Spelling suggestions: "subject:"angiologia molecular"" "subject:"algiologia molecular""
531 |
Obtención de un fragmento de anticuerpo específico contra oligómeros de Aβ como agente inmunoterapéutico de la enfermedad de Alzheimer: demostración de su eficacia en el modelo murino 3xTg-AD y mejora de su estabilidad termodinámicaRivera Hernández, Geovanny 28 February 2014 (has links)
La enfermedad de Alzheimer (AD) se ha convertido en un problema de primer orden en países desarrollados debido al coste sanitario social y humano que conlleva. La hipótesis de la cascada amiloide, la más aceptada por la comunidad científica, sitúa al péptido Aβ como el responsable directo del proceso neuropatológico, concretamente a los oligómeros de Aβ.
En la actualidad, existen multiples tratamientos sintomáticos-paliativos, sin que ningúno se haya descrito como curativo. Recientemente, la inmunoterapia β-amiloide se ha revelado como una posible herramienta en el tratamiento de la AD. En contraste con los anticuerpos completos, la administración de los scFv (fragmentos variables de cadena sencilla) no produce ni meningoencefalitis ni hemorragia cerebral. El uso de moléculas tipo scFv ha conseguido resultados prometedores en estudios pre-clinicos. Se trata de proteinas quimericas en donde se han fusionado los dominios VH y VL mediante un conector flexible, manteniendo la especificidad antígenica.En la presente tesis, se abordó la expresión recombinante de scFv-h3D6, un derivado de un anticuerpo monoclonal específico para los oligómeros de Aβ (mAb-h3D6, o bapineuzumab), en un sistema bateriano (E. coli) deficiente en reductasas y en co-expresión con los carriers Trx y NusA; asi como, su purificación mediante técnicas cromatográficas. La proteína presenta un plegamiento típico de las inmunoglobulinas. Su caracterización biofísica, permitió observar que bajo tratamiento térmico la molecula muestra tendencia a la agregación, promovida por la presencia de un estado intermediario con un componente-β worm-like enriquecido. De igual forma se evidenció durante el proceso de desplegamiento inducido por urea, la acumulación de un estado intermediario metaestable compuesto por el dominio menos estable (VL) desplegado y el dominio VH plegado; sugiriendo al dominio VL como el blanco para el rediseño de la estabilidad termodinámica global de la molécula. Auxiliándose en un modelo de la estructura tridimensional, se crearon una serie de variantes proteicas con el fin de aumentar la estabilidad del dominio VL. Dicho modelo tridimensional también reveló que el dominio VL, localizado en el C-terminal de la molécula, terminaba antes de que la última cadena-β fuera completada, por lo que decidimos extender dicho extremo en base a un alineamiento de 24 secuencias de scFvs depositados en el PDB.De ellos, las tres variantes de elongación del C-terminal presentaron un incremento en la estabilidad termodinámica de hasta el 26% y una disminución en la tendencia a la agregación de unos 4ºC. Esta mejora es deseable en una molécula de interés terapéutico, ya que ha de permitir una mayor vida media in vivo.Por otro lado, se examinó el efecto in vivo del scFv-h3D6 wild-type en un modelo murino triple transgénico que desarrolla la enfermedad de Alzheimer (3xTg-AD). El tratamiento se aplicó en una única dosis intraperitoneal en ratones hembra de 5 meses de edad, correspondiente a los primeros estadios de la enfermedad. Los beneficios del potencial terapéutico del scFv-h3D6 se mostraron a los 5 días, tanto a nivel conductual, como celular y molecular; principalmente, por su capacidad de eliminar los oligómeros de Aβ del córtex y el bulbo olfatorio, así como de restaurar los niveles de las apolipoproteínas apoE y apoJ (clusterina) en córtex y en hipocampo.
En resumen, la presente tesis hace un recorrido desde la obtención inicial y mejora de un fragmento de anticuerpo hasta la demostración de su eficiencia en un modelo murino de la enfermedad de Alzheimer. / Alzheimer's disease (AD) has become a public health problem in developed countries due to social and human health costs. The amyloid cascade hypothesis, the most accepted by the scientific community, places the Aβ peptide as directly responsible for the neuropathological process, specifically Aβ-oligomers.
Currently, there are multiple palliative-symptomatic treatments, but none has been described as curative.In recent years, Aβ (amyloid β) immunotherapy has been revealed as a possible tool in Alzheimer’s disease treatment. In contrast with complete antibodies, the administration of scFv (single-chain variable fragments) produces neither meningoencephalitis nor cerebral haemorrhage.The use of scFv-like molecules has achieved promising results in pre-clinical studies. In these chimeric proteins, the VH domain and the VL domain had been fused by a flexible linker, while maintaining the antigenic specificity.
In the present thesis, the recombinant expression of scFv-h3D6, a derivative of a monoclonal antibody specific for Aβ-oligomers (mAb-h3D6 or Bapineuzumab) was performed in a bacterial system (E.coli) defective for the two main redox pathways and Trx- and NusA- tagged, Purification of the islolated scFv-h3D6 was achieved by chromatographic techniques. The protein shows the typical immunoglobulin fold. Its biophysical characterization allowed for the observation that heat treatment initiates an aggregation pathway, characterized by a β-rich intermediate state which aggregates in the form of WL (worm-like) fibrils. In the same way, it was shown that its urea-induced unfolding pathway is characterized by the presence of a metaestable intermediate state composed of the unfolded VL domain and the folded VH domain, which suggests the VL domain as a target for thermodynamic stability redesign. The modeling of the 3D structure revealed that the VL domain, located at the C-terminal of the molecule, was ending before its latest β-strand was completed, so, a number of protein variants were created in order to increase the stability of the VL domain. Three elongation mutants, beyond VL-K107, showed increased thermodynamic stability up to 26% and lower aggregation tendency at around 4ºC. These traits shoud be of interest for a molecule with therapeutic potential, since its mean life in vivo should be longer.
Additionally, we examined the in vivo effects of the WT scFv-h3D6 in the triple-transgenic 3xTg-AD mouse model of Alzheimer disease. The treatment was applied in a single intraperitoneal dose to five-month-old females, corresponding to the early stages of the disease. Our results suggest that the benefit of scFv-h3D6 occurs at the behavioral cellular and molecular levels; mainly, decreasing Aβ-oligomers in the cortex and olfactory bulb and recovered the non-pathological levels of some apolipoproteins in the cortex (apoE and apoJ) and hippocampus (apoE).
In summary, this thesis makes a journey from the initial obtaining and improvement of an antibody fragment to the demonstration of its efficiency in a mouse model of Alzheimer's disease.
|
532 |
Classification of loops in protein structures: applications on loop modeling and protein functionFernández Fuentes, Narcís 30 June 2004 (has links)
Aquesta tesis esta estructurada en cinc capítols. Al capítol I, es fa una introducció als llaços, el subjecte d'estudi d'aquesta tesis. A més, es fa una petita introducció a les bases de dades biològiques de us corrent i de protocols bio-informàtics en comparacions de seqüències. Del capítol II al IV s'explora el paper que els llaços juguen a les proteïnes utilitzant un enfocament bio-informàtic, es realitza una classificació estructural de llaços (capítol II); es realitza un estudi per inferir relacions d'estructura i funció (capítol III) i es realitza un estudi de predicció d'estructura de llaços (capítol IV). Finalment al capítol V es presenten unes consideracions finals al treball realitzat i es proposen futures extensions al mateix.El treball realitza per el Dr. Oliva ha sigut el punt d'inici d'aquesta tesis. Al capítol II es presenta un procés totalment automatitzat de classificació estructural de llaços de proteïnes quinases. Diferent millores varen ser introduïdes al treball original del Dr. Oliva: (i) un nou procés de reagrupació que evita els solapament entre agrupacions de llaços, (ii) un servidor web que permet l'accés i recerca de dades sobre els llaços classificats a través de internet, (iii) referències creuades amb altre bases de dades important. El capítol III es centra en dues qüestions bàsiques: la conservació de la estructura dels llaços i la seva funció i la conservació de la estructura dels llaços i la seva relació amb l'evolució. Un extensiu estudi sobre una classificació estructural de llaços de proteïnes quinases va ser realitzat. El motiu pe el quan les quinases varen ser escollides com a subjecte d'estudi es degut a la seva importància biològica i perquè hi ha molta informació disponible a la literatura. Finalment al capítol IV s'estudia la aplicabilitat de les classificacions estructurals de llaços en el camp de la predicció d'estructura. Es va realitzat un test de validació (Jack-knife test) per provar la utilitat de la informació de la seqüència en forma de perfils de les agrupacions estructurals de llaços. / This thesis is structured into five chapters. In chapter I, protein loops - the topics of this thesis work - are introduced. Also, a short description of biological databases and current protocols in sequence comparison are given. Chapters II to IV explore a major role that loop segments play in protein structures by using a structural bio-informatics approach: (i) the structural classification (ii) the relationship between the structure and function and (iii) the structure prediction of loops. The conclusive chapter V is devoted to several considerations that complement the conclusions given in previous chapters. Extensions of this thesis work are also suggested.The research project on structural classification of loops, which was carried out by Dr. Oliva (Oliva et al. 1997), has been the starting point for all the other subsequent projects. In chapter II, a fully automated process for the structural classification of loops of kinases is presented. Several methodological improvements were made on the basis of Oliva's original work: (i) a newly introduced re-clustering process allows to avoid overlaps in classified loop clusters, (ii) a new web server was established to provide access and/or to query data through the internet, and (iii) cross referencing links were introduced with other biological databases. Chapter III focuses on two questions: the conservation of loop structures and functions and the extent of conservation of loop structures during evolution. An extensive analysis of a structural loop database of protein kinases was carried out. There are two main reasons why kinases were selected for the subject of this study: first, their critical biological relevance, and second the vast amount of functional information available in the literature and biological databases. Finally, in chapter IV, we apply ArchDB(Espadaler et al. 2004) for loop structure prediction. A Jack-knife test is performed to assess the usefulness of sequence information, which is included in the form of profiles in our structural clusters.
|
533 |
Estudio nutrigenómico de compuestos polifenólicos del cacao y del café en células tumorales humanasOleaga Sancho, Carlota 08 November 2012 (has links)
Tesi realitzada conjuntament amb el Departament de Nutrició i Bromatologia / La investigación en genómica nutricional combina las áreas de conocimiento de biología molecular, genética y nutrición. Los compuestos bioactivos de la dieta se podrían definir como aquellos componentes con potencial para modificar un elevado número de procesos biológicos asociados al equilibrio entre salud y enfermedad. En la presente tesis se han desarrollado tres estudios nutrigenómicos con compuestos polifenólicos del cacao y del café, con el objetivo de profundizar en el conocimiento de los mecanismos de acción por los que ejercen su actividad.
En el estudio de los efectos de un extracto de polifenoles de cacao (PCE) en líneas celulares de cáncer de mama, las conclusiones obtenidas son las siguientes:
1. El tratamiento con PCE induce la expresión de CYP1A1, así como sus niveles de proteína y la actividad enzimática en dos líneas celulares de cáncer de mama, MCF-7 y SKBR3.
2. La inducción de CYP1A1 mediada por PCE tiene lugar a través de la vía de señalización de AhR. PCE induce la transcripción de CYP1A1 a través de la unión de AhR a las cajas XRE de su promotor en ambas líneas celulares.
3. PCE induce los niveles de ERα en la línea celular SKBR3 aumentando la síntesis de la proteína, pero su vida media se reduce aproximadamente 10 horas en comparación con la proteína basal.
4. La incubación con PCE y tamoxifeno (TAM) a concentraciones no citotóxicas inducen un efecto sinérgico provocando un descenso en la viabilidad de dos líneas de cáncer de mama, MCF-7 y SKBR3, pero no en la línea no tumoral HEK293T.
En el análisis de los efectos de distintos metabolitos del cacao sobre la expresión de la apolipoproteína A1 en la línea celular HepG2 de hepatoma, establecimos las siguientes conclusiones:
1. La epicatequina (EPI) y los metabolitos del cacao inducen la expresión de ApoAI en la línea celular HepG2.
2. El tratamiento con EPI en células HepG2 induce la unión de factores de transcripción a dos regiones del “liver specific enhancer”, Site A y Site B. En la unión a Site A participan los factores de transcripción HNF-4, RXRα y ERα, además de HNF3β de manera indirecta. En la unión a Site B participa el factor de HNF-3β. EPI y los metabolitos del cacao estudiados inducen los niveles de mRNA de HNF-3β.
3. La transcripción de ApoAI se induce por EPI y los metabolitos del cacao estudiados a través del Site B, siendo 3-M-EPI el metabolito que provoca una mayor activación transcripcional.
4. Los factores de transcripción NFY y Sp1, además de HNF-3β, participan en la unión al Site B inducida por la incubación con 3-M-EPI. La sobreexpresión de NFY y Sp1 induce la transcripción de ApoAI a través del Site B.
Finalmente en la aproximación transcriptómica en células de cáncer de colon tratadas con ácido cafeico y café soluble, podemos concluir que:
1. El tratamiento con ácido cafeico (CA) y con café (ICC) genera un cambio en el perfil de expresión de la línea tumoral HT29.
2. Se han identificado dos genes nodo, STAT5B y ATF-2, tras la generación de una red de asociación biológica a partir de los genes diferencialmente expresados comunes a ambos tratamientos, CA e ICC.
3. La validación de los cambios en la expresión de ambos genes confirma la sobreexpresión de STAT5B e infraexpresión de ATF-2 inducida por la exposición a CA e ICC. También se ha confirmado el aumento en la proteína STAT5B inducida por el tratamiento con CA y con ICC y la disminución de los niveles de ATF-2 debidos al tratamiento con CA.
4. El tratamiento con CA e ICC modula los niveles de ciclina D1, proteína regulada por STAT5B y ATF-2 en dos líneas celulares de cáncer. En HT29, la exposición a CA reduce los niveles de ciclina D1, mientras que ICC induce los niveles de ciclina D1 al igual que los de ATF-2. En MCF-7 ambos tratamientos, CA e ICC, consiguen una disminución drástica de los niveles de proteína ciclina D1, a pesar de no acompañarles la disminución de ATF-2. / NUTRIGENOMIC STUDIES OF COCOA AND COFFEE POLYPHENOLS IN HUMAN TUMOR CELL LINES
Nutritional genomics research combines the knowledge areas of molecular biology, genetics and nutrition. Nutrigenomics studies how diet, or compounds from diet are able to modulate gene expression. Diet compounds such as polyphenols are known to produce beneficial effects in human homeostasis. Cocoa and coffee are two polyphenol food sources well studied in nutritional research. The aim of this work was to get further insight in the understanding of the mechanism of action through which cocoa and coffee polyphenols exert their beneficial effect, using three different nutrigenomics approaches.
The main conclusions of these nutrigenomic studies are:
1) The interaction between ERα and AhR upon incubation with a polyphenolic cocoa extract leads to CYP1A1 induction in breast cancer cells. The synergy between PCE and non-cytotoxic tamoxifen concentrations opens the possibility for a combination therapy based on polyphenols from cocoa that increased tamoxifen efficacy.
2) The activation of Apolipoprotein AI transcription through Site B in its promoter by cocoa flavanol metabolites is mainly mediated by an increase in HNF-3β, with a significant contribution of Sp1 and NFY, as a mechanism for the protective role of these compounds in cardiovascular diseases.
3) Coffee polyphenols are able to affect cyclin D1 expression in cancer cells through the modulation of STAT5B and ATF-2.
The results of this thesis led to three publications in international journals; i) “CYP1A1 is overexpressed upon incubation of breast cancer cells with a polyphenolic cocoa extract” in European Journal of Nutrition ii) “Cocoa flavanol metabolites activate HNF-3β, Sp1 and NFY mediated transcription of Apolipoprotein AI in human cells” in Molecular Nutrition and Food Research iii) “Coffee Polyphenols Change the Expression of STAT5B and ATF-2 Modifying Cyclin D1 Levels in Cancer Cells” in Oxidative Medicine and Cellular Longevity.
|
534 |
Biophysical Studies of the Tachykinin Peptides: Structural Characterization and Membrane InteractionsForoutan, Arash 14 December 2012 (has links)
En aquesta tesi doctoral, s’han aplicat metodologies biofísiques per estudiar i caracteritzar l'estructura dels pèptids substància P (SP), neuroquinina A (NKA) i scyliorinina I (ScyI), que pertanyen a la família de les taquiquinines (TK), així com la seva manera d'interacció amb membranes model. Els pèptids TKS són agonistes dels receptors de neuroquinina acoblats a la proteïna G. Els TKS estan involucrats en diversos processos fisiològics i malalties com el càncer, malalties neurodegeneratives i respostes inflamatòries, i això els converteix en un objecte de gran interès per a l'estudi estructural en la recerca d'agents terapèuticament rellevants.
Els tres pèptids SP, NKA i ScyI mostren una seqüència comuna en el domini C-terminal i es diferencien en el seu domini N-terminal. Per tant, sorgeixen preguntes: Què determina el seu diferent potencial d’activació? Quina és la conformació activa dels pèptids quan interactuen amb el receptor de NK per transferir la senyal? Quina és la seva manera d'interacció amb la superfície de la membrana? La superfície de la membrana, afecta la conformació del pèptid? Tenen els pèptids capacitat d’associar-se i si és així, quin tipus d'estructures formen i en quines condicions?
A la primera part dels resultats i discussió, s’utilitzen diferents mètodes d'espectroscòpia de fluorescència, per estudiar les interaccions dels sistemes de membranes amb TKS mimètics (micel·les SDS i vesícules DMPG / DMPC). Les cadenes laterals Trp i Phe CN es van utilitzar com fluoròfors intrínsecs, mentre la fluoresceïna fosfatidiletanolamina (FPE) i els lípids bromats es van utilitzar com sondes externes. Ja que SP i NKA no posseeixen el residu Trp, es va substituir el residu Phe en la posició 6 i 8 amb Trp, respectivament per als pèptids SP i NKA. L’espectroscòpia CD va confirmar la similitud de l'estructura general de SP i NKA amb els seus anàlegs. A més, mitjançant l'ús d'espectroscòpia de fluorescència de Trp (principalment λmax), es demostra que, en solució i en estat sub-micel·lar de SDS, la cadena lateral de Trp en SPW i NKAW està en un entorn hidròfob, mentre que apareix desplaçat a ambient hidrofílic després de la formació de micel·les. D'altra banda, l'espectroscòpia de CD mostra la transició de l’estructura PPII dominant en solució, a estructura α helicoïdal (en cas de SP i ScyI) o a la barreja de conformació desordenada i d’hèlix α (en el cas de NKA) una vegada es formen micel · les.
Aplicant una metodologia de fluorescència diferent, ha sigut possible separar el procés d'unió del pèptid a la superfície de la membrana, del procés d'inserció del pèptid / plegament al nucli hidrofòbic. SP, NKA i ScyI interaccionen amb DMPC i amb els liposomes amb càrrega negativa DMPG. No obstant això, les afinitats d'unió dels pèptids als liposomes de DMPC estan en el rang de 20-40 vegades menor, en comparació amb les afinitats a DMPG. A més, les afinitats d'unió de SP, NKA i ScyI correlacionen amb les seves càrregues netes, quan interactuen amb DMPG, però no amb DMPC.
A la segona part dels resultats i discussions, els factors que regeixen les estructures secundàries de les taquiquinines en estat monomèric (com el medi, la càrrega neta del pèptid i la càrrega superficial de la membrana) s’estudien per espectroscòpia CD. A més, es va aplicar la dispersió de raigs X d'angle petit per determinar l'estructura secundària del NKA en solució. En solució aquosa, l'estructura dominant de totes les taquiquininas és PPII. Per espectroscòpia d'infraroig, l’estructura flexible desordenada es va detectar per les taquiquininas en una concentració de 1,5 mM en solució. A més, en aquestes condicions, les estructures girs β i estructures esteses de làmina β es van detectar, respectivament, per SP i ScyI. En TFE, l'estructura dominant de les taquiqinines és helicoïdal, indicant la propensió helicoïdal intrínsec dels pèptids.
Igual que en solució, les taquiquinines mostren estructura PPII en presència de vesícules d’ions híbrids. En els liposomes carregats negativament, SP i ScyI posseeixen estructura α mentre NKA mostra una barreja d’estructura desordenada i conformacions en hèlix α. Els canvis conformacionals de les taquiquinines en augmentar la fracció de DMPG de la vesícula composta de DMPC / DMPG demostren clarament que l’estructura α dels pèptids depèn fortament de la quantitat relativa de DMPG aniònic en les vesícules. Això reflecteix la importància de les interaccions electrostàtiques dels pèptids amb els caps de la membrana.
A la part III dels resultats i discussió, s'estudia l'estat d'agregació de les taquiquinines. Es mostra que les taquiquinines són capaces de formar estructures fibril·lars. En solució, les taquiquinines a una concentració de 3 mM formen fibril·les amb diferent morfologia. En SP, es veuen llargues fibril·les retorçades i filaments individuals rectes, mentre que en ScyI i NKA només s’observen fibril·les rectes. Les taquiquinines en una concentració per sobre de 1,5 mm formen fibril·les immediatament en presència de vesícules de càrrega negativa, mentre que no es van detectar en les fibril·les de DMPC. Aquest fet indica la importància de les càrregues negatives en el procés de fibril·lizació. L’espectroscòpia FTIR mostra un augment significatiu de l'estructura de làmina β per les taquiquinines a una concentració de 3 mM i en presència de les vesícules de DMPG, que s'atribueix a la formació de fibril·les. A més, en aquesta condició, FTIR mostra estructura helicoïdal en tots els TKS i algunes conformacions de gir β per SP i NKA.
Sobre la base de TEM i espectroscòpia de CD, es mostra que la fibril·lizació de SP (100 mM) es produeix durant la transició d'estructura PPII a fulla β després de la incubació en concentracions de SDS prop de la CMC. En contrast, SPW no mostra fibril·lizació en les mateixes condicions. Sobre la base d'assaig THT, es van detectar fibril·les amiloides per NKA però de moment no tenim cap evidència sobre la formació amiloide en SP i ScyI. Els resultats indiquen que la formació d'amiloide en NKA disminueix a pH alcalí. En contrast, NKAW és capaç de formar fibril·les amiloides a pH àcid i alcalí però no a pH neutre. Analitzant l'activitat metabòlica de la línia cel·lular PC12 mitjançant la prova de TMM, es demostra que NKA a una concentració de més de 25 µM pot induir toxicitat, mentre que no es va observar cap disminució significativa de l'activitat metabòlica en presència de fins a 250 µM de SP o de ScyI / In this doctoral thesis, biophysical methodologies were applied to study and characterize the structures of substance P (SP), neurokinin A (NKA) and scyliorhinin I (ScyI) peptides, which belong to the tachykinin (TK) family, and their mode of interaction with model membranes. The TKs peptides are agonists of Neurokinin G-protein coupling receptors. TKs are involved in several physiological processes and diseases such as neurodegenerative disorders, cancer and inflammatory responses, what make them an object of high interest for structural study in search of relevant therapeutically agents.
The three peptides SP, NKA and ScyI are homologous sharing common C domain –terminal and differ in their N terminal domain. Therefore, questions arise: What determine their different activity potential? What is the active conformation of the peptides when they interact with the NK receptor to transfer the signal? What is their mode of interaction with the membrane surface? Does the membrane surface affect the peptide conformation? Do the peptides self associate and if they have these ability, what kind of structure they form and at which conditions?
In part I of the Results and Discussion, by using different fluorescence spectroscopy approaches, the mode of the interactions of TKs with membrane mimetic systems (SDS micelles and DMPG/DMPC vesicles) were studied. The Trp and Phe-CN amino acids were used as intrinsic fluorophores, while fluorescein phosphatidylethanolamine (FPE) and brominated lipids were used as external probes. Since SP and NKA lack the intrinsic Trp residue, we substituted Phe residue in position 6 and 8 with Trp, respectively for SP and NKA peptides. CD spectroscopy confirmed the similarity of the overall structure of SP and NKA with their analogues. Furthermore, by using Trp fluorescence spectroscopy (mainly λmax), we understood that in solution and in sub-micellar state of SDS, the Trp side chain of SPW and NKAW are in a hydrophobic environment, while they appear displaced to hydrophilic environment upon formation of micelles. On the other hand, CD spectroscopy show the transition of the dominant PPII helical structure in solution to α helical structure (in case of SP and ScyI) or to the mixture of unordered and α helical conformation (in the case of NKA) upon formation of micelles. Applying different fluorescence methodology it was possible to separate the process of peptide binding to a membrane surface from the process of peptide insertion/folding into the hydrophobic core. SP, NKA and ScyI bind to both zwitterionic DMPC and negatively charged DMPG liposomes. However, binding affinities of the peptides to DMPC liposomes are in the range 20-40 times lower, compared to the affinities to DMPG. Moreover the binding affinities of SP, NKA and ScyI correlate with their net charges, when they interact with DMPG, but not with DMPC.
In part II of the Results and Discussions, the factors governing the secondary structures of the tachykinins in monomeric state (such as environment, peptide net charge and membrane surface charge) are studied by CD spectroscopy. Moreover, small angle X-ray scattering was applied to determine the NKA secondary structure in solution.
In aqueous solution, the dominant structure of all tachykinins is PPII. By FTIR spectroscopy, flexible unordered structure was detected for tachykinins in a concentration of 1.5 mM in solution. Moreover, in these condition, β turn and extended β sheet structures were detected, respectively for SP and ScyI.
In the TFE the dominant structure of tachykinins is alpha helical which indicates the intrinsic helical propensity of peptides.
Like in solution, tachykinins have PPII structure in the presence of the zwitterionic vesicles. In negatively charged liposomes, SP and ScyI are in α helical structure while NKA shows a mixture of the unordered and α helical conformations. Conformational changes of tachykinins upon increasing of the DMPG fraction of the vesicle composed of DMPC/DMPG demonstrate clearly that the α helical fold of peptides strongly depends on the relative amount of anionic DMPG in the vesicles and reflecting the importance of the electrostatic interactions of peptides with headgroup of the membrane.
In part III of the Results and Discussion, the aggregation state of the tachykinins is studied. We understood that tachykinins are able to form fibrillar structures. In solution, 3 mM of tachykinins formed fibrils with different morphology. In SP long twisted fibrils and straight single filaments were seen while in ScyI and NKA fibrils are only single-straight. Tachykinins in a concentration of above 1.5 mM formed fibrils immediately in the presence of negatively charge vesicles, while no fibrils were detected in DMPC for any tachykinins. This fact indicates the importance of the negatively surface charges on fibrillization. FTIR spectroscopy shows a significant increase of the β sheet structure for tachykinins in a concentration of 3 mM and in the presence of the DMPG vesicles which is attributed to the fibrils formation. Moreover, in this condition, FTIR shows helical structure in all TKs and some β turn conformations for SP and NKA.
Based on TEM and CD spectroscopy, we understood that fibrillization of SP (100 µM) occurs upon transition of PPII structure of peptide to β sheet after incubation in SDS concentrations close to CMC. In contrast, SPW was not able to make fibrils in the same condition. Based on ThT assay, amiloid fibrils were detected for NKA but at the moment we do not have any evidence about the amiloid formation of SP and ScyI. Moreover we found that amyloid formation of NKA decreases at alkaline pH. In contrast, NKAW is able to form amyloid fibrils at acidic and alkaline pH but not at the neutral pH. Analyzing of the PC12 cell line metabolic activity by TMM test indicates that NKA in a concentration of more than 25 µM can induce toxicity, while no significant decrease of metabolic activity was seen in the presence of up to 250 µM SP or ScyI.
|
535 |
Structural and Functional Studies of Melibiose permease of escherichia coliLin, Yibin 27 July 2012 (has links)
Els transportadors de membrana tenen un paper molt important en el manteniment de la fisiologia normal de l'organisme, així com en l'eficàcia i la seguretat dels fàrmacs. Per tant, és molt important obtenir noves dades de l'estructura i la funció d'aquest tipus de proteïnes de membrana. La melibiosa permeasa (MelB), un transportador de membrana, és de gran interès, ja que pot utilitzar diferents sucres (ja sigui α- o β-galactòsids) i cations (Na+, Li+ i H +), mentre que altres simportadors com la lactosa permeasa, un membre de la important superfamília de facilitadors, utilitza només H+. Això implica que la MelB ha de presentar algunes característiques úniques en quant al reconeixement i el transport dels substrats. L'estudi en profunditat de l'estructura i funció de la MelB ens pot proporcionar millores clau en la comprensió del mecanisme de co-transport dels transportadors de membrana. Les dades actuals d’índole bioquímica, biofísica o estructural de la MelB no ens proporcionen una escena clara del mecanisme de reconeixement de substrats, i tampoc expliquen la reorganització estructural que es produeix i que en última instància, genera els canvis conformacionals necessaris per al transport a través de la membrana.
En aquesta tesi, he utilitzat tècniques espectroscòpiques, així com mètodes de cristal·lografia de macromolècules per explorar l'estructura i funció de la MelB. En primer lloc, m'he centrat en l’estudi del mutant R149C, el qual no pot unir el sucre i no pot transportar. En segon lloc, he estudiat el paper de l'hèlix V a partir de la substitució individual dels aminoàcids per cisteïna, per mutagènesi dirigida. Finalment, hem cristal·litzat el transportador MelB i hem aplicat difracció de raigs X per intentar obtenir la seva estructura 3D.
Els resultats mostren que la mutació R149C fixa la MelB en una conformació oberta cap al citoplasma. Per tant, l’Arg149, situada probablement al final del cantó citoplasmàtic de l'hèlix V, és una cadena lateral crucial per al mecanisme de reorientació de la MelB. Un altra resultat important és que l’Ala155, situat probablement cap el punt mig de l’hèlix V, és un residu essencial tan per la unió de Na+ com de melibiosa, ja que el mutant A155C perd absolutament qualsevol capacitat d'unir els substrats. Per altra banda, es proposa que l'hèlix V ha d'estar involucrada en el mecanisme de reorientació de la MelB.
Després de diversos intents de cristal·litzar la proteïna, hem estat capaços d'obtenir cristalls de la MelB silvestre i del mutant R149C, solubilitzats en β-DDM. Després de l'optimització, el millor cristall difracta a uns 8 Å a la font de radiació sincrotró. / Membrane transporters play a very important role to maintain the normal physiology of the organism as well as in drug safety and efficacy. Therefore, it is very important to gain new information on the structure and function of this type of membrane proteins. Melibiose permease (MelB), a membrane transporter, is of great interest because it can use different sugars (either α- or β-galactosides) and cations (Na+, Li+, and H+), whereas other symporters like lactose permease, a member of the major facilitator superfamily uses only H+. This implies that MelB should present some unique substrate recognition and transport characteristics. The in-depth study of the structure and function of MelB may provide us with key advancements in the understanding of the cotransport mechanism of membrane transporters.
The current biochemical, biophysical, and structural data for MelB fail to give us a clear scene of the substrates recognition mechanism, and to explain the structural reorganization that occurs and that ultimately forces the conformational changes needed for transport through the membrane. In this thesis, I used spectroscopic techniques as well as macromolecular crystallography methods to explore the structure and function of MelB. Firstly, I focused on the R149C mutant, which cannot bind sugar and cannot transport. Then I continued to study the role of helix V by cysteine scanning mutagenesis. Finally, I tried to crystallize the MelB transporter and apply X-ray diffraction to obtain its 3D structure. The results showed that the R149C mutation fixes the MelB in an inward-facing conformation. Therefore, Arg149, located probably in the cytoplasmic half of transmembrane helix V, is a crucial side chain for the reorientation mechanism of MelB. Ala155, located probably in the middle of helix V, is an essential residue for either Na+ or melibiose binding, since the mutant A155C absolutely loses the capability to bind substrates. The helix V should be involved in the reorientation mechanism of MelB from the outward-facing to the inward-facing conformation. After several attempts of crystallizing the protein, we were able to obtain crystals of MelB wt and R149C mutant solubilized in β-DDM. After optimization, the best crystal diffracted to about 8Å at the synchrotron radiation source.
|
536 |
Regulation of histamine synthesis and release in the central nervous system by H3 receptor transduction mechanismsGómez Ramírez, Jordi 26 September 2002 (has links)
La importancia de la neurotransmissió histaminèrgica sobre diversos procesos neurofisiològics i neuropatològics ha sigut ben descrita. Malgrat tot, els mecanismes de transducció que controlen l'alliberament i la síntesi d'histamina són poc coneguts. En aquest sentit, s'ha descrit que els autoreceptors H3 tenen una funció principal en la regulació dels nivells d'histamina cerebral però, fins al dia d'avui, els mecanismes de transducció de senyal acoplats als autoreceptors H3 són poc compresosLa principal finalitat d'aquest treball ha sigut la descripció de les vies de transducció de senyal involucrades en la modulació de l'alliberament i la síntesi d'histamina mitjançant els autoreceptors H3.Hem desenvolupat un mètode radioisotòpic per purificar, per cromatografia líquida d'elevada resolució (HPLC), [3H]-histamina sintetitzada a partir d'histidina radioactiva la qual cosa permet una quantificación de la [3H]-histamina més senzilla, sensible i exacte que la obtinguda mitjançant altres metodologies descrites previament.Hem demostrat que els autoreceptors H3 modulen la síntesi de [3H]-histamina mitjançant la via adenilat ciclasa-proteïna quinasa A. Malgrat tot, basant-nos en els nostres resultats no podem concloure si la proteïna quinasa A activa a la histidina descarboxilasa de forma directe mitjançant la seva fosforilació o de forma indirecta mitjançant l'activació d'altres proteïna quinases. D'altra banda, hem observat que els autoreceptors H3 no poden modular l'alliberament de [3H]-histamina mitjançant la via de transducció que hem mencionat previament.També hem descrit que els increments de l'alliberament i la síntesi de [3H]-histamina induïts per la despolarització amb potassi estàn mediats per la regulació de l'entrada de calci extracel·lular a través de canals de calci activats per voltatge de tipus N. Tenint present aquests resultats, seria d'interés investigar quin tipus de proteïna quinases dependents de calci podrien estar involucrades en el control de l'alliberament i la síntesi d'histamina a les neurones histaminèrgiques.Finalment, hem demostrat que la síntesi de [3H]-histamina pot ser estimulada per activació de la via adenilat ciclasa-proteïna quinasa A o per l'entrada de calci extracel·lular de forma independents.En conclusió, aquest treball de tesi doctoral ha permès una millora en la comprenssió de la funció histaminèrgica cerebral a la vegada que un millor coneixement dels mecanismes de transducció de senyal dels autoreceptors H3. Aquest coneixement podria ser útil pel desenvolupament de nous tipus de farmacs que podrien ser aplicables en el tractament de diverses malalties del sistema nerviós. / The importance of histaminergic neurotransmission on several neurophysiological and neuropathological processes is well established. However, little knowledge is available on the transduction mechanisms controlling histamine synthesis and release in neurons. It is known that histamine H3 autoreceptors have a main role on these processes. Nevertheless, the signal transduction mechanisms used by H3 autoreceptors are poorly understood.The main purpose of this work has been the elucidation of the signal transduction pathways involved in the modulation of histamine release and synthesis specifically by histamine H3 autoreceptors.We have developed a radioisotopic method to purify by HPLC [3H]-histamine synthesized from radiollabelled histidine which allows simpler, more sensitive and accurate quantification of [3H]-histamine compared to other previous methodologies. This procedure has been used to determine histidine decarboxylase activity in homogenates as well as [3H]-histamine synthesis and release in brain miniprisms.We have demonstrated that histamine H3 autoreceptors modulate [3H]-histamine synthesis through adenylate cyclase-protein kinase A pathway. Nevertheless, based on our data we can not conclude whether protein kinase A activates histidine decarboxylase through direct phosphorylation of this protein kinase. Otherwise, we have observed that histamine H3 autoreceptors did not modulated [3H]-histamine release through adenylate cyclase-protein kinase A pathway.In addition, we have described that depolarization-elicited increases of [3H]-histamine release and synthesis are mediated by calcium influx through N-type voltage activated calcium channels. Taking into account these data, it would be of interest to investigate which calcium dependent proteins are involved in the control of histamine release and synthesis in histaminergic neurons.Finally, we have indicated that histamine synthesis can be increased by adenylate cyclase-protein kinase A activation pathway and calcium entry in an independent manner. Based on these results, it could be possible that H3 receptors act on both pathways simultaneously to control histamine synthesis.In conclusion, this work allows an improvement of the comprehension of histaminergic function and a better knowledge of the transduction mechanisms of H3 autoreceptors which may help to the development of a new classes of drugs that may become useful for the treatment of several kind of diseases of the nervous system.
|
537 |
Caracterització molecular i funcional de la proteïna quinasa CK2 de blat de moro (Zea mays)Riera Bonet, Marta 16 September 2002 (has links)
La proteïna quinasa CK2 és una Ser/Thr quinasa ubiqua i altament conservada entre les espècies. S'ha trobat a pràcticament tots els compartiments de totes les cèl.lules eucariotes examinades. Tant en animals com en plantes s'ha demostrat que pot fosforilar in vitro un alt nombre de proteïnes involucrades en molts processos cel.lulars, no obstant, es desconeix el mecanisme de regulació de l'enzim així com la seva funció biològica. L'holoenzim CK2 és un heterotetràmer, format per dos tipus de subunitats, les catalítiques CK2a i les reguladores CK2b, encara que en blat de moro fins el moment de començar aquesta tesi no s'havia descrit l'existència de subunitats reguladores CK2b. Entre els substrats de CK2 descrits en blat de moro es troba la proteïna Rab17. Rab17 és una proteïna LEA (Late Embryogenesis Abundant) que s'acumula en embrió madur i en resposta a estrés abiòtic i àcid abscisic. Estudis funcionals previs varen indicar una possible funció de Rab17 en el procés de germinació en condicions d'estrés osmotic que podria està regulada per fosforilació per CK2.ResultatsLa tesi es divideix en tres capítols: En el primer es realitza la caracterització molecular de la proteïna quinasa CK2 de blat de moro i consta de dues publicacions internacionals: Maize protein kinase CK2: regulation and functionality of three beta subunits. Marta Riera, Giovanna Peracchia, Eulalia de Nadal, Joaquin Ariño and Montserrat Pagès. Plant J. 2001, 25: 365-374 i Distinctive features of plant protein kinase CK2. Marta Riera, Giovanna Peracchia, Montserrat Pagès. Mol. Cel. Biochem. 2001, 227:119-127. En aquests treballs es descriu l'aillament de tres subunitats reguladores CK2b en blat de moro i una nova subunitat catalítica. També s'estudia l'expressió gènica de les diferents subunitats CK2a/b, la especificitat d'interacció entre elles i es demostra la funcionalitat de les subunitats CK2b de blat de moro mitjançant estudis de complementació en llevat. També es va realitzar la purificació de l'holoenzim CK2 recombinant de blat de moro i es caracteritzar a nivell bioquímic, demostrant que presenta una estructura heteroteramèrica. En el segon capítol es presenta l'estudi de la regulació de la proteïna Rab17 per la proteïna quinasa CK2 de blat de moro. Es va determinar que existia interacció física entre les subunitats reguladores CK2b1 i CK2b3 i la proteïna Rab17 mitjançant l'aproximació del sistema del doble híbrid i l'anàlisi de "pull-down". També es va realitzar un estudi de la fosforilació in vitro i en extractes de blat de moro de la proteïna Rab17 pels diferents enzims CK2. A més, es va estudiar la localització subcel.lular tant de la proteïna Rab17 com de les subunitats CK2a/b fusionades a la proteïna GFP mitjançant transformació transient de cèl.lules de ceba i es va comprovar que existia una relocalització subcel.lular de Rab17 depenent de el seu estat de fosforilació CK2. També es va demostrar una localització nucleolar de les subunitats catalítiques CK2a mentre que les subunitats reguladores CK2b queden excloses d'aquest compartiment. Per últim al tercer capítol es descriu una sèrie de proteïnes que es van aïllar mitjançant un "screening" de doble híbrid utilitzant la subunitat reguladora CK2b1 com a "bait". Es tracta de proteïnes de localització nuclear implicades en diversos processos de regulació gènica com factors de transcripció de diferent tipus, proteïnes de reparació de DNA o d'unió a RNA indicant que la proteïna quinasa CK2 de blat de moro està implicada en processos essencials per a la viabilitat cel.lular. / Protein kinase CK2 is a ubiquitous and highly conserved Ser/Thr kinase present in nucleus and cytoplasm of all eukaryotic cells examined to date. It is not responsive to known second-messengers molecules and both in animals and plants is able to phosphorylate high number of proteins, however, its precise biological functions remain unknown. The enzyme is a heterotetramer composed of two types of subunits, catalytic (CK2a) and regulatory (CK2b), however, in maize, the existence of CK2 regulatory subunits was not previously described. It is known that maize Rab17 protein is in vitro phosphorylated by protein kinase CK2. Rab17 protein (for Responsive to ABA) is a Late Embryogenesis Abundant protein that accumulates during seed maturation and can be induced to reappear by ABA treatment or osmotic stress in the vegetative tissues. Preliminary functional studies indicate that a possible role of Rab17 in germination process under stress conditions should be regulated by CK2 phosphorylation.ResultsThe thesis manuscript includes three chapters: The first chapter is about the molecular characterization of maize protein kinase CK2 and includes two international publications: Maize protein kinase CK2: regulation and functionality of three beta subunits. Marta Riera, Giovanna Peracchia, Eulalia de Nadal, Joaquin Ariño and Montserrat Pagès. Plant J. 2001, 25: 365-374 and Distinctive features of plant protein kinase CK2. Marta Riera, Giovanna Peracchia, Montserrat Pagès. Mol. Cel. Biochem. 2001, 227:119-127. These two works demonstrates the existence and functionality of three CK2b regulatory subunits and a novel catalytic CK2a subunit in maize. It has been also studied the expression pattern of all CK2a/b subunits and the specific interactions between the different subunits. Moreover, it was demonstrated the functionality of maize CK2b regulatory subunits by yeast complementation assays. Purification and biochemical characterization of recombinant maize CK2 demonstrate the heterotetrameric structure of maize holoenzyme. In the second chapter is studied the regulation of Rab17 by CK2 phosphorylation. By using two-hybrid system and pull-down assays is showed that Rab17 interacts with regulatory subunits CK2b1 and CK2b3. It was also studied the phosphorylation of Rab17 by different CK2 enzymes. It was analysed in detail by confocal microscopy the subcellular localization of Rab17 and CK2a/b subunits fused to green-fluorescence protein (GFP) in transformed onion cells, showing that the subcelular localization of Rab17 is dependent on its CK2 phosphorylation . It is also described a mainly nucleolar localization of CK2a catalytic subunits whereas the regulatory CK2b subunits are absents of this compartment. Finally, the third chapter contains the description of several proteins isolated by two-hybrid screening using the regulatory CK2b1 subunit as a bait. All proteins present nuclear localization and are involved in several processes of gene regulation such as transcription factors, DNA repair or RNA binding indicating that maize CK2 is involves in main mechanism essentials for cell survival.
|
538 |
La via de la proteïna cinasa dependent de calci i calmodulina tipus II regula la síntesi i l'alliberament d'histamina cerebral durant la despolarització i forma part del mecanisme de transducció del receptor H3Torrent Moreno, Anna M. 15 September 2003 (has links)
En el cervell, la histamina és un neurotransmissor que participa en diferents processos bioquímics, fisiològics i comportamentals com per exemple l'alliberament de neurotransmissors i hormones hipotalàmiques, la regulació del cicle de la son, la ingesta d'aliments i la memòria, entre altres.En el cervell, l'enzim que sintetitza histamina a partir d'histidina és la histidina descarboxilasa. En aquesta tesi hem posat a punt un mètode radioisotòpic per determinar la síntesi d'histamina en teixits amb baixa activitat histidina descarboxilasa, com és el cas del cervell.Resultats previs del nostre grup assenyalaven que encara que l'activació de la via de l'adenilat ciclasa-proteïna cinasa depenent d'AMPc (PKA) estimulava la síntesi d'histamina, l'activació de la síntesi d'histamina per despolarització no depenia d'aquesta via.En aquesta tesi hem demostrat que la despolarització de les terminals histaminèrgiques corticals augmenta la síntesi d'histamina a través de l'entrada de calci principalment pels canals de calci activats per voltatge tipus N i de l'activació de la proteïna cinasa depenent de calci-calmodulina tipus II (CaMkII). Les vies de l'adenilat cilcasa-PKA i del calci-CaMkII estimulen la síntesi d'histamina independentment una de l'altra, i els agonistes de l'autoreceptor histaminèrgic H3 inhibeixen, de manera independent, la síntesi d'histamina estimulada per ambdues vies. L'agonista invers del receptor H3, tioperamida, augmenta la síntesi d'histamina en presència d'ibmx ( estimulador de la via de la PKA) o de 30 mM de potassi. Els resultats d'aquesta tesi indiquen que el mecanisme de transducció de la tioperamida no depèn de CaMkII però si de l'entrada de calci pels canals esmentats i de l'activitat de la PKA. Finalment, hem demostrat que la histidina descarboxilasa purificada es pot fosforilar i activar per la CaMkII i/o la PKA in vitro. / En el cerebro, la histamina es un neurotransmisor que participa en diferentes procesos bioquímicos, fisiológicos, patológicos y comportamentales como la liberación de neurotransmisores y hormonas hipotalámicas, la regulación del ciclo sueño / vigilia, la ingestión de alimentos y la memoria entre otros. El enzima que sintetiza histamina a partir de histidina en el cerebro es la histidina descarboxilasa (HDC). En esta tesis hemos puesto a punto un método radioisotópico para determinar la síntesis de histamina en tejidos con baja actividad histidina descarboxilasa como es el caso del cerebro. Aplicando este método en nuestro grupo se ha descrito que la activación de la vía de la adenilato ciclasa (AC) - proteína kinasa dependiente de AMPc (PKA) estimula la síntesis de histamina. No obstante, la activación de la síntesis de histamina por despolarización no depende de esta vía.En esta tesis hemos demostrado que la despolarización de las terminales histaminérgicas corticales aumenta la síntesis de histamina a través de la entrada de calcio, principalmente por los canales de calcio activados por voltaje tipo N y la activación de la proteína kinasa dependiente de calcio-calmodulina tipo II (CaMkII). Parte de la liberación de histamina activada por despolarización también depende de la entrada de calcio por dichos canales y de la actividad CaMkII. Las vías de la AC-PKA y del calcio-CaMkII estimulan la síntesis de histamina independientemente una de otra, y los agonistas del autoreceptor histaminérgico H3 inhiben de forma también independiente la síntesis de la amina estimulada por ambas vías. El agonista inverso del receptor H3, tioperamida, aumenta la síntesis de histamina en condiciones de pre-estimulación por ibmx (estimulador de la vía de la AC-PKA) o por despolarización con potasio. Esta tesis señala que el mecanismo de transducción de la tioperamida no depende de CaMkII pero si de la entrada de calcio por los canales y de la actividad PKA. Finalmente , hemos demostrado que in vitro la HDC purificada ( versión 1/512 ) se fosforila y activa por la CaMkII i la PKA. / Histaminergic neurons constitute a long and highly divergent system projecting in a diffuse manner to many areas in almost all regions of the brain and participate in the regulation of the sleep/wake cycle, memory, food intake among other brain functions. This histaminergic neurons modulate neurotransmitter synthesis and release through H3 autoreceptors. The regulatory enzyme that catalyzes the synthesis of histamine from histidine is the histidine decarboxylase . In this tesis we have developed a procedure for the accurate measurement of histamine synthesis and release in tissues expressing low levels of histidine decarboxylase activity. Using this procedure in rat brain cortical slices we have demonstrated the participation of the calcium/ calomodulin dependent protein kinase II in the stimulation by depolarization of histamine synthesis and release. In this tesis we show that the effects of depolarization on the HA synthesis and release are prevented by several agents that block N-type calcium channels and calcium/calmodulin dependent protein kinase II. Protein kinase A and calcium/calmodulin dependent protein kinase II stimulate histamine synthesis through separate mechanisms, each of them controlled by H3 receptors. A direct phosphorylation and activation of histidine decarboxylase by these kinases occurs in vitro. Finally, the stimulation of histamine synthesis elicited by the antagonist/inverse agonist thioperamide requires both extracellular calcium entry and protein kinase A activity. These results indicate that these two pathways are under control by H3 receptors in histaminergic terminals of the rat brain cortex.
|
539 |
Influència estructural i funcional de mutacions extrecel·lulars de la bacteriorodopsina: efectes locals i a llarga distànciaMárquez Martínez, Mercedes 25 July 2003 (has links)
La bacteriorodopsina (bR) és una proteïna transmembranal de set hèlices a de l'arqueobactèria Halobacterium salinarum. La bR té unida covalentment via una Base de Schiff (BS) protonada una molècula de retinal, cromòfor responsable de que, activada per la llum, la bacteriorodopsina bombegi protons des de l'interior al exterior de la cèl·lula. Aquest bombeig es realitza mitjançant un fotocicle, successió d'estats conformacionals i bioquímics anomenats intermediaris pels que passa la proteïna per dur a terme la translocació de protons. El gradient electroquímic de protons generat es aprofitat per les ATP sintases per a sintetitzar ATP, energia que és utilitzada per la bactèria en cas d'emergència quan hi ha una baixa disponibilitat d'oxigen en l'ambient. Gràcies al interès que despertà el descobriment d'un sistema fotosintètic tan senzill, la bR és una de les proteïnes transmembranals més conegudes i s'usa com a model per a l'estudi d'altres proteïnes de membrana com són els receptors acoblats a proteïna G. El treball presentat en aquesta tesi es troba centrat en la regió extracel·lular de la proteïna i s'ha agrupat en tres blocs diferents. En el primer, s'ha estudiat el rol funcional i estructural de diversos grups formadors de ponts d'hidrogen mitjançant les mutacions R7E/E9R, Y79F i S193A. L'estudi d'aquests mutants mostra que la tirosina 79, l'arginina 7 i el glutàmic 9 són grups importants per el manteniment estructural de la bR, ja que aquestes mutacions produeixen una acceleració en el temps de reacció de la hidroxilamina, indicant una menor compactació de les hèlices en aquests mutants. Aquestes alteracions de la bR produeixen alhora una disminució en l'estabilitat tèrmica de la proteïna. No obstant, aquestes mutacions no afecten de manera rellevant la funció de la bR, excepte pel fet de disminuir en una unitat de pH el pKa del complex alliberador del protó. La Tyr 79, el Glu 9 i l'Arg 7 es troben actuant com a nexe d'unió entre una xarxa d'aigües principal que connecta el retinal amb la zona extracel·lular de la proteïna, i una xarxa d'aigües local. Per una altra banda, la substitució de la serina 193 per una alanina dóna lloc a canvis estructurals de la proteïna i a un augment en el pKa del complex alliberador del protó, apart d'una important disminució en l'eficiència bombejadora de protons, demostrant que aquesta serina, mitjançant les seves interaccions amb el glutàmic 204, s'encarrega de mantenir la correcta funcionalitat i estructura del complex.En el segon bloc s'ha estudiat el paper funcional y estructural de les prolines 8, 77 i 200 que, disposades en forma de butxaca, es troben albergant quatre molècules d'aigua que formarien una xarxa d'aigües local. Encara que les prolines actuarien podrien interaccionar mitjançant un pont d'hidrogen amb aquestes molècules d'aigua, sembla ser que la distància entre els diferents grups seria massa important com per que dita interacció succeís. No obstant, la rigidesa de la cadena polipeptídica generada per les prolines, donaria lloc a que grups veïns a aquestes prolines poguessin interaccionar amb la xarxa d'aigües. La substitució d'aquestes prolines per glicines de forma individual i triple, i la substitució de la prolina 8 per un triptòfan, donen lloc a una sèrie d'alteracions importants en l'entorn del retinal, com és un increment en el pKa del principal contraió de la BS, l'Asp 85, o la disminució del pKa de la BS. Aquestes alteracions van acompanyades d'una menor compactació de les hèlices en realitzar les mutacions tal i com indiquen els experiments d'accessibilitat per la hidroxilamina. En el cas del mutant P200G el que s'ha observat ha estat una més gran compactació de la proteïna comparant amb la bR silvestre, indicant que al substituir la prolina per una glicina s'està donant una més gran rigidesa en les hèlices durant el fotocicle. Les mutacions P8W, P77G i P200G, a més a més presenten una important disminució en la capacitat bombejadora de protons. Tots aquests efectes es produirien per una alteració en les interaccions entre els grups veïns a les prolines i les molècules d'aigua de la xarxa local i altres grups de la proteïna. En el tercer i darrer bloc presentat, s'han aportat dades vers la relació a llarga distància entre l'aspàrtic 96 i el glutàmic 194. L'Asp 96 es troba localitzat en la regió citoplasmàtica de la bR, i és el grup encarregat de reprotonar la BS un cop aquesta s'ha desprotonat. Quan aquest aspàrtic és substituït per una asparragina, el protó que ha de reprotonar la BS prové directament del citoplasma, fet que fa més lenta la seva reprotonació. El Glu 194 per altra banda es troba localitzat en la regió extracel·lular i forma part del complex alliberador del protó. Quan s'afegeix la mutació E194Q al mutant D96N s'observa una important acceleració en la reprotonació de la BS tal i om ho indiquen els experiments de fotòlisi de llampec i espectroscòpia d'infraroig. Aquests resultats indicarien que l'anul·lació de la càrrega negativa del glutàmic 194 situat a la regió extracel·lular, estaria afectant l'entrada de protons des del costat citoplasmàtic indicant doncs, una interacció a llarga distància. El doble mutant a més presenta una important alteració del mecanisme de bombeig de protons, no solament perquè l'expulsió i recaptació del protó es realitza simultàniament en la proteïna, sinó perquè també l'eficiència del bombeig en aquest mutant és d'un 35 % comparat amb la bR silvestre.En aquest treball a més s'ha demostrat que com que l'aparició de l'intermediari M depèn de l'estat de protonació del Glu 194, el pKa d'aparició d'aquest intermediari és en realitat el pKa del complex alliberador del protó en l'estat basal de la proteïna. Per altre costat, els resultats de pKa alcalí obtingut per als diferents mutants estudiats en aquesta tesi, mostren que la desprotonació de la BS no és suficient per produir la desnaturalització de la proteïna degut a pH alcalí, sinó que a més seria necessària la desprotonació d'altres grups a pH bàsics com podrien ser diverses tirosines. / The Bacteriorhodopsin (bR) is a seven a-helices transmembrane protein from the arqueobacterium Halobacterium salinarum. The bR has a molecule of retinal covalently bound through a protonated Schiff Base (BS); this chromophore, after light activation, is the responsible of the pumping of protons from inside to outside of the cell by bR. This pumping activity is performed through the photocycle, a series of conformational and biochemical states of the protein called intermediates, which results in the proton pumping. Thus, an electrochemical gradient is generated, and these protons are used by ATPsynthases to synthesise ATP, energy used by the bacterium in case of emergency when very low oxygen availability exists in the ambient. Thanks to the interest of the discovery of a so simple photosynthetic system, the bR is one of the best known transmembrane proteins and it is used as a model of study for other transmembrane proteins like G-protein coupled receptors. The work presented in this thesis has been focused in the extracellular region of the protein and it has been divided in three different blocks. First of all we have studied the functional and structural role of several hydrogen-bonding residues through the construction of the mutants R7E/E9R, Y79F and S193A. The study of these mutants has demonstrated that tyrosine 79, arginine 7 and glutamic 9 are important groups for the structural maintenance of the bR, observing an altered time of reaction of the hydroxylamine, thus, indicating a reduced compactness of the helices in these mutants. These alterations of the bR produce, in addition, a diminished thermal stability of the protein. However, these mutations do not affect eminently the function of the bR, except by the decrease of one unit pH of the pKa of the proton release group. Tyr 79, Glu 9 and Arg 7 act as a binding nexus between the principal water network that connects the SB with the extracellular region, and a local water network. On the other hand, the substitution of the serine 193 by alanine produces structural changes of the protein and an increase in the pKa of the proton release group, in addition to an important decrease in the proton pumping efficiency, demonstrating that this serine, through its interactions with the glutamic 204, maintains the correct functionality and structure of the group. In the second block we have studied the functional and structural role of the prolines 8, 77 and 200 that seems to act as a pocket where several water molecules are located forming a local water network. Although the prolines can interact by hydrogen-bonding with these water molecules, it seems that the distance among the different groups is too high to allow the formation of this interaction. However, the rigidity produced by the polypeptidic chain of these, could allow the interaction of surrounding groups with this waters molecules. The individual and multiple substitution of these prolines by glicines, and the substitution of the proline 8 by a tryptophan produce several important alterations in the contour of the retinal, such as the increased pKa of the principal contra-ion of the SB, the Asp 85, and the diminished pKa of the SB. Moreover these mutants present lower helices compactness as is shown by hydroxylamine experiments. However, in the case of the mutant P200G we observe increased helices compactness compared to the wild type bR, indicating that the substitution of this proline is producing a more important rigidity of the helices during the photocycle. Besides, the mutations P8W, P77G and P200G present an important diminished proton pumping efficiency. All these effects would be produced by the alteration of the interactions among the surrounding groups of the prolines and the water molecules of the local network and other groups of the protein.In the last block presented in this thesis, we have provided more data about the long-range interactions between the aspartic 96 and the glutamic 194. The Asp 96 is located in the cytoplasm region of the bR and is the group that reprotonates the SB during the N intermediate. When this aspartic is mutated by an asparagine, the proton that reprotonates the SB comes directly from the cytoplasm, this fact produces a delay in its reprotonation. On the other side, he Glu 194, is located in the extracellular region and it is involved in the proton release group. When the mutation E194Q is added to the mutant D96N we observe an important speed up of the reprotonation of the SB as is shown by flash photolysis and infrared spectroscopy experiments. These results would indicate that the abolition of the negative charge of the Glu 194, located in the extracellular region, would be affecting the entrance of protons in the cytoplasmatic region, indicating a long-range interaction. Moreover, the double mutant shows an important alteration in the proton pumping mechanism as is seen not only by a release and capture of the proton done simultaneously in this mutant, but also by a decrease of the proton pumping efficiency of about a 35 % compared to the bR wild type. Besides, in this thesis we have demonstrated that as the formation of the M intermediate depends on the protonated state of the Glu 194, the pKa of the formation of this intermediate is truly the pKa of the proton release group in the ground state of the protein. On the other hand, the experiments of basic pH for the different mutants have shown that the deprotonation of the SB is not sufficient to produce the denaturation of the protein. It seems that the deprotonation of other groups at high pH, like tyrosines, is necessary to produce this denaturation.
|
540 |
Análisis de la estructura del transportador ADP/ATP por espectroscopia de infrarrojo utilizando métodos matemáticos de estrechamiento y ajuste de bandasLórenz Fonfría, Víctor A. 21 July 2003 (has links)
No description available.
|
Page generated in 0.1889 seconds