En el trabajo aquí presentado se investigó la participación de los niveles intracelulares de GMP-cíclico (CMPC) en la regulación de diferentes aspectos de la neuroinflamación. En el primer capítulo hemos observado que los cultivos de astrocitos y de celulas microgliales aisladas de rata expresan la maquinaria necesaria para sintetizar GMPc en repuesta a Péptidos Natriuréticos (PN) y también los enzimas necesarios para degradar el nucleótido. También se investigaron los efectos de la estimulación por PN en la expresión de la proteína pro-inflamatoria iNOS. Hemos observado que el pretratamiento con ANP hace disminuir los niveles de la proteína iNOS inducida por el agente pro-inflamatorio LPS a través de un mecanismo dependiente de NPR-A-PKG en células microgliales cultivadas de rata. Además hemos observado que esta regulación a la baja parece estar hecha a nivel de traducción, sin afectar a la transcripción o la tasa de degradación de la proteína. Sobre la base de datos obtenidos en nuestro laboratorio en cultivos de células gliales, se ha demostrado que las vías mediadas por GMPc regulan la dinámica del citoesqueleto, la expresión de GFAP en los astrocitos y la motilidad, así como la expresión de genes inflamatorios en la microglía que se demuestra en el primer capítulo, lo que sugiere un papel en la regulación del fenotipo reactivo glial. En el segundo capítulo, hemos querido verificar si el GMPc regula la respuesta inflamatoria glial in vivo después de un daño producido en el SNC causado por una criolesión focal en la corteza cerebral en ratas y ratones. Se investigó el efecto de 3 dosis de tratamiento con dos inhibidores de diferentes fosfodiesterasas de GMPc (PDE), zaprinast y sildenafilo. Hemos observado que el inhibidor no selectivo de PDE-GMPc zaprinast potencia la astrogliosis alrededor de la lesión, mientras que produce una disminución de la activación de macrófagos/microglía, el estrés oxidativo y muerte neuronal en la rata. Se observó también que el tratamiento con el inhibidor selectivo de la PDE5 sildenafilo reproduce en los ratones los cambios en la reactividad glial y los efectos antioxidantes y antiapoptóticos observados anteriormente con el zaprinast en ratas, indicando que la inhibición de la PDE5 es responsable de estas acciones neuroprotectoras. Sin embargo, los efectos de sildenafilo no se observaron en los ratones deficientes en MT-I/II. Asimismo, se muestra que el sildenafilo aumenta significativamente los niveles de las proteínas MT-I/II en homogenados corticales de ratones lesionados así como la inmunotinción de MT-I/II en las células gliales alrededor de la lesión, y disminuye la activación del factor transcriptor de STAT3, apoyando la participación de estas proteínas en los efectos neuroprotectores del sildenafilo en la lesión cerebral focal. Como resultado de los efectos antiinflamatorios y neuroprotectores observados por los inhibidores de la PDE5 en el modelo criolesión, en el tercer capítulo se investigó si el tratamiento con sildenafilo podría tener efectos beneficiosos en un modelo de EAE inducido por MOG35-55, un modelo animal de esclerosis múltiple, una enfermedad en la que existe una respuesta inflamatoria alterada. Se demuestra que el tratamiento con sildenafilo después del inicio de la enfermedad reduce notablemente los síntomas clínicos de la EAE mediante la prevención de la pérdida axonal y la promoción de la remielinización. Por otra parte, el sildenafilo disminuye la infiltración de leucocitos CD3+ así como la activación de microglia/macrófagos en la médula espinal, al tiempo que aumenta la presencia de Foxp3-Tregs. Además, el tratamiento con sildenafilo disminuye la expresión de ICAM-1 en las células infiltradas de la médula espinal. La presencia de astrocitos reactivos que forman estructuras similares a cicatrices alrededor de los infiltrados se potenció por el tratamiento con sildenafilo, sugiriendo un posible mecanismo para restringir la propagación de leucocitos en el parénquima sano. Se demuestra también que el tratamiento con sildenafilo al inicio de los síntomas clínicos, cuando el proceso inflamatorio es más fuerte, impide el avance de la enfermedad y regula la respuesta adaptativa inmune periférica y los niveles de la PDE5. Teniendo en cuenta todos los resultados obtenidos se demuestra que la modulación de los niveles intracelulares de GMPc tiene efectos beneficiosos en los procesos neuroinflamatorios y que estos beneficios están relacionados con la regulación de la gliosis reactiva, el estrés oxidativo, factores antioxidantes, la respuesta inmune adaptativa y la infiltración de células inmunes en el SNC que conducen a una disminuición en el daño neuronal. / In the present work we investigated the involvement of intracellular cGMP levels in regulating different aspects of neuroinflammation. In the first chapter we observed that cultured rat astrocytes and microglial cells express the necessary machinery to synthesize cGMP in response NPs and to degrade the nucleotide. We also investigated the effects of NP stimulation in the expression of the pro-inflammatory protein iNOS. We observed that pretreatment with ANP down-regulates iNOS protein levels induced by the pro-inflammatory agent LPS by an NPR-A-PKG dependent mechanism in rat cultured microglial cells. In addition we found that this down-regulation seems to be done at translational level, without affecting transcription or protein degradation rate. Based on evidence obtained in our laboratory in cultured glial cells indicates that cGMP-mediated pathways regulate cytoskeleton dynamics, GFAP expression and motility in astrocytes, as well as inflammatory gene expression in microglia found in the first chapter, suggesting a role in the regulation of the glial reactive phenotype. In the second chapter we wanted to examine if cGMP regulates the glial inflammatory response in vivo following CNS damage caused by a focal cryolesion onto the cortex in rats and mice. We investigated the effect of 3 doses of treatment with two different cGMP-phosphodiesterase (PDE) inhibitors, zaprinast and sildenafil. We observed that the non-selective GMP-PDE inhibitor zaprinast enhances astrogliosis around the lesion while decreasing macrophage/microglial activation, oxidative stress and neuronal death in rat. We observed also that treatment with the selective PDE5 inhibitor sildenafil reproduces in mice the changes in glial reactivity and the antioxidant and antiapoptotic effects previously observed with zaprinast in rats indicating that inhibition of PDE5 is responsible for these neuroprotective actions. However, sildenafil effects were not observed in mice deficient in MT-I/II. We further show that sildenafil significantly increases MT-I/II protein levels in lesioned cortical homogenates and MT-I/II immunostaining in glial cells around the lesion, and decreases activation of the transcriptor factor STAT3, supporting the involvement of these proteins in the neuroprotective effects of sildenafil in focal brain lesion. As a result of the anti- inflammatory and neuroprotective effects observed by PDE5 inhibitors in the cryolesion model, in the third chapter we investigate if treatment with sildenafil could have beneficial effects in a MOG35-55-induced EAE model, an animal model of MS, a disease where an altered inflammatory response occurs. We show that treatment with sildenafil after disease onset markedly reduces the clinical signs of EAE by preventing axonal loss and promoting remyelination. Furthermore, sildenafil decreases CD3+-leukocyte infiltration and microglial/macrophage activation in the spinal cord, while increasing Foxp3-Tregs. In addition, sildenafil treatment decreased ICAM-1 in spinal cord infiltrated cells. The presence of reactive astrocytes forming scar-like structures around infiltrates was enhanced by sildenafil suggesting a possible mechanism for restriction of leukocyte spread into healthy parenchyma. We show also that treatment with sildenafil at the onset of clinical symptoms, when the inflammatory process is stronger, prevent disease advance and regulates peripheral adaptative immune response and PDE5 levels. Taking in account all the results obtained we evidenced that modulation of intracellular cGMP levels have beneficial effects in neuroinflammatory processes and that this benefits are related to regulation of reactive gliosis, oxidative stress, antioxidant factors, adaptative immune response and infiltration of immune cells into CNS leading to decrease neuronal damage.

Un dels efectes del desenvolupament industrial i més concretament de la sofisticació de la indústria química ha estat l’aparició de contaminants capaços de produir els seus efectes tòxics mitjançant la seva interacció amb dianes moleculars molt específiques, com són els receptors nuclears. Aquest mecanisme de toxicitat fa que alguns contaminants tinguin efectes metabòlics rellevants a concentracions molt baixes, de l’orde de micrograms o fins i tot nanograms per litre. Són els anomenats microcontaminants, i el seu control representa un doble repte. Per un lloc, requereixen el desenvolupament de tècniques analítiques d’alta sensibilitat i precisió, capaces de detectar concentracions de ppbs o ppts de molècules orgàniques. Aquesta tesi ha desenvolupat alguns d’aquests assaigs per detectar efectes de microcontaminants sobre sistemes propis de vertebrats i que constitueixen una amenaça latent tant pels ecosistemes com per les poblacions humanes. Per tal efecte s’han utilitzat biomarcadors gènics en diversos animals sentinelles, tant procedents de llocs sospitosos de patir contaminació com en animals estabulats, el que ha permès l’avaluació mediambiental de determinats ecosistemes i el disseny de nous biomarcadors per a la detecció de microcontaminants, com és el cas dels disruptors tiroïdals. Més concretament, s’ha establert un bioassaig no letal basat en l’anàlisi d' escames de peix zebra per a la monitorització de l’activitat dioxina en aigües superficials, s’han realitzat estudis dels efectes de diversos fàrmacs sobre el correcte desenvolupament del sistema tiroïdal a Danio rerio, s'ha estudiat el Transcriptoma durant el desenvolupament embrionari de Danio rerio i els efectes de diversos disruptors tiroïdals sobre el sistema visual i hematopoètic de Danio rerio. / New regulations on water quality require a close control of the possible biological activities known or unexpected pollutants may bring about. It is known that many pollutants could interact directy with some regularory molecules like te nuclear receptors. We present here various protocols based on the direct exposure of the sentinell animal to various polluted river water and the analysis of expression of specific genes to determine the presence of compounds with differnt activities. More precisely this work develops a method that does not require the killing of sentinells animals and allows detection of the biological activity after a single day of exposure to the river water. When tested, the method with real samples from the Llobregat River, clear temporal and spatial variations were observed, demonstrating its suitability for monitoring natural variations in water quality linked to specific discharges. High biological activities were unrelated to the currently checked water quality parameters (macropollutants, turbidity, TOC, etc.), but they did correlate with the presence of micropollutants (estrogens, detergents, etc.) related to domestic and/or industrial runoffs. In addition, we present here a transcriptome analysis of thyroid hormone-regulated genes in zebrafish during the eleutheroembryonic stage (days 2-5 post fertilization) to detect potential markers of thyroid disruption. Exposure to 3,5,3'-triiodo-l-thyroxine (T3, 50 nM) induced changes in a minor portion (less than 2%) of the zebrafish transcriptome, with a significant fraction of genes involved in the haematopoietic system, eye formation, and ossification/skeletal system, including the thyroid receptor thra gene. Some of the transcriptomic changes were reflected macroscopically, as an allometric decrease of eye size and an increase on thra hybridization signal in the skeletal tissue. Using this information, changes on transcription of three genes (adult alpha globin gene si:ch211-5 k11.6, embryonic globin gene hbae3, and long wavelength cone opsin gene opn1/w1) were analyzed to monitor the effect of the suspected thyroid disrupter bisphenol A (BPA) on the thyroid system during this period of development of zebrafish.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica (IRB) / Es va generar un ratolí transgènic amb la capacitat d'activar JNK específicament al pàncrees. Tot i que aquests ratolins no tenen cap afectació morfoestructural en els seus illots pancreàtics ni diferències en el contingut total d'insulina però presenten intolerància a la glucosa i no secreten insulina en resposta a hiperglucèmia. A nivell molecular, les cèl•lules β pancreàtiques amb JNK activa, tenen un bloqueig a la via de senyalització d'insulina que fa que es redueixi la secreció d'insulina i l'expressió de gens diana de la insulina. El tractament amb rossiglitazona, un fàrmac del grup de les TZDs, aconsegueix revertir el fenotip in vivo. Tots aquests resultats indiquen que l'activació de JNK és suficient per promoure la resistència a insulina central però no n'hi ha prou per induir hiperplàsia dels illots o induir l'apoptosi de les cèl•lules β. A més a més, aquests ratolins estan protegits de la hiperinsulinèmia, la hiperglucèmia i l'obesitat induïdes per la dieta grassa o l'envelliment. També s'ha estudiat la interacció entre les vies de senyalització de JNK i NF-κB. Fins ara, s'ha va publicat que JNK pot induir l'activació de NF-κB mitjançant l'estabilització del mRNA de la βTrCP, responsable de la degradació d'IκBα. JNK va resultar fosforilar a CRD-BP, una proteïna que s'uneix al mRNA de βTrCP per protegir-li de l'atac per part del miR-183. A més, un mutant de βTrCP perquè no s'hi unís el miRNA, es seguia estabilitzant en resposta a l'activació de JNK a nivel de proteïna però no de mRNA. A part d'aquest efecte, JNK també aconsegueix estabilitzar SKP1 però la interacció SKP1-βTrCP és necessària per a una màxima estabilització. A més a més, aquest efecte podria ser extensiu a altres dianes de βTrCP com β-catenina i també estan afectades els nivells d'altres F-Box com la SKP2, i el dels seus substrats. / As a part of the research-line that deals with physiological and pharmacological (anti-inflammatory and/or anti-diabetic) actions conducted by some nuclear receptor (NR) ligands through negative interference with the c-Jun N-terminal kinase (JNK) signaling pathway, this project is focused on studying the effects of the activation of JNK in a mouse model and evaluating the capacity of those ligands to recover the homeostasis. In parallel, there is a second project about the characterization of the crosstalk between the JNK pathway and NF-κB, another major pathway in inflammation. The relevance of the activation of JNK in a wide range of pathologies with an inflammatory component, lead the group to the generation of a transgenic mouse carrying a a constitutively active form of the MAP2K of JNK, MKK7, with a conditional expression upon the regulation of the Cre recombinase. Despite these mice have no morphostructural affectation of the pancreatic islets or differences in the total insulin content, they have defective glucose homeostasis showing glucose intolerance and decreased insulin secretion in response to hyperglycemia. This reduction in glucoseinduced insulin release is β cell autonomous, as it is reproduced in isolated islets, and JNK activity dependent, as it is reverted by the specific inhibitor of JNK, TAT-JIPi. At molecular level, β-cells with activated JNK have a blockage in the insulin-signaling pathway that reduces the secretion of insulin and the expression of insulin target genes. The treatment with rosiglitazone, an insulin-sensitizing drug of the thiazolidinedione family that inhibits JNK activation, restored insulin secretion in response to glucose in isolated islets and in vivo. All these data indicate that the activation of JNK is sufficient to promote central insulin resistance but is not sufficient to induce islet hyperplasia or β-cell death. Moreover, these mice are protected from basal plasma hiperinsulinemia caused by aging or high fat diet challenge. Regarding the second project, the interaction between NF-κB.and JNK pathways, both signaling pathways are essential for the regulation of the immune and inflammatory response as well as other fundamental processes such as cell proliferation and survival. It was published that JNK was activating NF-κB. pathway by inducing the mRNA stabilization of the E3 ubiquitin ligase βTrcP. We have further reported that JNK is targeting the miRNA183/CRD-BP system to stabilize βTrCP mRNA. At a protein level we have shown that SPK1-βTrCP complex formation is required for JNKdependent SKP1 and βTrCP protein stabilization. Not only this but the βTrCP substrate β‐catenin is down regulated by the JNK-dependent increase of βTrCP and the protein levels of SKP2 and its substrate p27 are oppositely regulated by JNK

X-ray crystallography is, now at days, one of the most powerful techniques to study proteins at the atomic level. Unfortunately, obtaining high quality crystals of membrane proteins for x-ray diffraction is a difficult task due to the hydrophobic nature of these proteins. The low stability in solution of these proteins and their tendency to form aggregates are the biggest problems during crystallization studies. One of the most common strategies to overcome these problems consists on working with functional mutants of these proteins. It has been reported that single point mutations of key residues (normally within transmembrane segments) leads to a remarkable increase in the stability of some membrane proteins after detergent solubilization and extraction from the membrane. In addition, a single mutation can stabilize a specific conformer of the protein, decreasing its heterogeneity in solution. Despite this, predicting what mutations are going to improve the stabilization of a protein is virtually impossible. The main purpose of this thesis is to build up a medium-high throughput experimental protocol with the objective to generate and characterize random mutants of a membrane protein with more stability in detergent-solubilized solution and, therefore with a better probability to crystallize. The combination of random mutagenesis with rapid and sensitive screening protocols of protein expression and stability seems to be the best approach for this goal. The use of the green fluorescent protein (GFP) as reporter has enormously facilitated the studies of expression, purification and stability of a membrane protein. Also, with the aim of minimizing undesired effects of full-length GFP, we optimized an assay based on a split GFP to build and characterized the random mutants library. Specifically we focus on SteT, a Bacillus subtillis transporter that exchanges L-threonine by L-serine. SteT is an excellent prokaryotic model (30% of amino acid identity) of the mammalian L-amino acid transporter (LAT) family. Genetic mutations of some LATs are the direct cause of two types of aminoaciduries. Moreover, a member of this family, LAT1, is overexpressed in tumor cells, although the physiological role of this is still unknown. Unfortunately, SteT wild type solubility and stability in detergent solutions is very low and completely incompatible with crystallization tests. Our results suggest that random mutagenesis combined with the GFP split assay, appears to be an excellent strategy to build robustness in membrane proteins for structural studies. So far, using this strategy we found a mutant of SteT that currently is undergoing for crystallization screenings to study the structure and mechanism of mammalian LATs. / La cristalografía de rayos X es, hoy en día, una de las técnicas más potentes para el estudio de las proteínas a nivel atómico. Desafortunadamente, la obtención de cristales de alta calidad de proteínas de membrana para la difracción de rayos X es un desafío debido a la naturaleza hidrofóbica de estas proteínas. La baja estabilidad en solución de estas proteínas y su tendencia a formar agregados son los mayores problemas durante los estudios de cristalización. Una de las estrategias más comunes para superar estos obstáculos consiste en trabajar con mutantes funcionales de estas proteínas. Se han publicado estudios sobre mutaciones en residuos clave en proteínas de membrana (normalmente dentro de los segmentos transmembrana) que conducen a un notable incremento de la estabilidad en solución, previa extracción de la membrana y solubilización en detergente. Además, una sola mutación puede estabilizar un confórmero específico de una proteína, disminuyendo su heterogeneidad en solución. A pesar de esto, predecir qué mutaciones van a mejorar la estabilidad de una proteína es prácticamente imposible. El principal objetivo de esta tesis es la construcción de un protocolo de alto rendimiento experimental con el objetivo de generar y caracterizar mutantes aleatorios de una proteína de membrana que presenten una estabilidad adecuada después de solubilizar la proteína en detergente y, por lo tanto, con mejores garantías de cristalizar. Para conseguir estos objetivos hemos combinado técnicas de mutaciones aleatorias con métodos de cribaje rápidos y sensibles. En este sentido, el uso de la proteína fluorescente verde (GFP) ha facilitado enormemente los estudios de expresión y purificación de proteínas de membrana. Con el objetivo de minimizar los efectos no deseados de la GFP, se creó y optimizó un ensayo basado en la complementación de la GFP (GFP split system) con un fin doble: seleccionar y caracterizar los componentes de la librería de mutantes aleatorios. Este protocolo se ha puesto a punto con SteT, un intercambiador de L-serina por L-treonina de Bacillus subtilis. SteT es un excelente modelo procariota (30% de identidad de aminoácidos) de la familia de transportadores de mamíferos de amino ácidos L (LAT). Mutaciones congénitas de algunos LATs son la causa directa de dos tipos de aminoacidurias. Además, un miembro de esta familia, LAT1, se sobreexpresa en células tumorales, aunque el papel fisiológico es aún desconocido. Desafortunadamente, SteT tiene una muy baja solubilidad junto a un gran inestabilidad en detergente, propiedades totalmente incompatibles con estudios de cristalización. Nuestros resultados indican que la mutagénesis aleatoria combinada con el ensayo basado en el “GFP split system”, es una estrategia excelente para aumentar la estabilidad de proteínas de membrana en estudios estructurales. Utilizando esta metodología hemos encontrado un mutante de SteT que actualmente está siendo cristalizado. Estos estudios serán clave para conocer mejor la estructura y el mecanismo de la familia de transportadores de mamífero LAT.

En el primer trabajo de esta tesis se dilucida el camino de plegamiento oxidativo del LCI. El LCI reducido y desnaturalizado se repliega a través de un flujo secuencial y rápido de intermediarios de uno y dos puentes disulfuro, y llega a una etapa limitante en la cual la mezcla de tres especies mayoritarias que contienen 3 puentes disulfuro y una población heterogénea de isómeros de cuatro puentes disulfuro no nativos (scrambled) coexisten. Los intermediarios de tres puentes disulfuro se han identificado como trampas cinéticas que se hallan a lo largo del camino de plegamiento del LCI, y se han caracterizado sus estructuras: dos de ellos contienen sólo puentes disulfuro nativos. El camino de plegamiento del LCI comprende propiedades exhibidas tanto por el BPTI como por la hirudina, dos modelos divergentes con características de plegamiento opuestas. Los resultados obtenidos en el estudio de las vías de plegamiento del LCI confirman el enorme espectro de diversidad de los caminos de plegamiento de las proteínas.En el segundo trabajo de esta tesis se dilucidan las curvas de desplegamiento y desnaturalización del LCI. En presencia de un agente iniciador de la formación de tioles y un agente desnaturalizante se despliega el LCI nativo por el intercambio de sus puentes disulfuro, y la molécula se transforma en una mezcla de especies scrambled. Podemos distinguir claramente y aislar, entre los 104 posibles isómeros scrambled del LCI, a nueve de ellos que representan el 90% del total del LCI desplegado. La concentración de tiocianato de guanidinio e hidrocloruro de guanidinio requeridas para alcanzar el 50% de la desnaturalización son de 2,4 y 3,6 M, respectivamente. El LCI nativo es resistente a la desnaturalización por urea, incluso a concentraciones elevadas (8M). El camino de desplegamiento del LCI se ha podido definir en base a la evolución de la concentración relativa de los isómeros scrambled de la molécula a lo largo de su desnaturalización.Existen dos poblaciones de especies scrambled que sufren variaciones a lo largo del camino de desplegamiento. Una población se acumula como intermediarios bajo condiciones desnaturalizantes fuertes (incluye al isómero denominado beads-form). La otra población muestra una correlación inversa entre su abundancia relativa y las condiciones desnaturalizantes y debería poseer otro tipo de estructuras no nativas. Los resultados que se presentan en el segundo trabajo muestran que el LCI, una molécula con potenciales aplicaciones biotecnológicas, tiene cinéticas bajas de desplegamiento y es altamente estable.En el tercer trabajo de esta tesis se estudia el efecto del LCI en la fibrinólisis in vitro. Se ha descrito, tanto por estudios in vitro como in vivo, que el PCI (potato carboxypeptidase inhibitor) incrementa la tasa de lisis de los coágulos de fibrina. Con este mismo propósito, hemos evaluado y comparado la capacidad profibrinolítica del LCI con la del PCI. Todos los resultados han sido obtenidos en ensayos con plasma humano, en un sistema in vitro.Hemos demostrado que ambos inhibidores, el LCI y el PCI, aceleran de forma substancial la lisis de los coágulos tratados con t-PA, esta aceleración es dependiente de la concentración de inhibidor. El LCI se ha mostrado unas 10 veces más potente que el PCI como acelerador de la fibrinólisis, y también muestra una mayor capacidad inhibidora de TAFI al realizar ensayos de actividad enzimática en plasma.Se ha estudiado el posible efecto de estos dos inhibidores sobre la estructura del coágulo de fibrina mediante microscopía electrónica de transmisión y de barrido. Se ha observado un incremento significativo en el grosor de las fibras y una disminución simultánea en la densidad de su entrecruzamiento: el LCI puede tener una aplicación en las terapias trombolíticas basadas en t-PA. / The pathway of oxidative folding of LCI has been elucidated in the present work, using structural and kinetic analysis of the folding intermediates trapped by acid quenching. Reduced and denatured LCI refolds through a rapid, sequential flow of 1- and 2-disulfide intermediates and reaches a rate limiting step in which a mixture of three major 3-disulfide species and a heterogeneous population of non-native 4-disulfide (scrambled) isomers co-exist. The three 3-disulfide intermediates have been identified as major kinetic traps along the folding pathway of LCI, and their disulfide structures have been elucidated in this work. Two of them contain only native disulfide pairings, and one contains one native and two non-native disulfide bonds. The folding pathway of LCI features properties exhibited by both bovine pancreatic trypsin inhibitor and hirudin, two diverse models with extreme folding characteristics. The results further demonstrate the large diversity of disulfide folding pathways. The unfolding and denaturation curves of leech carboxypeptidase inhibitor (LCI) were elucidated using the technique of disulfide scrambling. In the presence of thiol initiator and denaturant, the native LCI denatures by shuffling its native disulfide bonds and transforms into a mixture of scrambled species. Nine out of 104 possible scrambled isomers of LCI, amounting to 90% of total denatured LCI, can be distinguished. The denaturation curve, shows that the concentration of guanidine thiocyanate and guanidine hydrochloride required to reach 50% of denaturation is 2.4M and 3.6M, respectively. Native LCI is resistant to urea denaturation, even at high concentration (8M). The LCI unfolding pathway was defined based on the evolution of the relative concentration of scrambled isoforms of LCI upon denaturation. Two populations of scrambled species suffer variations along the unfolding pathway. One accumulates as intermediates under strong denaturating conditions, and corresponds to open or relaxed structures, one of which turned out to be the bead-form isomer. The other population shows an inverse correlation between their relative abundances and the denaturing conditions, and should have another kind of non-native structure, more compact than the unfolded state. The rate constants of unfolding of LCI are low when compared to other disulfide containing proteins. The results presented in this study show unequivocally the high stability and low kinetics of unfolding of the LCI fold, that guarantee the appropriate industrial and therapeutical handling of the molecule.The potato carboxypeptidase inhibitor (PCI) has recently been reported to enhance the rate of fibrin clot lysis induced by tissue plasminogen activator (t-PA). Here, we have studied the fibrinolytic activity of LCI (leech carboxypeptidase inhibitor), and compared its effectiveness with that of PCI in vitro. Both LCI and PCI markedly accelerate the t-PA-induced lysis of human plasma clots in a concentration-dependent manner. Besides being approximately 10-fold more potent in accelerating fibrinolysis, LCI also showed a greater TAFIa inhibitory activity than PCI in enzymatic assays. The effects of both TAFIa inhibitors on the fibrin clot structure were compared by scanning and transmission electron microscopy. A significant increase in fiber thickness and a simultaneous decrease in the density of fiber entanglement were observed when clotting of human plasma was induced in the presence of either LCI or PCI. These alterations of clot structure correlated with the increased lysis rate determined in turbidimetric assays. In inhibitor-treated samples, formation of large pores within the fibrin gel occurs earlier than in controls, supporting the role of LCI as enhancer of clot lysis. These results suggest that LCI may be useful to improve the t-PA based therapy of thrombosis.

El càncer de pròstata és el tumor maligne no cutani més freqüent i una de les principals causes de mort per càncer en la població masculina. Tot i així, són menys els estudis moleculars realitzats sobre aquest tipus de càncer que en altres càncers (www.ncbi.nih.gov). L’objectiu de la tesi ha estat estudiar quins mecanismes moleculars estan implicats en la iniciació i progressió del càncer de pròstata. En el primer treball es va analitzar la freqüència de mutacions del gen FGFR3 ja que havien estat descrites mutacions d’aquest gen en altres tumors humans, però no en càncer de pròstata. També vam investigar la relació de mutacions de FGFR3 en pacients amb tumor de pròstata i altres tipus de tumors. Els nostres resultats indiquen que la freqüència de mutacions de FGFR3 en càncer de pròstata és baixa, per tant, no sembla ser un gen central en la patogènia del càncer de pròstata, tot i que està significativament associat a un grup de tumors de baix grau, i a pacients amb altres tumors concurrents, principalment bufeta i pell. En el segon treball es va analitzar, per primer cop en càncer de pròstata, les mutacions d’EGFR i PTEN conjuntament en un mateix grup de tumors. També es va analitzar l’expressió proteica i l’amplificació gènica d’EGFR. Vam trobar mutacions d’EGFR i PTEN en un nombre baix de tumors. Una tercera part dels adenocarcinomes prostàtics presentaven algun tipus d’alteració a la via de senyalització d’EGFR-PTEN, principalment en els càncers més avançats, sent la sobreexpressió proteica d’EGFR l’abnormalitat més freqüent. En un tercer article, enviat a la revista Human Pathology, s’ha analitzat la presència del gen de fusió TMPRSS2-ERG en els adenocarcinomes prostàtics, i la seva relació amb l’expressió de la proteïna d’ERG. Algun estudi havia descrit una associació entre el gen CXCR4 i l’expressió d’ERG, relacionada amb la fusió TMPRSS2-ERG. Nosaltres vam trobar que l’expressió d’ARNm de CXCR4 està associada amb tumors de pròstata amb elevat grau de Gleason, però és independent del reordenament TMPRSS2-ERG. / Prostate cancer is the most common non skin cancer in men and the second cause of cancer-related death in men of the Western World. Even so, the number of molecular studies in this type of cancer is lower than other types of cancer (www.ncbi.nih.gov). The aim of this work has been to study the molecular mechanisms that are involved in the initiation and progression of prostate cancer. In the first study, we have analyzed the frequency of FGFR3 mutations, as mutations of this gene have been reported in other human tumors, but not in prostate cancer. We have also investigated the relationship between FGFR3 mutations in patients with prostate cancer and other tumors. Our results show that the frequency of FGFR3 mutations in prostate cancer is low, so it does not seem to be central in the pathogenesis of prostate cancer, but it is statistically associated with a subpopulation of low grade tumors, and also with a subset of prostate carcinomas found incidentally in patients with concurrent bladder cancer or skin tumors. In the second study, we have analyzed, for the first time in prostate cancer, EGFR and PTEN mutations in the same subset of prostate tumors. We have also analyzed EGFR protein expression and amplification. We found EGFR or PTEN mutations in a low number of tumors. A third of prostate adenocarcinomas, mainly the most advanced tumors, showed some kind of alteration in the EGFR-PTEN signalling pathway, being EGFR protein overexpression the most frequent abnormality. In the third article, sent to Human Pathology, we have analyzed the presence of TMPRSS2-ERG fusion in prostate adenocarcinomas, and its relationship with ERG protein expression. Several studies have reported an association between CXCR4 gene and ERG expression, related to the TMPRSS2-ERG fusion. We have found an association between mRNA CXCR4 and high grade prostate tumors, but not between CXCR4 expression and the TMPRSS2-ERG rearrangement.

L’activitat Pkh resulta essencial pel creixement vegetatiu del llevat Saccharomyces cerevisiae i es proporcionada principalment per Pkh1 i Pkh2. Es desconeixen però, en gran mesura, tant la totalitat de les seves funcions cel·lulars com els mecanismes de regulació. Amb l’objectiu d’estudiar les funcions de les proteïnes Pkh en llevat, els diferents grups d’investigació han utilitzat fins a dia d’avui una única aproximació consistent en l’eliminació del gen PKH2 i la substitució de PKH1 per una versió que codifica una proteïna l’activitat de la qual resulta suprimida a 37 ºC. L’ús d’aquesta estratègia implica un estrès tèrmic per les cèl·lules de llevat, les quals responen activant la via de la CWI, on es troba implicada la via Pkh-Pkc1-MAPK. És per aquesta raó que en aquest treball s’ha utilitzat una estratègia diferent, desenvolupada al laboratori, la qual consisteix en l’obtenció d’una soca mutant en la que se li han suprimit els gens PKH1 i PKH3 i en la que s’ha col·locat un promotor regulable per doxiciclina que controla l’expressió de PKH2. Gràcies a aquesta soca hem pogut verificar per primera vegada que les proteïnes Pkh són necessàries per la fosforilació de Slt2 en front a diversos estressos de paret cel·lular. A més, s’han estudiat els canvis a nivell transcripcional provocats per la manca de les proteïnes Pkh, revelant que es produeix una resposta característica d’una situació d’estrès oxidatiu. En efecte, les cèl·lules sense activitat Pkh acumulen més ROS i aquest fet va acompanyat d’un procés de mort cel·lular programada independent de la metacaspasa del llevat Mca1, segons els anàlisis de TUNEL que s’han realitzat. Els fenotips d’estrès oxidatiu i mort cel·lular es veuen disminuïts en part, per l’activació de la via MAPK de Slt2 mitjançant l’expressió d’una versió constitutivament activa de la MAPKK Bck1 . Quelcom que afegeix complexitat a la regulació d’aquesta família de cinases, és el fet que alguns esfingolípids de cadena llarga o esfingolípids complexos de llevat, podrien regular la via de senyalització de Pkh1. Es coneix que les proteïnes Pkh tenen, a diferència de PDK1, un domini C-terminal molt més extens, de funció desconeguda, sense el domini PH, essencial per la unió de PtdIns(3,4,5)P3 en mamífers (que no sintetitza el llevat). Amb l’objectiu d’estudiar-ne la funcionalitat, s’han generat soques haploides on l’única activitat Pkh ve proporcionada per un plasmidi que porta la versió sencera de Pkh1 o bé una versió sense el domini C-terminal. Gràcies a aquestes soques hem identificat l’esfingolípid sulfàtid, no descrit en llevats, capaç d’unir-se específicament als últims 100 aa del domini no catalític de Pkh1. Aquest fet ens ha portat a estudiar el lipidoma del llevat, el qual s’ha separat per la tècnica de HPTLC, que ens ha permès identificar una fracció polar del lipidoma que s’uneix a Pkh1. A més hem determinat que el domini C-terminal de Pkh1 és responsable de la sensibilitat als inhibidors de la síntesis dels esfingolípids, indicant així que els esfingolípids podrien tenir un paper en l’activació de les proteïnes Pkh. A partir d’un assaig cinasa fet amb liposomes que contenen sulfàtid, hem vist que la unió amb sulfàtid té una efecte negatiu sobre la capacitat de Pkh1 de fosforilar el substrat PKBΔPH, a diferència de l’assaig realitzat amb liposomes que contenen la fracció polar del lipidoma, que no en modifiquen l’activitat. / Pkh activity is essential for vegetative growth of yeast Saccharomyces cerevisiae and is mainly provided by Pkh1 and Pkh2. However, it is still largely unknown the set of cellular functions and the regulatory mechanisms of Pkh. With the aim of studying the functions of Pkh proteins in yeast, different research groups have used the approach consisting in the deletion of the gene PKH2 and replacement of PKH1 by a protein version whose activity is suppressed at 37 ºC. The use of this strategy involves a heat stress for yeast cells and, consequently, activation of the CWI pathway, where the Pkh-Pkc1-Slt2 MAPK pathway is involved. For this reason we have used a different strategy, developed in the laboratory, for this study, consisting in generate a mutant strain where PKH1 and PKH3 genes were deleted and PKH2 was placed under control of doxycycline-repressed promoter. The use of this strain allowed us to verify, for the first time, that Pkh proteins are required for the phosphorylation of Slt2 in response to several cell wall stresses. We have also studied the transcriptional changes caused by lack of Pkh proteins, revealing that there is a response similar to that induced by oxidative stress. Indeed, cells without Pkh activity accumulate ROS and this was accompanied by a process of programmed cell death that was independent of the yeast metacaspasa Mca1, according to performed TUNEL analysis. The phenotypes of oxidative stress and cell death were attenuated, at least in part, by the activation of the Slt2 MAPK by expression of a constitutively active version of MAPKK Bck1. An element that adds complexity to the regulation of this kinases family is that long-chain sphingolipids, or yeast complex sphingolipids, could regulate Pkh1 signaling pathway. It is known that Pkh proteins, unlike mammalian PDK1, have a larger C-terminal domain of unknown function that apparently lacks a PH domain, which is essential for the binding of PDK1 to PtdIns(3,4,5)P3 (a lipid that is not synthesized in yeast). In order to study the functions of this domain, we have generated haploid strains where the only Pkh activity is provided by a plasmid, which carries either the full Pkh1 or a version without its C-terminal domain. With these strains, we have identified a sphingolipid sulfatide, not described in yeast, able to specifically bind to the last 100 aa of the non- catalytic domain of Pkh1. This has led us to study the yeast lipidome, which was separated by HPTLC technique, allowing us to identify a polar fraction that binds to Pkh1. In addition, we determined that the C-terminal domain is responsible for sensitivity to inhibitors of sphingolipid synthesis pathway, indicating that sphingolipids may play a role in the activation of Pkh proteins. Pkh1 kinase assay with liposomes containing sulfatide indicated that binding of Pkh1 to the sulfatide has a negative effect on the Pkh1 activity when PKBΔPH was used as a substrate. In contrast, liposomes containing the polar lipidome fraction did not alter the Pkh1 activity.

Aquesta Tesi Doctoral es centra en l’estudi molecular de tres proteïnes relacionades amb malalties conformacionals humanes, o Amiloïdosis. Mitjançant tècniques espectroscòpiques, s’han descrit els mecanismes de plegament natiu i d’agregació en fulla-β ordenada, dues vies que es troben en competència a través de la presència de diferents estats intermediaris a l’espai conformacional. Els intermediaris d’agregació, precursors de les fibres amiloides, són considerats els principals causants de la citotoxicitat cel·lular en moltes de les malalties amiloidogèniques, per tant, el seu estudi és crucial per aprofundir en l’etiologia d’aquestes patologies humanes, moltes d’elles sense tractament curatiu. Per una banda, s’ha obtingut un fragment d’anticòs recombinant específic per a β-oligòmers del pèptid Aβ1-42 causant de l’Alzheimer, l’scFv-h3D6. El seu estudi ha estat el primer en descriure el mecanisme pel qual un scFv retira el pèptid Aβ1-42 de la via amiloide i evita la seva toxicitat neuronal, tal i com s’ha demostrat en assajos de viabilitat en cultius cel·lulars. A més, l’obtenció d’un model tridimensional de l’scFv-h3D6, per homologia de seqüències, ha permès fer un redisseny racional de la molècula per tal de millorar-ne la seva estabilitat, augmentar la seva producció, i disminuir la dosi efectiva ja demostrada en ratolins model d’Alzheimer. Per altra banda, s’ha treballat amb un domini variable (VL) d’immunoglobulina, extret d’una pacient amb Amiloïdosi de cadena lleugera, l’AL-12. Aquest domini amiloidogènic presenta 7 mutacions respecte la seva línia germinal κI O18/O8. L’obtenció de les propietats termodinàmiques de l’AL-12, així com de quatre mutants restauratius, ha servit per estudiar l’efecte de les mutacions somàtiques sobre l’estabilitat dels dominis VL. Així, la restauració de residus puntuals de l’AL-12 cap a la seqüència germinal, implica la desestabilització del domini i un augment de la tendència a l’agregació i, per tant, s’ha demostrat que una única mutació somàtica no seria la causa del potencial amiloidogènic de l’AL-12, sinó que seria la combinació de varis factors desestabilitzants del plegament natiu, donant lloc a canvis conformacionals susceptibles a l’agregació amiloide, i la seva deposició en diferents òrgans i teixits cel·lulars. I per últim, s’ha estudiat el domini PSD95-PDZ3, una molècula reguladora de la sinapsis neuronal, i relacionada amb malalties com l’Alzheimer o l’Autisme. El domini PDZ3 segueix una via d’agregació amiloide reversible, una particularitat rellevant de la qual se n’han determinat els canvis conformacionals que la promouen. A més, el disseny de 6 variants del PDZ3 han servit per determinar les regions implicades en l’estabilitat i plegament global del domini, així com el seu paper en la regulació al·lostèrica de l’activitat del domini. Aquest treball demostra la importància dels estats intermediaris a l’espai conformacional de les proteïnes, la seva relació amb les malalties conformacionals, i l’aplicabilitat del seu coneixement en el desenvolupament de teràpies efectives. / The thesis here presented is focused on the molecular study of three human proteins related to conformational diseases, or Amyloidoses. The mechanisms of native folding and aggregation in a cross-β sheet structure have been described using several spectroscopic techniques. These two pathways are competing by the presence of intermediate states of the reaction. An oligomeric intermediate is the precursor of the β-aggregates and is considered the main responsible of the cellular toxicity in many amyloid diseases. Therefore, is necessary to perform a deeper study of the oligomeric state to delve into the etiology of these human diseases. On one hand, the expression and extraction of a single-chain variable fragment (scFv-h3D6), a derivative of an antibody specific for Aβ-oligomers, was performed. Here is the first description of a conformational mechanism by which a scFv-h3D6 withdraws Aβ1–42 oligomers from the amyloid pathway and, consistently, it prevents Aβ-oligomer toxicity in the SH-SY5Y human neuroblastoma cell line. Moreover, we modeled the 3D-structure of scFv-h3D6, obtained by sequence homology. This model has allowed to a rational redesign of the molecule in order to improve its stability, increase its recombinant production, and decrease the effective dose already demonstrated in a mice model of Alzheimer's disease. For another hand, we studied the AL-12 protein, an Ig variable domain (VL) obtained from a patient diagnosed with light chain Amyloidoses. This amyloidogenic domain shows seven non-conservative mutations from his germinal protein κI O18/O8. The thermodynamic study of AL-12 and four restoratives mutants, allowed us to determine the effect of somatic mutations on the VL stability. Thereby, the restoration of a residue toward the germinal sequence implies a destabilization of the domain and increases the aggregation tendency. Here we demonstrate that a single somatic mutation couldn’t be the cause of the amyloidogenic potential of AL-12, rather it is due to several factors. The destabilization of the native folding promotes a conformational reorganization more susceptible to β-aggregation. Finally, we work with PSD95-PDZ3 domain, a neuronal post-synaptic protein and related to human disease such as Alzheimer or Autism. PDZ3 follows a reversible aggregation pathway, a feature which is relevant to determining the conformational changes that promote it. In addition, the design of six variants of PDZ3 has helped determine the regions involved in the folding and stability of the global PDZ3 domain and its role in the aggregation process. This work demonstrates the importance of the states in the intermediate conformational space of proteins, their relationship with conformational diseases, and the application of knowledge in the development of effective therapies.

El present treball s'ha realitzat en el marc del Programa de Biologia Estructural i Computacional de l'IRB Barcelona, en el grup de RMN de proteïnes, sota la direcció de la Dra María J. Macías. L'interès del grup d'investigació se centra en la determinació estructural de dominis de proteïna, en l'estudi d'interaccions i en entendre els mecanismes per a la seva regulació. Concretament, aquest treball està enfocat en l'estudi estructural de dominis FF.En el nostre grup es va començar a estudiar els dominis FF a partir de l'observació que aquests dominis es troben sovint en proteïnes que també contenen WW, un petit domini d'interacció proteïna-proteïna que ha estat i continua sent la línia d'investigació principal del grup, i del qual s'han realitzat nombrosos i detallats estudis. En canvi, el dominis FF han estat identificats fa poc temps i la informació estructural i funcional de la qual es disposa és, a dia d'avui, escassa. En part, el pocs estudis realitzats amb aquests dominis pot ser conseqüència de que només els trobem en un conjunt reduït de proteïnes. De fet, la seva presència es limita a tres famílies de proteïnes: els factors d'splicing FBP11, Prp40 i URN1, el factor de transcripció CA150 i una família de proteïnes reguladores de RhoGTPases, les p190 RhoGAPs.Al meu grup, l'estudi amb dominis FF es va iniciar amb la resolució de l'estructura tridimensional del primer FF de la proteïna Prp40 de llevat, que va representar la segona estructura resolta per a un domini FF. En aquest treball l'objectiu ha estat aprofundir en el coneixement dels dominis FF, bàsicament des d'un punt de vista estructural utilitzant com a tècnica principal la resonànica magnètica nuclear (RMN). Aquesta tesi doctoral s'ha dividit en tres parts i en cada una d'elles s'ha treballat amb els dominis FF de les tres famílies de proteïnes esmentades anteriorment. L'enfoc també ha estat lleugerament diferent a cada part. Així, en el primer capítol, centrat en els dominis FF presents als factors d'splicing URN1 i Prp40, el gruix de la feina va ser l'obtenció de noves estructures tridimensionals per RMN d'aquests dominis. En canvi, en el segon capítol ens vam centrar en l'estudi de la interacció dels dominis FF de CA150 amb el seu primer lligand descrit, un motiu doble fosforilat del domini C-terminal de la RNA-polimerasa II (fosfo-CTD). Finalment, en la tercera part l'interès es va dirigir a l'estudi de la regulació de l'associació dels dominis FF de p190-A RhoGAP amb el factor de transcripció TFII-I, per mitjà d'una fosforilació sobre el primer FF de p190-A RhoGAP. / The present work has been done in the protein NMR group from the Structural and Computational Biology at the IRB Barcelona, under the direction of Dr. Maria J. Macias.The group's main interest is the structural determination of protein domains, in the study of their interactions and in the understanding of the mechanisms for their regulation. In particular, this work is focused in the structural study of FF domains.In our group, the study of FF domains began from the observation that these domains are often found in proteins that also contain WW domains, a small protein-protein interaction domain that has been, and continues to be the central research line of the group and that has been object of numerous and detailed studies.Conversely, FF domains have been recently identified and the structural and functional information available on them is, to date, limited. One of the reasons of the few studies reported for these domains could be consequence of their reduced presence in proteins. In fact, FF domains are only present in three protein families: the splicing factors FBP11, Prp40 and URN1, the transcription factor CA150 and a family of RhoGTPase regulators, the p190 RhoGAPs.In our group, the work with FF domains started with the solution of the three-dimensional structure of the first FF domain from yeast Prp40, which just represented the second solved structure for an FF domain. In the present work the aim has been to gain insight into FF domain knowledge, basically from a structural point of view, using nuclear magnetic resonance (NMR) as the principal methodology for the structural studies.This thesis has been divided in three parts, and in each of them we have work with FF domains from the different families mentioned above. The subject of study has been also slightly different in each part. In the first chapter, focused in FF domains present in Prp40 and URN1 splicing factors, the principal work consisted in the obtaining of novel three-dimensional structures for these domains by NMR. In contrast, in the second chapter the main interest was the study of the interaction of CA150 FF domains with their first described ligand, a doubly phosphorylated motif of the RNA polymerase II C-terminal domain (phospho-CTD). Finally, in the last part our efforts were focused in the study of the regulation of p190-A RhoGAP FF domains association with the general transcription factor TFII-I through phosphorylation on the first FF domain of p190-A RhoGAP.

In human there are 518 protein kinases reported and many of them are involved in several cellular processes and also in important pathologies. Kinases have a diverse specificity for the sequences they phosphorylate, and it has been shown that their in vivo specificity is guided by several elements such as the sequence surrounding the phosphorylated amino acid in the substrate, the co-localization with the substrate, interactions mediated by docking sites and the association of kinases to adaptor or scaffold proteins (AS). The objective of the current thesis has been the identification and quantification of the contribution to the specificity of i) the phosphorylated site and its surrounding residues in sequence and ii) the association of kinases to AS proteins. By integrating data from public resources we compiled a set of kinase-phosphorylation sites in human corresponding to 325 (62.7%) kinases, 1856 substrates and 5946 phosphorylation sites. We have used sequence logos for representing the phosphorylation motifs recognized by the kinases in our set and we have used these logos to guide the classification of kinases attending to the residue composition of the sequences surrounding the phosphorylation site. We have used position-specific scoring matrices (PSSMs) as the probabilistic representation of the sequences phosphorylated by the kinases. Based on the score in the PSSMs relative to the phospho-acceptor amino acid, we classified several residues as specificity-determinant residues (SDR) for several kinase families. The identity, position in the sequence alignment and the frequency of the SDRs identified vary considerably among the kinase families analyzed. The statistical significance of the PSSMs was assessed taking into account their recall and their information content (IC). We found negative correlations between the the number of seed sequences and i) the recall of the PSSMs and ii) the IC of the PSSMs. Based on the IC value, and in the comparison to random distributions, we found that statistically significant PSSMs differ from the non-statistically significant ones regarding their IC, recall, number of seed phosphorylation sites and AUC-ROC. We have developed a computational strategy for the identification of proteins with known function as adaptors or scaffolds of human kinases (kAS). In total, we have identified a set of 191 kAS proteins which is enriched in domains and functional terms that support their role as AS. These 191 kAS associate to 55% of human kinases, which suggest that the association to this type of AS molecules is common among human kinases. Our results suggest that, when compared to random proteins, kAS proteins are five times more likely to interact with a significantly large fraction of the substrates of a the kinases to which the kAS are associated. Starting from a set of 156 human kinases for which we count with at least five substrates, we identified a set of 279 proteins with a potential function as adaptor or scaffold (pAS). This set is enriched in protein domains and functional terms related to the predicted function and that also suggest a relationship to signalling processes. Our analysis on cellular co-localization suggest that, for 74.6% of the kinase-pAS associations found, the pAS protein may play a role in the co-localization of the kinases and their corresponding sets of substrates. Finally, we have analyzed the relationship between the association of different kinases to common AS proteins and the number of in vivo substrates shared by the kinases. Our results suggest that kinases with AS proteins in common do not share more in vivo substrates than what would be expected only due to chance. To our opinion, this suggests that AS proteins may diminish the substrate crossed specificity of the kinases to which they associate.