En la present tesi es desenvolupa una nova aproximació de teràpia gènica a fí de proporcionar un nou tractament per a la diabetis mellitus de tipus 1 que millori les teràpies actuals per aquesta malaltia. Aquesta nova aproximació es basa en la manipulació genètica del múscul esquelètic per tal d'oferir una producció constitutiva d'insulina, i incrementar la captació de glucosa per aquest teixit mitjançant l'expressió del enzim hepàtic glucoquinasa. Això es recolza en el fet que el múscul és el principal teixit responsable en l'eliminació de la glucosa després d'una ingesta, i que en diabetis la captació del sucre per aquest teixit és reduïda. A més a més ha estat prèviament demostrat que el múscul esquelètic presenta una elevada capacitat per a produir proteïnes terapèutiques de manera sistèmica, el qual permet obtenir uns nivells basals i fisiològics de la hormona. Per tal de desenvolupar aquesta aproximació, inicialment s'ha utilitzat un model dobletransgènic on l'expressió selectiva de la insulina i la glucoquinasa en cèl·lules musculars s'aconsegueix mitjançant l'utilització del promotor del gen de la cadena lleugera de la miosina. Cal fer palés que en condicions normals, els ratolins doble transgènics mostren una resposta més eficient davant canvis sobtats en la concentració de glucosa en sang. L'estudi realitzat en animals diabètics ha mostrat que la inducció de la malaltia mitjançant el tractament amb múltiples baixes dosis d'estreptozotocina produeix en els ratolins control el desenvolupament d'una diabetis aguda amb una marcada hiperglucèmia, mentre que en els ratolins doble transgènics l'expressió d'insulina i glucoquinasa contraresta l'aparició d'hiperglucèmia, sense induïr hipoglucèmia, i les alteracions associades amb la malaltia. Això indica que l'expressió d'insulina i de glucoquinasa pot constituir una nova aproximació de teràpia gènica per al tractament de la diabetis de tipus 1. A continuació, es va estudiar l'aplicació d'aquesta nova aproximació en ratolins diabètics mitjançant l'utilització d'estratègies de teràpia gènica (Electrotransferència). En aquest cas, es s'ha observat que després de la electrotransferència, la modificació genètica del 8% de la massa muscular dóna lloc a la normalització de la glucèmia, la recuperació dels nivells d'insulina circulants, així com un augment del metabolisme muscular i hepàtic de la glucosa, el qual contribueix a millorar l'estat general del animal. Per tant aquests resultats suggereixen que la manipulació genètica del múscul esquelètic per a produir insulina i incrementar la captació i la utilització de glucosa mitjançant l'expressió del enzim hepàtic glucoquinasa, pot esdevenir una teràpia alternativa als tractaments actuals per a la diabetis de tipus 1. / In this work we developed a new gene therapy approach for the treatment of type 1 diabetes. This approach is focused on the genetic manipulation of skeletal muscle to express insulin and glucokinase genes in order to obtain a constitutive production of the hormone and to increase the glucose uptake. As in type 1 diabetes the glucose uptake by muscle mass is reduced, this new approach seeks to increase the glucose uptake capacity in this disease. To develop this approach we use a double transgenic mouse model where the specific expression of insuline and glucokinase in the skeletal muscle were obtained driven under the control of miosine light chain promoter. The results showed that in the healthy conditions, the double transgenic mice has a normal oral glucose tolerance test. Furthermore, after treatment with multiple low dose of streptozotocine, control mice develop a severe diabetes with a high hiyperglycemia. In contrast, insuline and glucokinase expression in the double transgenic mice counteracted the hyperglycemia, without induce hypoglycemia and the alterations associated to diabetes. This results suggest that insuline and glucokinase expression could be a new gene therapy approach for the treathment of type 1 diabetes. Once obtained these results, we decided to carry out a novel gene transfer technique by using electrotransfer DNA in diabetic (non transgenic) mice. In this case, we observed that with just an 8% of skeletal muscle electrotroporated is sufficient to recover the normoglicemia, normoinsulinemia and restore the glucose metabolism of the skeletal muscle and liver, and the general health of this mice. Thus, all this results suggest that the manipulation of skeletal muscle to express insuline and to increase the glucose uptake by glucoquinase expression could be an alternative therapy for the diabetes type 1.

Les Metal·lotioneïnes (MTs) són unes metal·loproteïnes de baix pes molecular (60-100 aa) amb un elevat contingut en residus de cisteïna, les quals els confereixen la capacitat d'enllaçar metalls pesants. Ara bé, existeixen altres lligands tant proteics (histidines) com no proteics (sulfurs àcid-làbils i clorurs) que també poden participar en la coordinació metàl·lica. Si bé se les ha relacionat amb diferents funcions dins de l'organisme (detoxificació enfront de metalls pesants, homeòstasi de Zn i Cu, funcions antioxidants i antiapoptòtiques, etc), encara es treballa intensament per determinar la seva funcionalitat específica. Aquest fet ha dificultat la seva classificació, de manera que fins a l'actualitat se n'han fet diferents propostes. La més recent es centra en la preferència metàl·lica de les MTs envers els ions essencial Zn(II) i Cu(I). Aquests ions, amb comportaments coordinants clarament diferenciats, probablement determinen estructures diferents per als complexos M-MT, les quals, tenint en compte la relació estructura/funció, segurament porten a funcions diferenciades per a les anomenades Zn- i Cu-tioneïnes.Amb l'objectiu d'aprofundir en el coneixement actual d'aquestes proteïnes, en aquesta Tesi Doctoral s'han estudiat un elevat número de MTs de diversos organismes, tant d'animals (nematodes i mol·luscos) com de planta (alzina surera) i de llevat.Els treballs realitzats amb les metal·lotioneïnes CeMT1 i CeMT2 del nematode C.elegans han permès conèixer amb més detall el paper que juguen els aminoàcids histidina en la coordinació metàl·lica en les MTs i com aquests aminoàcids determinarien el caràcter de Zn-tioneïna d'una MT.Els treballs realitzats amb la MT de planta (QsMT de l'alzina surera Q.suber) han permès aprofundir en el coneixement actual sobre el paper dels lligands sulfur àcid-làbils en les MTs recombinants, observant-se que aquests lligands augmenten la capacitat coordinant de QsMT enfront el Cd(II). Per altra banda, gràcies a la purificació d'una MT nativa de llevat (Cup1) s'ha demostrat que els agregats metall-MT d'aquesta proteïna també contenen anions sulfurs àcid-làbils, de manera que aquests lligands es troben presents en les metal·lotioneïnes natives i per tant no són un artefacte de la síntesi recombinant a partir de cèl·lules de bacteri, tal i com alguns especialistes en el camp havien proposat.Un dels punts forts d'aquesta Tesi Doctoral ha estat l'estudi de la reactivitat de les MTs enfront els radicals reductors, on s'ha demostrat per primera vegada que els radicals reductors poden causar la desulfurització dels aminoàcids cisteïna i metionina de les MTs causant danys a les membranes cel·lulars.Per últim, gràcies a l'estudi d'un considerable nombre de MTs de diversos organismes, s'ha pogut refinar la classificació anterior de les MTs per part d'aquest grup de recerca en Zn-tioneïnes i Cu-tioneïnes, demostrant que existeix una gradació entre aquests dos grups, formant un grup amb característiques intermèdies que podrien comportar-se com a Cu- o Zn-tioneïnes depenent de les necessitats específiques de la cèl·lula. / Metallothioneins (MTs) are low molecular weight proteins (60-100 aa) with a high cysteine content (30% of the total amino acid content), which confers them the ability to bind heavy metal ions. As well as the Cys residues, other kind of proteic (histidines) and non-proteic (acid-labile sulfide and chloride) ligands exists in MTs that also could participate in metal coordination. Although they have been related to different functions in the organism (heavy metal detoxification processes, Zn and Cu homeostasis, antioxidant and antiapoptotic functions, etc), their physiological function is still a matter of debate and prompts most of the research within this field. This fact has difficulted their classification, and in consequence several models of classification have been proposed. The most recent one is based on the metallic preferences of the MTs towards the essential Zn(II) and Cu(I) ions. These ions clearly show different coordinative abilities and must, therefore, determine the formation of different M-MT structures. Thus, when considering the structural/function relationship, these differences in the structure of the M-MT complexes might determine different functions for the so-called Zn- and Cu-thioneins.Thus, and with the objective of increasing the actual knowledge about these proteins, the Zn(II), Cd(II) and Cu(I) coordinative abilities of a large number of MTs from different organisms, such as animals (nematode and mollusk), plants (cork oak) and yeast have been studied in this PhD.The work performed with CeMT1 and CeMT2 from the nematode C.elegans has shed light on the role played by the histidines in the metallic coordination in MTs and how these amino acids are responsible for determining the Zn-thionein nature of MTs.The work performed with the plant MT (QsMT, from the cork oak Q.suber) has allowed to increase the actual knowledge about the role of the acid-labile sulfide ligands in recombinant MTs, noticing that these ligands increase the coordinative abilities of QsMT when binding Cd(II).On the other hand, thanks to the purification of a native MT from yeast (Cup1), it has been demonstrated that the metal-MT complexes from this protein contains acid-labile sulfide anions, and therefore these ligands are also present in native metallothioneins, and therefore, they are not an artifact from the recombinant synthesis in bacteria cells, just as some specialists in the field proposed.One of the strong points of this Thesis has been the study of the MTs' reactivity against the reductive radicals, where it has been demonstrated by first time that this type of radical species could cause the desulfurization of the metionine and cysteine amino acids, causing damage to the cell membrane in turn.Finally, thanks to the study of a considerable number of MTs from different organisms, it has been possible to refine the MT classification previously presented by this group in Zn- or Cu-thioneins. Thus, it has been demonstrated that a gradation between these two extreme groups of MTs exists, which leads to a group of proteins with intermediate features that could behave as Cu-thioneins or Zn-thioneins depending on the specific requirements of cell.

En la actualidad no se ha descrito ningún procedimiento de medida de referencia para la medición de la concentración de masa de la isoenzima 2 de la creatina-quinasa, por lo que para la asignación de un valor de concentración de masa al material de referencia BCR 608 se siguió la siguiente estrategia: en la campaña de certificación se midió la concentración de masa del material mediante inmunoanálisis de distintas características, utilizando como calibrador una solución purificada de creatina-quinasa 2 a la que previamente se le había asignado un valor de concentración de proteína mediante el procedimiento de Doetsch, utilizando como calibrador el material de referencia SRM 927b con un valor de concentración de proteína certificado. La creatina-quinasa 2 se purificó a partir de músculo cardiaco humano. A la solución purificada se le asignó un valor de concentración de proteína por el procedimiento de Doetsch de 124,3 mg/L, diluyéndose hasta una concentración de 80,362 mg/L para poder ser utilizada como calibrador en los distintos inmunoanálisis. El valor certificado de concentración de masa de la creatina-quinasa 2 del material de referencia BCR 608 fue de 94,5 mg/L con una incertidumbre asociada de 9,6 mg/L. / This report describes the certification of a mass concentration value to the already prepared creatine kinase 2 reference material (BCR 608) with a catalytic concentration assigned value. At present, a mass creatine kinase 2 reference method have not been described. For this reason, we measured the BCR 608 mass concentration in different immunoassays using a creatine kinase 2 purified solution as a calibrator. Previously, the protein concentration of the creatine kinase 2 solution was measured by Doestch method using the reference material SRM 927b as calibrator. Creatine kinase 2 was purified from human heart. A protein concentration value of 124.30 mg/L was assigned to the solution of purified creatine kinase 2 by Doetsch method, and then this solution was diluted to obtain a liquid standard of known protein concentration (80.36 mg/L) to calibrate the immunoassays. The mass concentration of creatine kinase 2 in the BCR 608 reference material was certified to be 94.5 mg/L with an associated uncertainty of 9.6 mg/L.

Les metal·lotioneïnes (MTs) són unes metal·loproteïnes de baix pes molecular i un elevat contingut en residus de cisteïna que els confereixen una gran capacitat per coordinar i intercanviar ions metàl·lics pesants. A més dels residus de cisteïna, existeixen altres lligands no proteics, com els lligands sulfur àcid-làbils, que també poden participar en la coordinació metàl·lica. L’estudi de les capacitats coordinants de les MTs ha permès classificar-les segons la seva preferència metàl·lica en Zn-tioneïnes i Cu-tioneïnes, així com demostrar l’existència d’una gradació entre aquests dos tipus extrems de MTs, donant lloc a un conjunt de proteïnes amb característiques intermèdies que podrien comportar-se com Cu-tioneïnes o Zn-tioneïnes depenent de les necessitats específiques de la cèl·lula. En els mamífers es troben 4 isoformes de metal·lotioneïna (MT1, MT2, MT3 i MT4). Aquestes 4 isoformes tenen 20 cisteïnes conservades en la seva seqüència proteica, i s’accepta que al unir-se a metalls divalents formen una estructura en dos dominis, β i α, que uneixen 3 i 4 ions divalents respectivament. MT1 i MT4 ja han estat estudiades per el nostre equip de recerca i han estat classificades com a Zn-tioneïna i Cu-tioneïna respectivament, així com els seus dominis. Amb l’objectiu d’ampliar el coneixement actual d’aquestes proteïnes, en aquesta Tesi Doctoral s’ha estudiat la capacitat coordinant respecte als metalls zinc, cadmi i coure de les dues isoformes restants de MT de mamífer, MT2 i MT3. Aquest estudi té com objectiu diferenciar la preferència metàl·lica de MT2, comparant-la amb MT1 (considerades fins ara equivalents), determinar les característiques de coordinació metàl·lica de MT3 i relacionar-les amb la seva funció biològica i, finalment, integrar les MTs de mamífer en la classificació global de les metal·lotioneïnes. Per això, s’han sintetitzat mitjançant enginyeria genètica aquestes isoformes i els seus dominis per separat a partir de cultius bacterians suplementats amb Zn, Cd o Cu. Els complexos metàl·lics així obtinguts s’han caracteritzat químicament mitjançant tècniques espectroscòpiques i espectromètriques (ESI-MS, ICP-AES, CD i UV-Vis). Els treballs realitzats amb la isoforma MT2 de mamífer i els seus dos dominis han permès conèixer les diferències de preferència metàl·lica respecta a MT1. Així, mentre que MT1 ha estat classificada com una Zn-tioneïna, MT2 presenta certes característiques de Cu-tioneïna, amb un domini β clarament Cu-tioneïna i un domini α Zn-tioneïna, que situa la isoforma en una pla intermedi en la classificació de les MTs. S’ha demostrat la relació entre les diferencies de seqüència entre les isoformes MT1 i MT2 i les seves preferències de coordinació metàl·lica, per la qual cosa es proposa que siguin considerades separadament, i no de manera conjunta com s’ha fet tradicionalment. Per altra banda, MT3 és clarament una Cu-tioneïna, amb els dos dominis Cu-tioneïna. De fer, s’ha revelat com una MT de caràcter Cu-tioneïna més accentuat que la mateixa MT4. Finalment, en aquesta Tesi Doctoral, s’ha pogut establir definitivament la gradació de preferència metàl·lica de totes les MTs de mamífer des de Zn-tioneïna a Cu-tioneïna tal i com segueix: MT1 > MT2 > MT4 > MT3, per posteriorment incloure aquestes isoformes en la classificació global de les MTs. / Las metalotioneínas (MTs) son unas metaloproteínas de bajo peso molecular y un elevado contenido en residuos de cisteína que les confieren gran capacidad de coordinar e intercambiar iones metálicos pesados. Además de los residuos de cisteína existen otros ligandos no proteicos, como los ligandos sulfuro ácido-lábiles, que también pueden participar en la coordinación metálica. El estudio de las capacidades coordinantes de las MTs ha permitido clasificarlas según su preferencia metálica en Zn-tioneínas y Cu-tioneínas así como demostrar la existencia de una gradación entre estos dos tipos extremos de MTs, dando lugar a un conjunto de proteínas con características intermedias que podrían comportarse como Cu-tioneínas o Zn-tioneínas dependiendo de las necesidades específicas de la célula. En mamífero se encuentran 4 isoformas de metalotioneína (MT1, MT2, MT3 y MT4). Estas 4 isoformas tienen 20 cisteínas conservadas en su secuencia proteica y, se acepta que al unirse a metales divalentes forman una estructura en dos dominios, β y α, que unen 3 y 4 iones divalentes respectivamente. MT1 y MT4 ya han sido estudiadas por nuestro equipo de investigación y clasificadas como Zn-tioneína y Cu-tioneína respectivamente, así como sus dominios. Con el objetivo de ampliar el conocimiento actual sobre estas proteínas, en esta Tesis Doctoral se ha estudiado la capacidad coordinante respecto a los metales zinc, cadmio y cobre de las dos isoformas restantes de MT de mamífero, MT2 y MT3. Este estudio tiene como objetivo diferenciar la preferencia metálica de MT2, comparándola con MT1 (consideradas hasta el momento como equivalentes), determinar las características de coordinación de MT3 y relacionarlas con su función biológica y, finalmente, integrar las MTs de mamífero en la clasificación global de las metalotioneínas. Para ello, se han sintetizado mediante ingeniería genética estas isoformas y sus dominios por separado a partir de cultivos bacterianos suplementados con Zn, Cd o Cu. Los complejos metálicos así obtenidos, se han caracterizado químicamente mediante técnicas espectroscópicas y espectrométricas (ESI-MS, ICP-AES, CD y UV-Vis). Los trabajos realizados con la isoforma MT2 de mamífero y sus dos dominios han permitido conocer las diferencias de preferencia metálica respecto a MT1. Así pues, mientras MT1 se había clasificado como Zn-tioneína, MT2 exhibe ciertas características de Cu-tioneína, con un dominio β claramente Cu-tioneína y un dominio α Zn-tioneína, que sitúan la isoforma en un plano intermedio en la clasificación de las MTs. Se ha demostrado la relación entre las diferencias de secuencia entre las isoformas MT1 y MT2 y sus preferencias de coordinación metálica, por lo que se propone la consideración separada de estas dos isoformas, y no conjunta como se ha hecho tradicionalmente. Por otra parte, MT3 es claramente una Cu-tioneína, con ambos dominios Cu-tioneína. De hecho se ha revelado como una MT de carácter Cu-tioneína más acentuado que la propia MT4. Finalmente, en esta Tesis Doctoral, se ha podido establecer definitivamente la gradación de preferencia metálica de todas las MTs de mamífero desde Zn-tioneína a Cu-tioneína como sigue: MT1 > MT2 > MT4 > MT3, para posteriormente incluir las isoformas en la clasificación global de las MTs. / Metallothioneins (MTs) are low molecular weight proteins with a high cysteine content, which confers them the ability to bind heavy metal ions. As well as the Cys residues, other kind of non-proteic ligands (such as acid labile sulfide) exist in MTs that also could participate in metal coordination. The study of the MT’s coordinative abilities has allowed classifying them following their metallic preferences as Zn- and Cu-thioneins, and to demonstrate the existence of a gradation between these two extreme MT’s types. These proteins with intermediate features could thus behave as Cu-thionein or Zn-thionein depending on the specific requirements of cell. In mammals, 4 isoforms of MT were found (MT1, MT2, MT3 and MT4). These 4 isoforms show 20 preserved Cys, and it’s accepted that in the union with divalent metals, they form a 2-domain structure (β and α) with 3 and 4 divalent ions, respectively. Our research team has already studied MT1 and MT4 and their domains, and classified them as Zn-thionein and Cu-thionein, respectively. With the objective of increasing the actual knowledge about these proteins, the Zn(II), Cd(II) and Cu(I) coordinative abilities of the 2 other mammal’s MT isoforms, MT2 and MT3 were studied. The goal of this PhD was to differentiate the metallic preferences of MT2 and MT1 (which were formerly considered as equal), to determinate the metallic coordinative characteristics of MT3 with respect to their biological function and finally, to integrate the mammal’s MT into the global MT classification. Using genetic engineering, these isoforms and their individual domains were synthetized from bacterial cultures in presence of Zn, Cd or Cu. The metal complex was chemically characterized using spectroscopy and spectrometry technics (ESI-MS, ICP-AES, CD i UV-Vis). These experiments showed different metallic preferences between MT2 and MT1. MT1 was identified as a Zn-thionein, whereas MT2 displays some characteristics of Cu-thioneins. The β domain of MT2 is a Cu-thionein and the α domain is a Zn-thionein, classifying MT2 as an intermediate MT into the global MT classification. The relationship between the sequence differences of MT1 and MT2, and their metallic coordinative preferences were demonstrated. These results suggest that MT1 and MT2 should be considered separately and not together as it was traditionally studied. On the other hand, MT3 is clearly a Cu-thionein, with 2 Cu-thionein domains, with a stronger Cu-thionein characteristic than MT4. Finally, this work has determined a gradation of metallic preferences of all mammal’s MTs, from Zn-thionein to Cu-thionein, as follow: MT1 > MT2 > MT4 > MT3. These isoforms were included into the global MT classification.

Irosustat is a first-generation, irreversible, steroid sulfatase inhibitor currently in development for hormone-dependent cancer therapy. Its structure is a tricyclic coumarin-based sulfamate that undergoes desulfamoylation in aqueous solution, yielding the sulfamoyl-free derivative, 667-coumarin. The first aim of the present work was to study the in vitro metabolism of irosustat, including its metabolic profile in liver microsomes and hepatocytes, the potential species differences, and the identification of the main metabolites. And the second aim of the present work was to predict potential drug-drug interactions between irosustat and possible concomitantly administered medications through the investigation in vitro of the enzymes participating in the metabolism of irosustat and its inhibition/induction potential with the main drug-metabolizing enzymes. The interaction of aromatase inhibitors in the in vitro metabolism of irosustat was also studied. Irosustat was extensively metabolized in vitro, showing similar metabolite profiles among rat, dog, monkey, and humans (both sexes). In liver microsomes, the dog was the species that metabolized irosustat most similarly to metabolism in humans. Marked differences were found between liver microsomes and hepatocytes, meaning that phase I and phase II enzymes contribute to irosustat metabolism. Various monohydroxylated metabolites of irosustat and of 667-coumarin were found in liver microsomes, which mostly involved hydroxylations at the C8, C10, and C12 positions in the cycloheptane ring moiety. 667-Coumarin was formed by degradation but also by non-NADPH-dependent enzymatic hydrolysis, probably catalyzed by microsomal steroid sulfatase. The main metabolites formed by hepatocytes were glucuronide and sulfate conjugates of 667-coumarin and of some of its monohydroxylated metabolites. The major cytochrome P450 enzymes involved in the transformation of irosustat were CYP2C8, CYP2C9, CYP3A4/5, and CYP2E1. Moreover, various phase II enzymes (UDP-glucuronosyltransferases and sulfotransferases) were capable of conjugating many of the metabolites of irosustat and 667-coumarin; however, the clinically relevant isoforms could not be elucidated. Irosustat inhibited CYP1A2 activity in human liver microsomes through the formation of its desulfamoylated degradation product and metabolite 667-coumarin. CYP1A2 inhibition by 667-coumarin was competitive, with a K(i) of 0.77 μM, a concentration exceeding by only 5-fold the maximal steady-state concentration of 667-coumarin in human plasma with the recommended dose of irosustat. In addition, 667-coumarin metabolites enhanced the inhibition of CYP1A2 activity. Additional clinical interaction studies of irosustat with CYP1A2 substrate drugs are strongly recommended. 667-Coumarin also appeared to be a competitive inhibitor of CYP2C19 (K(i) = 5.8 μM) in human liver microsomes, and this inhibition increased with assessment in human hepatocytes. Inhibition of CYP2C19 enzyme activity was not caused by repression of CYP2C19 gene expression. Therefore, additional mechanistic experiments or follow-up studies with clinical evaluation are recommended. Irosustat neither inhibited CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4/5, or UDP-glucuronosyltransferase 1A1, 1A4, or 2B7 activities nor induced CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, or CYP3A4/5 at clinically relevant concentrations. Results from human liver microsomes indicated that no changes in irosustat pharmacokinetics in vivo are expected as a result of inhibition of irosustat metabolism in cases of concomitant medication administration or irosustat-aromatase inhibitor combination therapy with letrozole, anastrozole, or exemestane. / Irosustat és un inhibidor irreversible de la sulfatasa esteroidal, de primera generació, actualment en desenvolupament per al tractament del càncer dependent d'hormones. Els objectius d'aquest treball van ser estudiar el metabolisme in vitro d'irosustat, incloent el seu perfil metabòlic en microsomes hepàtics i hepatòcits, les diferències entre espècies, així com la identificació dels principals metabòlits. I també predir les possibles interaccions fàrmac-fàrmac entre irosustat i possibles medicaments administrats de forma concomitant, a través de la investigació in vitro dels enzims que participen en el metabolisme de irosustat i el seu potencial d'inhibició / inducció dels principals enzims metabolitzants de fàrmacs. La interacció dels inhibidors de l'aromatasa en el metabolisme in vitro del irosustat també es va estudiar. Irosustat és extensament metabolitzat in vitro, mostrant perfils metabòlics similars entre rates, gossos, micos i humans (ambdós sexes). En microsomes de fetge, el gos va ser l'espècie que metabolitza irosustat de forma més similar al metabolisme en humans. 667-coumarin es va formar per degradació, però també per hidròlisi enzimàtica no dependent de NADPH, probablement catalitzada per la sulfatasa esteroidal microsomal. Es van trobar grans diferències entre els perfils metabòlics de microsomes hepàtics i de hepatòcits, significant que tant enzims de fase I com de fase II contribueixen al metabolisme del irosustat. Els principals metabòlits formats pels microsomes de fetge van ser monohidroxilats del irosustat i de la 667-coumarin, mentres que en hepatòcits van ser conjugats glucurònids i sulfats de 667-coumarin i d'alguns dels seus metabòlits monohidroxilats. Els principals enzims del citocrom P450 involucrats en la transformació del irosustat van ser CYP2C8, CYP2C9, CYP3A4/5, i CYP2E1. D'altra banda, diversos enzims de fase II (UDP-glucuronosiltransferasas i sulfotransferasas) eren capaços de conjugar molts dels metabòlits de irosustat i 667-coumarin, però, les isoformes clínicament rellevants no es van poden dilucidar. Irosustat inhibeix les activitats dels CYP1A2 i CYP2C19 en microsomes de fetge humà a través de la formació de 667-coumarin. Es recomanen estudis clínics addicionals d'interacció entre irosustat i substrats del CYP1A2. Pel CYP2C19, aquesta inhibició va augmentar amb l'avaluació en hepatòcits humans, tot i que no va ser causada per la repressió de l'expressió del gen CYP2C19. Per tant, es recomanen experiments mecanistics addicionals o estudis de seguiment amb avaluació clínica. Irosustat no inhibeix CYP2A6, CYP2B6, CYP2C8, CYP2C9, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4/5, UGT1A1, UGT1A4 ni UGT2B7. Tampoc indueix CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19 o CYP3A4/5, a concentracions clínicament rellevants. Els resultats dels microsomes hepàtics humans van indicar que no s'espera canvis en la farmacocinètica del irosustat com a resultat de la inhibició del seu metabolisme en els casos d'administració concomitant d’inhibidors de l’aromatase: letrozole, anastrozole, o exemestane.

Tesi realitzada al Centre de Recerca en Agrigenòmica (CRAG) / En esta tesis se describen los resultados obtenidos en la clonación y caracterización de una nueva transglutaminasa (TGasa) vegetal aislada en arroz (Oryza sativa), la segunda transglutaminasa clonada en plantas y la primera en plantas C3. Las TGasas (E.C.2.3.2.13) son una familia de enzimas que promueven modificaciones postraduccionales de proteínas. Tienen especial importancia debido a sus implicaciones en enfermedades humanas y a sus aplicaciones biotecnológicas de interés industrial. Su investigación en plantas es aún incipiente y hasta la fecha, solo se ha clonado la TGasa cloroplástica de maíz (TGZ), a partir de una librería de ADN copia (ADNc) de plántulas de maíz. El aislamiento de la nueva transglutaminasa de arroz, descrita en esta tesis, se ha realizado a partir de ADNc y genómico. Utilizando cebadores diferenciales se realizó la clonación del gen (tgo), su inserción en un vector de expresión y su caracterización. Los análisis de la secuencia de tgo han permitido deducir que este nuevo gen está constituido por una secuencia de 1605 pb y que codifica para una proteína (TGO) de 352 aminoácidos. El análisis de la secuencia de TGO ha permitido detectar diferentes dominios relacionados con la actividad TGasa, como son la triada catalítica (Cys-His-Asp), secuencias repetidas en tándem y varios sitios de N-miristoilación. Además, otros dominios detectados, como los leucine-zipper, no eran conocidos en TGasas vegetales. La expresión de la proteína TGO en E. coli ha permitido realizar la caracterización de la enzima con respecto a diferentes parámetros. Así, mediante ensayos de actividad se ha podido confirmar la preferencia de la enzima frente a diferentes sustratos, así como su dependencia de calcio y la inhibición de su actividad frente a conocidos inhibidores de la actividad TGasa. Igualmente, la enzima fue capaz de polimerizar un sustrato in vitro y se comprobó su dependencia de la luz utilizando proteínas tilacoidales como sustrato. Éstas y otras características relevantes han permitido identificar a esta enzima como una verdadera TGasa. Finalmente, ensayos realizados con plantas de arroz para determinar su localización subcelular, así como su relación con proteínas implicadas en la fotosíntesis y su dependencia de la luz, llevan a sugerir que las funciones de TGO están asociadas a procesos fotosintéticos, probablemente relacionados con fotoprotección, al igual que ya se había descrito para la TGasa de maíz, aunque no se descartan otras funciones relacionadas. / This thesis presents the results of cloning and characterization of a novel transglutaminase (TGase) from rice (Oryza sativa). This is the second transglutaminase cloned in plants and the first in C3 plants . TGases (EC2.3.2.13) are a family of enzymes that promote protein post-translational modifications. These enzymes are of particular importance because of their implication in human diseases and their biotechnological applications of industrial interest. Research on plant TGases is still incipient. To date, maize chloroplast TGase (TGZ) cloned from a DNA library is the only cloned TGase. The isolation of a new rice transglutaminase (TGO), described in this thesis, was performed using differential primers designed from both genomic and copy DNA, which has allowed the cloning of the gene (tgo), its insertion into an expression vector, and further characterization. Analysis of both the gene and protein sequences shows that this new gene is comprised of 1605 bp and encodes for a protein (TGO) of 352 amino acids. During sequence analysis different domains associated with TGase activity, such as a catalytic triad (Cys-His-Asp), tandem repeat sequences, and several N-myristoylation sites, were identified. Additionally, other domains not previously reported in plant TGases, such as a leucine-zipper domain, were observed. TGO protein expression in E. coli, allows enzyme characterization with respect to different parameters. Thus, the enzyme preference for different substrates, as well as calcium dependence and activity inhibition in the presence of known TGase inhibitors, was confirmed by these activity assays. The enzyme was able to polymerize in vitro a substrate and was also tested for light dependence using thylakoid proteins as substrate. All of these and other relevant TGO characteristics allowed the identification of this enzyme as a true TGase. Finally, studies with rice plants to determine TGO subcellular localization, as well as its relation to photosynthesis-involved proteins and light dependence, suggested that TGO functionality is associated with photosynthetic processes, probably related to photoprotection, which has already been described for maize TGase. In addition to photoprotection there are possibly additional functions that cannot be excluded.

En esta tesis doctoral se analiza el papel del estrés oxidativo en el transporte iónico en distintos modelos, mediante técnicas de imagen y de electrofisiología. El trabajo se subdivide en cuatro capítulos. El primero, a modo de marco teórico, introduce el transporte iónico en condiciones de estrés oxidativo. La interacción entre especies reactivas de oxígeno (ROS) y el transporte iónico ha sido poco estudiada hasta el momento, por lo que los principales objetivos de la tesis se han centrado en el estudio del transporte iónico en condiciones de estrés oxidativo en diferentes modelos, con la finalidad de contribuir a un mejor conocimiento de los mecanismos subyacentes a la regulación del transporte iónico por parte de estas ROS. En el segundo capítulo se analizan diferencias entre fuentes primarias y secundarias (salinidad) de estrés oxidativo sobre la homeostasis de potasio en dos especies halófitas, Chenopodium quinoa and Atriplex lentiformis. En el tercero el modelo empleado es Arabidopsis thaliana y diferentes mutantes con pérdida/ganancia de función en relación a su capacidad de transportar cobre. El capítulo se centra en la generación de radicales hidroxilo, una ROS altamente tóxica, a partir del cobre, y en su implicación en la regulación de canales iónicos de calcio y potasio. Por último, en el capítulo cuarto, se introduce la activación de los canales de calcio de tipo anexina (Anexina 1 de Arabidopsis y anexina 5 humana) en condiciones de estrés oxidativo. / In this PhD Thesis, a range of electrophysiological and imaging techniques are applied in different models in order to get a better understanding of oxidative stress-induced ion transport. The work is subdivided in 4 chapters. In the first one, ion transport under oxidative stress conditions are reviewed. Taking into account this potential, but still not well characterized interaction between reactive oxygen species (ROS) signalling and ion channel activity, the objectives of this Ph. D. Thesis were to study the influence of oxidative stress on ion transport in different models, in order to contribute to a better knowledge of the mechanisms underlying the possible role of ROS in ion transport regulation. The second chapter analyses differences between salinity-induced oxidative stress and primary oxidative sources in the disturbance of potassium homeostasis in two halophytes, Chenopodium quinoa and Atriplex lentiformis. For the third chapter, seedlings of the plant model Arabidopsis thaliana differing in their ability of copper transport were used. The chapter focuses on copper-induced hydroxyl radical, a highly toxic reactive oxygen species, and its implications on calcium and potassium homeostasis. The last chapter refers to the activation of annexin-type calcium channels (Arabidopsis thaliana annexin 1 and human annexin V) under oxidative stress conditions.

La composición de la matriz extracelular (MEC) determina algunos aspectos cruciales del comportamiento tumoral. Entre sus componentes destacan glicoproteínas y proteoglicanos (PGs), algunos de los cuales tienen receptores en la membrana celular. Nuestro grupo de investigación está interesado en la biología de los PGs en el melanoma humano. El VS es un PG de matriz de la familia de los hialectanos. Está formado por tres dominios: G1, G2 y G3. El splicing alternativo del dominio central G2 genera cuatro isoformas denominadas V0, V1, V2 y V3. En células de melanoma humano se ha descrito la expresión de proteoglicanos como el proteoglicano específico de melanoma (mel-PG), CD44 o versicano (VS), cuya presencia fue descrita en nuestro laboratorio. Asimismo, describimos su capacidad para incrementar la proliferación y migración en células de melanoma humano, además de disminuir su adhesión. En la primera parte de este trabajo determinamos el patrón de expresión de las isoformas de VS y de mel-PG durante el proceso de desdiferenciación de las células de melanoma, utilizando líneas celulares con diferentes grados de diferenciación (temprano, intermedio y tardío). Nuestros resultados muestran que el grado de diferenciación de las células determina la expresión diferencial de VS y mel-PG, de tal forma que las líneas celulares más indiferenciadas expresan todas las isoformas de versicano y las más diferenciadas ninguna de ellas. De ello concluimos que la pérdida del estado diferenciado se acompaña de la expresión de las diferentes isoformas de VS, hecho que parece ser común en tumores derivados de células con mismo origen embrionario, como muestran nuestros análisis preliminares realizados en células de neuroblastoma y astrocitoma. Durante el proceso de diferenciación in vitro de las líneas celulares SK-mel-1.36-1-5 y SK¬mel-3.44 estos PGs desaparecen, por lo que proponemos que la producción de versicano es señal de regresión a un estado no diferenciado durante la progresión tumoral, y que existe un patrón temporal para la expresión de cada isoforma de versicano. En la segunda parte analizamos la regulación del promotor de VS en líneas celulares de melanoma humano con grados de diferenciación temprano y tardío. Aislamos, secuenciamos y clonamos el promotor de VS humano. El análisis in silico del mismo determinó tres regiones de regulación: la primera en el extremo 5', presenta dos cajas de reconocimiento para TCF-4; la segunda en la zona central, 6 cajas de unión para Sp1, 7 para AP¬2 y una para Smad3/4; y la tercera en el extremo 3', una caja de unión para AP-1. Construimos diversos mutantes de deleción diseñados para aislar el papel de cada uno de los elementos reguladores del promotor de VS y los transfectamos de manera transiente en las líneas celulares. Los resultados muestran que TCF-4 es un activador responsable de más del 50% de la actividad total de este promotor, ya que la sobrexpresión de algunos de los participantes de la vía de señalización de TCF-4 tiene un efecto directo sobre la actividad del mismo. Además, mediante ensayos de EMSA determinamos la unión específica del complejo TCF-4/?-catenina. En la región central reside aproximadamente el 10% de la actividad total del promotor y hemos determinado la unión específica a 3 de los posibles sitios de unión para Sp1. Planteamos por tanto, que Sp1 es un modulador o quizás regulador de respuesta rápida de VS. Por último, en la región 3' del promotor, que contiene la secuencia de reconocimiento para AP-1, se encuentra el 40% restante de la actividad y hemos determinado que dicha secuencia es la responsable de la actividad basal de VS. / Extracellular matrix composition is crucial for some aspects of tumor behavior. Among its constituent factors, glycoproteins and proteoglycans play very important roles (some of which even having cell membrane receptors). Our research group is interested on proteoglycan biology in human melanoma. Versican is an extracellular matrix proteoglycan. It is a member of the hyalectan family and has three domains called G1, G2 and G3. The G2 central domain undergoes alternative splicing to generate four isoforms known as V0, V1, V2 and V3. The presence of proteoglycans such as the melanoma specific proteoglycan (mel- PG), CD44 or versican (VS), has been described in human melanoma cells. In our laboratory we have described VS presence in human melanoma cells and have showed how it increases cell migration and proliferation and how it diminishes cellular adhesion. In this work we first determined the expression pattern for both the four versican isoforms and mel- PG during melanoma cells desdifferentiation process. We used cell lines under early, intermediate and late differentiation degrees. Our results show that there is a close correlation between cell differentiation and either versican or mel-PG expression, in such a way that undifferentiated cells express all VS isoforms whereas the more differentiated express none. From this we concluded that the loss of a differentiated state is often accompanied by the expression of VS isoforms: our preliminary results using neuroblastoma and astrocytoma cells show that this might be a common fact among tumors originating from cells having the same embryonic origin. During in vitro differentiation, SK-mel-1.36-1-5 and SK-mel-3.44 cell lines loose these proteoglycans. For this reason we propose that versican production signals the regression to an undifferentiated state during tumor progression, and that there is a temporal pattern for the expression of each versican isoform. In this work we also analyzed versican promoter regulation in human melanoma cell lines under early and late differentatiation. We isolated, sequenced and cloned VS human promoter. Its in silico analysis showed that there are three regulation zones: 1) at the 5' end there are two recognition boxes for TCF-4. 2) In the central zone there are six binding boxes for Sp1, 7 for AP-2 and one for Smad3/4. 3) Finally, at the 3' end there is a binding box for AP-1. We also constructed several deletion mutants designed to study the role of each these regulating elements in the VS promoter. These were transiently transfected into the cell lines. Our results show that TCF-4 is responsible for more than 50% of the promoter's total activity as seen by the overexpression of some of the participants in the TCF-4 signaling pathway. Furthermore, through EMSA analysis we determined the specific union of the TCF-4/?-cathenine complex. The central region counts for roughly 10% of the promoter's total activity where we have determined the specific union for three of the possible Sp1 binding sites. For this reason, we postulate that Sp1 is a VS fast response regulator. Finally, the 3' region is responsible for the remaining 40% of promoter activity and we have determined that it is responsible for versican's basal activity.

El versicano es un proteoglicano de matriz extracelular cuyas isoformas grandes (V0 y V1) han demostrado participar en la regulación de procesos como la proliferación, adhesión y migración celular. Su expresión se ha encontrado en diferentes tipos de células tumorales, entre ellos el melanoma. Anteriormente se describió que la expresión de la isoforma pequeña de versicano (V3) en dos líneas celulares de melanoma humano (una que expresa las isoformas grandes de versicano de forma endógena y otra que no expresa ninguna isoforma) provoca una reversión del fenotipo maligno. En el caso de las células que expresan versicano de forma endógena, este efecto del versicano V3 se explicó por una competencia con dichas isoformas, mientras que en el caso de la línea que no expresa versicano la acción de V3 iría mediada a través de una interacción con el receptor de ácido hialurónico CD44. La finalidad de este trabajo ha sido confirmar estas hipótesis mediante el silenciamiento por RNA de interferencia de la expresión de CD44 y versicano en estas líneas. Los resultados confirman que la mayor parte de los efectos del versicano V3 tienen lugar a través de los mecanismos propuestos.

El benestar animal és un problema de gran importància en el món de la ramaderia actual a causa de la seva relació amb la seguretat i qualitat alimentària, amb implicacions legislatives i econòmiques. No obstant, els criteris actuals per avaluar el grau de benestar d’un animal encara estan lluny de ser suficientment objectius i específics. El descobriment de nous marcadors o d'un perfil de marcadors relacionats amb el benestar permetria millorar la prevenció i el tractament de les malalties, i optimitzar el maneig i la productivitat dels animals de granja. L'objectiu principal d'aquesta tesi ha estat la cerca de biomarcadors plasmàtics de benestar en tres situacions a les que estan exposats habitualment els porcs durant la seva etapa productiva a les granges d'explotació porcina: l'elevada densitat d'estabulació, l'allotjament en gàbies individuals amb fins reproductius (pràctica prohibida a Espanya des del gener de 2013) i la infecció pel circovirus porcí 2 (PCV2). A conseqüència de la innovació i el desenvolupament de les tecnologies -òmiques, que permeten fer un anàlisi massiu de les molècules presents en una cèl·lula, teixit o fluid en un moment determinat, la cerca de nous biomarcadors ha pres un fort impuls i s’ha convertit en un dels objectius de més interés per als investigadors. El suport bibliogràfic i l'anàlisi diferencial mitjançant 2-DE DIGE i iTRAQ del proteoma sanguini dels animals sotmesos a les dues primeres situacions de pobre benestar ha permès proposar un perfil de benestar porcí de laboratori basat en la quantificació de: 1) cortisol en sèrum i saliva; 2) paràmetres relacionats amb el metabolisme dels lípids (colesterol i les seves partícules transportadores, àcids grassos i triglicèrids); 3) indicadors de l'estat de salut de l'animal (marcadors musculars, hepàtics, renals i immunoglobulines); 4) proteïnes de fase aguda (haptoglobina, Pig-MAP i apolipoproteïna A-I) i altres components del sistema immune innat (pèptids antimicrobians); 5) marcadors d'estrès oxidatiu (glutatió peroxidasa, superòxid dismutasa, glutatió total, peroxiredoxina 2 i grups carbonil de les proteïnes oxidades), 6) proteïnes estructurals del citosquelet; i 7) proteïnes de xoc tèrmic. A més, s'han caracteritzat estructuralment les isoformes proteiques de l'haptoglobina i l'apolipoproteïna A-I mitjançant espectrometria de masses en tàndem. Per una banda, es van detectar cadenes glucídiques de tipus N- i O- a les quatres isoformes principals de la cadena β de l'haptoglobina, mentre que les tres isoformes de l'apolipoproteïna A-I estaven oxidades. Així mateix, es va observar un comportament diferent entre les tres isoformes de l'apolipoproteïna A-I en els porcs infectats pel virus PCV2: la isoforma que correspon a la preproteïna va augmentar i les altres dos van disminuir. En canvi, la freqüència relativa de les isoformes de la cadena β i α de l'haptoglobina no va variar. Per una altra banda, s'ha iniciat la posta a punt d'una tècnica quantitativa basada en espectrometria de masses, el SRM, per a la mesura d'algunes proteïnes de fase aguda porcines com ara l'haptoglobina, la Pig-MAP, l'apolipoproteïna A-I i la glicoproteïna α2-Heremans Schmid. Aquesta tecnologia s’està erigint com una bona alternativa a l’ús dels reactius comercials, que no solen presentar reactivitat contra les proteïnes d'origen porcí. / El bienestar animal es un problema de gran importancia en el mundo de la ganadería actual debido a su relación con la seguridad y calidad alimentaria, con implicaciones legislativas y económicas. Sin embargo, los criterios actuales para evaluar el grado de bienestar aún están lejos de ser lo suficientemente objetivos y específicos. El descubrimiento de nuevos marcadores o de un perfil de marcadores relacionados con el bienestar permitiría mejorar la prevención y el tratamiento de las enfermedades, y optimizar el manejo y la productividad de los animales de granja. El objetivo principal de esta tesis ha sido la búsqueda de biomarcadores plasmáticos de bienestar en tres situaciones a las que están expuestos habitualmente los cerdos durante su etapa productiva en las granjas de explotación porcina: la elevada densidad de estabulación, el alojamiento en jaulas individuales con fines reproductivos (práctica prohibida en España desde enero del 2013) y la infección por el circovirus porcino 2 (PCV2). A consecuencia de la innovación y el desarrollo de las tecnologías –ómicas, que permiten realizar un análisis masivo de las moléculas presentes en una célula, tejido o fluido en un momento determinado, la búsqueda de nuevos biomarcadores ha tomado un fuerte impulso y se ha convertido en uno de los objetivos de mayor interés para los investigadores. El soporte bibliográfico y el análisis diferencial mediante 2-DE DIGE e iTRAQ del proteoma sanguíneo de los animales sometidos a las dos primeras situaciones de pobre bienestar ha permitido proponer un perfil de bienestar porcino de laboratorio basado en la cuantificación de: 1) cortisol en suero y saliva; 2) parámetros relacionados con el metabolismo de los lípidos (colesterol y sus partículas transportadoras, ácidos grasos y triglicéridos); 3) indicadores del estado de salud del animal (marcadores musculares, hepáticos, renales e inmunoglobulinas); 4) proteínas de fase aguda (haptoglobina, Pig-MAP y apolipoproteína A-I) y otros componentes del sistema inmune innato (péptidos antimicrobianos); 5) marcadores de estrés oxidativo (glutatión peroxidasa, superóxido dismutasa, glutatión total, peroxiredoxina 2 y grupos carbonilo de las proteínas oxidadas), 6) proteínas estructurales del citosqueleto; y 7) proteínas de choque térmico. Además, se han caracterizado estructuralmente las isoformas proteicas de la haptoglobina y la apolipoproteína A-I mediante espectrometría de masas en tándem. Por un lado, se detectaron cadenas glucídicas de tipo N- y O- en las cuatro isoformas principales de la cadena β de la haptoglobina, mientras que las tres isoformas de la apolipoproteína A-I estaban oxidadas. Asimismo, se observó un comportamiento diferente entre las tres isoformas de la apolipoproteína A-I en los cerdos infectados por el virus PCV2: la isoforma que corresponde a la preproteína aumentó y las otras dos disminuyeron. En cambio, la frecuencia relativa de las isoformas de la cadena β y α de la haptoglobina no variaron. Por otro lado, se ha iniciado la puesta a punto de una técnica cuantitativa basada en espectrometría de masas, el SRM, para la determinación de algunas proteínas de fase aguda porcinas como la haptoglobina, la Pig-MAP, la apolipoproteína A-I y la glicoproteína α2-Heremans Schmid. Esta tecnología se está erigiendo como una buena alternativa al uso de reactivos comerciales, que no suelen presentar reactividad contra las proteínas de origen porcino. / Animal welfare is an issue of great importance due to its relationship with food safety and quality, and its legislative, economic, ethical and public opinion implications. However, the current criteria for assessing the degree of animal welfare are still far from being sufficiently objective and specific. The discovery of new markers or combination of markers associated to welfare would improve the prevention and treatment of diseases, and optimize the management and productivity of farm animals. The main aim of this thesis was the search for new serum biomarkers in three common situations in the pig farm which adversely affect the well-being of the animals: the high density housing, the accommodation in individual cages for breeding purposes (practice banned in Spain since January 2013) and the infection with porcine's circovirus 2 (PCV2). As a result of the innovation and development of the -omics technologies, which allow a massive analysis of the molecules present in a cell, tissue or fluid at a given time, the search for new biomarkers has taken a strong run and has become one of the most common goals among researchers. Bibliographical support and experimental analysis of differential serum proteome of animals subjected to these two first situations of poor welfare with 2-DE DIGE and iTRAQ has led to propose a profile of laboratory-based parameters based on 1) cortisol in serum and saliva; 2) lipid metabolism parameters (cholesterol and its transporting particles, fatty acids and triglycerides), 3) indicators of the health of the animal (muscle, liver and kidney markers and immunoglobulins), 4) acute phase proteins (haptoglobin, Pig-MAP and apolipoprotein AI) and other components of the innate immune system (antimicrobial peptides), 5) oxidative stress markers (glutathione peroxidase and total glutathione, superoxide dismutase, peroxiredoxin 2 and carbonyl groups of the oxidized proteins) 6) filamentous cytoskeletal proteins; and 7) heat shock proteins. Moreover, we characterized the haptoglobin and apolipoprotein A-I protein isoforms with tandem mass spectrometry. On one hand, we detected N- and O-glycan chains in the four main isoforms of the haptoglobin β chain, while the three isoforms of apolipoprotein A-I were oxidized. Furthermore, we observed a different behaviour between the three isoforms of apolipoprotein A-I in pigs infected with PCV2: the isoform corresponding to the preprotein increased and whereas the other two decreased. However, the relative frequency of the β and α chain haptoglobin isoforms did not change. On the other hand, we optimized a quantitative method based on mass spectrometry to measure several acute phase proteins as haptoglobin, Pig-MAP, apolipoprotein A-I and α2-Heremans Schmid glycoprotein. SRM is being set up as a good alternative to the use of commercial reagents, which many times have a poor reactivity against proteins of porcine origin.