All clinically relevant Enterobacteriaceae strains isolated between 1994 and 1996 without inducible chromosomal b-lactamase, that showed decreased susceptibility to broad-spectrum cephalosporins and/or aztreonam, were selected. The mechanism implicated in the decreased susceptibility was determined by analytical isoelectric focusing, PCR and/or sequenciation. The results obtained showed that the most frequent mechanism implicated in the decreased susceptibility to broad-spectrum cephalosporins and/or aztreonam in E. coli and K. oxytoca was the hyperproduction of the chromosomal b-lactamase, followed by the SHV-1 hyperproduction in E. coli and K. pneumoniae. In our hospital, the incidence of plasmid-mediated extended-spectrum b-lactamases (ESBLs) between 1994 and 1996 was low (0.14%). The b-lactamase that couldn't be identified by the techniques previously described, was characterised by conjugation studies, clonation, and sequenciation experiments, allowing us to describe a new b-lactamase, CTX-M-9, that was the most frequent ESBL detected in our laboratory. The CTX-M-type b-lactamases has been described in various species of the family Enterobacteriaceae in geographically and temporally widely distant areas, most of them being plasmid-encoded. To know more about the dissemination of these enzymes around the world, we decided to study the environment of blaCTX-M-9. This study suggested us that blaCTX-M-9 is contained in a new complex integron, In60. This integron has the common 5'-CS and 3'-CS conserved sequences of class 1 integron and two gene cassettes encoding for a dihydrofolate reductase (dfrA16) and aminoglycoside-adenylytransferase (aadA2). Downstream of the first sul1 gene is present the orf513. Following this region there is the blaCTX-M-9 and an orf3-like region showing both about 80% identity with blaKLUA-1 and orf3 of K. ascorbata, respectively. Downstream of the orf3-like region, a new insertion sequence designated IS3000, is found. This IS is flanked by two imperfect inverted repeats and its deduced amino acid sequence presents the DD(35)-E motif highly conserved in the transposases. Close to the downstream IS3000 inverted repeat the second 3'-CS, is found. The presence of In60 was evaluated in a total of 37 enterobacteria isolated between 1994 and 1999 carrying a b-lactamase compatible with CTX-M-9. The results obtained showed that 33 strains had the environment compatible with In60 and four strains showed modifications or did not share this environment.

Davant la impossibilitat econòmica i física de controlar enginyerilment tots els paràmetres involucrats en la pèrdua de viabilitat en cultius in vitro de cèl·lules animals quan es dóna una limitació en el subministrament de nutrients, així com per la presència d'elevades concentracions de subproductes tòxics del metabolisme, en aquest treball s'ha explorat la modificació tant de la formulació del medi com genètica de cèl·lules d'hibridoma amb l'objectiu de perllongar la seva supervivència dins els bioreactors i rendibilitzar el procés d'obtenció d'anticossos monoclonals. La reformulació del medi va permetre alentir la proliferació cel·lular i retardar l'exhauriment de nutrients essencials. Tanmateix, aquests canvis induïen la mort cel·lular per apoptosi.El bloqueig de l'apoptosi mitjançant l'ús d'inhibidors peptídics específics de Caspases va permetre no només retardar la pèrdua de viabilitat dels cultius si no també recuperar-los 36 hores després d'haver induït la mort per manca de glutamina. Resultats similars es van obtenir en la inhibició genètica de l'activació de les Caspases sobreexpressant gens protectors de la família de Bcl-2, tant d'origen endogen com víric. A més a més, els cultius d'aquestes noves línies cel·lulars d'hibridoma poden ser recuperats després d'haver estat sotmesos fins a 48 hores sota condicions inductores de l'apoptosi.Aquests resultats demostren la viabilitat d'incorporar una vàlvula de seguretat genètica que permet retardar el procés de mort per apoptosi de cèl·lules que, en altres circumstàncies, moririen i s'acumularien en el bioreactor. A més a més, la sobreexpressió de gens antiapoptòtics fa les cèl·lules més resistents i permet recuperar cultius que, per causes accidentals inherents a la metodologia emprada en el monitoratge i control del bioprocés o per limitacions físiques de subministrament de nutrients, factors de creixement i oxigen, es vegin sotmeses a condicions inductores de l'apoptosi. D'aquesta manera, aquest treball de tesi contribueix a la creació d'un sistema de cultiu més robust que evitaria l'enorme pèrdua de rendibilitat en els processos d'obtenció del producte desitjat quan els cultius entren en la fase de mort per apoptosi / Due to the economical and physical unavailability to control a number of parameters involved in the loss of viability of animal cell cultures as a result of a limitation in nutrient supply, as well as high levels of toxic byproducts, we have explored the effect of medium modification on cell viability as well as the genetic manipulation of hybridoma cells with the aim of prolonging the life span of these cultures in bioreactors and therefore optimize the productivity of monoclonal antibodies.Reformulation of culture medium allowed a decrease in cellular proliferation and therefore delay nutrient exhaustion. However, these changes induce cell death by apoptosis.The use of caspase inhibitors has enabled to mantain cell viability during a significant period of time, when glutamine depletion was maintained in the culture. Two caspase inhibitors partially suppressed the progress of PCD under glutamine deprivation: Ac-DEVD-cho and z-VAD-fmk. Indeed, as a consequence of this protection, the number of viable cells decreased by 10% (for z-VAD-fmk) and by 80% (for Ac-DEVD-cmk) after 36 hours of culture, while it decreased by 90% for a control culture in absence of protective compounds. However, when the culture was exposed to non-apoptotic conditions after this period of time under apoptosis protection conditions, normal growth pattern was not recovered. Interestingly, the simultaneous use of both inhibitors made the recovery of the cell culture possible even after a period of 36 hours under glutamine depletion, indicating that the inhibition of the effector caspases occurs upstream of the point in which hybridoma cells enter into the commitment step of the death programme.Similar results were obtained by genetic inhibition of the Caspase cascade activation by means of overexpression of protector genes of the Bcl-2 family: Bcl-2, Bcl-XL, and viral homolgues BHRF-1 and KSBcl-2. Moreover, cultures of these genetically modified hybridomas could be rescued from cell death phase after a significant period of time (i.e., 24 and 48 h) under apoptosis inducing conditions.These results show the viability of the incorporation of a security valve that could delay the cell death process by apoptosis in cell cultures which, under other circumstances, would die and be accumulated in the bioreactor. Moreover, overexpression of Bcl-2 homologues make hybridomas more resistant to apoptosis and allow the recovery of viability of cultures deprived from glutamine after 48 hours of apoptosis inducing conditions. Thus, the present work help towards the creation of a more robust culture system that will avoid tremendous loss of cost-effectiveness of biotechnological processes when cultures of animal cells trigger apoptosis.

En S. cerevisiae, al igual que en células de mamífero, el principal control durante el ciclo celular está situado al final de la fase G1, en un punto llamado START (Cross 1995). En START se coordina el crecimiento con la división celular la célula solo entrará en un nuevo ciclo celular si ha alcanzado un tamaño crítico y las condiciones medioambientales son apropiadas. Un proceso clave en START es la activación de un programa de transcripción específico de la fase G1 tardía. Dos factores de transcripción similares, SBF y MBF, son los responsables de esta regulación de la expresión génica. Con el objeto de un mejor conocimiento de los mecanismos moleculares que controlan START y la transición G1/S en el ciclo celular, se inició una estrategia de rastreo genético diseñada para identificar genes cuya mutación sea letal en combinación con una deleción en el gen SWI4 (Igual et al. 1996). De dicho rastreo se aislaron 14 mutantes rsf ("requiring SWI four"). La caracterización preliminar de estos mutantes puso de manifiesto que Swi4p interviene en muchas y variadas funciones además, e independientemente, de la regulación de las ciclinas CLN1,2 (Igual et al. 1997). Durante el presente trabajo se han caracterizado dos de estos mutantes rsf. En el caso del mutante clb5swi4, se ha demostrado la conexión funcional de la ciclina Clb5p, de la ruta PKC y del factor de transcripción SBF en procesos de metabolismo del DNA y en el mantenimiento de la integridad celular. También se ha demostrado que la inactivación del gen CLB5 provoca defectos en la integridad celular siendo un mutante clb5 sensible al tratamiento con SDS, CFW, latrunculina B, cafeína o a la digestión con enzimas que degradan la pared celular como la zimoliasa. Estos resultados indican que la ciclina Clb5p está implicada en el metabolismo de la pared celular y en el mantenimiento de la integridad celular. Por otro lado, se ha descrito que el gen ROT1, al cual se le había relacionado con la ruta PKC por estudios de interacciones genéticas, participa en la salida de mitosis y en citoquinesis. Se ha demostrado que Rot1p presenta funciones antagónicas a la ciclina Clb2p en el control de la salida de mitosis y participa en la regulación del citoesqueleto de actina. En el segundo caso, la caracterización del mutante msn5swi4 realizada durante los últimos años ha permitido identificar una relación funcional entre el factor de transcripción de ciclo celular SBF y la carioferina Msn5p. También se ha demostrado que Msn5p participa en el control de Start regulando la transcripción dependiente de SBF y no la de MBF. Msn5p es una carioferina que se requiere para la exportación de Swi6p al citoplasma en la transición G2/M del ciclo celular. Este mecanismo de exportación de Swi6p al citosol es esencial para su funcionalidad y es un proceso de regulación que actúa en cada ciclo celular. Nuestros resultados son un buen ejemplo de la importancia de la regulación espacial en el control del ciclo celular. En el caso de Swi6p el concepto de regulación espacial va más allá en el sentido de que un interruptor funcional de la proteína se acopla a cambios en la localización subcelular. En el curso del trabajo se observaron algunas diferencias funcionales entre las ciclinas Cln1p y Cln2p. Estas ciclinas son proteínas muy similares, su niveles se regulan por los mismos mecanismos moleculares y la actividad quinasa asociada fluctúa con la misma periodicidad. Además, numerosos estudios han puesto de manifiesto el solapamiento funcional entre estas dos ciclinas lo cual ha conducido a considerarlas como proteínas equivalentes. Sin embargo, diversas observaciones nos han permitido esclarecer el diferente papel que para la célula de levadura juegan Cln1p y Cln2p en la progresión en la transición G1/S del ciclo celular, concretamente en el proceso de gemación. / In S. cerevisiae, similarly with mammals cells, the major control point during cell cycle appears at late G1 phase, in a process called Start. In that moment cells decide to initiate or not a new round of cell division. In Start, when enviromental conditions are appropiate and cells reach a critical size, different processes begin such as DNA replication, bud emergence and spindle pole body duplication. One of the mechanisms contributing to cell cycle regulation is the control of transcription. In the budding yeast expression of some 250 genes is thougt to fluctuate throug the cell cycle. The transcription factors responsible for the periodic gene expression in late G1 phase are SBF (Swi4p-Swi6p) and MBF (Mbp1-Swi6p). To further understand Swi4p function, we step up a synthetic lethal screen for genes interacting with SWI4 (Igual et al. 1996). Fourteen conditional mutations which resulted in lethality only in the absence of SWI4 have been isolated. Two of these mutants, rsf12 and msn5swi4, were characterized in details in that work. In rsf12 mutant we were demonstrated a functional link between cyclin Clb5p, PKC pathway and SBF transcription factor in DNA metabolism and cell integrity. Moreover, we were characterized that ROT1 gen is functionally linked to the PKC pathway and is required for proper mitotic exit. In msn5swi4 mutant, we were identified that Msn5p is involved in control of Start, being required specifically for SBF activity but is not affecting MBF function. The karyopherin Msn5p is essential for the export of Swi6p to the cytoplasm during G2-M phases and this regulatory mechanism is acting in every cell cycle.

Estructura Tridimensional de Granzima B humanaGranzima B es la proteina prototípica de la familia de serina proteasas que se encuentran en células NK y CTLs. GzmB induce apoptosis mediante activación de las caspasas, y está implicada en la etiología de la artritis reumatoidea. Hemos cristalizado y resuelto la estructura 3D de la GzmB humana a una resolución de 3.1Å. GzmB muestra un plegamiento similar al de catepsina G y quimasa humanas. GzmB exhibe una especificidad de substrato muy inusual ya que corta tras Asp, debido a la presencia de Arg226 en bolsillo de especificidad S1. El sitio de unión del substrato está diseñado para acomodar y cortar hexapéptidos, i.e. IETD_SG, secuencia presente en el lugar de activación de la caspasa-3 y de Bid, sus substratos fisiológicos. Esta estructura ayudará en el diseño de inhibidores que podrian ser usados en la cura de enfermedades inflamatorias crónicas.Granzyme B y el Receptor Manosa-6-Fosfato Independiente de CationesGzmB cristalizó como dímero, mediante la interdigitación de las cadenas de azúcares unidas a Asn65 en los dos monómeros. GzmB es captada por las células mediante el Receptor Manosa-6-Fosfato Independiente de Cationes. Sugerimos que la GzmB dimérica sea la forma internalizada por las células diana. Hemos modelado cómo posiblemente GzmB se une a su receptor celular.Estructura Tridimensional de pro-Granzyme K humanaHemos determinado la estructura 3D de la pGzmK a una resolución de 2.2Å. pGzmK se parece más a una serina proteasa activa, a pesar de ser un zimógeno. Esta proteina carece de triada zimogénica y utiliza un nuevo mecanismo de estabilización de la forma inactiva.Estructura Tridimensional de una Procarboxipeptidasa de Helicoverpa armigera. H. armigera es un insecto cuya plaga afecta a un gran número de países. Hemos determinado la estructura 3D de una nueva carboxipeptidasa (PCPAHa) de larvas de H. armigera, la primera resuelta de un insecto hasta la fecha. El zimógeno de PCPAHa muestra una estructura similar a las ya resueltas de mamífero. Su sitio de activación presenta el motivo (Ala)5Lys. Es curioso apreciar similar motivo ((Ala)6Lys) cerca del extremo N-terminal del enzima activo. Ser255 agranda el bolsillo S1´de especificidad y influencia las preferencias de substrato de ésta enzima. Hemos modelado el extremo C-terminal del LCI dentro del sitio activo de PCPAHa. / Crystal Structure of Human Granzyme BGranzyme B is the prototypic member of the granzymes, trypsin-like serine proteinases localized in activated NK cells and CTLs. GzmB triggers apoptosis by activating the caspases, and is implicated in the etiology of rheumatoid arthritis. Human GzmB has been crystallized and its structure has been determined to 3.1 Å resolution. GzmB overall fold is similar to that found in cathepsin G and human chymase. GzmB exhibits an unusual substrate specificity as it cleaves after Asp residues due to the presence of Arg226 at the back of the S1-specificity pocket. GzmB substrate binding site is designed to fit and cleave hexapeptides, i.e. IETD_SG, sequence present in the activation site of caspase-3 and Bid, physiological substrates of GzmB. This structure would help in the design of inhibitors for a treatment of chronic inflammatory disorders.Granzyme B and the Cation-Independent Mannose-6-Phosphate ReceptorOur crystal structure of GzmB unexpectedly revealed a dimer, mediated by the interdigitation of the sugar chains attached to Asn65 in the two monomers. The uptake of GzmB is effected by the cation-independent mannose-6-phosphate (M6P) receptor. We suggest that the GzmB dimer would be the form preferentially recognized by its receptor. To investigate the probable binding mode of GzmB to its cell receptor we have modeled the binding of the GzmB dimer to the M6P-receptor. Crystal Structure of Human Pro-Granzyme KWe have determined the crystal structure of human pGzmK at 2.2 resolution. The overall fold of pGzmK is most similar to that found in active serine proteinases rather than in zymogens. An unusual feature of pGzmK is that the residues Ser32, His40 and Asp194 do not form a zymogen triad, while pGzmK uses a novel mechanism for zymogen stabilization.Crystal Structure of a Procarboxypeptidase from Helicoverpa armigeraH. armigera is one of the most serious insect pests worldwide. We present the 2.5 Å crystal structure from this novel procarboxypeptidase (PCPAHa) from H. armigera larvae, the first one reported for an insect. PCPAHa zymogen has a 3D structure similar to the corresponding mammalian digestive carboxypeptidases. The activation site contains the motif (Ala)5Lys. It is noteworthy the occurrence of the same (Ala)6Lys near the C-terminus of the active enzyme. Ser255 enlarges the S1' specificity pocket and influences the substrate preferences of the enzyme. The C-terminal tail of LCI was modeled into PCPAHa active site.

Els Defectes Congènits de la Glicosilació (CDG) y les deficiències de Piruvat Deshidrogenasa (PDH) són dos grups de malalties que afecten a vies molt importants pel correcte funcionament de l'organisme. En tots dos casos, petits defectes ja mostres manifestacions clíniques, que en aquests casos lleus poden arribar a sobreposar-se. Per aquest motiu l'objectiu d'aquesta tesi ha estat millorar i implementar metodologies, tant bioquímiques com genètiques, per l'estudi d'aquests dos grups de malalties, per tal de poder descartar o confirmar aquests defectes, agilitzant el diagnòstic dels pacients.Per això hem millorat les tècniques de cribratge pels CDG, primer implementant l'estudi de les isoformes de la transferrina en gels d'agarosa y finalment, posant al punt dos mètodes semi-automàtics i quantitatius: HPLC i CZE. Aquests nous mètodes permeten una interpretació més objectiva dels patrons d'isoformes de la transferrina i faciliten la detecció de mostres lleument alterades.Hem ampliat les tècniques per l'estudi dels pacients CDG-II, implementant l'anàlisi de les isoformes d'apolipoproteïna C-III.L'aplicació d'aquestes tècniques a l'estudi de pacients ha permès diagnosticar 14 nous pacients amb defectes congènits de la glicosilació. I també definir dues noves causes d'alteració secundària del patró de sialotransferrines: la sepsis bacteriana i la fructosa-1,6-bisfosfatasa. Volem ressaltar la importància de descartar causes secundaries per tal d'evitar un retard en el correcte diagnòstic dels pacients.Degut a la gran importància de la via de la glicosilació, una activitat residual zero és incompatible amb la vida, és per això que hem ampliat el cribratge a fetus amb malformacions ecogràfiques o avortaments espontanis, per intentar detectar les formes més severes de la malaltia. Però estudi de 238 individuos no ha mostrat cap individu afecte de CDG. Per altra banda, hem incrementat i millorat l'estudi molecular de les deficiències de PDHA1, el subtipus més freqüent de deficiència de PDH, y ampliat l'estudi a altres subunitats del complex PDH. Això ens ha permès finalitzar el diagnòstic de 10 pacients amb deficiència en PDH-E1α i diagnosticar els primers pacients espanyols amb deficiències de PDH-E1β i PDH-E3.En conclusió, aquesta tesi ha contribuït a ampliar i millorar del diagnòstic dels CDG i de les deficiències de PDHc, a incrementar el seu coneixement tant bioquímica com genètic i alhora ha desvelat formes clíniques no conegudes d'aquests defectes. / Congenital Disorders of Glycosylation (CDG) and Pyruvate Dehydrogenase (PDH) deficiencies are two groups of diseases which affect very important pathways for the correct organism working. In both cases, slight changes in these pathways can have pathologic significances with overlapped clinical features. For these reasons, the aim of this thesis has been the implementation of biochemical and genetic methodologies in order to improve their diagnosis.We have improved the CDG screening techniques, first we have implemented the study of transferrin isoforms in agarose gels, and finally we have changed the screening techniques for CDG to semi-automated and quantitative methodologies: HPLC and CZE. Both methods allow a more objective sialotransferrin pattern interpretation and they permit an easier detection of slight altered patterns.We have implemented the apolipoprotein C-III isoform analysis in order to improve the CDG-II patient studies.With the application of these techniques to the patient studies we have diagnosed 14 new CDG patients. And we have also described two unknown secondary causes of sialotransferrin altered pattern: bacterial meningitis and fructose-1,6-bisphosphatase deficiency. We would emphasised the importance of role out secondary alterations in order to avoid a delay in the correct patient diagnosis. The glycosylation pathway is very important, and defects with no residual activity are incompatible with life. For this reason we have extended our screening for CDG to foetus with ecographic abnormalities and sporadic miscarriages, in order to detect the most severe forms of these diseases. But the study of 238 samples has shown no CDG patient.On the other hand, we have increased and improved the molecular study for PDHA1 (PDH-E1α) deficiencies, the most frequently affected subunit, and we have also extended the molecular analysis to other PDH complex subunits. These works have permit us finishing the molecular diagnosis in 10 patients with PDHA1 deficiency, and describing the first Spanish patient with PDH-E1β deficiency and PDH-E3 deficiency respectively.In conclusion, this thesis has contributed to improve the CDG and PDH deficiency diagnosis, has increased their biochemical and genetic knowledge, and has reported new clinical features.

Des del descobriment de la insulina per Banting i Best el 1922 s'ha fet un gran progrés en el coneixement i la comprensió de la seva química, fisiologia i mode d'acció (1). Totes les accions que du a terme aquesta hormona pancreàtica, tant les metabòliques com les mitogèniques, es donen a través del seu receptor. Aquest és un receptor de membrana, constituït per dues subunitats a que són extracel·lulars i que uneixen la insulina, i dues subunitats b, amb una regió transmembrana i una regió intracel·lular que té activitat tirosina quinasa intrínseca (2). Ja que el receptor és el primer pas en la senyalització iniciada per la insulina, ha estat considerat com un candidat a patir mutacions que serien les responsables de la disrupció del senyal de la insulina i conseqüentment donarien lloc a la resistència a la insulina.S'han descrit tres síndromes genètiques de resitència a la insulina associades a mutacions en el gen del receptor d'insulina: Síndrome de Leprechaunisme, Síndrome de Rabson-Mendenhall i Síndrome de Resistència Tipus A a la insulina, encara que també s'han descrit algunes mutacions en alguns pacients afectes de Lipodistròfia i Obesitat.En el present treball s'han estudiat 18 pacients amb síndromes associades a resistència a la insulina. L'estudi molecular dels receptors mitjançant amplificació per PCR i seqüenciació automàtica, va permetre detectar tres noves mutacions en heterozigosi en tres pacients afectes de resistència a la insulina Tipus A (A1 Leu140/acceptor d'spicing-1239Aturada, A2 acceptor d'spicing-1239Aturada i A3 Val1028), dues mutacions prèviament descrites en un pacient afecte de la Síndrome de Rabson-Mendenhall (RM1 Lys15 i Aturada1000), i una variació en un individu control (Val985Met), a més de diferents polimorfismes. L'estudi funcional dels receptors portadors de les noves mutacions va concloure que la mutació Leu140 s'expressa menys que els receptors WT, en conseqüència uneix menys insulina i presenta una activitat tirosina quinasa disminuïda. La mutació Val1028 afecta a la seqüència consens d'unió de l'ATP i per tant aboleix l'activitat tirosina quinasa. Per últim la mutació d'splicing-1239Aturada dóna com a resultat dos mRNAs anòmals i deferents, però que al ser traduïts donen lloc a la mateixa proteïna: al receptor li manca l'extrem C-terminal (l'exó 22). Aquest receptor mutat s'expressa normalment, uneix un 50% d'insulina comparat amb els WT i no presenta activitat tirosina quinasa.Per tant es pot concloure que la resistència a la insulina que pateixen els pacients portadors d'aquestes mutacions, és deguda a l'efecte que les mutacions exerceixen sobre la funcionalitat dels receptors. / Insulin was discovered by Banting & Best in 1922, since then a great progress has been made in the knowledge and comprehension of its chemicals, physiology and function (1). All the insulin actions, including the metabolic and mitogenic ones, take place through its receptor. Insulin receptor is a heterotetrameric membrane protein with two extracellular a subunits that bind insulin, and two transmembrane b subunits. The intracellular portions of these b subunits have an intrinsic enzymatic tyrosine kinase activity (5).Insulin binding to its receptor is the first step in insulin signalling and it has been considered that insulin receptor mutations are responsible for disrupting the insulin signal and consequently giving rise to insulin resistance.There are three insulin resistant genetic syndromes associated with insulin receptor mutations: Leprechaunism, Rabson-Mendenhall syndrome and Type A Insulin Resistance syndrome, although some mutations in obese and Lipodystrophic patients have been described.Eighteen insulin resistant patients have been studied in the present work. The molecular study of its insulin receptor gene by means of PCR and automatic sequencing revealed three novel mutations in heterozigote state in three Type A insulin resistant patients (A1 patient Leu140/splicing acceptor-1239Stop, A2 patient splicing acceptor-1239Stop/WT and A3 patient Val1028/WT). Two previously described mutations in a Rabson Mendenhall patient (Lys15/Stop1000), and a variation in a control subject (Val985Met), as well as some polymorphisms. Functional studies of the mutant receptors showed that the Leu140 receptor expresses less than the Wt receptor, binds less insulin and has a decreased tyrosine kinase activity. Val1028 mutation affects the consensus sequence for ATP binding and abolishes tyrosine kinase activity. The splicing acceptor-1239Stop mutation gives rise to two abnormal and different mRNAs, but the resultant protein of both is the same: the receptor lacks the C-terminal domain (exon 22). This mutant receptor expresses as a WT receptor, binds a 50% less insulin than WT and lacks tyrosine kinase activity.In conclusion we can say that the insulin resistance of the patients is due to the mutations present in their insulin receptors.

Les deplecions de DNA mitocondrial (mtDNA) i les alteracions de NFU1 són dos grups de malalties que afecten vies molt importants dins de la mitocòndria i que alteren el metabolisme energètic. Clínicament, els pacients afectes de depleció de mtDNA es caracteritzen per mostrar un ampli ventall de símptomes, depenent del gen afectat. Els símptomes clínics són molt greus i la majoria de vegades porten a la mort del pacient. Els pacients amb mutacions en el gen NFU1, descrits per primera vegada en aquest treball, presenten una clínica més homogènia, caracteritzada sobretot per presentar una encefalopatia infantil fatal i/o hipertensió pulmonar i un fenotip bioquímic molt particular però ben definit, caracteritzat principalment per presentar acidosi làctica, hiperglicinèmia i deficiència de l’activitat piruvat deshidrogenasa. L’objectiu principal d’aquesta tesis ha consistit en millorar i implementar metodologies per a contribuir al diagnòstic, i millorar la comprensió de la fisiopatologia d’aquestes deficiències. Per a tal fita s’ha posat a punt una tècnica de PCR a temps real per estudiar el número de còpies de mtDNA i poder relacionar-lo amb l’activitat citrat sintasa. A més, la depleció s’ha pogut estudiar en biòpsies incloses en parafina, una important font de material biològic arxivat mai utilitzat fins al moment. D’aquesta forma s’han pogut estudiat 50 pacients amb sospita clínica de depleció de mtDNA i cercar mutacions en els gens relacionats; DGUOK, MPV17, C10orf2, SUCLG1, SUCLA2 i POLG. L’estudi molecular ens ha permès identificar 4 mutacions no descrites prèviament, c.70+5G>A en el gen MPV17, c.1048G>A i c.1049G>T en el gen SUCLA2, i c.531+4A>T en el gen SUCLG1. A més s’han identificat 7 mutacions prèviament descrites en un total de 10 pacients (8 famílies). Quan va ser possible, es va quantificar el ràtio mtDNA/nDNA i la activitat citrat sintasa en la mateixa mostra de teixit, proveint noves dades per l’estudi de les MDS. La depleció relacionada amb la citrat sintasa, (mtDNA/nDNA)/CS, ha donat resposta a certes discrepàncies observades entre els resultats de depleció i els resultats de la cadena respiratòria mitocondrial en alguns pacients. Per altra banda, utilitzant el mapatge per homozigositat, es va identificar una mutació de canvi de sentit en homozigositat en el gen NFU1 (c.622G>T, p.Gly208Cys), que codifica per una proteïna altament conservada en totes les espècies i que està implicada en la biogènesis dels clústers de sulfur de ferro (Fe-S). Aquesta ha esta la primera vegada que s’ha associat mutacions en aquest gen a patologia humana. El fenotip bioquímic dels pacients suggeria una activitat deficient de l’enzima lipoic àcid sintasa (LAS), una proteïna que necessita clústers de Fe-S com a cofactor. Es va poder constatar una disminució del grau de lipoilació de les proteïnes dependents d’àcid lipoic, el que suggeria una manca d’ activitat LAS. Utilitzant models cel·lulars hem demostrat que la proteïna NFU1 és necessària com a donadora de sulfur per la biosíntesi d’àcid lipoic i també ens ha permès conèixer la funció específica en la biosíntesi dels clústers de Fe-S i en la maduració de proteïnes Fe-S, concretament LAS i la succinat deshidrogenasa (SDH). La descripció clínica, bioquímica y genètica d’aquesta malaltia és molt important pel diagnòstic de nous pacients i obre les portes a la cerca d’altres gens implicats en la biosíntesi de l’àcid lipoic, així com al disseny futur de noves estratègies terapèutiques. / Mitochondrial DNA (mtDNA) depletion syndromes (MDS) and NFU1 defects are two groups of diseases affecting crucial mitochondrial pathways of energetic metabolism. Clinically, patients affected of mtDNA depletion displayed a wide range of symptoms, depending on the altered gene. The clinical symptoms are severe and in most cases lead to death of the patient. Patients with NFU1 mutations, described for the first time in this paper, present a more homogeneous clinical phenotype, characterized by fatal infantile encephalopathy and / or pulmonary hypertension. NFU1 patients also showed a peculiar, but well defined, biochemical phenotype, presenting with lactic acidosis, hyperglycinemia and deficiency of pyruvate dehydrogenase activity. The main objective of the present thesis is to improve and to implement new methods for the diagnosis and understanding of the pathophysiology of these deficiencies. To this goal, a real-time PCR technique has been developed to study the mtDNA copy number and its relationship to citrate synthase activity in MDS patients. In addition, mtDNA depletion has been studied in formalin-fixed paraffin-embedded tissues, an important source of biological material never used for this purpose. We studied 50 paediatric individuals suspected to have mtDNA depletion and the appropriate MDS genes have been screened according to their clinical and biochemical phenotypes. Mutational study of DGUOK, MPV17, SUCLA2, SUCLG1 and POLG allowed us to identify 4 novel mutations; c.70+5G>A in MPV17, c.1048G>A and c.1049G>T in SUCLA2 and c.531+4A>T in SUCLG1, and 7 already known mutations in 10 patients (8 families). When possible, we quantified mtDNA/nDNA and CS activity in the same tissue sample, providing an additional tool for the study of MDS. The ratio (mtDNA/nDNA)/CS has shed some light in the discrepant results between the mtDNA copy number and the enzymatic respiratory chain activities of some cases. Using homozigosity mapping, we identified a homozygous missense mutation in NFU1 gene (c.622G> T, p.Gly208Cys), which encodes a conserved protein suggested to participate in Fe-S cluster biogenesis. This is the first time that a clinical phenotype has been associated with mutations to NFU1. The biochemical phenotype suggested an impaired activity of the Fe-S enzyme lipoic acid synthase (LAS), a protein that requires Fe-S cluster as a cofactor. Direct measurement of protein-bound lipoic acid in individual tissues indeed showed marked decreases, which suggested a lack of LAS activity. Human cell models studies showed that NFU1 protein is required as sulfur donor for the biosynthesis of lipoic acid and it performs a specific function in mitochondrial Fe-S proteins maturation, particularly succinate dehydrogenase and LAS (SDH). Clinical, biochemical and genetic description of NFU1 disease is very important for the diagnosis of new patients and will allow us to find other genes involved in the biosynthesis of lipoic acid, and provided the basis for the future design of new therapeutic strategies.

En païssos industrialitzats, el càncer de pròstata (CP) és la neoplasia més comunment diagnosticada en homes i la segona causa de mort relacionada amb càncer, donat que els nivells de mortalitat en aquesta població són molt més baixos que els que es troben en els païssos en desenvolupament, es veu un clar benefici en els avenços tant en el diagnòstic precoç com el desenvolupament de teràpies eficients. No obstant, la disseminació metastàtica més que el tumor primari en sí és la responsable dels problemes de mortalitat i morbiditat associats al CP. Les metàstasis esquelètiques estan presents en més d’un 70% dels casos de CP avançat i confereixen alts nivells de morbiditat, un 25% de supervivència als 5 anys i una mitjana de supervivència de 40 mesos després de ser diagnosticats. Tot i que les fractures patològiques i la compressió de la columna vertebral són les complicacions més probables pel pacient metastàtic, el major símptoma és el dolor. Les metàstasis òssies del CP comporten un estat d’acceleració de la remodelació òssia que es caracteritza per una activació patològica tant dels osteoblasts com dels osteoclasts. Aquesta elevada activació dels osteoclasts està directament correlacionada amb un increment en la incidència de les complicacions òssies, de la progressió tumoral i la mort. A més, una vegada el tumor metastatitza a os, la malaltia esdevé incurable i les teràpies actuals són solament pal·liatives i principalment es dirigeixen a les cèl·lules tumorals o als osteoclasts. Per tant, per entendre millor la biologia de les metàstasis òssies del PC i poder investigar noves teràpies és important desenvolupar nous models animals. En aquesta tesi, s’han establert nous models experimentals de metàstasis del CP mitjançant la inoculació de cèl·lules humanes en ratolins immunodeficients per diferents vies, intraòssia, intracardíaca o intratibial. Finalment, diferents estratègies s’han dut a terme per descriure noves dianes moleculars involucrades en el mecanisme de les metàstasis i poder desenvolupar un model adequat per la evaluació de possibles compostos candidats a ser futures aproximacions terapèutiques. Per concloure, aquests models proporcionen una fiable reproducció de la situació clínica i permeten tant la caracterització com el diseny de tractaments efectibles per compendre millor els mecanismes moleculars de les metàstasis òssies del CP. / In industrialized countries, prostate cancer (PCa) is the most common malignancy in men, but mortality rates are much lower than those recorded in developing countries, reflecting benefits from advances in early diagnosis and effective treatment. However, the metastatic disease rather than the primary tumor is responsible for much of the resulting morbidity and mortality. Skeletal metastases occur in more than 70% of cases of late-stage of PCa and they confer a high level of morbidity, a 5 year survival rate of 25% and median survival of approximately 40 months. Though fractures and spinal cord compression are potential complications, the most common symptom of bone metastases is pain. Bone metastases from PCa lead to an accelerated bone turnover state that features pathological activation of both osteoblasts and osteoclasts. Raised activation of osteoclasts is directly correlated with an increased incidence of skeletal complications, cancer progression and death. Further, once tumor metastasizes to bone, the metastatic disease become incurable and current therapies are palliative and mostly target either tumor cells or osteoclasts. Thus, to better understand the biology of PCa bone metastasis and to investigate new therapy options it is crucial to develop new animal models. In this thesis, we have established new experimental models of PCa bone metastasis by intraosseous (i.o.), intracardiac (i.c.) or intratibial (i.t.) inoculation of human PCa cells in immunodeficient mice. Extensive bone metastasis were monitored by in vivo bioluminescence imaging. Different strategies were performed to describe new molecular targets involved in the mechanisms of PCa bone metastasis and to make a suitable model for evaluating novel compounds as future therapeutic approaches. To conclude, these models provide a reliable reproduction of the clinical situation and allows characterization and design effective treatments by better understanding the molecular mechanisms of PCa bone metastasis.

Intercambiar la especifidad de las isoformas de SUMO1 y SUMO2/3 para SENP6/SENP7 SENP6 y SENP7 son los miembros más divergentes de la familia de proteasas SENP y los únicos miembros que llevan cuatro inserciónes o “loops” localizadas en su dominio catalítico. Al sobreponer el dominio catalítico de SENP7 sobre el complejo SENP2-SUMO podemos ver una posible interfaz entre el Loop1 de SENP7 y SUMO. También identificamos diferentes residuos de SUMO1 y SUMO2 que podrían formar parte de la interfaz. Diseñamos una serie de mutantes de SUMO1 y SUMO2 donde se intercambian entre ellos los residuos que forman parte de la interfaz. De esta manera fuimos capaces de intercambiar la actividad proteolítica de SENP6 y SENP7 hacia estos substratos. El Loop1 de SENP6 y SENP7 es responsable de la especificidad de la interfaz entre los SUMOs y las SENP6/7 Diseñamos una serie de mutantes del Loop1 de SENP7 dentro de la posible interfaz entre el Loop1 de SENP7 y SUMO para determinar los papeles estructurales y funcionales de los residuos que están dentro de esta región. Los mutantes de SENP6/7 sin el Loop1 perdían gran parte de su actividad, esta se podía recuperar un poco al reemplazar las cuatro prolinas del Loop1 por glicinas. De esta manera probamos que el Loop1 tiene un papel por lo menos estructural en el reconocimiento de SUMO. También identificamos el residuo Lys691 del Loop1 de SENP7 como elemento indispensable en la actividad de la enzima ya que al mutar este residuo por un aspártico disminuye la actividad para sustratos con SUMO2. Por otra parte el residuo Asp71 de SUMO2 es uno de los residuos propuestos para el reconocimiento de SUMO2/3. Cuando mutamos este residuo a lisina, vemos una bajada en la actividad de SENP7. Este hecho sugiere que Asp71 de SUMO2 está interaccionando con Loop1 y quizas con la Lys691, y que la bajada en la actividad es causada por una repulsión de cargas. Por otro lado con el objectivo de estudiar el efecto de Loop1 en la desconjugación de especies SUMOyladas, insertamos los ocho residuos de SENP6 Loop en el dominio catalítico de SENP2. Esta inserción provoca un aumento de la actividad sustancial de SENP2 contra diSUMO en comparación con la forma wild type. Complejos con substratos Para ver si SENP6 es capaz de formar algún complejo estable, producimos cantidades en miligramos de los mutantes inactivos de Δ3SENP6C1030S y de Δ2Δ3SENP6C1030S. Incubamos cada proteasa con los precursors de SUMO, con RanGAP1-SUMO2 y con diSUMO2. De todos los substratos que probamos, diSUMO2 fue el único que podía formar un complejo estable con Δ3SENP6CS y Δ2Δ3SENP6CS por copurificación en una columna de gel fitración. Con Δ2SENP6CS no pudimos formar ningún complejo. Con esta información llegamos a la conclusión que el Loop3 de SENP6 reduce, quizá por razones de entropía, la capacidad de SENP6 de formar un complejo estable con diSUMO2. Caracterización del Loop3 de SENP6 Para descifrar el papel que este loop tiene en el contexto de la proteasa, producimos y purificamos los 185 residuos de Loop3 de SENP6. Análysis 1-H 1-D RMN mostraba una falta de estructura terciaria dentro del loop, pero proteólisis limitada y espectroscopia de masas mostraban un fragmento estable de cerca de 11kDa. Dicroísmo circular y FTIR tambien sugieren la presencia de algunos elementos de estructura secundaria. Globalmente, la caracterización biofísica del Loop3 de SENP6 muestra que el loop es una proteína desestructurada. / Swapping the SUMO Isoform Specificity of SENP6/7 SENP6 and SENP7 are the most divergent members in the SENP family of proteases and they are the only members that bear four loop insertions dispersed throughout their catalytic domains. The superposition of the SENP7 catalytic domain with the SENP2-SUMO complex revealed a tentative SENP7 Loop1-SUMO interface and upon further inspection, distinct residues on SUMO1 and SUMO2 were identified at the interface. A series of mutants were constructed bearing characteristics of both SUMOs and by swapping the residues from SUMO1 to SUMO2 and vice versus we were able to both decrease and increase the activity of the SENP6 and SENP7 toward these substrates. Loop1 SENP6/7 Is Responsible For SUMO Interface Specificity In addition to mutations on SUMO we constructed a series of mutations on SENP7-Loop1 within the tentative SENP7-Loop1-SUMO interface to determine the structural and functional roles of the residues that reside within this region. We were able to recover some of the activity lost by the removal of Loop1 by replacing the four prolines of Loop1 with glycines proving that Loop1 plays at least a structural role in SUMO recognition. We also identified Lys691 of Loop1 in SENP7 as indispensible to the activity of the enzyme. D71 is one of the residues proposed to confer SUMO2/3 specificity in the previous swapping experiments. We mutated this residue in diSUMO2 and saw a decrease in activity of SENP7. This could be explained by our theory that this region on SUMO is interacting with Loop1, more specifically K691, and the decrease in activity was caused by a charge clash between SUMO2 and SENP7 Loop1. To further show the utility of Loop1 in deconjugation of multi-SUMOylated species we inserted the eight residues of SENP6 Loop1 into SENP2. We saw an overall increase in activity of SENP2 against diSUMO2 but not against any other substrate tested. Complexes With Substrates In order to see if SENP6 was able to form any stable complexes in solution, we produced milligram amounts of Δ3SENP6CS and Δ2Δ3SENP6CS (the two constructs of the protein that showed both good yields in protein production and high performance in activity assay). We incubated each protease with SUMO precursors, RanGAP1-SUMO2 and diSUMO2 substrates. Of all the substrates tested, only diSUMO was able to form a stable complex with Δ3SENP6CS and Δ2Δ3SENP6CS. Δ2SENP6CS was also tested but there was no indication of any complex formation, leading to the hypothesis that SENP6 Loop3 was impeding, perhaps entropically, the ability of SENP6 to form a stable complex with diSUMO2. SENP6 Loop3 Characterization Loop3 takes up roughly 40% and 20% of the catalytic domains of SENP6 and SENP7 respectively. In our loop deletion experiments we saw an overall increase in the activity when Loop3 was not present and removal of Loop3 proved vital to the ability of the enzyme to form a stable complex with diSUMO2. In order to try to decipher what role this loop plays in the context of the protease, we isolated the 184 insert from SENP6 and produced and purified the protein. 1-H 1-D NMR pointed to an overall lack of tertiary structure within the loop but limited proteolysis and mass spectrometry analyses showed a stable fragment of around 11kDa. Further circular dichroism and Fourier Transform Infrared Spectroscopy suggested the presence of some secondary structural elements but overall characterization of SENP6 Loop3 showed a mainly unstructured loop.

Beta amiloide (Aß), es un péptido generado a partir de la proteína precursora de amiloide (APP) por las neuronas, que se cree esta implicado en la base de la fisiopatología de la enfermedad de Alzheimer (AD). Aß está directamente implicada en la modulación de la función sináptica y los niveles patológicos de Aß inhiben la plasticidad sináptica. Las formas solubles de A afectan negativamente al proceso de la transmisión sináptica, implicando la pérdida de los receptores sinápticos por mecanismos todavía desconocidos. Los principales receptores de glutamato ionotrópicos implicados en la transmisión sináptica excitatoria son los receptors para el ácido 4,5 alfa-amino-3-hidroxi-metil-isoxazolpropiónico (AMPARs) y los receptores de N-metil D-aspartato (NMDAR). El movimiento de los AMPARs dentro y fuera de la sinapsis, entre los depósitos intracelulares y la superficie de la célula juega un papel muy importante en los fenomenos de plasticidad sináptica como la potenciaón o la depression a largo término. La proteína de anclaje para la quinasa A (AKAPs), juega un papel crítico en la plasticidad sináptica y en la estabilización de AMPARs y NMDAR. En nuestro estudio, la exposición de las neuronas corticales cultivadas a Aβo o NMDA (generandose depression a largo término) reduce los niveles de proteína AKAP150. Mediante el uso de diferentes agentes farmacológicos y herramientas moleculares, hemos estudiado los cambios en los niveles de AKAP provocados por Aβo y NMDA. Nuestros resultados indican una reducción de AKAP150 por estimulación de NMDAR y por Aßo. Este efecto es dependiente de la actividad clacineurina y del proteosoma. Por otra parte, el efecto reductor de Aβo y NMDA en los niveles de AMPAR fue imitado mediante el silenciamiento de la expresión de AKAP150 y bloqueado por la sobreexpresión de AKAP150. Aβo podría estar implicado en el déficit de transporte dendrítico de los ARNm y su traducción. Los miRNAs son pequeños ARN no codificantes que actúan como reguladores post-transcripcional de la expresión génica. En AD temprana, que presenta neuritas distróficas y el fracaso sináptica, hay una alteración en los niveles de ciertos miRNAs. La exposición a largo plazo de Ao demostró que miR125a y miR132 fueron tanto reducen mientras que la exposición a largo plazo de NMDA induce la disminución de miR181a. Los experimentos con inhibidores indicaron que puede y Ca2+ pueden estar implicados en la modulación de mir181a por la exposición a largo plazo de NMDA. / Beta amyloid (Aß) is a peptide generated from the amyloid precursor protein (APP) by the neurons, which is believed to be involved in the basis of the pathophysiology of Alzheimer's disease (AD). Aß is directly involved in modulating synaptic function and pathological Aß levels inhibit synaptic plasticity. Soluble forms of A adversely affect the process of synaptic transmission, involving the loss of synaptic receptors by yet unknown mechanisms. Major ionotropic glutamate receptors implicated in excitatory synaptic transmission are the receptors for the alpha 4,5-amino-3-hydroxy-methyl-isoxazolepropionic (AMPARs) receptors and N-methyl D-aspartate receptor (NMDAR). The movement of AMPARs into and out of the synapse between intracellular stores and the cell surface plays an important role in synaptic plasticity phenomena as long-term potentiation (LTP) or long-term depression (LTD). The A-kinase anchoring protein (AKAPs), plays a critical role in synaptic plasticity and in stabilizing NMDAR and AMPARs. In our study, exposure of cultured cortical neurons to Aβo or NMDA (cLTD) reduced the levels of protein AKAP150. By using different pharmacological agents and molecular tools, we studied the changes in the levels of AKAP induced Aβo and NMDA. Our results indicate that this effect is dependent on proteasome and calcineurin activities. Moreover, the reducing effect of NMDA on Aβo and AMPAR levels was mimicked by silencing expression AKAP150 and blocked by overexpression of AKAP150. Aβo could be involved in the deficit of dendritic mRNA transport and translation. miRNAs are small non-coding RNAs that act as post-transcriptional regulators of gene expression. In early AD, and dystrophic neurites having the synaptic failure, there is an alteration in the levels of certain miRNAs. Exposure to long-term showed Ao miR125a and miR132 were reduced as much exposure to NMDA induces long-term decline of miR181a. Inhibitor experiments indicated that Ca2 + can and may be involved in modulating mir181a by long term exposure to NMDA.