravenosa en modelos de ratón, mostrando que las interacciones intermoleculares que se generan durante el proceso de ensamblaje de las nanoparticulas in vitro, son suficientemente fuertes como para asegurar su estabilidad estructural in vivo. Se ha descrito que el receptor CXCR4 es un elemento clave en la formación de focos metastaticos durante el desarrollo tumoral de diferentes tipos de cáncer incluyendo el cáncer de colon, para el cual actualmente no existe todavía ningún vehículo que reconozca de forma específica las células metastaticas. En este contexto, en este estudio hemos explorado la posibilidad de funcionalizar las nanoparticulas proteicas con ligandos que reconocen el receptor CXCR4 con tal de dirigirlas de forma específica a las células que expresan este receptor. Entre los ligandos testados, hemos visto que el péptido T22 es un ligando inusualmente eficiente para el reconocimiento selectivo e internalización en células que expresan el receptor CXCR4 y que las nanoparticulas funcionalizadas con este ligando se biodistribuyen de forma selectiva a las células CXCR4+ in vivo en modelos murinos de cáncer colorectal. Finalmente, también hemos explorado la posibilidad de usar nanoparticulas proteicas funcionalizadas como virus artificiales para la entrega especifica de ácidos nucleicos en las células diana. Este trabajo muestra como las nanoparticulas que contienen dominios de unión a ácidos nucleicos, cuando son incubados junto a un DNA externo, son capaces de generar estructuras que imitan las estructuras virales, encapsulando el DNA en la parte interna de las estructura y protegiéndolo a su vez del ataque de nucleasas externas. Sin embargo, es necesario añadir un paso de hidrolisis con DNasa y RNasas en la purificación de nanoparticulas que contienen dominios de unión a ácidos nucleicos ya que se ha visto que unen ácidos nucleicos bacterianos provenientes del sistema de expresión bacteriano utilizado para su producción recombinante, afectando muy negativamente sobre su funcionalidad como virus artificiales. Por lo tanto, dado la gran biocompatibilidad que a priori se espera de las proteínas, sus propiedades arquitectónicas regulables y la posibilidad de funcionalizarlos con ligandos específicos, hace que las nanoparticulas proteicas autoensamblables sean una herramienta muy prometedora para la entrega dirigida de ácidos nucleicos y drogas terapéuticas en las células de cáncer metastatico de colon y en general en las células de mamífero. / Cancer is ranked as the second leading cause of death worldwide. Consequently there is a huge necessity of finding more effective cancer therapies. Currently available cancer therapies, far from being effective, present high systemic toxicity and low patient survival rates being the main mortality cause the appearance of metastatic foci, especially in colon cancer. Thus, improving cell specificity and avoiding metastases generation are the mayor challenges for future cancer therapies. In this context, gene therapy appears as very promising alternative therapy since cell targeted personalized therapies can be performed with low systemic toxicity. Since biosafety is the current mayor concern in this type of therapies, multifunctional proteins appear as the most promising gene therapy vectors because of their high biocompatibility and biosafety, low toxicity and really complete tuneability. Moreover, the necessity of effectively controlling nanoparticles size for their efficient biodistribution and delivery has been widely described in the literature. In the present work has been explored the possibility of effectively modulating the self-assembling of multifunctional protein building blocks into predefined size distribution nanoparticles in order to get the full potential of those protein-only nanoparticles for their application in therapeutic drugs and nucleic acids delivery approaches. In this regard, we have described cationic architectonic tag pairs ( one of them being a poly-histidine) that when incorporating to proteins, they induce the self-assembling of protein monomers into nanoparticles with predefined structural properties. It has also been studied the interaction and intracellular trafficking of these kind of protein nanoparticles in cultured cells proving not to be toxic for mammalian cells. Moreover, the structural stability of generated nanoparticles upon intravenous administration in mice has been also studied proving in vitro generated intermolecular interactions during protein assembling process strong enough to ensure nanoparticles structural stability in vivo. It has been shown that CXCR4 chemoquine receptor is a key element in metastasis formation during cancer evolution in different types of tumors, including colorectal cancer, for which metastatic intracellular targeting vehicles are currently missing. In this context, the possibility of effectively functionalizing protein nanoparticles with CXCR4 specific ligands has been deeply explored in this study. Among tested peptide ligands, T22 peptide has shown to be an unusually powerful tag for selective intracellular targeting in CXCR4+ cells having T22-empowered protein nanoparticles of optimal size selectively biodistribute in CXCR4+ cells in vivo. Finally, the suitability of functionalized self-assembling protein nanoparticles for their use as artificial viruses has been also extensively explored. Protein nanoparticles that contain nucleic acid binding domains have shown an appealing capacity to generate virus-like structures when combined with external DNA, completely shielding cargo DNA in the inner part of the structure and protecting it from external nucleases hydrolysis. However, the necessity of an additional DNase/RNase hydrolysis treatment during the nanoparticles purification process has been described since nanoparticles with nucleic acid binding domains have been shown to bind nucleic acids from the bacterial host used for their recombinant expression, resulting strongly detrimental for their functionality as artificial viruses. All together, the high biocompatibility expected for proteins, their regulatable architectonic properties and their efficient targeting possibility, make self-assembling protein-only nanoparticles a very promising material for the therapeutic delivery of drugs and nucleic acids in metastatic colorectal cancer cells and in general in mammalian cells.

Los estudios realizados sobre las proteínas Arv indican que estaría involucrada en la regulación de la homeostasis de esteroles y esfingolípidos. En levadura se observó una posible función en la síntesis de GPI (Kajiwara et al., 2008) y respecto a su topología, posee 3 dominios hidrofóbicos con el extremo N-terminal orientado hacia el citosol (Villasmil y Nickels 2011). En plantas, se caracterizaron los genes AtARV1 y AtARV2 de Arabidopsis thaliana que codifican dos proteínas de RE funcionales, AtArv1 y AtArv2. Estas comparten una identidad del 66% entre sí y poseen un dominio N-terminal AHD muy conservado en diferentes especies. Ambos genes poseen patrones solapantes de expresión en tejidos meristemáticos, excepto en hojas donde AtARV2 no se expresa (Forés et al., 2006). En este trabajo se determinó que AtArv1 posee un número par de dominios hidrofóbicos y que los extremos N- y C-terminales están orientados hacia el citosol. Además, se caracterizaron mutantes simples con pérdida de función (arv1) y dobles (arv1:arv2), que si bien no mostraron alteraciones fenotípicas, la activación de un RNAi en los doble mutantes arv1:arv2 indica que la pérdida de AtArv produce alteraciones fenotípicas en plántulas, que presentan acortamiento de la raíz y de los cotiledones que se vuelven amarillentos y se curvan en forma de « punta de flecha ». Los niveles de esteroles disminuyen y se ven incrementadas algunas BECL (Bases Esfingoides de Cadena Larga). Por otro lado, AtArv1 no parece estar vinculada a la UPR (Unfolded Protein Response) y su pérdida no es capaz de activar esta respuesta. La farnesildifosfato sintasa (FPS) es una enzima dimérica que cataliza la condensación de una molécula de dimetilalildifosfato con dos moléculas de isopentenildifosfato para dar lugar a farnesildifosfato, que es el punto de partida para la síntesis de isoprenoides en el citosol y las mitocondrias. Los genes FPS1 y FPS2 de Arabidopsis thaliana codifican las isoenzimas FPS1L mitocondrial), FPS1S y FPS2. Las secuencias aminoacídicas de FPS1S y FPS2 poseen una identidad del 90.6% y difieren en sólo 32 aminoácidos. El gen FPS1 se expresa de forma generalizada durante todo el desarrollo de la planta, en cambio, FPS2 muestra un patrón de expresión restringido a órganos florales, semillas y estadios tempranos de la germinación. En la caracterización de los mutantes nulos de Arabidopsis fps1 y fps2 se observó que el gen FPS2 es más importante en las semillas y las etapas tempranas de la germinación. La isoenzima FPS2 contribuye entre un 70-80% a la actividad FPS total en semillas maduras. Como consecuencia, las semillas del mutante fps2 presentan niveles reducidos de sitosterol, un aumento de la actividad HMG-CoA reductasa (HMGR) e hipersensibilidad a la mevastatina (Closa et al., 2010). En este trabajo se ha determinado mediante ensayos bioquímicos, que la isoenzima FPS2 es catalíticamente más eficiente, más sensible al efecto inhibitorio del NaCl, y termodinámicamente más estable que FPS1S. También se ha demostrado la localización citosólica de ambas isoenzimas. Los patrones de expresión de los genes FPS1 y FPS2 son complementarios en semilla e indican que el FPP necesario para el desarrollo de las semillas tiene dos posibles orígenes separados en el espacio y en el tiempo. Por último, los estudios de complementación funcional en semillas del mutante fps2 demuestran que en condiciones normales FPS1S y FPS2 son funcionalmente intercambiables. / The previously characterized Arabidopsis thaliana proteins AtArv1 and AtArv2 have been suggested to be involved in the regulation of cellular lipid homeostasis as demonstrated for their yeast and mammalian counterparts. In this study, we established the citosolic orientation of both N- and C-terminal ends of the AtArv1 protein in the yeast ER membrane. Functional complementation assays of an arv1Δ yeast strain with a truncated AtArv1 protein also showed that the C-terminal 31 aminoacids are essential for AtArv1 function. Characterization of single Arabidopsis arv mutants did not reveal any effect on plant phenotype. On the contrary, characterization of loss-of-function Arabidopsis arv1:arv2 double mutants obtained by inducible siRNA-mediated silencing of AtARV genes demonstrated that lack of AtArv function leads to reduced root lenght and pale green curved cotiledons as well as to reduced levels of major sterols and increased levels of some sphingolipid LCBs (Long Chain Bases). In contrast to S. cerevisiae Arv1p, AtArv is not involved in the UPR (Unfolded Protein Response) in Arabidopsis since lack of AtArv1 does not activate this response. Previous results obtained in our laboratory showed that Arabidopsis thaliana contains two genes encoding farnesyl diphosphate (FPP) synthase (FPS), the short-chain prenyl diphoshate synthase that catalyzes the synthesis of FPP from isopentenyl diphosphate (IPP) and dimethylallyl diphosphate (DMAPP). The FPS1 gene is widely expressed in all plant tissues throughout development, whereas FPS2 shows a pattern of expression restricted to specific floral organs, developing and mature seeds. Characterization of fps single knock-out mutants suggested that FPS2 has a major role in seeds and during the early stages of seedling development. Actually, FPS2 provides 70-80% of total FPS activity in mature Arabidopsis seeds, hence lack of FPS2 activity in seeds leads to a marked reduction in sitosterol content and a positive feedback regulatory response of HMG-CoA reductase (HMGR) activity that renders seeds hypersensitive to mevastatin. In this study, we provide evidence that the two Arabidopsis short FPS isozymes FPS1S and FPS2 localize to the cytosol. Biochemical characterization of these recombinant enzymes expressed in E. coli, revealed that, despite FPS1S and FPS2 share more than 90% amino acid sequence identity, FPS2 is more efficient as a catalyst, more sensitive to the inhibitory effect of NaCl, and more resistant to thermal inactivation than FPS1S. Expression analysis of FPS::GUS genes in seeds also showed that FPS1 and FPS2 display complementary patterns of expression particularly at late stages of seed development, which suggests that developping Arabidopsis seeds have two spatially segregated sources of FPP. Functional complementation studies of the fps2 knock-out mutant seed phenotypes demonstrated that at least under normal conditions FPS1S and FPS2 are functionally interchangeable.

Las sales biliares son cruciales para la solubilización y absorción en el intestino de las grasas y las vitaminas liposolubles procedentes de la dieta. Estas sales biliares son sintetizadas a partir de colesterol en los hepatocitos, lo que representa la mayor vía de eliminación de colesterol del cuerpo. Además de este importante papel fisiológico, las sales biliares también actúan como moléculas de señalización endocrina que afectan a múltiples órganos. Para ejercer estos efectos, los ácidos biliares se unen al receptor de membrana TGR5 (G protein-coupled bile acid receptor 1) y al receptor nuclear FXR (Farnesoid X receptor). Este receptor nuclear es capaz de regular la síntesis de ácidos biliares, inhibiendo la expresión de una enzima clave para su síntesis. FXR también regula genes implicados en el transporte de estos ácidos biliares hacia el exterior de la célula, no solo a nivel hepático sino también intestinal. Por todo esto se considera que FXR es un sensor de los ácidos biliares en el contexto enterohepático. Además del papel crucial que desarrolla FXR en la homeostasis de los ácidos biliares, también está involucrado en la regulación del colesterol y en el metabolismo de lípidos y glucosa. Estudios recientes han demostrado la participación de FXR en nuevas funciones relacionadas con procesos biológicos como la regeneración hepática (Huang W et al, 2006) y la inhibición de la progresión tumoral (Yang F et al, 2007; Modica S et al, 2008). La identificación de la expresión de este receptor nuclear en tejidos vasculares ha relacionado a FXR con enfermedades tan extendidas como la aterosclerosis (Bishop-Bailey, 2004). Por todo esto, FXR se ha convertido en una esperanza terapéutica en la lucha contra múltiples enfermedades. Se han empleado aproximaciones genómicas y farmacológicas con el objetivo de identificar nuevos genes diana humanos del receptor nuclear FXR. Los experimentos realizados con micromatrices en diferentes tejidos, donde la expresión de FXR está reportada, han permitido cumplir dicho objetivo. Por otro lado, los numerosos experimentos de biología molecular llevados a cabo han confirmado los resultados obtenidos y han permitido caracterizar los mecanismos de regulación que ejerce FXR sobre los nuevos genes humanos identificados. La investigación realizada ha evidenciado que FXR regula genes involucrados en el transporte de ácidos grasos y retinol, así como en la ubiquitinación, el transporte vesicular o la supervivencia celular. De la misma manera, se ha descubierto la regulación por FXR de genes asociados a enfermedades como la inflamación, el alcoholismo, la litiasis o el cáncer. / Bile salts are crucial for the solubilization and absorption in the intestine of fats and vitamins from the diet. These bile salts are synthesized from cholesterol in hepatocytes, which represents the major route of elimination of cholesterol from the body. Besides this important physiological role, bile salts also act as signaling molecules that affect multiple endocrine organs. To exert these effects, bile acids bind to the membrane receptor TGR5 (G protein-coupled bile acid receptor 1) and the nuclear receptor FXR (Farnesoid X receptor). This nuclear receptor is able to regulate the bile acid synthesis by inhibition of a key enzyme for its synthesis and regulation of genes involved in the transport of bile acids to the outside of the cell, in the liver and intestine. By all this FXR is considered a bile acid sensor in the enterohepatic context. On the other hand, recent studies have shown the involvement of FXR in new functions related to biological processes such as liver regeneration (Huang W et al, 2006) and inhibition of tumor progression (Yang F et al, 2007; Modica S et al, 2008). The identification of the expression of FXR in vascular tissues it has been associated with diseases such as atherosclerosis (Bishop-Bailey, 2004). For all this, FXR has become a therapeutic hope in the fight against multiple diseases. Genomic approaches have been employed with the pharmacological target and identify novel human target genes of FXR. The microarrays in different tissues, where expression of FXR is reported, have allowed us to get this objective. Furthermore, molecular biology experiments carried out have confirmed the results obtained and allowed characterize the mechanisms of regulation exerted on new human target genes. Research has shown that FXR regulates genes involved in the transport of fatty acids and retinol, ubiquitination, vesicular transport or cell survival. Similarly, it has been discovered regulation by FXR of genes associated with diseases such as inflammation, alcoholism, lithiasis or cancer.

Nek9 is a NIMA-related kinase that is phosphorylated in mitosis and a small pool of it (5%) is activated at the centrosomes by a complex mechanism which has remained elusive until now. Nek6 and Nek7 bind to the C-terminal tail of Nek9 and are directly phosphorylated and activated by Nek9, thus forming with Nek9 a signalling cassette of mitotic kinases. Once active, Nek6 and Nek7 phosphorylate the kinesin Eg5 at the Ser1033, a residue that has been shown to be important for mitotic progression. We have described that Nek9 is activated by a two-step mechanism, first by the phosphorylation of Cdk1, which leads to the binding of Plk1 through its PBD domain and further phosphorylation of Plk1 at different sites, including the activation loop at the Thr210. We show that both phosphorylation by Cdk1 and Plk1 are necessary for the activation of Nek9 in vivo. Results in our group demonstrate that active Nek9 and Nek6 induce centrosome separation in an Eg5-dependent manner, and also that active Nek9 and Nek6 can rescue Plk1 but not Eg5 downregulation in prophase centrosome separation. This work has demonstrated that Nek9 activation by Plk1 is necessary for the phosphorylation of the kinesin Eg5 at the Ser1033, and that this phosphorylation is necessary for prophase centrosome separation and Eg5 recruitment. During the last years we have inhibited Nek9 using different approaches, but in order to have an acute inhibition of the kinase we decided to take a chemical genetic approach. As a general overview, the strategy consists on doing a functionally silent mutation in the ATP binding pocket (gatekeeper residue) of the target kinase that sensitizes it to inhibition by an ATP analog and that does not inhibit wild type kinases. So far I have identified the gatekeeper residue of Nek9 and have been able to find a mutant that acts as an analog sensitive mutant in vitro. / Nek9 és una quinasa de la família de les NIMA que és fosforilada en mitosis i una petita part d’aquesta és activada als centrosomes mitjançant un mecanisme complex desconegut fins a ara. Nek6 i Nek7 són dues proteïnes de la mateixa família, que s’uneixen a la cua de Nek9 i que són fosforilades i activades directament per la fosforilació de Nek9, formant d’aquesta manera una casset de quinases mitòtiques. Una vegada actives, Nek6 i Nek7 fosforilen la quinesina Eg5 al residu Ser1033, residu que s’ha descrit que és important per una correcta progressió de la mitosis. En aquest treball hem descrit que Nek9 és activada mitjançant un mecanisme de dos passos, en el qual primer és fosforilada per Cdk1, que permet la unió de Plk1 mitjançant el seu domini PBD i posteriorment és fosforilada per Plk1 a diferents llocs, incloent el llaç d’activació a la Thr210. Demostrem que les fosforilacions tant per part de Cdk1 i Plk1 són necessàries per l’activació de Nek9 in vivo. Resultats del nostre grup demostren que Nek9 activa i Nek6 indueixen la separació dels centrosomes en profase de manera dependent d’Eg5, i també que Nek9 activa i Nek6 poden recuperar la separació dels centrosomes causades per una downregulació de Plk1, però no la produïda per la downregulació d’Eg5. Aquest treball demostra que l’activació de Nek9 per part de Plk1 és necessària per la fosforilació d’Eg5 a la Ser1044, i que aquesta fosforilació és necessària per la separació dels centrosomes en profase i pel reclutament d’Eg5 als centrosomes. Durant els últims anys hem inhibit Nek9 utilitzant diversos enfocs, però per tal d’obtenir una inhibició de la quinasa de forma aguda vàrem decidir seguir un “chemical genetic approach”. Aquesta estratègia consisteix en fer mutacions funcionalment silencioses en la butxaca d’unió de l’ATP (gatekeeper residue) que la sensititza per la inhibició mitjançant un anàleg d’ATP que no inhibeix la forma salvatge de la quinasa. Fins al moment, hem identificat el residu gatekeeper de Nek9 i hem pogut demostrar que aquest mutant actua com un mutant sensitiu a l’anàleg d’ATP in vitro.

The TGF-β pathway is currently considered a therapeutic target in advanced tumors, including glioblastoma (GBM), and several anti-TGFβ agents are in clinical trials and have shown promising results .A thorough understanding of the molecular mechanisms involved in the protumorigenic function of TGF-β will facilitate the identification of markers of response that can be used to stratify patients to be treated with anti-TGFβ compounds and, moreover, will allow for the discovery of new therapeutic agents. TGF-β is highly active in high-grade glioma, and elevated TGF-β activity confers poor prognosis. Aberrant activation of TGF-β is caused in part by enhanced secretion of the TGF-β ligands by tumor cells and tumor stroma cells. However, the precise mechanisms that lead to the hyperactivation of the TGF-β pathway are not yet fully understood. In this work, we have demonstrated that the TGF-β signaling pathway can be hyperactivated in GBM by different means including the stabilization of the TβRI by overexpression of the deubiquitinating enzyme USP15 or the enhanced secretion of TGF-β2 by the generation of a malignant autocrine loop via CREB. In this project, we identified USP15 and CREB as two novel regulators of TGF-β activity. USP15 and CREB could be considered as markers of response to anti–TGF-β molecules and potential therapeutic targets against GBM. / La vía de señalización de TGF-β es una diana terapéutica en tumores avanzados tales como glioblastoma (GBM). Diversos fármacos anti-TGF-β están siendo evaluados en ensayos clínicos y muestran resultados esperanzadores. En GBM, la vía de señalización de TGF-β se encuentra hiperactivada y es factor de mal pronóstico ya que promueve invasividad, angiogénesis, metástasis, inmunosupresión e induce la auto-renovación de las “células iniciadoras de glioma”. La hiperactivación de la vía de señalización de TGF-β en GBM en parte está causada por un aumento de la secreción por parte de las células tumorales y las células del estroma de los ligandos de TGF-β. Sin embargo, los mecanismos precisos que originan la hiperactivación de la vía de señalización de TGF-β en GBM son aún ampliamente desconocidos. En este trabajo, hemos descrito dos nuevos mecanismos moleculares que dan lugar a una hiperactivación de la actividad TGF-β en GBM, tales como la estabilización de TβR-I debido a la sobre-expresión de la deubiquitinasa USP15 o la sobre-expresión de TGF-β2 debido a la generación de un ciclo maligno autocrino mediado por el factor de transcripción CREB. En este proyecto, hemos identificado USP15 y CREB como dos nuevos reguladores de la actividad TGF- β. Nuestros resultados sugieren que tanto USP15 como CREB podrían ser evaluados como dos nuevos marcadores de respuesta a fármacos anti-TGF-β y nuevas dianas terapéuticas contra GBM.

Programa de Doctorat de Biotecnologia / Carbohydrates play a central role in transport and storage of energy and as molecular building blocks. Additionally, glycoconjugates, specifically glycoproteins and glycolipids, are important components of cell surfaces and the extracellular environment that mediate cellular and molecular interactions. Defects in glycosylation are associated with human diseases while the ability of glycans to modulate immune responses leads to them playing a critical role in susceptibility and resistance to pathogens. This huge amount of glycan structures requires the existence of a diverse group of degrading and remodelling enzymes: glycoside hydrolases (GHs) and glycoside transferases (GTs). GHs and GTs are highly specific enzymes responsible of the hydrolysis (GHs) and formation (GTs) of glycosidic bonds in carbohydrates. They are responsible for the modification of polysaccharides and glycoconjugates involved in numerous biological processes such as pathogenesis mechanisms, cell-cell recognition and polysaccharide degradation for biofuel processing. Knowledge of their enzymatic mechanism at a molecular level is crucial to understand how carbohydrates are assembled/degraded in organisms, as well as in developing new drugs. The detailed characterization of the transition state of the chemical reaction in which they participate, for instance, is key for the development of TS-analog inhibitors, which are known to be very efficient. In recent years, our group has investigated the implications of the conformational changes on the substrate during catalysis in several GHs and has related these changes with the conformations that can be sampled by a single sugar unit (e.g. glucose). This was analyzed by adapting sugar puckering coordinates as collective variables in ab initio metadynamics simulations. These studies are having a significant impact not only in the theoretical community but also in biochemistry and biophysics, because of the possibility to predict substrate catalytic itineraries for GHs. In this thesis, we extend these analyses to other sugar molecules to verify the proposed catalytic itineraries and also to GH inhibitors and sugar oxocarbenium ions to gain insights into transition state mimicry. Unlike GHs, known to operate by means of a double displacement mechanism, the reaction mechanism of retaining GTs is controversial. Both a two-step mechanism (by analogy to retaining glycoside hydrolases) and a one-step mechanism have been proposed and studied by means of quantum mechanics / molecular mechanics (QM/MM) simulations. Here, we applied this methodology to elucidate the catalytic mechanism of an engineered glycoside hydrolase and a glycoside transferase, giving support for a front-face single displacement mechanism. / Los azúcares presentan una gran variabilidad estructural que es aprovechada por los diferentes organismos para realizar una multitud de procesos biológicos, que incluyen el almacenamiento de energía, el reconocimiento y la señalización celular. Las glicosil hidrolasas y glicosil transferasas son las enzimas responsables de la hidrólisis y síntesis, respectivamente, de estos biopolímeros y por lo tanto están presentes en una gran variedad de procesos celulares. Las técnicas de modelado molecular permiten analizar estos procesos biológicos, como por ejemplo la reacción de formación de un enlace entre azúcares, a un nivel atomístico. De esta forma, se pueden describir los cambios conformacionales que se producen en el sustrato al unirse a la enzima, identificar el estado de transición de la reacción química y determinar otros aspectos fundamentales de la catálisis enzimática.

Tesi vinculada a l'Institut de Biologia Molecular de Barcelona / Aquesta tesi doctoral presenta l'estudi estructural de dues proteïnes implicades en la replicació dels picornavirus: la proteïna 2B del virus de l'hepatitis A (HAV) i la proteïna 3D, la polimerasa d'ARN dependent d'ARN (RdRp), dels virus Coxsackie B3 i el virus de l'Encefalomiocarditis (EMCV). Aquest treball aporta la primera estructura tridimensional d'una proteïna 2B d'aquesta família de virus. La seva estructura i la disposició al cristall suggereixen un mecanisme mitjançant fibres, semblants a les amiloide, pel qual dur a terme la funció en la que està implicada: la reorganització de membranes cel-lulars per tal de crear espais de replicació viral dins el citoplasma de la cèl-lula infectada. Pel que fa a les RdRp, s'han estudiat amb l'objectiu de trobar el lloc d'unió de fàrmacs i entendre els mecanismes de resistència que desenvolupen certes soques de virus mitjançant mutacions en aquesta proteïna. L'estructura del complex de la RdRp de CVB3 amb el GPC-N114, molècula amb activitat antiviral contra enterovirus i cardiovirus, ha revelat que el lloc d'unió se solapa amb el del motlle-encebador. Les estructures de les RdRp d'EMCV mutants de les dues soques resistents del virus (M300V i I304V) han permès entendre que el solapament del loop del motiu B amb el lloc d'unió de l'inhibidor podria ser el mecanisme de resistència davant del GPC-N114. La resolució de l'estructura de la RdRp d'EMCV salvatge ha mostrat una conformació de la polimerasa que no s'havia observat abans en la qual el motiu A adopta una conformació alterada que la inactivaria i podria tenir a veure amb un mecanisme d'autoregulació de la replicació viral. La RdRp mutant S299T de CVB3 present en una soca resistent a la inhibició de la replicació de l'ARN provocada per l'amilorida, fàrmac actiu contra els cardiovirus, ha permès determinar la importància del contacte entre aquest residu i el motiu conservat del centre actiu (GDD) per una correcta activitat de la RdRp. En conclusió, aquest treball presenta resultats importants per ampliar el coneixement general de la replicació en picornavirus afegint nova informació per concretar el funcionament pas a pas de les RdRp i iniciant una nova via cap a l'estudi de les proteïnes auxiliars de la replicació que permeten que aquesta funcioni. / The PhD thesis "NON STRUCTURAL PROTEINS OF PICORNAVIRUS: FUNCTIONAL IMPLICATIONS OF THE 2B AND 3DPOL CRYSTAL STRUCTURES" presents the structural study of two proteins involved in the replication of picornaviruses: 2B protein of hepatitis A (HAV) and 3D protein, the RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) of Coxsackie virus B3 and Encephalomyocarditis virus (EMCV). This work provides the first three-dimensional structure of a protein 2B from this viral family. The structure of the protein and the arrangement in the crystal suggest a mechanism to perform the function that is involved in: the reorganization of cellular membranes in order to create spaces for viral replication in the infected cell cytoplasm. Regarding the RdRp, the study was focused on finding the binding site and understand the drug resistance mechanisms that certain strains of viruses develop through mutations in this protein. The structure of the CVB3 RdRp with GPC-N114 molecule, an antiviral against enterovirus and cardiovirus, complex has revealed that the binding site overlaps with the template-primer duplex. The structures of the RdRp of both EMCV mutant resistant strains of the virus (M300V and I304V) have led to understand that the overlap of loop B with the inhibitor binding site may be the mechanism of resistance to the GPC-N114. The structure of the RdRp of EMCV showed a wild non complexed polymerase conformation nat previously seen in which the motifA adopts an altered conformation, probably inactive that could be related to a self-regulation mechanism of the viral replication. The model proposed for the mutant RdRp S299T of CVB3 resistant to the RNA replication inhibition caused by amiloride, a drug active against cardiovirus, reveals the importance of the contact between this residue and the conserved motif active site (GDD) to properly develop the RdRp activity. In conclusion, this study presents important results to expand the general knowledge of picornavirus replication by adding new information to define step by step the RdRp function and initiating a new way to study the assistant proteins that allow the replication.

Las gotas lipídicas (lipid droplets, LD) son orgánulos presentes en la mayor parte de las células eucarióticas. Están compuestas por un núcleo hidrofóbico de triacilglicéridos y ésteres de colesterol, rodeado por una monocapa de fosfolípidos a la que se asocian proteínas específicas.El interés despertado por las LD ha aumentado en los últimos años, debido a su implicación en patologías. En algunos casos, el número y el tamaño de las LD es anormalmente alto, como ocurre en los hepatocitos en el hígado esteatótico o en los macrófagos de las placas ateroscleróticas. Existen también evidencias que sugieren la implicación de LD en procesos neurodegenerativos como las enfermedades de Parkinson y Alzheimer. Así, entender los mecanismos de biogénesis y movilización de LD es crítico para el diseño racional de terapias contra las principales patologías de las sociedades occidentales. Las células en cultivo forman LD en dos situaciones fisiológicas: En primer lugar, como respuesta a la disponibilidad de lípidos en el medio, ya sea en forma de lipoproteínas del suero o como ácidos grasos libres. En este caso, la síntesis de LD tiene la doble función de prevenir la toxicidad debida a un exceso de lípidos en el citoplasma, y de generar una reserva de ácidos grasos para su uso cuando la situación se revierta. En segundo lugar, las células sintetizan LD cuando se encuentran sometidas a estrés. La función fisiológica de la biogénesis de LD en el segundo caso es desconocida, aunque se ha comprobado en modelos de apoptosis inducida por Fas-L o exposición a pH ácido. De hecho, las LD que se acumulan en el núcleo anóxico de los tumores son visibles in vivo mediante NMR, constituyendo la base de técnicas de imagen muy prometedoras para el diagnóstico. La hipótesis central sobre la que se plantea este proyecto de tesis postula que la biogénesis de LD en situaciones de estrés constituye un mecanismo de reciclaje de componentes lipídicos estructurales para darles una función energética. Nuestros resultados evidencian que el estrés por privación total de nutrientes induce la síntesis de triacilglicéridos (TAG) a partir de ácidos grasos liberados de fosfolípidos estructurales. Estos TAG se empaquetan en LD, que son posteriormente movilizadas para proporcionar combustible para la beta oxidación mitocondrial. Este proceso sostiene la supervivencia celular al estrés, y su inhibición en cualquier punto resulta tóxica para las células sometidas a privación total de nutrientes, pero no para las células mantenidas en condiciones normales de cultivo. La diferencias funcionales y de composición de las LD generadas en respuesta a disponibilidad de lípidos o a situaciones de estrés está acompañada por una serie de diferencias regulatorias, tanto en el proceso de biosíntesis como en el de movilización. Esta diversidad regulatoria sugiere que la formación de gotas lipídicas en situaciones de estrés es una respuesta orientada a canalizar ácidos grasos estructurales hacia funciones energéticas, con el objetivo de sostener la supervivencia celular durante el estrés. / Lipid droplets (LD) are intracellular organelles present in most eukaryotic cell types. They are composed of a hydrophobic core of triacylglycerol (TAG) and cholesterol esters, surrounded by a phospholipid monolayer with which a series of specific proteins interact. The interest in the study of LD has increased considerably over the last years, due to their implication in several pathologies. In some cases, the number and size of LD is abnormally high, as is the case in hepatocytes from steatotic liver or macrophages in atherosclerotic plaques. Evidence suggests the implication of LD in neurodegenerative processes, such as Parkinson’s and Alzheimer’s diseases. Thus, an understanding of the mechanisms of biogenesis and mobilization of LD is critical for the rational design of therapies against some of the major pathologies of the western society. Cells form LD in two different physiological situations. First, as a response to lipid availability in the medim, either in the form of serum lipoproteins or free fatty acids. In this situation. LD serve the double function of buffering cells from the toxic effects of excessive cytosolic lipids, and generating a reservoir of fatty acids for future anabolic or catabolic use when conditions are reversed. Second, cells form LD when they undergo stress. The physiological function of LD biogenesis under stress is unknown, although it has been observed in models of Fas-L-induced apoptosis or exposure to acidic pH. In fact, LD that accumulate in the anoxic core of tumors are visible in vivo through nuclear magnetic resonance (NMR), constituting the basis of very promising imaging techniques for diagnosis. The central hypothesis of this PhD project postulates that LD biogenesis is situations of stress constitutes a mechanism of recycling of structural lipidic components into catabolic fuel. Our results evidence that stress due to complete nutrient deprivation induces the synthesis of TAG from fatty acids released from structural phospholipids. Those TAG are packaged into LD, which are subsequently mobilized to fuel mitochondrial beta-oxidation. This process sustains cell survival to stress, and its inhibition at any stage is toxic for cells undergoing complete nutrient deprivation, but not to cells maintained in normal culture conditions. The functional differences of LD generated as a response to lipid availability or stress is mirrored by a series of regulatory differences, which are evident in the processes of LD biogenesis and LD mobilization. This regulatory diversity suggests that LD biogenesis induced by stress is a conserved response, aimed at channeling structural fatty acids towards catabolic pathways, with the objective of sustaining cell survival to stress.

En esta tesis se presentan las Interfaces Proteína-­Proteína como un Nuevo Tipo de Diana Terapéutica a explotar, a través del estudio de un sistema de dos proteínas implicado en la quimiotaxis bacteriana: CheA/CheY. En la segunda parte de la tesis, presentamos la regulación alostérica por fosforilación en HDAC8, a través de esta proteína poco conocida todavía, queremos vislumbrar el método de propagación que sigue a la entrada del fosfato en el lugar alostérico, y cómo en última instancia esto genera la inhibición de la función desacetilasa de la proteína. Para la primera parte de la tesis, primeramente, se elige un sistema tipo de dos proteínas, en base a un cribado inicial del PDB en busca de cavidades capaces de unir moléculas pequeñas tipo fármaco, que reúnan una serie de características, y posterior caracterización de la cavidad a estudiar. Tras estre cribado, se eligió el sistema CheA/CheY como sistema tipo. Paralelamente, otros miembros del grupo, seleccionaron compuestos comerciales capaces de unirse a la interfaz, mediante programas de docking como rDock, a fin de seleccionar compuestos con posible acción estabilizadora del complejo (compuestos con acción PP-­‐glue). Más adelante, también se adquirieron 4 fragmentos derivados de la benzen-­‐sulfonamida. La afinidad del complejo y cómo los compuestos le afectaban, fue estudiado: mediante técnicas biofísicas, como SPR y Termoforesis. Mediante la primera técnica, caracterizamos la afinidad del complejo y ensayamos los más de 100 compuestos que se adquirieron, en busca de compuestos activadores, que actuasen como PP-­‐ glue. Una vez encontrados, estos se estudiaron más a fondo mediante Termoforesis a fin de saber cuál es la afinidad de cada uno de ellos por cada una de las proteínas del sistema, cómo afecta a la Kd del complejo la adición de estos, y si esta es dependiente de la concentración. Una vez seleccionados los compuestos activadores, se quiso comprobar mediante cristalografía que el luegar de unión de estos era el predicho mediante técnicas computacionales. Para ello, primeramente se obtuvo la estructura cristal del sistema de dos proteínas a 2,5Å. Posteriormente, se buscó obtener la estructura cristal del mismo complejo, esta vez en presencia de los compuestos activadores y fragmentos, mediante co-cristalización y soaks. También realizamos una serie de experimentos in vivo, aprovechando la implicación del sistema en la quimiotaxis bacteriana y que la alteración del mismo puede traducirse en un cambio en la motilidad bacteriana, apreciable macroscópicamente. Para ello, realizamos una batería de cultivos en agar motil, en presencia de atractantes, repelentes, dichos compuestos, y observamos la distancia recorrida en cada uno de los casos. Para la segunda parte de la tesis y el estudio del alosterismo en HDAC8, realizamos una serie de mutaciones estratégicas, determinadas mediante dinámicas moleculares previas, realizadas por miembros del grupo, y observamos mediante Western Blot, cómo afectan estas mutaciones al nivel de fosforilación final de la proteína, y mediante ensayos in vitro observamos su correlación con la actividad desacetilasa final de cada uno de los mutantes.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / Our research group focuses on protein translation and more specifically on the mechanism of transfer RNA (tRNA) aminoacylation by a family of essential and universal enzymes called aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs). aaRS are essential and universal components of the genetic code and their long evolutionary history explains the growing number of functions being discovered for aaRS and for aaRS homologues, beyond their canonical role in gene translation. During the process of constructing a model for human disorders caused by mitochondrial tRNA aminoacylation deficiencies in Drosophila melanogaster in the laboratory has been identified a previously uncharacterized paralog of a seryl-tRNA synthetase (SerRS) named SLIMP. Given the conservation of SLIMP in all available insect genomes, a characterization of the phenotype upon SLIMP depletion was conducted in Drosophila melanogaster. We analyzed the specific effect of SLIMP knockdown in muscles and glia, and we observed a dramatic reduction of the lifespan in both mutants. Interestingly, SLIMP knockdown in the glia causes neurodegeneration visualized as vacuolization in the brain of mutant flies. The sequence identity that SLIMP shares with SerRS allowed to predict that this protein has an identical fold of a seryl-tRNA synthetase. It was previously shown that SLIMP does not posses tRNA aminoacylation activity, but it retains the property to bind mitochondrial tRNASer isoacceptors as a possible reflection of the evolutionary origin of the protein. We characterized the RNA-and DNA-binding property of SLIMP through in vitro and in vivo methodologies. We found that SLIMP binds in vitro all RNA sequences that are encoded in the mitochondrial genome. We suggest that the composition of these sequences (AT enrichment) and the respective folding energy (low .G) are the main determinants for SLIMP binding to RNA. We performed ribonucleoprotein immunoprecipitation assay (RIP) in cells to study SLIMP-RNA interaction in vivo and we showed that SLIMP interact with almost all mitochondrial transcripts. Pull-down experiments combined to mass spectrometry analysis revealed at least two SLIMP protein interactors: SRS2 and LON protease. We demonstrated that SLIMP and SRS2 are interdependent, as the knockdown or the overexpression of one protein reduced or increase respectively the level of the other. We suggest that SLIMP and SRS2 might form a functional complex that is maintained at a given SLIMP:SRS2 ratio. LON was the other identified SLIMP interactor. Our data shows that LON and SRS2 do not interact, but SRS2 might be a substrate of LON proteolytic activity. We also found OPA1 as a potential interactor of LON. OPA1 is a dynamin-like GTPase that is responsible for inner membrane fusion. Our results indicated that the overexpression of LON protease results in an increase of the smaller OPA1 isoforms that correlates with mitochondrial stress. Given the proposed role of SLIMP in RNA binding, we aimed to determine whether SLIMP has an effect on mitochondrial transcription. The results obtained by Northern blot screening of some mitochondrial mRNAs revealed that knockdown of SLIMP significantly reduced the steady-state levels of COX2 and COX3 mRNA, and 12S and 16S rRNAs whereas tRNA levels were found constant. Our results suggest that the defect in transcription upon SLIMP depletion, might be limited to mature mRNAs and may reveal a specific function for SLIMP in the binding and stabilization of processed mitochondrial mRNAs rather than a role in the control of their transcriptional rate or processing. We showed that knockdown of SLIMP affects also cellular growth and cell cycle progression, in fact, upon SLIMP depletion, we observed a dramatic increase of cells in G2/M phase. This result suggests that the mitochondrial role of SLIMP, or a consequence of its function, may be acting as a crosstalk between mitochondria and nuclear transcription factors that regulate cell proliferation. Collectively, the work described in this thesis has contributed to the characterization of a mitochondrial seryl-tRNA synthetase paralog that has acquired an essential function in insects despite a relatively modest divergence from a canonical SerRS structure. / El nostre grup de recerca es centra en la traducció de proteïnes i més específicament en el mecanisme d’aminoacilació dels àcids ribonucleics (ARNs) de transferència (ARNt) per una família d’enzims essencials i universals anomenats aminoacil-ARNt sintetases (aaRSs). Al laboratori s’han analitzat el paper de les aaRSs en la traducció proteica, les seves funcions no canòniques, la seva evolució, així com la seva implicació en malalties humanes. Les aaRSs són components universals i essencials del codi genètic. La seva llarga historia evolutiva explica el creixent número de funcions que s’estan descobrint, tant per a elles com per a proteïnes paràlogues, més enllà del seu paper canònic en traducció genètica. Al laboratori, durant el procés d’obtenció d’un model a Drosophila melanogaster per a l’estudi de malalties humanes degudes a deficiències en l’aminoacilació d’ARNt, es va identificar un nou gen, paràlog de la seril-ARNt sintetasa (SeRS) mitocondrial, anomenat SLIMP. La proteïna SLIMP representa un nou tipus de proteïna similar a aaRS que ha adquirit una funció essencial a insectes, tot i la relativament baixa divergència respecta a una estructura d’SeRS canònica. Tot i amb això, són necessaris estudis addicionals per a identificar el paper biològic de SLIMP. Per aconseguir aquesta fita, s’ha portat a terme el projecte descrit en aquest manuscrit, el qual consisteix en anàlisis addicionals del fenotip resultant de la depleció de SLIMP in vivo, seguits d’estudis detallats de les interaccions moleculars amb àcids nucleics i proteïnes, per acabar amb un estudi dels efectes de SLIMP en la fisiologia cel•lular. En conjunt, els nostres resultats demostren que SLIMP s’uneix específicament a ARNs mitocondrials in vivo i in vitro. SLIMP interacciona amb SerRS2 i les dues són interdependents a nivell d’estabilitat proteica. La depleció de SLIMP o de SerRS2 redueix els nivells basals d’alguns ARNm mitocondrials, però la transcripció d’ARNt és manté inalterada. Es proposa un rol en la regulació post-transcripcional o en l’estabilitat dels ARNm madurs. Hem observat també que la depleció de SLIMP indueix l’aturada del cicle cel•lular en la transició G2/M. Aquests resultats suggereixen que SLIMP, o una conseqüència de la seva funció, podria tenir un paper d’enllaç entre els mitocondris i els factors de transcripció nuclears que regulen la proliferació cel•lular.