La identificación de interacciones proteína-proteína en las células resulta de gran importancia para entender los procesos biológicos a nivel molecular. Así, cada vez despierta mayor interés el estudio de las proteínas, no de manera individual sino a través de las interacciones que establecen con otras proteínas o biomoléculas ya que estas asociaciones son fundamentales para el desarrollo de las funciones celulares. En este sentido, una gran parte de este trabajo se ha dirigido a la aplicación de metodologías que permiten identificar y evaluar interacciones proteína-proteína, con la finalidad de asignar nuevas funciones a la enzima gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH) en E. coli. Estudios realizados en humanos muestran que GAPDH es una proteína multifuncional, implicada en diversos procesos celulares. Las diferentes funciones dependen de su localización subcelular, estado oligomérico o interacciones con otras proteínas o ligandos. Sin embargo en bacterias, funciones alternativas a la glicólisis sólo se han descrito para la GAPDH secretada al medio extracelular por cepas patógenas y probióticas. El objetivo de este trabajo es contribuir a la identificación de nuevas funciones de GAPDH en E. coli a nivel intracelular mediante el estudio de las interacciones que establece con otras proteínas. Mediante experimentos de cross-linking in vivo seguidos de inmunoprecipitación y análisis por espectrometría de masas se han identificado varias proteínas implicadas en distintos procesos celulares. A través de ensayos de Pull-down seguidos de Western Blot se ha validado la interacción de GAPDH con EF-Tu, piruvato quinasa, triptofanasa, fosfoglicolato fosfatasa (PGPasa) y las subunidades α y β de la ATP sintasa. La diversidad de proteínas identificadas sugiere que GAPDH, a través de múltiples interacciones, podría estar participando o modulando procesos metabólicos, de transporte, síntesis de proteínas, obtención de energía y reparación de DNA. La implicación de GAPDH en procesos de reparación del DNA se ha evidenciado en estudios funcionales, utilizando células deficientes en esta proteína, en concreto mutantes knockout gapA o células silenciadas para la expresión del gen gapA mediante RNA antisentido. Se ha observado que estas células presentan una menor viabilidad que las control cuando son tratadas con agentes genotóxicos como bleomicina o metilmetanosulfonato. Además en el DNA genómico del mutante knockout gapA se observa un incremento en el número de centros abásicos generados de modo espontáneo. Mediante ensayos de Pull-down seguidos de Western Blot se ha evidenciado la interacción de GAPDH con proteínas que participan en los sistemas de reparación del DNA, como Endo IV del sistema de reparación por escisión de bases (BER) y SSB (single stranded DNA binding protein) implicada en los procesos de recombinación homóloga y en la respuesta SOS. Por último, las células deficientes en GAPDH (knockout y silenciadas) presentan morfología filamentosa en fase estacionaria de crecimiento, fenotipo sugerente de una inhibición de la replicación por acúmulo de mutaciones no reparadas. / Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) is considered a multifunctional protein with defined functions in numerous mammalian cellular processes. GAPDH functional diversity depends on various factors such as covalent modifications, subcellular localization, oligomeric state or intracellular concentration of substrates or ligands, as well as protein–protein interactions. In bacteria, alternative GAPDH functions have been associated with its extracellular location in pathogens or probiotics. In this study, new intracellular functions of Escherichia coli GAPDH were investigated following a proteomic approach aimed at identifying interacting partners using in vivo formaldehyde cross-linking followed by mass spectrometry. The identified proteins were involved in metabolic processes, protein synthesis and folding or DNA repair suggesting involvement of GAPDH in many cellular processes. Some interacting proteins were also identified in immunopurification experiments in the absence of cross-linking. Among the proteins identified as potential GAPDH interacting partners, we found the interaction with PGPase to be of special interest due to its physiological role in processes linked to DNA repair. This enzyme is involved in the metabolism of 2-phosphoglycolate formed in the DNA repair of 3’-phosphoglycolate ends generated by bleomycin damage. We show that PGPase-GAPDH interacting complexes increased in cells challenged with bleomycin, suggesting involvement of GAPDH in cellular processes linked to DNA repair mechanisms. The functional implication of GAPDH in DNA repair was evidenced in GAPDH deficient strains (gapA knockout mutants or conditional silencing of gapA gene by antisense RNA) following different approaches: (i) GAPDH deficient cells presented lower viability with respect to wild type cells when treated with bleomycin or the alkylating agent methyl methanesulfonate (MMS); (ii) The gapA mutant showed increased number of spontaneous apurinic / apyrimidinic (AP) sites in its DNA genomic; (iii) Pull-down experiments followed by Western Blot showed interaction of GAPDH with endonuclease IV (Endo IV), a protein involved in the repair of AP sites and with the single-stranded DNA binding protein (SSB), essential for DNA repair induced under conditions of SOS response. Finally, (iv) GAPDH deficient cells presented a filamentous morphology in stationary phase, phenotype that suggests an inhibition of cellular division, probably due to accumulation of unrepaired mutations as a consequence of GAPDH deficiency.

Different aspects and disciplines have been enclosed in this thesis in order to unravel the effects of low temperature to wine yeast. Results enclosed in chapters 1st and 2nd of this thesis reveal original empirical data with the purpose of understand how temperature has impact on Saccharomyces evolution and ecology in wine fermentation environments. Chapters 3rd and 4th enclose a proteomic analysis of yeast during wine fermentation at low temperatures and a functional genomics approach, issue from the proteomic study, developed in order to identify single gene influence at low temperature fermentations. In general, studies presented in this thesis provide oenological biotechnology with a broad range of new and original data that will allow going further in both, developing new biotechnological solutions and performing knowledge-based process management of low temperature fermentations. / Diferents aspectes i disciplines s’han inclòs en aquesta tesis per tal de desentranyar els efectes de la baixa temperatura sobre els llevats vínics. Els resultats inclosos en els capítols 1r i 2n d’aquesta tesis aporten dades empíriques originals amb la finalitat de comprendre com la temperatura ha influït en la evolució del gènere Saccharomyces i en la seva ecologia en ambients vínics. Els capítols 3r i 4rt inclouen un anàlisis proteòmic del llevat durant la vinificació a baixes temperatures i un anàlisis de genòmica funcional, que ha permès detectar i analitzar el rol de gens potencialment importants en les fermentacions a baixes temperatures. En general, els estudis realitzats durant aquesta tesis han proporcionat a la biotecnologia enològica d’un ampli ventall de dades noves i originals que permetran desenvolupar tant noves solucions biotecnològiques com millora de la gestió basada en el coneixement de les fermentacions a baixes temperatures. / Diferentes aspectos y disciplinas se han incluido en esta tesis para desentrañar los efectos de la baja temperatura sobre las levaduras vínicas. Los resultados incluidos en el 1º y 2º capítulos de esta tesis aportan datos empíricos originalescon el fin de comprender cómo la temperatura influye en la evolución del género Saccharomyces y en su ecología en ambientes vínicos. Los capítulos 3º y 4º incluyen un análisis proteómico de la levadura durante lavinificación a bajas temperaturas y un análisis de genómica funcional, que han permitido detectar y analizar el rol de genes potencialmente importantes en las fermentaciones vínicas a bajas temperaturas. En general los estudios realizados durante esta tesis han provisto a la biotecnología enológica de un amplio abanico de datos nuevos y originales que van a permitir desarrollar tanto nuevas soluciones biotecnológicas como mejorar la gestión basada en el conocimiento de las fermentaciones a bajas temperaturas.

Malonil-CoA Descarboxilasa humana (MCD) es un enzima que tiene un papel muy importante en la oxidación de ácidos grasos. Presenta dos isoformas y debido a sus características puede residir en diferentes compartimentos celulares, como el peroxisoma, citoplasma o mitocondria. En los tres compartimentos MCD está implicada de alguna forma en la vía metabólica de los ácidos grasos. En peroxisoma, MCD descarboxila el malonil-CoA procedente de la beta oxidación de ácidos grasos. En citoplasma, MCD actúa junto a Acetil-CoA Carboxilasa, el enzima que sintetiza el malonil-CoA. Ambos se encargan de controlar la concentración del malonil-CoA citoplasmático, imprescindible para la síntesis de ácidos grasos en células lipogénicas y también inhibidor de la Carnitina Aciltransferasa 1 (CPT1), el enzima que inicia el transporte de los ácidos grasos a la mitocondria para la beta oxidación. Finalmente, MCD en mitocondria convierte el malonil-CoA (utilizado para la síntesis de ácidos grasos) en acetil-CoA. La estructura cristalina de MCD resuelta a 3.29Å presenta una disposición oligomérica basada en un dímero de heterodímeros. Los monómeros que componen a los heterodímeros exhiben una fuerte asimetría estructural sugiriendo reactividad “half-of-the-sites”. Cada monómero está constituido por un dominio N-Terminal todo hélice y un dominio catalítico C-Terminal con plegamiento típico de la família GCN5 Histona acetiltransferasa (GNAT). Sin embargo, el lugar de unión de malonil-CoA en MCD, presenta una variación con respecto a sus homólogos. El cambio de un residuo glutámico (Glu302) por una glicina en el centro del motivo de unión que facilita la liberación del sustrato actuando como palanca molecular. Cada heterodímero del tetrámero presenta una interfase de contacto hidrofóbica además de la posibilidad de formar un enlace disulfuro entre subunidades. Los heterodímeros están unidos entre sí por una pequeña superficie de contacto del dominio C-Terminal donde se exponen parejas de cisteínas, lo que hace de MCD una estructura tetramérica unida por superficies hidrofóbicas y con la posibilidad de unirse covalentemente mediante los puentes disulfuro en presencia de oxidantes como el peróxido de hidrógeno. / Human Malonyl-CoA Decarboxylase (MCD) plays an important role in fatty acids oxidation. There are two different isoforms and due to their characteristics is distributed in different cellular compartments such as peroxisome, cytoplasm and mitochondria. MCD is involved in the metabolic fatty acid pathway of all these compartments. In peroxisome, malonyl-CoA from fatty acid beta oxidation is decarboxylated by MCD. In cytoplasm, MCD acts with Acetyl-CoA Carboxylase, the enzyme that synthesizes malonyl-CoA. Both enzymes are responsible for controlling the intracellular concentration of malonyl-CoA, a key molecule for fatty acid synthesis in lipogenic cells and also a inhibitor of Carnitine acyltransferase 1 (CPT1), the enzyme that initiates fatty acid transport into mitochondria for beta oxidation. Finally, mitochondrial MCD converts malonyl-CoA (the substrate for fatty acids synthesis) into acetyl-CoA. The crystal structure of MCD solved at 3.29 Å shows a tetrameric state based on a dimer of heterodimers with a strong structural asymmetry between the monomers conformation forming the heterodimer, suggesting half of the sites reactivity. Each monomer is composed of an all-helical N-Terminal domain and a very precise catalytic C-Terminal domain present in GCN5-Histone acetyltransferase (GNAT) family. However, the binding site for malonyl-CoA in MCD shows a variation with respect to their homologous. The center of the binding motif has a glutamic residue (Glu302) instead of a glycine acting as a molecular lever in the substrate releasing. In addition, each heterodimer composing the tetramer exhibits a large hydrophobic interface with the possibility to form a inter subunit disulfide bridge. Heterodimers are also interconnected by a small C-Terminal domain interface, where a pair of cysteines are properly disposed. The disulfide bonds gives to MCD the capability to form a tetrameric enzyme linked by inter subunits covalent bonds in the presence of oxidants such as hydrogen peroxide.

Aquest treball de tesi doctoral s’engloba dins la coneguda Biotecnologia Blanca, concretament en el camp de la Producció de Proteïnes Recombinants. Les aplicacions d’aquesta àrea de coneixement en processos industrials es basa en el disseny de microorganismes per obtenir productes d’alt valor afegit. En aquest cas, el microorganisme productor és Escherichia coli i la proteïna d’interès es tracta de Fuculosa-1-fosfat aldolasa, enzim que catalitza estereoselectivament reaccions d’addició aldòlica. Per una banda, s’han dut a terme diverses modificacions a nivell de plasmidi per tecnologia de DNA recombinant a fi de millorar un sistema d’expressió auxotròfic per la glicina. Aquestes millores no tan sols han anat enfocades a l’increment dels nivells de producció de la proteïna d’interès, sinó també a la obtenció d’un sistema d’expressió segur, simplificat i estable. El creixement i producció de la Fuculosa-1-fosfat aldolasa mitjançant les soques modificades han estat efectuats en matrassos d’Erlenmeyer i en fermentadors operant en discontinu alimentat quan s’ha requerit. Per altra banda, l’expressió de la proteïna d’interès en forma de cossos d’inclusió, a banda de soluble, ha permès obtenir alts nivells de Fuculosa-1-fosfat pura i activa. L’aplicació d’aquests cossos d’inclusió prèviament immobilitzats per encapsulament mitjançant la tecnologia Lentikat® en una reacció estereoselectiva d’addició aldòlica ha donat com a resultat un biocatalitzador actiu, robust i estable a llarg termini. Per tant, es tracta d’una petita aportació en la biotecnologia industrial que intenta conceptualitzar el bioprocés de manera hol·lística tot fusionant diverses àrees de coneixement. Tot i que no s’ha realitzat una avaluació econòmica del procés, consideracions tals com la possibilitat de reutilització del biocatalitzador han estat contemplades, per tal que el resultat fos atractiu industrialment parlant.

L’anàlisi sistemàtic de la fisiologia cel·lular és de gran importància en la millora del coneixement sobre els microorganismes. En aquesta direcció, la biologia de sistemes ens permet l’anàlisi quantitatiu de diferents nivells fisiològics obtenint representacions in silico de les vies metabòliques estudiades que, en conjunt, s’adrecen a la millor comprensió del comportament de sistemes biològics complexos. Aquest projecte de recerca va ser dissenyat per contribuir en la comprensió de la fisiologia de Pichia pastoris sota diferents condicions d’estrès. Específicament, aquesta tesis se centre en l’estudi sistemàtic del conjunt de metabòlits lliures dins la cèl·lula i en la velocitat que aquests es transformen. En el Capítol 2, una caracterització dels principals component de la biomassa de P. pastoris es va realitzadar sota diferents condicions de. Per una altre part, la consistència dels fluxos dels metabòlits extracel·lulars van ser utilitzats per identificar la producció d’un subproducte de fermentació, arabinitol. En el Capítol 3, s’obtingué la relació entre diferents fluxos metabòlics del metabolisme central del carboni de P. pastoris mitjançant l’estudi del carboni marcat dels aminoàcids sintetitzats de novo. Posteriorment, aquest valors van ser utilitzats delimitant l’anàlisi de fluxos metabòlics sota diferents condicions d’oxigenació i producció de proteïna recombinant. Els resultat més destacats obtinguts foren la gran similitud entre els fluxos estimats per les soques productora i control en condicions equivalents. Tot i així, diferencies clares van ser observades quan es van comparar el patró de fluxos corresponents a diferents nivells d’oxigenació. L’anàlisi dels metabòlits lliures dins la cèl·lula va començar en el Capítol 4 amb l’avaluació sistemàtica de cinc protocols de parada ràpida del metabolisme en P. pastoris respecte la concentració de metanol i la temperatura. Com a resultat, la parada del metabolisme realitzada a -27ºC amb una solució de 60% v/v de metanol a ser amb la que menys pèrdues es van observar. Consecutivament, es va demostrar que cinc temps de residència són els necessaris per arribar a un estat estacionari del metabòlits intracel·lulars en cultius amb glucosa limitant. D’altra banda, sota les mateixes condicions de treball, els perfils intracel·lulars dels principals metabòlits eren similars entre els llevats P. pastoris i S. cerevisiae. En el Capítol 5, l’estequiometria redox i energètica de P. pastoris va ser validada veient un augment en els requeriments energètics d’aquesta sota condicions deficitàries d’oxigen. A més a més, es va realitzar un anàlisi termodinàmic dels metabòlits intracel·lulars mitjançant lo qual s’obtingueren millores en el patró de fluxos en la via de les pentoses fosfat conjuntament amb informació de l’estat redox del citosol. En el Capítol 6, la regulació transcripcional i termodinàmica dels fluxes del metabolisme central del carboni va ser investigada entre diferents condicions de cultiu. En general, la contribució dels diferents nivells omics en el canvi final dels fluxos metabòlics van resultar ser diferents entre els llevats P. pastoris i S. cerevisiae. Específicament, per P. pastoris, la regulació transcripcional va ser significant en la majoria de reaccions, contràriament al que s’havia descrit per S. cerevisiae. Finalment, en el Capítol 7, per una millor comprensió de l’efecte i la interacció de la disponibilitat d’oxigen i la producció d’una proteïna forania, es va realitzar un anàlisi quantitatiu del aminoàcids lliures intracel·lulars sota la producció d’aquesta proteïna i en diferents condicions d’oxigenació. Els valors obtinguts indicaren una variació significativa d’aquests aminoàcids intracel·lulars entre diferents disponibilitats d’oxigen. Sorprenentment, l’expressió d’aquesta es va veure que tenia un impacte limitat, però significant, en els pools d’aminoàcids. Amb tot, els canvis individuals observats no presentaven una correlació amb l’abundància relativa d’aquests en la proteïna recombinant, en canvi, concordava amb la variació de la composició aminoacídica de la biomassa. / The systematic analysis of the cell physiological it is critical to gain knowledge about microorganisms. Systems biology gives the opportunity to obtain quantitatively analysis of different physiological levels which allow the in silico representations of the studied pathways. Overall, this field is addressed to the crucial understanding of complex biological networks behaviour. This research project was aimed to contribute to the understandings of the Pichia pastoris physiology under different stress conditions. Specifically, the thesis was centred in the systematic analysis of the metabolome and fluxome omic levels. In Chapter 2, a consistent description of the biomass principal components of P. pastoris is obtained for different oxygenation conditions, as well as under recombinant protein producing and non-producing backgrounds obtaining the best estimation of the biomass composition. In addition, consistency of the input and output extracellular metabolic fluxes was used to identify the production of an unexpected by-product, which was subsequently identified as arabinitol. In Chapter 3, biosynthetically directed fractional 13C-labellings were performed obtaining information about the principals metabolic flux ratios of the carbon central metabolism of P. pastoris as well as a 13C-constrained metabolic flux analysis under the different cultures conditions. The most prominent feature obtained was the similarity in flux estimations between the expressing and the control strains. Nevertheless, clear differences were observed when comparing flux patterns corresponding to different oxygenations set points. The issue of metabolome analysis was started in Chapter 4 with the systematic evaluation of five quenching protocols applied to P. pastoris regarding the methanol concentration and temperature. As result, acceptable recoveries (>90%) were obtained for all quenching procedures tested. However, quenching at -27ºC in 60% v/v methanol performed slightly better in terms of leakage minimization. Thereafter, it was demonstrated that five residence times under glucose limitation were enough to reach stable intracellular metabolite pools. Moreover, when comparing P. pastoris and S. cerevisiae metabolomes, under the same cultivation conditions, similar metabolite fingerprints were found in both yeasts, except for the lower glycolysis. In Chapter 5, the redox and energy stoichiometry of P. pastoris was validated showing increasing energy requirements as the oxygen availability became shortage. In addition, a network-embedded thermodynamic analysis of the quantitative intracellular metabolites pools was performed allowing an improvement of the non-oxidative pentose phosphate pathway fluxes as well as determination of the oxygen impact over the redox state of the cytosol. In Chapter 6, the transcriptional and thermodynamic regulations over the metabolic flow between conditions were investigated for the central carbon metabolism reactions. Overall, the different omic contributions to the final metabolic flux changes were resulted to be different between P. pastoris and S. cerevisae. Specifically, for P. pastoris, transcriptional regulation was found to be in most cases significant, contrarily to the baker yeast. Finally, in Chapter 7, to better understand the effect and interplay of oxygen availability and foreign protein secretion on central metabolism, a first quantitative metabolomic analysis of free amino acids pools in a recombinant P. pastoris strain growing under different oxygen availability conditions was performed. The values obtained indicated significant variations in the intracellular amino acid levels due to different oxygen availability conditions. Notably, even that foreign protein productivities were relatively low, recombinant protein production was found to have a limited but significant impact. However, observed changes in individual amino acids pools were not correlated with their corresponding relative abundance in the recombinant protein sequence, but to the overall cell protein amino acid compositional variations.

Els riscos biològics associats a la teràpia gènica viral limiten el ple desenvolupament de vectors virals i plantegen importants problemes a la seva incorporació en assajos clínics. La teràpia gènica no viral representa una alternativa segura als virus naturals per al lliurament dirigida de gens a cèl·lules, tot i els baixos nivells d'expressió gènica obtinguts que és l’obstacle principal per la seva aplicació terapèutica. Els diferents tipus de vectors no virals que s'han desenvolupat fins ara, inclouen els basats en liposomes, dendrímers o proteïnes. Recentment, el concepte de "virus artificial” s'ha proposat per descriure nanocomplexes per al lliurament de gens que imiten les funcions virals pertinents per a la captació del gen i el tràfic intracel·lular. Entre ells, els basats en proteïnes i construïts a través de principis modulars permeten la incorporació, en un únic polipèptid, de diferents proteïnes o dominis de proteïnes amb funcions similars a virus, és a dir, la unió i la condensació a ADN, la unió al receptor, la internalització, l’escapament endosomal, la localització nuclear i l’alliberament del material transportat. Hem desenvolupat una sèrie de vehicles proteics modulars formades per diferents dominis funcionals que són capaços d'entrar en les cèl·lules a través de la unió un receptor específic i promoure nivells importants de l'expressió gènica. En aquesta tesi s'analitza aquest enfocament amb dos articles de revisió i es demostra amb tres treballs originals. / The biological risks associated to viral gene therapy limit the full development of viral vectors and pose major concerns to their incorporation into clinical trials. Non-viral gene therapy represents a safe alternative to natural viruses for cell targeted gene delivery, although the low gene expression levels achieved by non-viral vectors are a main obstacle for their therapeutic application. Different types of non-viral vectors have been developed up to date, including those based in liposomes, dendrimers or proteins. Recently, the ‘Artificial virus’ concept has been proposed to describe nanocomplexes for gene delivery that mimic the viral functions relevant to gene uptake and intracellular trafficking. Among them, those based on proteins and constructed through modular principles allow the incorporation, in a single polypeptide, of different proteins or protein domains with virus-like functions, namely DNA binding and condensation, receptor binding, internalization, endosomal escape, nuclear targeting and uncoating. We have developed a series of protein-only modular vehicles composed by different functional domains that are able to enter cells through specific receptor binding and promotes important levels of transgene expression. In this thesis this approach is discussed with two review articles and demonstrated with three original papers.

DE LA TESIS:Distintas evidencias en la bibliografía apuntan al colesterol como uno de los componentes lipídicos celulares cuyos niveles están más alterados en la mayoría de células tumorales, y en particular, en el carcinoma hepatocelular. Se analizó la composición lipídica (niveles de colesterol y fosfolípidos) en mitocondrias de carcinoma hepatocelular, y en particular en los niveles de colesterol, que afectan a la fluidez de membrana y a la funcionalidad mitocondrial. La acumulación de colesterol observado en las mitocondrias aisladas tanto de líneas celulares de carcinoma hepatocelular (H35 y HepG2) como de muestras de hepatocarcinoma humano, provoca una mayor rigidez de sus membranas que afecta al funcionamiento de la cadena respiratoria y a la penetrabilidad de la proteína Bax, insensibilizándolas a la permeabilización mitocondrial e impidiendo la liberación de proteínas proapoptóticas al citosol. Al disminuir in vitro el contenido de colesterol de mitocondrias aisladas de células H35 y HepG2, éstas se sensibilizaron a estímulos que inducen la formación del poro mitocondrial transitorio (atractilósido, anión superóxido y calcio) y a la permeabilización por Bax activado por tBid. Las líneas celulares de carcinoma hepatocelular estudiadas se sensibilizaron a quimioterapéuticos que actúan en la mitocondria al bloquear farmacológicamente la síntesis endógena de colesterol, tanto a nivel del enzima HMG-CoA reductasa como del escualeno sintasa. Resultados similares respecto a la disminución del colesterol mitocondrial y a la sensibilización a los agentes quimioterapéuticos se observaron tras el silenciamiento de la proteína de transporte mitocondrial de colesterol StAR mediante ARN de interferencia. Se analizó in vivo con un modelo xenograft si el tratamiento con drogas que inhiben la síntesis de colesterol combinado con la quimioterapia disminuye el crecimiento tumoral. El tratamiento tanto con atorvastatina como con YM-53601 combinado con la droga doxorubicina bloqueó el crecimiento tumoral in vivo, induciendo apoptosis sin afectar a la vascularización del tejido.

La vasodilatación arterial sistémica, especialmente en la circulación mesentérica, es el mecanismo inicial responsable de las alteraciones hemodinámicas asociadas a la hipertensión portal. Esta vasodilatación arterial, contribuye de manera evidente a las complicaciones de la hipertensión portal, como la hemorragia por varices esofágicas, la ascitis, el síndrome hepatorenal o la encefalopatía hepática. Debido a la gravedad de estas complicaciones, la hipertensión portal representa la primera causa de muerte y de trasplante en pacientes con cirrosis. Muchos factores con actividad vasodilatadora han sido objeto de estudio por su potencial papel en desarrollo de la vasodilatación arterial asociada a la hipertensión portal, pero el óxido nítrico, un potente vasodilatador endógeno, es considerado como el principal mediador de esta alteración vascular. Con el objetivo de determinar nuevos mecanismos implicados en la alteración vascular asplácnica de la hipertensión portal experimental, se realizó un estudio de expresión génica diferencial con muestras de arteria mesentérica superior (SMA) de ratas con hipertensión portal y ratas control (Coll, et al; JHepatol 08). Por un lado, se utilizó un modelo experimental en rata (14 días post¬ligadura de la vena porta), el cual reproduce todas las alteraciones hemodinámicas que se observa en pacientes con hipertensión portal, y por otro lado, el estudio de expresión diferencial se llevo a cabo con microarrays de DNA. De esta manera se evaluaron las alteraciones de expresión génica que tenían lugar en las SMA de estos animales desde los estadios más tempranos hasta la instauración de la hipertensión portal experimental. Este primer estudio reveló un incremento inicial (1 hora post¬ligadura) en la producción de RNA mensajeros de más de 50 genes relacionados con la neurogénesis y la neurotransmisión, especialmente adrenérgica, seguido de una intensa inhibición a los 14 días post¬ligadura. Esta inhibición de la producción de RNA mensajeros se acompañaba de una reducción del nivel de proteínas implicadas en la biosíntesis de noradrenalina: tirosina hidroxilasa (Th) y dopamina β¬hidroxilasa (Dbh) así como de la proteína asociada al sinaptosoma (Snap¬25) responsable de la exocitosis del mismo neurotransmisor. En un segundo trabajo (Coll, et al; Liver Int, 09), se determinó que la inhibición de la producción de proteínas relacionadas con el sistema adrenérgico (Th, Dbh i Snap25), que habíamos detectado en el tronco principal de la arteria mesentérica, también tenía lugar en las arterias mesentéricas de resistencia de ratas con hipertensión portal. Este estudio también demostró, por hibridación in situ del RNA mensajero de Th, que la síntesis de estas proteínas se produce en el ganglio mesentérico superior así como en la parte proximal (del origen aórtico) de los paquetes axonales peri¬SMA. Finalmente, el resultado más relevante de este trabajo es la determinación de una atrofia muy importante de la inervación simpática de las SMA en ratas con hipertensión portal. Esta regresión simpática se correlaciona de forma positiva con el desarrollo de de las manifestaciones hemodinámicas de la hipertensión portal experimental. La atrofia de la inervación simpática de la vasculatura mesentérica de ratas con hipertensión portal confiere una nueva diana terapéutica de la vasodilatación esplácnica asociada a la hipertensión portal. Con la hipótesis de que un tratamiento dirigido a revertir el déficit simpático podría mejorar el trastorno vascular de esta fisiopatología, se evaluó el efecto de un fármaco pro¬adrenérgico en ratas con hipertensión portal. L¬threo¬3,4¬dihidroxifenilserina (L¬Dops, Droxidopa) es un aminoácido sintético que con la presencia de la enzima L¬aromático aminoácido descarboxilasa (LAAAD), se convierte en noradrenalina (NA). Este fármaco permite mejorar los síntomas de la hipotensión ortostática a pacientes con Insuficiencia Autonómica Pura (PAF). La enfermedad de PAF, que implica la pérdida de neuronas post¬ganglionares simpáticas, presenta una cierta similitud con la atrofia simpática observada en ratas con hipertensión portal. Debido a que comercialmente sólo la forma racémica del compuesto (D,L¬threo¬Dops) está disponible, se determinó el efecto de esta mezcla racémica en los parámetros hemodinámicos de ratas con hipertensión portal . El resultado más destacado de este trabajo es el aumento significativo de la presión arterial media (15%) de las ratas con hipertensión portal secundaria a la administración endovenosa de la mescla racémica. En conclusión, la atrofia de la innervación simpática determinada en la vasculatura mesentérica de ratas con hipertensión portal podría contribuir a la vasodilatación esplacnica asociada a esta fisiopatología, sugiriendo una nueva diana terapéutica para el tratamiento de la hipertensión portal.

En el infarto agudo de miocardio el tejido isquémico no sobrevive a no ser que se restaure el flujo coronario. Sin embargo, esta restauración del flujo causa por sí misma la muerte de cardiomiocitos que han sobrevivido al periodo isquémico, reduciendo notablemente los beneficios de la reperfusión. Este fenómeno, conocido como daño letal por reperfusión, se caracteriza por una muerte celular de tipo necrótico que tiene lugar principalmente en los primeros minutos de la reperfusión y cuya extensión depende de la duración del episodio isquémico.La sobrecarga de Ca2+ citosólico es uno de los principales determinantes del daño por reperfusión. El Ca2+ contribuye a la inducción de necrosis a través de tres mecanismos principales: la hipercontractura, la disfunción mitocondrial y la activación de enzimas como las calpaínas. Las calpaínas son proteasas dependientes de Ca2+ cuya activación aumenta la fragilidad del sarcolema en la isquemia/reperfusión. Esta fragilidad facilita la ruptura del sarcolema mediante la degradación de proteínas estructurales como la fodrina, que forma la base del citoesqueleto de membrana. Las calpaínas también participan en mecanismos endógenos de protección como el precondicionamiento isquémico, que inhibe estas proteasas y reduce la fragilidad sarcolemal.La primera parte de esta tesis evalúa la idoneidad de las calpaínas como diana terapéutica en un modelo de corazón aislado de rata. En este trabajo se descarta por primera vez la activación de las calpaínas durante la isquemia, situación que haría inútil cualquier tratamiento realizado durante la reperfusión. En cambio se observa translocación de la m-calpaína a membrana durante la isquemia; la posibilidad de que este fenómeno implicara un estado de preactivación es descartada al no inhibirse su activación durante la reperfusión cuando se inhibe su translocación. En un modelo de sobrecarga de Ca2+ sin isquemia la acidosis inhibe la actividad de las calpaínas, demostrándose que la acidosis es uno de los factores que previenen su activación durante la isquemia. Estos resultados indican que las calpaínas se activan exclusivamente durante la reperfusión y su inhibición farmacológica postisquémica podría ser una estrategia eficaz frente al daño por reperfusión.La segunda parte propone un nuevo mecanismo de daño por reperfusión mediado por las calpaínas. Su actividad durante la reperfusión provoca la degradación de fodrina y anquirina, dando lugar a la disociación de las subunidades ± de la Na+/K+-ATPasa del citoesqueleto de membrana y con ello a una disminución en su actividad. La reducida actividad de la Na+/K+-ATPasa impide una rápida normalización del gradiente de Na+, favoreciendo la entrada de Ca2+ a través del intercambiador Na+/ Ca2+ y por tanto la muerte por reperfusión.La tercera parte estudia el papel de las calpaínas en la cardioprotección. Por un lado demuestra que el precondicionamiento isquémico a través de la inhibición de las calpaínas protege la función de la Na+/K+-ATPasa, mejorando la cinética de recuperación del Na+ en el inicio de la reperfusión y reduciendo la muerte celular. Por otro lado se demuestra que el retraso en la normalización del pH intracelular es esencial en la cardioprotección otorgada por el postcondicionamiento isquémico, y que uno de los efectos de la prolongación de la acidosis en la reperfusión es la inhibición de las calpaínas, cuya actividad se correlaciona con la muerte celular. Finalmente, la inhibición farmacológica de las calpaínas exclusivamente en la reperfusión protege el miocardio en riesgo en un modelo de rata in vivo, demostrando el potencial de las calpaínas como diana terapéutica dirigida a reducir el tamaño del infarto.En conclusión, los resultados presentados en esta tesis demuestran la importancia de las calpaínas en el daño por reperfusión así como la posible utilidad terapéutica de su inhibición en el infarto agudo de miocardio. / In the acute myocardial infarct, the ischemic tissue dies unless coronary flow is restored. However, flow restoration causes by itself the death of cardiomyocytes which have survived the ischemic period reducing the benefits of reperfusion. This phenomenon, known as lethal reperfusion injury, consists in necrotic cell death ocurring at the onset of reperfusion and whose extension depends on the duration of the ischemic period.Cytosolic Ca2+ overload is one of the main determinants of reperfusion injury. Ca2+ contributes to necrosis induction through different mechanisms including hypercontracture, mytochondrial dysfunction and activation of enzymes such as calpains. Calpains are Ca2+-dependent proteases and their activation increases sarcolemmal fragility in ischemia/reperfusion. This increase in the membrane fragility facilitates sarcolemmal rupture by means of degradation of structural proteins such as fodrin, which forms membrane cytoskeleton backbone. Calpains also participate in endogenous cardioprotection mechanisms, like ischemic preconditioning, which inhibits these proteases and reduces sarcolemmal fragility.The first part of this thesis characterizes the mechanisms regulating calpain activity during ischemia/reperfusion. The results demonstrate that calpains activate during reperfusion while translocation to membrane is observed during ischemia; the possibility of translocation implying a preactivation state is ruled out as calpains activation during reperfusion is not inhibited by reduction of their translocation. In a Ca2+ overload model without ischemia, intracellular acidosis prevents calpains activity, demonstrating that low pH is one of the factors inhibiting calpains during ischemia. These results show that calpains are activated exclusively during reperfusion and their pharmacological inhibition after ischemia could be an effective strategy against reperfusion injury.In the second part a new reperfusion injury mechanism mediated by calpains is proposed. Their activity during reperfusion proteolyzes fodrin and ankyrin, causing the disanchorage of Na+/K+-ATPase ± subunits from the membrane cytoskeleton and the reduction in the activity of the pump. Na+/K+-ATPase dysfunction during the first minutes of reperfusion impairs the normalization of the Na+ gradient, favouring more Ca2+ entry through the Na+/Ca2+ exchanger and resulting in Ca2+-dependent cell death.The third part studies the role of calpains in cardioprotection. Initially, it is demonstrated that ischemic preconditioning protects Na+/K+-ATPase function through calpains inhibition, improving Na+ recovery kinetics during the first minutes of reperfusion and reducing cell death. Furthermore, our results demonstrate that a delay in intracellular pH recovery is essential for the cardioprotective effects of ischemic postconditioning. Prolongation of acidosis at the onset of reperfusion prevents calpain activation and this effect explains, at least in part, the cardioprotective effects of postconditioning. Finally, pharmacological inhibition of calpains exclusively during reperfusion protects the myocardium at risk in an in vivo rat experimental model, proving the potential of calpains as therapeutical targets aimed to reduce myocardial infarct size.In conclusion, the results presented in this thesis provides evidence of an important role of calpains in reperfusion injury and demonstrates that their inhibition is a potentially useful strategy to limit infarct size.

Ratolins transgènics que expressen interferó ß humà (hIFNß) exclusivament en les cèl·lules ß pancreàtiques (RIP/IFNß) presenten alteracions funcionals en els illots i són més susceptibles a desenvolupar insulitis. Amb la finalitat d'obtenir un nou model de diabetis tipus 1, s'han tractat aquests ratolins amb dosis molt baixes de streptozotocina (STZ) (15 i 20 mg/Kg) que no afecten als ratolins control. Ratolins transgènics que expressen IGF-I en les cèl·lules ß (RIP/IGF-I) mostren una recuperació de la massa de cèl·lula ß després del tractament amb STZ. Aquí també hem volgut estudiar si l'expressió local d'IGF-I pot contrarestar la diabetis autoimmune en els ratolins transgènics RIP/IFNß. Amb aquest objectiu s'han generat ratolins dobles transgènics (IFNß/IGF-I) que expressen IFNß i IGF-I en les cèl·lules ß pancreàtiques.Els ratolins transgènics RIP/IFNß mostren una lleugera infiltració dels illots pancreàtics. No obstant, aquests ratolins són normoglucèmics i normoinsulinèmics, es reprodueixen amb facilitat i mostren una bona viabilitat. Aquests ratolins però desenvolupaven una severa infiltració dels illots amb presència de cèl·lules T CD4+ i CD8+ després del tractament amb 15 o 20 mg/Kg de STZ . A més a més, presentaven una dràstica reducció de la massa de cèl·lula ß, probablement per mecanismes apoptòtics i com a conseqüència, mostraven un increment crònic de la glucèmia, hipoinsulinèmia i aparició de diabetis oberta. Per contra, el tractament amb aquestes dosis de STZ no induïa diabetis als ratolins control. Després del tractament amb STZ, l'expressió d'IGF-I en les cèl·lules ß contrarestava la insulitis en els ratolins dobles transgènics IFNß/IGF-I. Així mateix, aquests ratolins, després del tractament eren normoglucèmics, normoinsulinèmics i presentaven una recuperació tant del contingut pancreàtic d'insulina com de la massa de cèl·lula ß.Aquests resultats indiquen que els ratolins transgènics RIP/IFNß tractats amb dosis molt baixes de STZ poden ser un bon model animal de diabetis tipus 1, en el qual poder assajar noves teràpies per aquesta malaltia. A més a més, aquests estudis suggereixen que l'expressió local d'IGF-I pot protegir a la cèl·lula ß contra la resposta inflamatòria i prevenir la diabetis autoimmune. / Background and AimsTransgenic mice expressing human IFN-ß in ß-cells (RIP/hIFNß) show functional alterations in islets and increased susceptibility to develop insulitis. To obtain a new model of type 1 diabetes, the inflammatory effect of multiple very low doses of streptozotocin (STZ) (15 and 20 mg/Kg) were examined in these mice. Transgenic mice expressing IGF-I in ß cells recover ß-cell mass after STZ treatment. Here we also studied whether IGF-I expression may counteract autoimmune diabetes in IFN-ß expressing mice. To this end, double transgenic mice expressing both IFN-ß and IGF-I in ß cells were obtained.ResultsTransgenic mice expressing IFN-ß in ß cells showed mild infiltration of the pancreatic islets. Nevertheless, these mice were normoglycemic and normoinsulinemic and presented normal fertility and viability throughout adulthood. However, IFN-ß transgenic mice developed high lymphocytic infiltration of the islets, with presence of CD4+ and CD8+ T cells, when treated with 15 or 20 mg/Kg of STZ. These mice presented ß-cell destruction by apoptotic mechanisms and showed a chronic increase in glycemia and hypoinsulinemia. These STZ treatments did not induce diabetes in control mice. After STZ treatment, the expression of IGF-I in ß-cells of double transgenic mice IFNß/IGF-I counteracted insulitis. STZ-treated double transgenic mice were normoglycemic and normoinsulinemic and presented similar pancreatic insulin content and ß cell mass to control healthy mice.ConclusionsThese results indicate that transgenic mice expressing IFN-ß in ß cells treated with very low doses of STZ may be a new animal model of type 1 diabetes in which to assay new therapies. Furthermore, our studies suggest that local expression of IGF-I may protect ß cells against inflammatory responses and prevent autoimmune diabetes.