Los biosensores representan actualmente herramientas importantes para la detección de moléculas de interés. Los biosensores proteicos destacan por su fácil producción y uso, permitiendo un desarrollo económico de biosensores que pueden ser utilizados en todo el mundo y sobretodo, útiles en países con falta de recursos y tecnología. Un diagnóstico rápido y eficaz de enfermedades infecciosas permitiría un tratamiento más rápido y un mejor aprovechamiento de los recursos disponibles.En este estudio, el biosensor proteico NF795gpC, útil para la detección de anticuerpos anti-virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), ha sido caracterizado. La proteína NF795gpC es una beta-galactosidasa modificada previamente sintetizada en nuestro laboratorio, que contiene el péptido antigénico P1 de la proteína gp41 de VIH insertado entre los residuos 795 y 796. La inserción de péptidos en lugares permisivos expuestos del enzima, permite la síntesis de proteínas que responden a la presencia de anticuerpos específicos. El hecho de que contengan inserciones, hace que estas proteínas tengan una actividad enzimática reducida. Sin embargo, en presencia de anticuerpos específicos para el péptido insertado, estos enzimas híbridos traducen la interacción antígeno-anticuerpo en un incremento de actividad enzimática fácil de medir. Finalmente, y teniendo un ejemplo previo con el virus de la fiebre aftosa, este principio puede extenderse a la detección de otras enfermedades infecciosas que producen una respuesta immune mediada por anticuerpos.Primero se optimizó el ensayo buscando las concentraciones óptimas de proteína y sustrato y también analizando el efecto sobre sensibilidad, ratio señal-fondo y rango de respuesta, de seis sustratos diferentes. La proteína NF795gpC fue también inmovilizada en un soporte para analizar su capacidad de respuesta en estas condiciones, siendo el primer paso para un futuro desarrollo de un sistema de detección útil para hacer medidas de campo.El análisis de los diferentes tipos de anticuerpos específicos presentes en muestras de suero con el sensor mostró una correlación entre la cantidad de inmunoglobulinas IgG4 y la respuesta, considerándose esta inmunoglobulina como la mayormente responsable de la activación del sensor.Finalmente, nuevos enzimas alostéricos fueron sintetizados para mejorar la sensibilidad del sistema previamente descrito. El hecho de que la proteína NF795gpC contiene solamente un único inserto representa una limitación a la hora de diagnosticar la enfermedad, llegando solo a un 94% de coincidencia entre este y el método estándar normalmente utilizado para diagnosticar VIH. Por tanto, la inserción de otros fragmentos antigénicos del virus en la proteína permitiría aumentar el número de anticuerpos VIH específicos y, por tanto, también aumentar la sensibilidad del sistema. El desarrollo de un sistema mucho más completo representaría un gran avance en la salud pública y también sería de gran importancia para entender mejor el mecanismo de regulación enzimática en biosensores alostéricos. / Biosensors have become important tools in the detection of different types of molecules of analytical interest. Among them, protein-only biosensors stand out due to their ease production and use, what allow a cheaper development and applicability with low costs, especially important in low resource areas. A better and quicker diagnosis of illnesses would allow a faster treatment and an effective use of the available resources. In this study, the protein-only biosensor NF795gpC, suitable for the detection of anti-human immunodeficiency virus (HIV) antibodies, has been characterized. NF795gpC protein is an engineered beta-galactosidase previously developed in our laboratory, containing the antigenic P1 peptide of gp41 protein of HIV in between the residues 795 and 796. The insertion of small peptides in permissive solvent exposed sites of the enzyme produces hybrid beta-galactosidases with a reduced enzymatic activity but allows the protein to respond enzymatically to peptide-specific antibodies. In presence of anti peptide monoclonal antibodies or polyclonal sera, these hybrid enzymes translate the antigen-antibody interaction into an easily measurable increase of the enzymatic activity. Furthermore, and having a previous example with FMDV, this principle can be extended to other infectious diseases producing an antibody response. First, the sensing assay was optimized looking for the optimal concentrations of NF795gpC protein and substrate generating a higher sensing response, and also analyzing the sensor response regarding sensitivity, signal-background ratio and range of response with six different substrates. Protein NF795gpC was also immobilized into a support to analyze the sensor response in these conditions, being the first step to the further development of a sensor device useful for field measurements. The analysis of the different types of antibodies present in sera samples through the sensor showed a correlation between the amount of IgG4 subpopulation of antibodies of a group of sera samples and the sensing signal, considering this immunoglobulin as the most important for sensor activation.Finally, new allosteric enzymes were constructed in order to improve the sensitivity of the test. The fact that the NF795gpC contains only one type of HIV peptide represents a limitation to the proper diagnosis of HIV infection, arriving only to a 94% of agreement between this test and the standard method normally used for HIV detection. Hence, the insertion of other antigenic fragments of HIV into the beta-galactosidase could allow the detection of other specific antibodies. The development of a more complete device could represent big advances in public health and also be helpful in a better understanding of the mechanism of enzymatic regulation in allosteric biosensors.

L’ús de nanopartícules (NPs) ha emergit com una eina prometedora pel tractament de càncer. Entre els seus usos en teràpia i en tècniques d’imatge, destaca l’ús com agents de direccionament de fàrmacs. Tot i així, encara es requereix un profund coneixement d’aquests sistemes abans de poder aplicar-los a la clínica. Aquí presentem l’ús de nanopartícules d’or (AuNPs) per a detoxificar un dels fàrmacs de major ús en quimioteràpia, el cisplatí. Aquest fàrmac està lligat a la NP via un enllaç de coordinació sensible a pH per assegurar l’alliberament de fàrmac als endosomes. El tamany de les NPs juga un paper molt important en determinar algunes respostes biològiques com la biodistribució o la seva remoció per part del sistema immune. Per això, és indispensable controlar perfectament el tamany de la NP en la seva síntesis abans de qualsevol aplicació biològica. Aquí descrivim un nou protocol per sintetitzar AuNPs amb un control exquisit del tamany entre 5 i 200 nm. Un dels avantatges d’aquest protocol és l’obtenció de NPs estabilitzades amb citrat que poden ser funcionalitzades a posteriori. D’aquesta manera podem aprofundir aquí en el mecanisme de formació de monocapes autoensamblades (SAM) i capes formades per barreges de surfactants. El control pel que fa a la composició i conformació d’aquestes és molt important doncs determina respostes biològiques com l’adsorció de proteïnes i l’estabilitat col·loïdal en medis fisiològics. Aquests conjugats han servit com a esquelet per enllaçar-hi cisplatí via la formació d’un enllaç de coordinació que asseguri un alliberament de la droga desencadenat per una baixada de pH. Aquesta conjugació està caracteritzada en profunditat per tal de garantir la estabilitat col·loïdal així com la de l’enllaç. Finalment, el disseny del conjugat té efectes significatius en les propietats farmacocinètiques, en l’evolució del propi conjugat i en la manca de toxicitat. En aquest treball mostrem en models animals com la toxicitat deguda a cisplatí disminueix clarament sense afectar això a les propietats terapèutiques del fàrmac. A més a més, les NPs no només actuen com a vehicles sinó que també protegeixen el fàrmac contra la inactivació per part de proteïnes del sèrum fins que els conjugats són internalitzats per cèl·lules i el cisplatí alliberat. La possibilitat de seguir el fàrmac (Pt) i el vehicle (Au) separadament en funció de l’òrgan i el temps aporta també un millor coneixement sobre com els nanovehicles són processats per l’organisme. / The use of nanoparticles (NPs) has emerged as a potential tool to improve cancer treatment. Among the proposed uses in imaging and therapy, their use as a drug delivery scaffold has been extensively highlighted. However, there are still some controversial points which need a deeper understanding before applying them in the clinics. Here, it is presented the use of gold nanoparticles (AuNPs) to detoxify the antitumoral agent cisplatin linked to the nanoparticle via a pH sensitive coordination bond for endosomal release. Since size of NPs plays an important role in determining biological responses such as biodistribution or clearance by immune system, a perfect control on the synthesis of AuNPs is required previously to any biological application of these AuNPs. It is described in this work a new synthetic protocol of biocompatible AuNPs with a perfect control of the size between 5 to 200 nm. One of the advantages of this protocol is the obtaining of citrate-capped AuNPs that can be further functionalized. This allowed us to provide insights on the mechanism of Self-Assembled Monolayers and mixed layers formation. The control of the mixed layer composition and conformation is important since it determines biological outcomes such as protein adsorption and colloidal stability in physiological media. These AuNPs conjugates are used as scaffold for cisplatin attachment via the formation of a coordination bond that ensures a pH-triggered release of the drug. This conjugation is deeply characterized to ensure the maintenance of colloidal and link stability on working conditions. Finally, the NP conjugate design has important effects on pharmacokinetics, conjugate evolution and biodistribution and absence of observed toxicity. Here we show that cisplatin-induced toxicity is clearly reduced without affecting the therapeutic benefits in mice models. The NPs not only act as carriers, but also protect the drug from deactivation by plasma proteins until conjugates are internalised in cells and cisplatin released. Also, the possibility to track the drug (Pt) and the vehicle (Au) separately as a function of organ and time enables a better understanding of how nanocarriers are processed by the organism.

La toxina tetánica (TeNT) es una potente neurotoxina clostridial causante de la enfermedad del tétanos. Actúa en el sistema nervioso periférico y central bloqueando la neurotransmisión inhibitoria y causando una parálisis espástica del músculo. Su extrema neuroespecificidad viene determinada por la interacción de su dominio carboxilo terminal (Hc TeNT) con las membranas neuronales mediante un mecanismo de receptor dual. Primeramente interacciona con los polisialogangliósidos, presentes en gran cantidad en la membrana plasmática, y en segundo lugar con un receptor proteico de alta afinidad que permite su endocitosis en la neurona. Aunque aún se desconoce cuál es este receptor proteico, se ha descrito que la TeNT comparte la misma ruta endocítica que las neurotrofinas y sus receptores. Las neurotrofinas son una familia de factores de crecimiento que regulan el desarrollo, el mantenimiento y la función del sistema nervioso. La interacción con sus receptores Trk (TrkA, TrkB y TrkC) y p75NTR desencadena la activación de diversas vías de señalización como la vía PI3K/Akt, la Ras/MAPK y la PLCγ/PKC, que derivan en la inducción de la supervivencia neuronal y la diferenciación. El Hc TeNT es capaz de activar a estos receptores de neurotrofinas, así como a las vías de señalización dependientes de ellos, provocando un efecto neuroprotector en distintos modelos celulares sometidos a estrés. Basándonos en estas premisas proponemos que la TeNT podría actuar sobre las neuronas mimetizando a las neurotrofinas, uniéndose a sus receptores y aprovechando su maquinaria de transporte retroaxonal para su proceso infectivo. En este trabajo se presentan evidencias que identifican al receptor TrkB como receptor proteico para la TeNT. El Hc TeNT es capaz de unirse a un péptido derivado de un dominio extracelular de TrkB y de inducir la fosforilación de éste receptor, propiedades que parecen debilitarse al mutar tres residuos de Hc TeNT en la zona de unión teórica. También compite con su agonista nativo por la unión a membranas neuronales y por la internalización junto a TrkB. Ambas moléculas además localizan conjuntamente in vivo en las uniones neuromusculares y en las motoneuronas. Centrándonos en el efecto neuroprotector observado en Hc TeNT, nos proponemos también estudiar la respuesta de la célula frente al tratamiento con neurotrofinas y con Hc TeNT después de un estímulo apoptótico, para determinar qué receptores participan, qué vías de señalización se activan y la implicación de la esfingomielinasa neutra (nSMasa) en el proceso. La nSMasa es activada por el receptor p75NTR e hidroliza la esfingomielina presente en las membranas generando ceramida, que actúa como segundo mensajero interviniendo en procesos tan dispares como la apoptosis o la supervivencia. Se ha observado que las neurotrofinas promueven la viabilidad celular actuando a través de los receptores Trk, de forma dependiente de los niveles basales de nSMasa pero no mediante el incremento de la actividad de ésta. La respuesta de supervivencia inducida por el Hc TeNT también depende de nSMasa, ya que al inhibirla o silenciarla anula este efecto. La capacidad del Hc TeNT de pasar del SNP hasta el SNC mediante saltos transinápticos, así como sus propiedades neuroprotectoras, son características de gran interés que podrían ser aplicadas en el desarrollo y la administración de fármacos al SNC. / Tetanus neurotoxin (TeNT) is a potent clostridial neurotoxin causing tetanus disease. It acts on peripheral and CNS blocking inhibitory neurotransmission and causing spastic paralysis in the muscle. Its extreme neurospecificity is determined by the interaction of the carboxyl-terminal domain (Hc-TeNT) with neuronal membranes via a dual-receptor mechanism. TeNT first binds to polysialogangliosides, and then to a second specific protein receptor that promotes its uptake. Although this protein receptor is not known yet, it has been reported that TeNT shares the same endocytic route with neurotrophins and their receptors. Neurotrophins are a family of growth factors that regulate development, maintenance and function of nervous system. The interaction with their receptors Trk (TrkA, TrkB and TrkC) and p75NTR triggers the activation of various signaling pathways like PI3K/Akt, Ras/MAPK and PLCγ/PKC, promoting neuronal survival and differentiation. Hc TeNT activates the neurotrophin receptors, as well as several signaling pathways dependent on them, inducing a neuroprotector effect in diverse cellular models. Based on these premises, we propose that TeNT acts on neurons mimicking the neurotrophins, binds to its receptors, and uses their machinery of retroaxonal transport in its infective process. In this work we present evidences that identify TrkB as a protein receptor for TeNT. Hc TeNT binds to a TrkB extracellular domain-derived peptide and acts similar to an agonist ligand for TrkB, resulting in phosphorylation of the receptor. These properties are weakened by mutagenesis of three residues of the hypothetical interaction region in Hc TeNT. It also competes with BDNF, a TrkB native ligand, for the binding to neural membranes, and for uptake in TrkB-positive vesicles. Both molecules also are located together in vivo at neuromuscular junctions and in motor neurons. Focusing on the neuroprotective effect observed for Hc TeNT, we also intend to study the cell response to treatment with neurotrophins and Hc TeNT after apoptotic stimulus. The objective is to determine which neurotrophin receptors are involved, which signaling pathways are activated and the involvement of neutral sphingomyelinase (nSMase) in the process. SMase is activated by p75NTR receptor and hydrolyzes sphingomyelin located in the membranes obtaining ceramide, which acts as a second messenger intervening in such diverse processes as apoptosis or cell survival. We find that neurotrophins promote cellular viability through Trk receptors in a manner depending on basal nSMase but not through SMase activity enhancement. Hc TeNT also induces survival in a nSMase dependent manner, since an nSMase inhibitor or siRNA knockdown abrogates its protective effects. Hc TeNT capacity to move from SNP to the CNS as well as its neuroprotective properties are characteristics of great interest that could be applied in the development and delivery of drugs to the CNS.

El arroz es uno de los cultivos más importantes del mundo, siendo el segundo cereal más producido y el alimento fundamental de casi la mitad de la población humana. Año tras año, su producción es amenazada principalmente por enfermedades como la piriculariosis, causada por el hongo Magnaporthe oryzae, escasez de agua dulce en las áreas agrícolas debido al cambio climático que golpea con periodos de sequía extrema y la pérdida de nutrientes del suelo, como el fósforo. En este contexto, es cada vez más necesario mejorar los cultivos para hacerlos más productivos y mejor adaptados a las condiciones ambientales desfavorables. Conocer los procesos y los componentes que median la respuesta natural de la planta, así como la alteración de estos componentes puede afectar a otros procesos de adaptación al entorno y a los procesos de desarrollo de la planta, es importante para el diseño de estrategias de mejora del cultivo del arroz. En este trabajo se ha caracterizado la participación funcional de OsCPK13 en la respuesta de defensa y la fertilización fosfatada, y de los miRNAs osa-miR390, osa-miR397a, osa-miR397b y osa-miR1319a como componentes reguladores de la respuesta de defensa de la planta de arroz, y en la adaptación de la planta a condiciones de sequía. El trabajo se ha estructurado en dos capítulos. El capítulo I se enfoca en la proteína OsCPK13, una proteína quinasa dependiente de calcio miembro de una familia multigénica cuyos componentes participan en la red de señalización que controla muchos aspectos de la biología de las plantas, desde procesos de desarrollo hasta las respuestas a estrés. Esta proteína se ha descrito previamente como un modulador positivo de la tolerancia a sequía y a estrés. Los estudios de esta tesis demuestran que OsCPK13 media la acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS), causando un incremento en la susceptibilidad a la infección por el hongo M. oryzae. Además demuestran que tiene un papel positivo en la translocación de fosfatos a la parte aérea de la planta, y que su sobreacumulación deriva en una acumulación tóxica de fosfatos y serios defectos en el desarrollo vegetativo y reproductivo. Estos estudios demuestran que aunque podría ser una diana de mejora de tolerancia a sequía y salinidad, y crecimiento en condiciones deficientes de fosfato en el suelo, su acumulación debe estar finamente regulada para evitar efectos pleiotrópicos negativos. El capítulo II se ha enfocado en la identificación y caracterización de miRNAs como reguladores de la respuesta de defensa. Mediante análisis de expresión global se han seleccionado 10 miRNAs regulados negativamente en respuesta a infección por M. oryzae, de los cuales se han caracterizado funcionalmente osa-MIR390, osa-MIR397a, osa-MIR397b y osa-MIR1319a e identificado sus dianas. Los resultados obtenidos demuestran que osa-miR390, osa-miR397b y osa-miR1319a son reguladores negativos de la resistencia a M. oryzae. Además se demuestra que osa-miR397a, el otro miembro de la familia de los miR397 de arroz, no participa en la respuesta de defensa frente a M. oryzae, y regula positivamente la tolerancia a sequía mostrando una especificidad funcional. Consistentemente, el gen OsLAC13, diana de los osa-miR397, que codifica una proteína lacasa, es un modulador negativo de la tolerancia a sequía. De entre todos los miRNAs estudiados, la estrategia basada en la disminución de los niveles de acumulación de osa-miR1319a parece ser la más eficaz para mejorar tanto la resistencia a la piriculariosis del arroz como la tolerancia a sequía, sin efectos aparentes en el desarrollo de la planta. / Rice is an important crop, the second most produced cereal and the staple food for more than a half of the world population. Year by year, its production is threaten by diseases like the “blast disease”, caused by the pathogenic fungus Magnaporthe oryzae, shortage of freshwater in farming areas due to climate change that strikes with extreme dry seasons, and soil nutrient losses, like phosphorus. In this context, the crop improvement is critical, in order to achieve optimal yields under adverse environmental conditions. Elucidating the mechanisms and identifying the components that mediate natural rice defenses, as well as the interactions with plant development and the adaptation to the environment processes, are important factors to consider in the design of novel and efficient strategies for rice crop improvement. In this work, the contribution of the protein OsCPK13 as a signaling component of the rice immunity and to phosphate altered condition responses, and the participation of the miRNAs, osa-miR390, osa-miR397a, osa-miR397b and osa-miR1319a, as regulators of the rice defense and water stress responses has been characterized. This thesis is organized into two chapters. Chapter I focuses on the OsCPK13, a isoform of the calcium dependent protein kinase family that function as signaling components in many aspects of plant biology, from developmental processes to stress responses. This protein has been previously described as a positive modulator of drought and salt stress tolerance. This thesis shows that OsCPK13 mediates the accumulation of reactive oxygen species (ROS) causing increased susceptibility to M. oryzae infection. Moreover, we demonstrate that OsCPK13 plays a positive role in the translocation of phosphates to the aerial part of plant, its overaccumulation leading to toxic phosphate levels in leaves, and serious defects in vegetative and reproductive development. These studies demonstrate that although OsCPK13 could be a good target for improving drought and salt tolerance, and growth in phosphate-deficient conditions, its accumulation must be tightly regulated to avoid negative pleiotropic effects. Chapter II focuses on the identification and characterization of miRNAs as regulators of the defense response. Using global expression analysis, 10 miRNAs negatively regulated in response to M. oryzae infection have been selected. From these ten, osa-MIR390, osa-MIR397a, osa-MIR397b and osa-MIR1319a were functionally characterized and their targets identified. This thesis shows that osa-miR390, osa-miR397b and osa-miR1319a are negative regulators of M. oryzae resistance. Interestingly, the osa-miR397a, the other family member of miR397, is not involved M. oryzae defense response but regulates drought tolerance, implying a functional specificity among members of a same miRNAs family. Consistently, the OsLAC13 gene, the target of osa-miR397, was identified as a negative modulator of drought tolerance. Among these miRNAs, the strategy based on reducing osa-miR1319a accumulation appears promising to improve both blast resistance and drought tolerance, without affecting plant performance.

En los últimos 10 años, diferentes inmunoestimulantes han sido probados en más de 18 especies de peces, incluyendo carpa, turbot, salmón del atlántico, dorada, trucha, entre otros. Los compuestos que han sido estudiados son muy variados e incluyen componentes bacterianos, polisacáridos, extractos de plantas, algas y animales, factores nutricionales, e incluso hormonas y citoquinas. Sin embargo, a pesar del gran interés que han generado estos estudios, los inmunoestimulantes dietarios comercialmente disponibles contienen principalmente sólo β-glucanos. La mayoría de los estudios están basados en la respuesta celular de los peces, como actividad fagocítica, especies reactivas de oxígeno (ROS), y mediciones en sangres, como contenido de IgM en suero. La gran mayoría de estos estudios han mostrado resultados positivos, pero se sabe muy poco sobre los mecanismos moleculares que hay detrás de la respuesta a la administración de inmunoestimulantes a través de la dieta. Por lo anteriormente mencionado, el objetivo principal de este trabajo es evaluar a respuesta transcriptómica de las branquias de peces alimentados con dietas inmunoestimulantes, utilizando dos acercamientos, el molecular y celular. Experimentalmente, 360 doradas (Sparus aurata) sanas, de un peso promedio de 38±7.3 g fueron separados en 27 tanques y alimentados con dos dietas inmunoestimulantes manufacturadas por Skretting (Dieta A y Dieta B) y una dieta control (Dieta C, Skretting). Cada dieta fue administrada los peces a una razón del 3% de su masa corporal dos veces al día, con un periodo de pre-aclimatación de 14 días. Muestras de agallas fueron tomadas a 2, 7, 14 y 28 días de administración de la dieta. Todas las muestras fueron divididas en dos para realizar un análisis de microarray (Microarray específico para dorada 44K, diseñado por Agilent) y para un análisis in situ. Los datos de microarray fueron analizados con dos métodos, con un análisis referente al control y un análisis en loop. Los resultados del microarray mostraron la expresión diferencial de genes relacionados a procesos inmunológicos, como inflamación, activación y respuesta de células T, apoptosis, entre otros, sin embargo la intensidad y magnitud de la respuesta no fue muy alta. Los resultados del análisis in situ mostró que algunos de estos transcritos se localizaron en un tipo celular ubicado en la lamela secundaria de las agallas de dorada. Estas células, podrían ser células clorhídricas o linfocitos T, pero más estudios hacen falta para poder confirmar estas hipótesis. / Over the past 10 years, different immunostimulants have been tested in more than 18 fish species including: Carp, Yellow croaker, Turbot, Atlantic salmon and Seabream, amongst others. The compounds tested are varied including bacterial components, polysaccharides, animal, plant and algae extract, nutritional factors, and even hormones and cytokines and some synthetics such as Levamisole. However even although a lot of interest and studies have been carried out, commercially available immunostimulant diets mainly contain β-glucans. The majority of the studies reported are based upon cellular response assays such as phagocyte activity and ROS and simple blood measurements such as total serum IgM content. All studies have shown positive results, but little is known about the underlying molecular response to dietary administration of immunostimulants. In order to evaluate the transcriptomic response in gills we analyzed and evaluated gene expression profiles associated with exposure to immunostimulant diets over time, using both a molecular and cellular approach. Experimentally, 360 healthy Gilthead Seabream (Sparus aurata) of average body weight of 38±7.3 g were separated in 27 tanks and fed with two Skretting immunostimulant diets (Diet A and Diet B) and a control diet (Diet C). Each diet were fed at a feeding rate of 3% of body weight twice daily for 28 days with a period of 14 days of pre-acclimation. Gills samples were taken at 2, 7, 14 and 28 days post diet. All samples were divided for microarray analysis (specific Sparus aurata 44K microarray, Agilent custom design) and in situ hybridization (ISH) analysis. A diet dependent and a loop analysis were carried out, with control diet as a reference point. Microarray results shown a differential expression of genes associated to immunological processes such as inflammation, T and B cell response amongst others but the intensity and magnitude of the modulation of these responses was not high. ISH analysis showed localization of immunological transcripts in a specific cellular type in the primary lamellae of gilthead seabream gills.

La dislipèmia i la hipertensió són factors clàssics de risc cardiovascular, relacionats amb el desenvolupament de l’arteriosclerosi. Donat a què el colesterol de la lipoproteïna d’alta densitat (HDL) ha estat inversament relacionat a l’aterogènesi, les teràpies han estat focalitzades en incrementar el colesterol HDL. Assaigs clínics que han fet augmentar el colesterol HDL han estat associats a un increment de mortalitat, tot i que en estudis recents aquesta ha estat atribuïda a efectes secundaris de la medicació. A més, últimament s’ha publicat que variants genètiques que predisposen a tenir un colesterol-HDL elevat no estan associades a tenir menys risc de patir un event coronari. Tot això ha fet que la funcionalitat de l’HDL sigui considerada com un aspecte més important que la seva quantitat. Els compostos fenòlics (CF) de l’oli d’oliva (OO) són protectors front malalties coronàries del cor incrementant la concentració de colesterol HDL, disminuïnt in vivo el dany oxidatiu a lípids, activant la funció de l’HDL, i millorant la funció endotelial. En aquest context, l’enriquiment de l’oli d’oliva verge (OOV) amb CF és una estrategia prometadora que permet no incrementar el greix consumit, no obstant aquest enriquiment podria tenir una doble acció perquè un excés d’antioxidants podria també revertir-los a pro-oxidants. Olis d’oliva verge funcionals amb antioxidants complementaris, acord amb la seva relació estructura/activitat, podria ser una opció adequada per obtenir més efectes beneficiosos. L’objectiu d’aquest present treball va ser investigar, en humans amb risc cardiovascular, si: (i) un OO verge enriquit amb els seus compostos fenòlics (OOVF; 961 ppm) modula l’expressió gènica de gens relacionats amb l’eflux de colesterol i la funció endotelial, comparat amb un OO verge (OOV; 289 ppm); i si (ii) OOs verge funcionals, un enriquit amb els seus CFOO (OOFV; 500 ppm) i un altre amb els seus CFOO (250 ppm) més CF de la farigola (250 ppm) (OOFVT; total: 500 ppm), podria millorar propietats relacionades amb la funcionalitat de l’HDL en comparació amb un OO verge control (OOV; 80 ppm). Dos assaigs clínics, creuats, aleatoritzats, doble cecs i controlats han estat realitzats: (i) 13 humans pre-/hipertensos van rebre una dosi única de 30 mL de OOV (289 ppm) i OOFV (961 ppm); i (ii) 33 individus hipercolesterolèmics van ingerir 25 mL/dia durant 3 setmanes de OOV (80 ppm), OOVF (500 ppm), i OOVFT (500 ppm). Els resultats indiquen que una dosi única d’OOVF va incrementar l’expressió gènica de gens relacionats amb l’eflux de colesterol comparat amb el consum de OOV, concretament d’ATP binding cassette transporter-A1, scavenger receptor class B type 1, peroxisome proliferator-activated receptors (PPARBP, PPARα, PPARγ, PPARδ), i CD36. A més, aquest consum va augmentar la hiperèmia isquèmica reactiva comparat amb el d’OOV. En aquest sentit, una disminució de l’inhibidor de l’activador del plasminogen-1 va ser observada després de l’OOVF comparat amb l’OOV. Una intervenció sostinguda d’OOVFT va incrementar el percentatge de la subclasse gran d’HDL en comparació a la d’OOV, i també va augmentar els ratios colesterol esterificat/colesterol lliure i fosfolípids/colesterol lliure en HDL comparat amb les intervencions d’OOV i OOVF. A més a més, el consum d’OOVFT va incrementar la massa de lecitin colesterol acil transferasa comparat amb el d’OOV. En conclusió, un consum postprandial d’OOVF millora la transcriptòmica de l’eflux de colesterol, la funció endotelial, i els marcadors de inflamació. També, els beneficis aconseguits amb el consum sostingut de OOVFT sobre el perfil funcional d’HDL han estat demostrats. Els resultats d’aquests estudis suggereixen que el OOVF i el OOVFT podrien ser eines dietètiques útils en el maneig de pacients amb risc cardiovascular. / Dyslipidemia and hypertension are the classical risk factors of cardiovascular diseases related to atherosclerosis development. Due to the fact that high-density lipoprotein (HDL) cholesterol has been inversely related to atherogenesis, therapies have focused on increasing HDL-cholesterol. Clinical trials which augment HDL have shown an increased mortality risk, however, recent studies have attributed to side effects. Moreover, it has lately been reported that genetic variants predisposing to high HDL-C are not associated with a lower risk of suffering a coronary event. All of the above has led to HDL functionality being considered as a more important aspect than its quantity. Olive oil (OO) phenolic compounds (PC) are protective against risk factors for coronary heart disease by increasing HDL cholesterol concentration, decreasing in vivo lipid oxidative damage, enhancing HDL function, and improving endothelial function. Within this context, the enrichment of virgin olive oil (VOO) with PC is a promising strategy as it does not increase the amount of fat consumed, nevertheless such enrichment might have a dual action because an excess of antioxidants could also revert them to pro-oxidants. Functional virgin OOs with complementary antioxidants, according to their structure/activity relationship, could be a suitable option to obtain greater beneficial effects. The scope of the present work was to investigate, in cardiovascular risk subjects, whether: (i) a functional virgin OO enriched with its own OOPC (FVOO; 961 ppm) modulates the cholesterol efflux-related gene expression and endothelial function, compared to a virgin OO (VOO; 289 ppm); and whether (ii) functional virgin OOs, one enriched with its own OOPC (FVOO; 500 ppm) and another with its own OOPC (250 ppm) plus additional complementary PC from thyme (250 ppm) (FVOOT; total: 500 ppm), could improve HDL functionality-related properties versus a virgin OO control (VOO; 80 ppm). Two cross-over, randomized, double blind, control trial were performed: (i) 13 pre-/hypertensive subjects received a single 30 mL dose of VOO (289 ppm) and FVOO (961 ppm); and (ii) 33 hypercholesterolemic individuals ingested 25 mL/day during 3 weeks of VOO (80 ppm), FVOO (500 ppm), FVOOT (500 ppm). The results indicate that a single dose of FVOO increased cholesterol efflux gene expression compared with VOO consumption, specifically ATP binding cassette transporter-A1, scavenger receptor class B type 1, peroxisome proliferator-activated receptors (PPARBP, PPARα, PPARγ, PPARδ), and CD36. Moreover, this consumption augmented ischemic reactive hyperemia versus the VOO one. In this regard, a decrease of circulating plasminogen activator inhibitor-1 was observed after FVOO compared to VOO. A sustained intervention of FVOOT increased large HDL subclass percentage versus VOO, and also augmented esterified cholesterol/free cholesterol and phospholipids/free cholesterol ratios in HDL compared with the VOO and FVOO interventions. In addition, FVOOT consumption increased lecithin-cholesterol acyltransferase mass compared with VOO one. In conclusion, a postprandial consumption of a FVOO improves cholesterol efflux transcriptomics, endothelial function, and inflammatory biomarkers. Furthermore, the benefits achieved with FVOOT sustained consumption on the HDL functional profile have been demonstrated. Data from our studies suggest that FVOO and FVOOT could be a useful dietary tool in the management of cardiovascular risk patients.

Les proteïnes quinasa dependents de calci (CDPKs o CPKs) són components de senyalització presents en molts aspectes de la biologia de les plantes, des dels processos de desenvolupament fins a les respostes a estrès. Aquesta tesi aborda la identificació i la caracterització funcional de les isoformes OsCPK que intervenen en la resposta de defensa de l’arròs contra els patògens, així com la seva contribució a d´altres vies de senyalització. Aquests estudis són necessaris per entendre les interaccions entre diferents vies de senyalització d’estrès i desenvolupament. Un millor coneixement d’aquestes interaccions entre vies de senyalització, i la identificació dels components que les regulen, són importants per al disseny d’estratègies de millora de la tolerància a estrès en plantes. Tots aquests estudis s’apliquen a l’arròs, un important cultiu tant econòmic com social a nivell mundial. El treball d’aquesta tesi es divideix en tres capítols. El primer capítol es centra en la identificació de gens OsCPK implicats en la resposta de defensa contra el fong del cremat de l’arròs, Magnaporthe oryzae, mitjançant una anàlisi d’expressió global. Aquests estudis es complementen amb anàlisis específiques dels perfils d’expressió en els quals s’identifiquen OsCPK4 i OsCPK10 com a gens induïts en resposta a la infecció per M. oryzae, encara que els gens OsCPK13 i OsCPK5 també responen a elicitors fúngics. El segon capítol aborda la caracterització funcional del gen OsCPK4 en la resposta de defensa de l’arròs contra M. oryzae. La sobreexpressió d´OsCPK4 confereix una millor resistència a la infecció de M. oryzae en les plantes d’arròs potenciant les seves respostes de defensa, que inclouen la producció d’espècies reactives de l’oxigen, deposicions de calosa, i l’expressió de gens de defensa. Totes s’associen a una acumulació superior d’àcid salicílic conjugat en fulles, sense comprometre el desenvolupament de les plantes. Atès que se sap que la sobreexpressió d´OsCPK4 confereix més tolerància a la salinitat i a la sequera, aquests resultats demostren que la OsCPK4 actua com a punt de convergència modulant positivament ambdues vies de senyalització d’estrès biòtic i abiòtic en plantes d’arròs. La caracterització funcional del gen OsCPK10 es presenta en el tercer capítol. Aquests estudis demostren que OsCPK10 també és un modulador positiu de la resposta de defensa contra M. oryzae i de la resposta a estrès per sequera en plantes d’arròs. L’acumulació constitutiva de la proteïna OsCPK10 confereix a les plantes d’arròs una millor tolerància a l’estrès oxidatiu causada per un increment de la capacitat antioxidant. Aquest augment de la capacitat d’eliminar el peròxid d’hidrogen tòxic produït durant la dessecació és degut en part a una acumulació més gran de Catalasa A, cosa que comporta la reducció de peroxidació lipídica i la preservació de la integritat de la membrana cel·lular, donant com a resultat la tolerància a estrès per sequera. En conjunt, els resultats d’aquesta tesi identifiquen les proteïnes OsCPK4 i OsCPK10 com a components de convergència que modulen positivament ambdues vies de senyalització a estrès biòtic i abiòtic, suggerint que són bones dianes moleculars per a la millora de la tolerància a diferents estressos en les plantes d’arròs / Las proteínas quinasa dependientes de calcio (CDPKs o CPKs) son componentes de señalización presentes en muchos aspectos de la biología de las plantas, desde los procesos de desarrollo hasta las respuestas a estrés. Esta tesis aborda la identificación y la caracterización funcional de las isoformas OsCPK que median la respuesta de defensa del arroz frente a patógenos, así como su contribución en otras vías de señalización. Estos estudios son necesarios para entender las interacciones entre distintas vías de señalización de estrés y desarrollo. Un mejor conocimiento de estos interacciones entre vías de señalización, y la identificación de los componentes que los regulan, son importantes para el diseño de estrategias de mejora de la tolerancia a estrés en plantas. Todos estos estudios se aplican a las plantas de arroz, un importante cultivo tanto económico como social a nivel mundial. El trabajo de esta tesis se divide en tres capítulos. El primer capítulo se centra en la identificación de genes OsCPK implicados en la respuesta de defensa frente al hongo del quemado del arroz, Magnaporthe oryzae, mediante un análisis de expresión global. Estos estudios se complementan con análisis específicos de los perfiles de expresión en los que se identifican a OsCPK4 y OsCPK10 como genes inducidos en respuesta a la infección por M. oryzae, aunque los genes OsCPK13 y OsCPK5 también responden a elicitores fúngicos. El segundo capítulo aborda la caracterización funcional del gen OsCPK4 en la respuesta de defensa del arroz frente a M. oryzae. La sobreexpresión de OsCPK4 confiere una mayor resistencia a la infección por M. oryzae en las plantas de arroz, potenciando sus respuestas de defensa, que incluyen la producción de especies reactivas del oxígeno, deposiciones de callosa, y la expresión de genes de defensa, todo ello asociado a una mayor acumulación de ácido salicílico conjugado en hojas, sin comprometer el desarrollo de las plantas. Dado que se sabe que la sobrexpresión de OsCPK4 confiere además tolerancia a salinidad y la sequía, estos resultados demuestran que la OsCPK4 actúa como punto de convergencia modulando positivamente ambas vías de señalización de estrés biótico y abiótico en plantas de arroz. La caracterización funcional del gen OsCPK10 se presenta en el tercer capítulo. Estos estudios demuestran que OsCPK10 también es un modulador positivo de la respuesta de defensa frente a la infección por M. oryzae y de la respuesta a estrés por sequía en plantas de arroz. La acumulación constitutiva de la proteína OsCPK10 confiere a las plantas de arroz una mejor tolerancia al estrés oxidativo debido a una mayor capacidad antioxidante. Esta mayor capacidad de eliminar el peróxido de hidrógeno tóxico producido durante la desecación es debida en parte a una mayor acumulación de Catalasa A, lo que conlleva la reducción de peroxidación lipídica y la preservación de la integridad de la membrana celular, dando como resultado la tolerancia a estrés por sequía. En conjunto, los resultados de esta tesis identifican las proteínas OsCPK4 y OsCPK10 como componentes de convergencia que modulan positivamente ambas vías de señalización a estrés biótico y abiótico, sugiriendo que son buenas dianas moleculares para la mejora de la tolerancia a distintos estreses en las plantas de arroz / Calcium-dependent protein kinases (CDPKs or CPKs) are signaling components in many aspects of plant biology, from developmental processes to stress responses. This thesis addresses the identification and functional characterization of the OsCPK isoforms mediating the rice defense response to pathogens, as well as their contribution to other signaling pathways. These studies are important to understand the interactions between different stress signaling pathways and the development process in rice plants. A better understanding of these crosstalks among signaling pathways, as well as the identification of the signaling components mediating them, are relevant to develop strategies to improve plant stress tolerance. All these studies apply to rice plants, an economical and social important crop worldwide. The work of this thesis is divided in three chapters. The first chapter focuses on the identification of OsCPK genes involved in the defense response to the rice blast fungal pathogen Magnaporthe oryzae by global expression analysis. These studies complemented with specific expression profile analyses which identified OsCPK4 and OsCPK10 as upregulated genes in response to M. oryzae fungal infection, although the OsCPK5 and OsCPK13 genes were also responding to fungal elicitors. The second chapter addresses the functional characterization of the OsCPK4 gene in the rice defense response to the M. oryzae pathogen. The overexpression of the OsCPK4 gene conferred enhanced resistance to M. oryzae infection in rice plants by potentiating their defense responses, including the production of reactive oxygen species, callose deposition, and defense gene expression, associated to an increased accumulation of conjugated salicylic acid in leaves without compromising rice yield. Given that OsCPK4 overexpression was known to confer also salt and drought tolerance in rice, these results demonstrate that OsCPK4 acts as a convergence component that positively modulates both biotic and abiotic signaling pathways in rice. The functional characterization of the OsCPK10 gene is presented in the third chapter. These studies demonstrate that OsCPK10 is also a positive modulator of both the defense response to M. oryzae infection and the drought stress response in rice plants. The constitutive accumulation of OsCPK10 conferred the rice plants with an improved tolerance to oxidative stress by increasing their antioxidant capacity. This improved capacity to scavenge the produced toxic hydrogen peroxide upon desiccation is due in part to an increased accumulation of the Catalase A, which leads to a reduction in lipid peroxidation and preservation of the cellular membrane integrity, and as a result drought stress tolerance. All together, the results of this thesis identify the OsCPK4 and the OsCPK10 proteins as convergence components that positively modulate both biotic and abiotic signaling pathways, suggesting they are good molecular targets to improve tolerance to different stresses in rice plants.

Las metalocarboxipeptidasas (MCPs) son enzimas zinc-dependientes que hidrolizan amino ácidos del extremo C terminal en proteínas y péptidos. La primera MCP en ser identificada fue la carboxipeptidasa A1 (CPA1), una enzima pancreática que hidroliza residuos C terminales hidrofóbicos. En las décadas siguientes después del descubrimiento de la CPA1, docenas de MCPs adicionales han sido descritas en diferentes tejidos y fluidos extrapancreaticos, comprendiendo un amplio rango de funciones fisiológicas que van desde la digestión de los alimentos hasta la producción de neuropéptidos y hormonas peptídicas o el procesamiento selectivo de la tubulina. La presente tesis tiene como objeto profundizar en el conocimiento de la estructura y función biológica de dos MCPs reguladoras. Para este propósito, se aplicaron un amplio espectro de aproximaciones bioquímicas con el fin de elucidar la actividad biológica de las carboxipeptidasas D y Z humanas. Además, se decidió estudiar por primera vez la estructura y funciones de los dominios tipo transtiretina (TTL) que se encuentran en todos los miembros de esta subfamilia de proteasas, escogiéndose como ejemplo el primer dominio TTL perteneciente al primer dominio catalítico de la carboxipeptidasa D humana (denominada en este trabajo como h-TTL). En el primer capítulo se describe la formación de estructuras amiloides bajo condiciones fisiológicas por el dominio h-TTL, y se descubre que el motivo de plegamiento transtiretina monomérico tiene una propensión inherente a agregar, dada la presencia de elementos estructurales amiloidogénicos preformados. El mecanismo de agregación que se describe en este trabajo para una proteína nativa monomérica tipo transtiretina, también se ha encontrado en diversas proteínas globulares, inicialmente solubles y asociadas con enfermedades conformacionales que se generan por la deposición de agregados, pudiendo ser un hecho genérico para motivos de plegamiento que muestren elementos amiloidogenicos preformados en sus estructuras, esencialmente hojas β. El segundo capítulo muestra la estructura cristalográfica resuelta a súper alta resolución de la h-TTL descrita en el primer capítulo. La información derivada del presente estudio podría facilitar el conocimiento del papel biológico de los dominios TTL encontrados en todos los miembros de la subfamilia M14B, pudiendo ser utilizada como una herramienta interesante para analizar en detalle las propiedades estructurales y los mecanismos de plegamiento de estos dominios. El tercer capítulo comprende la caracterización de la especificidad de sustrato de la carboxipeptidasa D humana, utilizando una combinación de diferentes aproximaciones peptidómicas cuantitativas. Esta enzima única con múltiples centros catalíticos, podría estar implicada en el procesamiento de neuropéptidos y factores de crecimiento. Por lo tanto, el estudio de su mecanismo de acción es de especial relevancia para el campo de la biomedicina. En el cuarto capítulo se describe el desarrollo de un método simple y barato para mejorar la producción proteica de carboxipeptidasas que presentan afinidad por heparina usando células de mamífero, cogiendo como ejemplo el caso de la carboxipeptidasa Z. La proteína purificada mediante este sistema es enzimáticamente activa y puede ser utilizada para estudios estructurales y funcionales de alto rendimiento. En el último capítulo se utilizan diferentes aproximaciones peptidómicas cuantitativas para caracterizar la especificidad de sustrato de la carboxipeptidasa Z humana. Además, en este trabajo se presenta el modelado de su dominio catalítico, así como el de su dominio tipo frizzled, con el fin de analizar su papel en la vía señalización de Wnt. / Metallocarboxypeptidases (MCPs) are zinc-dependent enzymes that cleave single amino acids from the C termini of proteins and peptides. The first MCP to be identified was carboxypeptidase A1 (CPA1), a pancreatic enzyme that removes C-terminal hydrophobic residues. In the ensuing decades since the discovery of CPA1, dozens of additional MCPs have been found in different extra-pancreatic tissues and fluids, comprising a wide range of physiological roles ranging from digestion of food to the production of neuropeptides and peptide hormones and the selective processing of tubulin. The present thesis has the aim to gain insights into the knowledge of the structure and biological functions of two regulatory MCPs. For this purpose, we applied a wide range of biochemical approaches to elucidate biological activities of human carboxypeptidases D and Z. Furthermore, we decided to study for the first time the structure and roles of the transthyretin-like (TTL) domains found in all members of this subfamily of proteases, taking as example the first TTL domain belonging to the first catalytic domain of human carboxypeptidase D (termed here as h-TTL). The first chapter describes the amyloid formation under physiological conditions by h-TTL and unravels that the monomeric transthyretin fold has an inherent propensity to aggregate due to the presence of preformed amyloidogenic structural elements. The aggregation mechanism described in this work for a natively monomeric transthyretin-like protein, is being found also in a number of initially soluble globular proteins associated with protein deposition diseases and might be in fact quite generic for folds displaying preformed amyloidogenic elements in their structures, essentially β-sheets. The second chapter presents the crystal structure solved at ultra-high resolution of the h-TTL described in the first chapter. The information derived in the present study might facilitate the understanding of the biological roles of the TTL domains found in M14B subfamily members and would be an interesting tool to analyze in detail the structural properties and the folding mechanisms of these domains. The third chapter comprises the characterization of the substrate specificity of human carboxypeptidase D by using a combination of quantitative peptidomic approaches. This unique enzyme with multiple catalytic sites might be implicated in the processing of neuropeptides and growth factors. Thereby, the study of its mechanism of action is of significant importance for biomedicine. The fourth chapter describes de development of a simple and inexpensive method to improve protein production of heparin-affinity carboxypeptidases using mammalian cells, taking as example the case of carboxypeptidase Z. The purified protein is enzymatically active and can be used for high-throughput functional and structural studies. The fifth chapter applies several quantitative peptidomic approaches to characterize the substrate specificity of the human carboxypeptidase Z. Furthermore, this work provides the modelling of its catalytic domain, as well as of their frizzled-like domain, in order to analyze their role in Wnt signaling.

El estudio de los astrocitos se ha vuelto muy relevante en el ámbito de las neurociencias desde el descubrimiento, a principios de los años 90, de que aquellas “células de soporte” podían responder a la actividad sináptica. Actualmente, está aceptado que los astrocitos poseen la capacidad de modular la transmisión sináptica a través de la liberación de moléculas que actúan tanto en el terminal pre-sináptico como en el post-sináptico, los llamados gliotransmisores. Sin embargo, todavía quedan muchas cuestiones por resolver sobre el papel que juega esta población de células gliales en la fisiología cerebral. En el presente trabajo, hemos estudiado un campo ampliamente explorado en neuronas pero poco conocido en astrocitos: la transcripción dependiente de CREB. Este factor de transcripción expresado en todos los tipos celulares integra respuestas de todo tipo de estímulos y, por tanto, regula numerosos procesos tanto fisiológicos como patológicos. En neuronas, CREB es un factor clave en los mecanismos de plasticidad sináptica, que son la base para la adquisición de nuevas memorias, y también participa en los procesos neuroprotectores desencadenados por numerosas patologías cerebrales. Dado que los astrocitos participan tanto en procesos de regulación de la actividad sináptica como en neuroprotección, nuestro estudio pretende determinar en qué medida estas funciones están reguladas por CREB. Para ello hemos caracterizado, en cultivos primarios de astrocitos, los mecanismos moleculares de la activación de CREB tras la estimulación con los transmisores ATP y NE, y hemos estudiado los programas genéticos inducidos por la activación de CREB a través de diferentes vías de señalización. Finalmente, hemos determinado el papel protector del CREB astrocitario en un modelo murino de daño cerebral agudo. Los principales hallazgos de esta tesis son: (i) una nueva vía de señalización que activa CREB en astrocitos, (ii) la asociación de los programas transcripcionales de CREB con el metabolismo oxidativo, la homeostasis y la comunicación celular, (iii) el papel neuroprotector del CREB astrocitario en un modelo de daño cerebral a través de un incremento de la supervivencia neuronal y regeneración axonal, un descenso de la inflamación y un rescate energético a través de la estimulación de vías metabólicas mitocondriales. / The study of astrocytes has become highly relevant in the realm of neurosciences since the discovery in the early 90’s that those “supportive cells” can respond to synaptic activity. Nowadays, it is accepted that astrocytes have the ability to modulate synaptic transmission through the release of molecules that act at both pre-synaptic and post-synaptic sites, the so-called gliotransmitters. However, there are still many questions to be solved about the role of this glial cell population in brain physiology. In the present work, we studied a field that has been largely explored in neurons, but that is poorly known in astrocytes: the CREB-dependent transcription. This widely-expressed transcription factor integrates the cellular responses of multiple stimuli, thus regulating numerous physiological and pathological functions. In neurons, CREB is a key player in the mechanisms that underlie synaptic plasticity, which is the molecular basis of memory acquisition, and it is involved in neuroprotective processes triggered by several brain disorders. Given the fact that astrocytes also play a role in synaptic activity and neuroprotection, we ought to know whether those functions are regulated by astrocytic CREB. Thus, we studied the molecular mechanisms of CREB activation in cell cultures upon stimulation with the transmitters ATP and NE and characterized the transcriptional programs triggered by CREB activation through different signalling pathways. Finally, we determine the protective roles of astrocytic CREB in a mouse model of traumatic brain injury. The main findings of this thesis are: (i) a novel signalling pathway for CREB activation in astrocytes, (ii) the functional association of CREB-dependent transcriptional programs with oxidative metabolism, homeostasis and intercellular communication, and (iii) the neuroprotective roles of astrocytic CREB in a model of traumatic brain injury, through an increase in neuronal survival and axonal regeneration, a decrease in inflammation and a rescue of bioenergetic failure by increasing the mitochondrial metabolic pathways.

La microbiota intestinal es un factor determinante de la homeostasis intestinal, siendo por lo tanto un agente imprescindible del estado de salud. Su composición podría estar alterada como consecuencia de factores externos tales como tratamientos con antibióticos o causada por enfermedades intestinales como el síndrome del intestino irritable (SII). Esta tesis doctoral se centró en la comprensión de la alteración de esta ecología microbiana con respecto a una terapia con antibióticos y la presencia de movimientos intestinales modificados en personas que sufren de síndrome de intestino irritable. Nuestros resultados mostraron que la baja diversidad surgida después del tratamiento con antibióticos fue asociada, inesperadamente, con un aumento de la carga bacteriana total. Sin embargo, sujetos afectados con SII, particularmente del subtipo diarreico, tenían menor diversidad bacteriana acompañada de una reducción de las bacterias productoras de butirato y de las productoras de metano comparado con sujetos sanos. En general los hallazgos de este estudio son que una administración incontrolada de antibióticos puede causar cambios severos en la composición de la comunidad bacteriana intestinal, favorecer el sobrecrecimiento de microbios resistentes y esta observación puede explicar que las alteraciones microbianas en etapas iniciales de la vida podrían llegar a desarrollar enfermedades intestinales. / The intestinal microbiota is a key determinant of gut homeostasis, thereby being an imperative agent of health status. Its composition could be altered as a consequence of external factors such as antibiotic treatment or as a possible cause of intestinal disorders such as irritable bowel syndrome (IBS). In this doctoral thesis we focused on understanding to which extent antibiotic treatment could modify the gut microbiome and how an alteration of its composition could be associated with IBS. Our results showed that the lower diversity occurring after antibiotic treatment was unexpectedly associated with an increase of the overall microbial load. Furthermore, subjects suffering from IBS, particularly diarrhoea predominant subtype, had lower bacterial diversity accompanied by a reduced relative abundance of butyrate-producing and methanogenic microbes compared to healthy subjects. Altogether the findings of this study are that uncontrolled intake of antibiotics may cause tremendous changes in the gut microbial community composition, favouring the overgrowth of resistant microbes; and this observation may explain that alterations of the microbial composition earlier in life could lead to intestinal disorders.