La búsqueda de procesos de síntesis de moléculas orgánicas altamente eficientes y selectivos es uno de los retos de la química. En los últimos años, las enzimas se han presentado como una seria alternativa a los catalizadores homogéneos tradicionales debido a su alta eficiencia y selectividad natural. Desafortunadamente, las reacciones que pueden catalizar estas especies se suelen restringir a aquellas que tienen importancia para el huésped que las alberga, limitando su aplicación en el ámbito químico/industrial. Para poder solventar estas limitaciones se han desarrollado las llamadas metaloenzimas artificiales. Estos híbridos se obtienen a partir de la inserción de un catalizador homogéneo en una proteína. De este modo el receptor protege el cofactor inorgánico y aporta un entorno quiral (enantioselectivo) mientras que el metal es responsable de la reactividad del sistema. Pero el diseño de estos híbridos representa todo un reto: la proteína no ha sido diseñada evolutivamente para reconocer el fragmento inorgánico y el complejo resultante puede no reconocer de forma eficiente el sustrato. Todo esto provoca que la enzima diseñada presente deficiencias en cuanto a la eficiencia catalítica y/o selectividad. Las técnicas de modelización molecular pueden resultar de gran ayuda en el proceso de diseño y de optimización de las metaloenzimas artificiales. Sin embargo, su aplicación en este tipo de sistemas no es trivial. Necesitamos técnicas que permiten una amplia y rápida búsqueda tanto del espacio conformacional como del químico (mecánica molecular) así cómo técnicas que permitan una descripción precisa del metal y sus propiedad electrónicas (mecánica cuántica). Lamentablemente, estas últimas son demasiado costosas a nivel computacional cómo para poder tratar sistemas de estas dimensiones. En esta tesis nos hemos basado en la combinación de diferentes técnicas de modelización molecular, basadas tanto en aproximaciones mecanoclásicas como mecanocuánticas, para poder solventar estas limitaciones. Este enfoque ha sido aplicado al diseño y optimización de metaloenzimas artificiales. En primer lugar hemos estudiado la unión entre el cofactor inorgánico y la proteína, obteniendo una gran correlación entre los modelos teóricos y los resultados experimentales. A continuación las hemos aplicado al estudio de la reactividad del sistema, tanto a la unión del sustrato al complejo proteína-cofactor como a la caracterización de los estados de transición más probables. En este último caso hemos podido comprobar que estos protocolos integrativos son capaces de ofrecer un nivel muy aceptable de predictibilidad de la enantioselectividad del sistema. Aunque en esta tesis hemos demostrado la gran utilidad que pueden tener los protocolos que integran diversas técnicas de modelización molecular en el estudio de complejos biometálicos, su desarrollo no es trivial. La mayoría de programas de modelización molecular no han sido diseñados para ser utilizados en tándem y todos ellos tienen su propia forma de tratar la información molecular. Para solventar estas incompatibilidades se necesitaría una plataforma integrativa que englobara todas estas técnicas y regulara el flujo de información entre ellas. A nivel comercial estas plataformas ya existen, pero su uso es altamente restrictivo ya que son muy caras y son de código cerrado, dejando muy poco margen para su adaptabilidad a cada problema molecular. Por este motivo en esta tesis nos hemos centrado en el desarrollo de una plataforma integrativa de código abierto accesible a toda la comunidad de modelizadores. Hasta el momento, esta plataforma incluye interfaces para realizar cálculos de modos normales y dinámicas moleculares, así como permitir el análisis de cálculos cuánticos con Gaussian y cálculos de docking proteína-ligando con GOLD. Se espera incorporar muchas mas técnicas en un futuro próximo. / The search of highly efficient and selective processes for the synthesis of organic molecules is one of the challenges of chemistry. In the last years, enzymes have positioned as a clear alternative to traditional homogeneous catalysts due to their high natural efficiency and selectivity. Unfortunately, their range of different reactions is restricted to those that are useful for their host. To solve this limitation the so-called artificial metalloenzymes have been developed. These hybrids are based on the insertion of an homogeneous catalyst into a protein scaffold. This way, the receptor protects the inorganic cofactor and provides with a chiral (enantioselective) environment while the metal is responsible for the reactivity of the system. However, their design is highly challenging: the protein has not been optimized to bind such inorganic compounds and the resulting complex may not efficiently recognize the substrate. Altogether, these could mean that the artificial enzyme has several deficiencies in terms of catalytic efficiency and/or enantioselectivity. Molecular modelling techniques could aid in the design and optimization of artificial metalloenzymes. However, their application is not straightforward due to the complexity of these hybrids. We need both techniques allowing wide and fast conformational and chemical space searches (molecular mechanics) and techniques offering an accurate description of the metal and its electronic states (quantum mechanics). Unfortunately, the later ones are too computational intensive to treat systems of a huge size such as enzymes. In this Ph. D. thesis we combined several molecular modeling techniques, based either in classical or quantum mechanics approximations, to solve those limitations. This approach has been applied on the design and optimization of artificial metalloenzymes. First, we have studied the binding of the inorfanic cofactor in the protein scaffold, obtaining very good agreement between the theoretical models and the experimental results. Afterwards, we applied them to the study of the reactivity of the system, including the binding of the substrate to the cofactor-protein complex and the characterization of the most-likely transition states. In this last case we demonstrated that these kind of integrative protocols are able to offer high predictive profiles of the enantioselectivity of the system. Even though in Ph. D. thesis we have demonstrated the great utility that integrative approaches encompassing several different molecular modeling tehcniques could have in the study of biometallic complexes, their development is far from easy. The major part of modeling softwares have not been designed to be part of this kind of integrative protocols and each one of them has their own way to treat the molecular data. To solve those incompatibilities, it is necessary an integrative platform encompassing all those techniques that regulates the flux of information between them. This kind of platforms are already available at a commercial level, but they are rather expensive and are based on a black-box approach, thus the user cannot adapt them to its own molecular problem. For this reason, in this thesis we have developed an integrative platform, which is open-code and freely-available to all the members of the modeling community. At the moment, it includes interfaces to perform Normal Modes Analysis and Molecular Dynamics simulations. Additionally, it is also able to analyze the results of quantum calculations performed with Gaussian and protein-ligand dockings performed with GOLD. More implementations are still under development.

1- ROLE OF SIRT1 IN THE REGULATION OF FATTY ACID OXIDATION AND KETOGENESIS UNDER DIFFERENT NUTRIONAL CHANGES. The homolog of the yeast silencing information regulator2 (SIRT1) has been implicated in several aspects of food limitation and caloric restriction in mammals. We have observed that there were no important changes, between wild type (WT) and SIRT1 liver-specific knockout (LKO) mice subjected to either CR or high fat diet (HFD), in the mRNA expression of Cpt1a, Cpt2 and Hmgcs2. SIRT1 had been shown to control hepatic glyconeogenic/glycolytic pathways in response to nutrients (Rodgers et al., 2005). So, we have hypothesized that SIRT1 could have a role in the metabolic adaptation to the changes of nutrient of weaning, when milk is replaced by the adult diet which contains less fat and more carbohydrate. Neither fatty acid oxidation (Cpt1a), ketogenesis (Hmgcs2), nor gluconeogenic (Pck1) liver pathways were significantly affected by the liver-specific knockdown of SIRT1, in both suckling and post-weaning conditions. If SIRT1 is involved in the response to aging, old LKO mice might be more susceptible to age-associated diseases as obesity, type 2 diabetes, hypertension, etc. To test this hypothesis we first weight and performed a glucose tolerance test in 7 months-old mice. There were no differences in weight neither in glucose tolerance between WT and LKO mice. Using a cell system, PPARα induced the expression of its known target genes CPT1A, HMGCS2, and FGF21 in HepG2 cells. SIRT1 overexpression by itself had almost no effect, although it increased PPARα induction of its target genes. We have interfered SIRT1 in these cells, and PPARα-induced expression of PEPCK and FGF21 was SIRT1-dependent. We have fasted WT and LKO mice for 15h and we found that the expression of Pck1 in liver was moderately but significantly induced in SIRT1-LKO mice after fasting, consistent with an increase in glucose levels. However, neither G6pase nor Pgc1α mRNA levels were affected. As expected, liver mRNA levels of Cpt1a, Hmgcs2, and Fgf21 were also induced upon fasting. However, Cpt1a and Hmgcs2 mRNA transcripts were comparable in fasted WT versus LKO mice, while Fgf21 expression was reduced around 40% in LKO mice liver. This result was consistent with the fact that fasting induction of FGF21 serum levels was also impaired in LKO mice. 2- ROLE OF SIRT1 IN THE HMGCS2 REGULATION OF FGF21 EXPRESSION. (Article 1: Human HMGCS2 regulates fatty acid oxidation and FGF21 expression in HepG2 cells. Vilà-Brau et al., 2011) Recently, our group has seen that HMGCS2 expression stimulates FGF21 expression and that these events are dependent on HMGCS2 activity. A catalytic dead mutant (C166A) failed to induce either fatty acid β-oxidation or FGF21 expression, whereas acetoacetate (an oxidized form of ketone bodies) could stimulate FGF21 mRNA expression in a dose-dependent manner. Because ketone bodies production implies the reduction of acetoacetate to β- hydroxybutyrate with the concomitant generation of NAD+ (Hegardt et al, 1999), and SIRT1 is a NAD+-dependent deacetylase enzyme, this specificity could explain why FGF21 fasting induction was affected in LKO-SIRT1 mice liver, while other PPARα target genes were not. We have treated HepG2 cells with the oxidizing (acetoacetate) partner of ketone bodies, and endogenous SIRT1 was knockdown by a specific siRNA. FGF21 induction was dependent on SIRT1 expression, since knocking down impaired acetoacetate response. 3- ACTIVATING TRANSCRIPTION FACTOR 4-DEPENDENT INDUCTION OF FGF21 DURING AMINO ACID DEPRIVTION (Article 2: De Sousa-Coelho et al., 2012) Considering the central role of PPARα in the regulation of metabolic homeostasis we sought to investigate how the turnover of PPARα affected the expression of its target genes. HepG2 cells were infected with PPARα and exposed to DMSO or to the 26S proteasome inhibitor MG132. As expected, MG132-treatment blocked the PPARα-dependent expression of HMGCS2, indicating that the transcriptional activity of PPARα is increased by protein degradation (Blanquart et al, 2004). Contrary to what we had predicted, the expression of FGF21 was strongly increased by the MG132 treatment. We hypothesized that proteasome inhibition in HepG2 could decrease the pool of free amino acids. We treated HepG2 cells with histidinol (HisOH) a potent and reversible inhibitor of protein synthesis, (Hansen et al, 1972). Amino acid deprivation produced a time-dependent induction of FGF21 mRNA. To test whether this induction was due to an increase in the FGF21 gene transcription, we measured the FGF21 primary transcript (hnRNA) levels; HisOH treatment clearly induced FGF21 hnRNA levels in a time-dependent manner. As expected, HisOH induced an increase in the ATF4 protein levels after 2h treatment. By analyzing the sequence of the 5’-flanking region of the human FGF21 gene, we found two putative ATF4 response elements (AARE) starting at positions -152 and -610 upstream of the transcription start site. HepG2 cells were transfected with pGL3b-hFGF21 promoter-luciferase constructs and an expression vector for human ATF4. The expression of ATF4 induced the WT reporter in a concentration dependent manner. This induction was totally obliterated either when the AARE1 was mutated or when both elements were deleted. Induction was diminished when AARE2 was mutated. To further analyze the functionality of this sequence we tested the binding of ATF4 by an EMSA, where ATF4 bound as a C/EBPβ heterodimer to both AARE sequence elements. We also confirmed the in vivo binding by ChIP experiments. The chromatin binding of ATF4 was greatly increased in both ATF4 responsive sequences in HisOH treated cells. To confirm if the induction of FGF21 produced by amino acid starvation was mediated by ATF4, we treated siCtl and siATF4 HepG2 cells with HisOH. FGF21 mRNA levels after HisOH treatment were significantly lower when ATF4 was depleted. To analyze the effect of amino acid deprivation on FGF21 expression in vivo, we fed mice with a leucine-deficient [(-)leu] diet or a control (Ctl, nutrionally complete) diet for 7 days. Fgf21 mRNA levels were greatly increased in liver from mice fed a (-)leu diet compared to control. The circulating FGF21 levels were also increased in the serum of leucine deprived animals, paralleling hepatic gene expression. 4- LEUCINE DEPRIVATION SIGNALING UNDER FASTING CONDITIONS. We were interested to know whether FGF21 induction by a (-)leu diet would affect, or be affected by, the adaptive fasting response. We have fed mice for 7 days within a Ctl or (-)leu diet. Weights and food intake were recorded daily. Then, mice were randomly separated in a total of 4 groups, where 2 groups (one from each diet) were fasted overnight. Leucine deprivation affected the levels of free fatty acids and ketone bodies in serum in the fed state, while it does not upon fasting. Although no changes between groups were observed in the fed state, after fasting the β-oxidation, ketogenesis and gluconeogenesis keygenes were further up-regulated in the (-)leu diet group compared to control. The highest induction was seen in the Pgc1α gene, a known coactivator on these processes. The fasting activation of FGF21 was impaired in mice fed with (-)leu diet, underlying a crosstalk between the fasting and amino acid deprivation signalling. 5- ROLE OF FGF21 IN THE LEUCINE DEPRIVATION PHENOTYPE IN MICE (Article 3: De Sousa-Coelho et al., in preparation). According with our previously reported results (De Sousa-Coelho et al., 2012) mice maintained on a leucine-deficient [(-)leu] diet show a dramatic increase in FGF21 circulating levels. To check its origin we analyzed the Fgf21 gene expression in liver, where Fgf21 mRNA levels paralleled those in serum; brown adipose tissue (BAT), where it were unchanged; and in epididymal white adipose tissue (eWAT), where unexpectedly it were significantly decreased in wild type mice maintained in (-)leu diet. Because upon (-)leu diet, mice undergo rapid weight loss (Cheng et al., 2010), we wanted to investigate whether this phenotype is FGF21-dependent. For this purpose, WT and FGF21-KO mice were fed a Ctl or (-)leu diet for 7 days. Weight loss was diminished in FGF21-KO, while food intake decrease by (-)leu was unchanged between genotypes. Histological analysis of WAT showed that leucine deprivation resulted in a reduction in adipocyte volume compared with mice fed a control diet, while it was only slightly reduced in (-)leu FGF21-KO mice. It has been previously described that leucine deprivation increases lipolysis in WAT (Cheng et al., 2010). Consistent with changes in body weight, lack of FGF21 significantly decreased levels of phosphorylated (P)-HSL in WAT, indicating an impaired lipolysis. Gene expression analysis revealed reduction in the mRNA levels of the lipogenic genes Fas, Srebp1c and Acc1 in the WAT of mice maintained in (-)leu diet. These changes were impaired in FGF21-KO. Consistent with previous results (Cheng et al., 2010), leucine deprivation increased levels of Ucp1 mRNA in WT mice BAT. This increase was not observed in the FGF21-KO mice. mRNA levels of Pgc1α, which regulates the expression of Ucp1 (Handschin and Spiegelman, 2006), were also increased, although did not differ between WT and FGF21-KO mice under either control or (-)leu diet conditions. It has been recently proposed a link between FGF21 and SREBP1c during lipogenesis in HepG2 cells (Zhang et al., 2011). We examined levels of Fas, Srebp1c and Acc1 mRNA in liver of WT and FGF21-KO. As expected (Guo and Cavener, 2007), lipogenic program was decreased upon (-)leu diet, but this reduction was blocked in FGF21-KO mice. However, the amino acid response program was correctly initiated in these mice as shown by the increased levels of ATF4 protein and the increase in mRNA levels of Asns, a prototypical ATF4 target gene. The liver staining showed a decreased lipid accumulation under (-)leu in WT animals that is not produced in the FGF21-KO mice. These results demonstrate an important role of FGF21 in the regulation of lipid metabolism during amino acid starvation. References: Blanquart C, Mansouri R, Fruchart JC, Staels B, & Glineur C (2004) Different ways to regulate the PPARalpha stability. Biochem Biophys Res Commun 319, 663-70. Cheng, Y., Meng, Q., Wang, C., Li, H., Huang, Z., Chen, S., Xiao, F., and Guo, F. (2010). Leucine deprivation decreases fat mass by stimulation of lipolysis in white adipose tissue and upregulation of uncoupling protein 1 (UCP1) in brown adipose tissue. Diabetes 59, 17-25. Guo, F., and Cavener, D.R. (2007). The GCN2 eIF2alpha kinase regulates fatty-acid homeostasis in the liver during deprivation of an essential amino acid. Cell Metab 5, 103-14. Handschin, C., and Spiegelman, B.M. (2006). Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 coactivators, energy homeostasis, and metabolism. Endocr Rev 27, 728-735. Hansen BS, Vaughan MH, & Wang L (1972) Reversible inhibition by histidinol of protein synthesis in human cells at the activation of histidine. J Biol Chem 247, 3854-3857. Hegardt FG (1999) Mitochondrial 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase: a control enzyme in ketogenesis. Biochem J. 338, 569-582. Hotta, Y., Nakamura, H., Konishi, M., Murata, Y., Takagi, H., Matsumura, S., Inoue, K., Fushiki, T., and Itoh, N. (2009). Fibroblast growth factor 21 regulates lipolysis in white adipose tissue but is not required for ketogenesis and triglyceride clearance in liver. Endocrinology 150, 4625-4633. Rodgers JT, Lerin C, Haas W, Gygi SP, Spiegelman BM, Puigserver P (2005) Nutrient control of glucose homeostasis through a complex of PGC-1alpha and SIRT1. Nature 434, 113-8 Zhang, Y., Lei, T., Huang, J.F., Wang, S.B., Zhou, L.L., Yang, Z.Q., and Chen, X.D. (2011). The link between fibroblast growth factor 21 and sterol regulatory element binding protein 1c during lipogenesis in hepatocytes. Mol Cell Endocrinol 342, 41-47. / Durante su vida un individuo se somete a diversos cambios nutricionales. La capacidad de detectar la disponibilidad de nutrientes y regular la homeostasis energética es un proceso fundamental. SIRT1 es un regulador clave en el metabolismo energético. SIRT1 puede modular la expresión génica en tejidos metabólicamente activos en respuesta a la restricción calórica o el ayuno. La dependencia de la actividad deacetilasa de SIRT1 en los niveles de NAD+ constituye un vínculo fundamental entre el estado metabólico celular y la regulación de genes. FGF21 es una hormona que se induce en el ayuno y que afecta al metabolismo de los carbohidratos y de los lípidos. Recientemente se han demostrado sus efectos benéficos en la protección de la obesidad inducida por la dieta y en la mejoría en la resistencia a la insulina. En este trabajo hemos demostrado que en células hepáticas en cultivo, SIRT1 desempeña un papel importante en la activación por PPARα de la expresión de FGF21, CPT1A, HMGCS2, y PEPCK. También, que la actividad de SIRT1 regula los niveles de glicemia y la expresión de PCK1 en hígado, en la respuesta al ayuno. Aún así, hemos visto que la actividad de SIRT1 no afecta la expresión de los genes de la oxidación de los ácidos grasos o la cetogénesis en el hígado, en respuesta a diferentes cambios nutricionales, como la restricción calórica, la transición de la lactancia/destete, y el ayuno. Adicionalmente, hemos demostrado que la activación de FGF21 por SIRT1 depende de la actividad HMGCS2. También hemos descrito que FGF21 se induce por la privación de aminoácidos, de manera dependiente de ATF4, y hemos identificado dos elementos de respuesta funcionales en la región promotora del gene humano, altamente conservados entre las especies. Además, hemos demostrado que FGF21 interviene en la regulación del metabolismo de los lípidos en el hígado y el tejido adiposo blanco, y de la termogénesis en el tejido adiposo marrón, durante la privación de aminoácidos. De todas formas, hemos visto que la privación de leucina afecta a los niveles de ácidos grasos libres y cuerpos cetónicos en suero en el estado de alimentación, mientras que no lo hace en el ayuno; y la activación de FGF21 en el ayuno está afectada en los ratones alimentados con esta dieta, desvelando un “crosstalk” entre la señalización del ayuno y la privación de aminoácidos.

Els pacients diabètics de tipus 1 necessiten teràpia substitutòria amb insulina per poder sobreviure, però tot i això, no sempre s’aconsegueix una regulació adequada de la seva glucèmia. La hiperglucèmia crònica porta al desenvolupament d’importants complicacions secundàries que estan associades amb una elevada morbilitat i mortalitat. El desenvolupament de complicacions secundàries es pot enlentir mitjançant un control estricte de la glucèmia, però això resulta difícil degut a que la teràpia amb insulina exògena està associada amb un risc sever d’episodis d’hipoglucèmia. Per tant, la regulació precisa de l’homeostasi de la glucosa és un repte en el tractament de la diabetis. La manipulació genètica del múscul esquelètic representa una estratègia atractiva per tal de tractar la diabetis. El múscul esquelètic és el responsable de la captació de més d’un 70% de la glucosa postpandrial. A més a més, el múscul esquelètic és fàcilment manipulable, és capaç de secretar proteïnes a torrent sanguini i és transduible per varis vectors terapèutics. Al nostre laboratori prèviament s’ha demonstrat que és possible generar al múscul esquelètic un “sensor de la glucosa” mitjançant la coexpressió de glucoquinasa (Gck) i de nivells constitutius i basals d’insulina (Ins). En aquest sistema, el flux de glucosa cap al múscul esquelètic és regulat pels nivells de glucosa circulants, permetent un increment en la captació de glucosa en presència d’hiperglucèmia, però evitant-se possibles episodis d’hipoglucèmia. Per tal de comprovar aquesta hipòtesi, ratolins diabètics van ser administrats intramuscularment amb 2 vectors adenoassociats de tipus 1 (AAV1) que expressaven els gens de la Ins i la Gck. Després del tractament els ratolins diabètics van corregir la malaltia. Els vectors AAV han estat els vectors d’elecció per moltes aplicacions de teràpia gènica in vivo degut al seu excel·lent perfil de seguretat i eficàcia. Estudis preclínics han mostrat que la transferència genètica mitjançant vectors AAV permet en models animals petits i grans de malalties l’expressió gènica a llarg plaç. Recentment vàries d’aquestes aproximacions de teràpia gènica han estat traslladades a humans amb resultats prometedors. Tot i això, la gran majoria d’assajos preclínics exitosos en ratolins han fracassat al ser traslladats a models animals grans o en humans. Encara no s’ha aconseguit traslladar amb èxit a animals grans cap aproximació de teràpia gènica o cel·lular per la diabetis. En aquest estudi, l’administració en gossos diabètics una única vegada de vectors AAV1 que codifiquen pels gens de l’Ins i de la Gck va resultar en la normalització de la glucèmia en dejú, de la tolerància a la glucosa després d’un bolus oral de glucosa i en l’absència d’episodis d’hipoglucèmia en exercici durant >4 anys després de la transferència gènica. Això va estar associat amb una recuperació del pes corporal, una normalització dels nivells de proteïnes glicosilades en plasma i una supervivència a llarg plaç sense el desenvolupament de complicacions secundàries. En canvi, el tractament amb insulina exògena o la transferència gènica únicament d’Ins o Gck va ser incapaç d’aconseguir una correcció completa de la diabetis, demonstrant-se que l’acció conjunta de la Ins i la Gck és necessària per tal d’obtenir un efecte terapèutic complet. Aquesta demonstració de la correcció a llarg plaç de la hiperglucèmia diabètica en gossos diabètics representa el pimer èxit en un model animal gran de una teràpia gènica o cel·lular pel tractament de la diabetis y senta les bases pel futur assaig d’aquesta aproximació terapèutica en humans. / Type 1 diabetes patients need insulin replacement therapy to survive, but glycemia is not always regulated in a physiologic manner. Chronic hyperglycemia leads to the development of severe secondary complications that are associated with significant morbidity and mortality. The development of secondary complications can be delayed by tight control of glycemia, however, this is difficult to achieve with exogenous insulin administration because of the associated risk of severe hypoglycemic episodes. Thus, precise regulation of glucose homeostasis is a major challenge in diabetes management. Genetic engineering of skeletal muscle to counteract hyperglycemia is an attractive strategy to correct diabetes. Skeletal muscle is responsible for the disposal of most (70%) of the circulating glucose after a meal. In addition, skeletal muscle is easily manipulated and is able to secrete proteins into the circulation as well as being transducible by a number of therapeutic vectors. We previously demonstrated in our laboratory that it is possible to generate a “glucose sensor” in the skeletal muscle through co-expression of glucokinase (Gck) and constitutive basal levels of insulin (Ins). In such a system, glucose flux into skeletal muscle is regulated by circulating glucose levels, allowing increased glucose uptake whenever hyperglycemia is present, but avoiding hpyoglycemia. To test this hypothesis, two adeno-associated viral vectors of serotype 1 (AAV1) expressing Ins and Gck were delivered intramuscularly to diabetic mice, showing correction of the disease. AAV vectors are the vector of choice for many in vivo gene therapy approaches due to their excellent safety and efficacy profile. Pre-clinical studies have shown that AAV vector-mediated gene transfer results in long-term gene expression in small and large animal models of disease. Recently, some of this preclinical data have been translated into humans with encouraging results. However, for the vast majority of successful proof-of-concept studies in mice, scale-up and long-term efficacy in large animal models or humans has been problematic or disappointing. Scale-up has yet to be demonstrated in large animal models of diabetes with either gene or cell therapy approaches. In this study, a one-time intramuscular administration of AAV1 vectors encoding for Gck and Ins in diabetic dogs resulted in normalization of fasting glycemia, normalized disposal of glucose after oral challenge, and no episodes of hypoglycemia during exercise for >4 years after gene transfer. This was associated with recovery of body weight, normal glycosylated plasma proteins levels, and long-term survival without secondary complications. Conversely, exogenous insulin or gene transfer for Ins or Gck alone failed to achieve complete correction of diabetes, indicating that the synergistic action of Ins and Gck are needed for full therapeutic effect. This demonstration of long-term correction of diabetic hyperglycemia has provided the first proof-of-concept in a large animal model for a gene transfer approach to treat diabetes and lays the foundations for the future translation of this approach to the clinic.

Aquesta Tesi Doctoral se centra en el desenvolupament de noves metodologies analítiques en biosensors òptics com a solucions alternatives per a la diagnosi o la monitorització terapèutica de diferents malalties, com ara l’al·lèrgia, la celiaquia o el càncer. En particular, es proposa l’ús de biosensors nanoplasmònics per a la detecció de biomarcardors presents en fluids humans de manera ràpida, sensible i que no requereixi d’amplificació de senyal o de l’ús d’etiquetes. Tant el ja ben establert biosensor de Ressonància de Plasmó Superficial (SPR) com un innovador biosensor nanoplasmonic basat en nanodiscs d’or han estat avaluats per a la seva aplicació real en l’àrea clínica. Les distintes metodologies biosensores presentades estan basades en l’ús d’anticossos, tant com a elements de bioreconeixement o com a biomarcadors específics de malalties. Primer, es presenta un estudi en profunditat de dues estratègies d’immobilització orientada d’anticossos per tal d’obtenir immunoassaigs en format directe de biomarcadors proteics en fluids biològics. En segon lloc, es proposa una nova estratègia immunosensora per a la detecció de pèptids derivats del gluten directament en orina com a tècnica ràpida i no invasiva per al control dietètic de pacients celíacs. A més, s’han desenvolupat dues metodologies utilitzant el biosensor nanoplasmònic per a detectar anticossos circulants en sang com a biomarcadors de malalties. Per una banda, s’ha dissenyat una estratègia alternativa per a la diagnosi d’al·lèrgia als medicaments (en particular a l’antibiòtic amoxicil·lina) basada en uns receptors dendrimèrics per a la detecció directa d’anticossos tipus IgE en sèrum. Finalment, s’ha avaluat una nova estratègia biosensora per a quantificar específicament autoanticossos tumorals per a la diagnosi precoç de càncer colorectal. El treball d’aquesta Tesi combina l’experiència del grup de recerca en el disseny i fabricació de tecnologia biosensora avançada i innovadora amb el desenvolupament de tècniques bioanalítiques i de química de superfície per tal de superar els reptes actuals relacionats amb el cost i el temps requerit per a les anàlisis clíniques. A més, l’àmplia experiència del grup de recerca en transferència tecnològica i les col·laboracions establertes durant la tesi doctoral amb empreses com Biomedal S.L. o Protein Alternatives S.L. obren oportunitats interesants de cara a facilitar el procés de transferència tecnològica per a la implementació real de biosensors tipus Point-of-Care. / This Doctoral Thesis focuses on the development of novel analytical methodologies in optical biosensors as alternative solutions for diagnosis or therapy monitoring of relevant diseases, such as allergy, celiac disease or cancer. In particular, we propose the use of nanoplasmonic biosensors for a rapid, sensitive and label-free detection of biomarkers present in human fluids. Both the well-known Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensor and an innovative nanoplasmonic biosensor based on gold nanodisks surfaces have been evaluated for their real application in the clinical field. The different biosensor methodologies make use of antibodies, either as biorecognition elements in immunoassays or as specific disease biomarkers for diagnostics. First, an in-depth study of two site-directed antibody immobilization strategies is presented for the direct immunoassay of protein biomarkers in biological fluids. In second place, a novel immunosensing strategy is proposed for the detection of gluten-derivative peptides in urine as a rapid and non-invasive technique for dietary control in celiac patients. On the other hand, two assays have been developed employing the nanoplasmonic biosensor to detect blood circulating antibodies as disease biomarkers. First, we have designed an alternative approach for drug allergy diagnosis (in particular for amoxicillin) based on dendrimer-based receptors, which enable the detection IgE antibodies directly in serum. And second, a new biosensing strategy is assessed to quantify specific tumor-related autoantibodies for the early diagnosis of colorectal cancer. The work in this Thesis combines the wide knowledge of the research group in the design and fabrication of powerful biosensor technology with the development of surface activation chemistry and bioanalytical techniques to overcome current challenges related to costly and time-consuming clinical analysis. Besides, the strong experience of our research group in technological transfer and the established collaborations during this doctoral work with companies as Biomedal S.L. or Protein Alternatives S.L. open up interesting opportunities to facilitate the technology-transfer process for the real implementation of Point-of-Care biosensors.

Los tumores cerebrales constituyen menos del 2% de los tumores primarios, pero son uno de los peores tipos de cáncer en cuanto a “años de vida perdidos”. Los gliomas son los tumores cerebrales más prevalentes, con una esperanza de vida inferior a 15 meses para los casos de alto grado, como los glioblastomas (GBM). El método no invasivo más utlilizado para diagnóstico y seguimiento de la respuesta a la terapia en tumores cerebrales es la Resonancia Magnética (MR), en forma de imagen (MRI) y espectroscopía (MRS) o imagen espectroscópica (MRSI). Sin embargo, debido a restricciones éticas relacionadas a la participación de pacientes humanos en investigación, la optimización de los métodos de diagnóstico y seguimiento de la terapia requieren modelos preclínicos que reproduzcan las patologías humanas. Para este tipo de estudios, se utilizan principalmente modelos murinos, que pueden dividirse en modelos genéticamente modificados (GEM) con desarrollo espontáneo de tumor y los modelos de generación de tumores por inyección estereotáxica de líneas celulares. En la presente tesis, se llevó a cabo una detallada caracterización de dos colonias GEM, S100β-v-erbB/inK4a-Arf (+/-) y GFAP-V12 HA-ras B8. Se observó una baja penetrancia de desarrollo de tumores (16% y 1% respectivamente), haciendo de éstos una herramienta poco útil para estudios de respuesta a la terapia. La escasez de modelos preclínicos de grado bajo/intermedio sirvió de motivación para desarrollar un modelo de tumor glial transplantable con esas características, por disgregación de tumores provenientes de la colonia GEM. Ello nos debería permitir obtener una mayor incidencia tumoral en comparación con las colonias GEM. Se generaron gliosferas a partir de tumores GEM de grado III y se logró más de un 60% de penetrancia cuando estas células fueron inyectadas estereotácticamente en el estriado de ratones C57BL/6. Sin embargo, la aplicación de protocolos de descongelación y cultivo a éstas células ocasionó una progresión a grado IV (GBM), lo que sugiere que el modelo generado constituye, potencialmente, un modelo murino de GBM secundario. Además, este modelo transplantable fue ampliamente caracterizado por métodos de MRI/MRSI, así como por métodos de perturbación del patrón espectral con MRSI (PE-MRSI) para una posible aplicación en el desarrollo de clasificadores de respuesta a la terapia en tumores. También se llevó a cabo una evaluación genética restringida de los modelos murinos seleccionados (p.e. tumores GL261, línea celular GL261, GEM y tumores derivados de GEM), utilizando el método de secuenciación de Sanger para comprobar la presencia de mutaciones normalmente presentes en gliomas (en los genes IDH1, IDH2 y p53). Finalmente, esta tesis describe la estrategia desarrollada para estudios longitudinales de detección de respuesta temprana a la terapia/recidiva en tumores preclínicos, utilizando métodos de imagen molecular basados en MRSI. Así ratones implantados con tumores GL261 (glioblastoma) recibieron tratamiento con temozolamida (TMZ), basándonos en protocolos previamente establecidos. La detención del crecimiento tumoral (respuesta a la terapia) fue detectada por MRI. Tanto animales tratados como animales control fueron estudiados por MRSI y técnicas de reconocimiento de patrones (extracción de fuentes en sistema semi-supervisado). Las fuentes extraídas de regiones de interés fueron capaces de distinguir entre tumores GL261 proliferando activamente y tumores respondiendo a la terapia, basándose en cambios de patrón del metaboloma registrado por MRSI. Se obtuvieron mapas nosológicos codificados en tipo e intensidad de color durante y después de la terapia, lo que permitió un seguimiento de la respuesta, así como la detección de heterogeneidad intratumoral en dicha respuesta, siendo capaces de detectar la detención del crecimiento tumoral y la recidiva antes de los cambios observados en el volumen tumoral por MRI. Esta metodología fue ratificada por análisis histopatológico y cálculo de tasas de proliferación, apoptosis y de índice mitótico. / Brain tumours account for less than 2% of all primary tumours, but are one of the most lethal cancers when “life lost” years are considered. Gliomas are the most prevalent type with a median life expectancy below 15 months for the high grade ones, such as glioblastomas (GBM). The most common non-invasive medical technique used for tumour diagnosis and therapy monitoring of brain tumours patients is Magnetic Resonance (MR), in the form of imaging (MRI) and spectroscopy (MRS) or spectroscopic imaging (MRSI). However, due to the ethical restrictions regarding the use of human patients for research study, the improvement of diagnostic and therapy follow-up protocols requires reliable models that mimic human disease. In this regard, mainly murine models are used and can be divided into the genetically engineered model (GEM) of spontaneous tumour development and the engrafted tumour model. In this thesis, a comprehensive MR characterization of two GEM colonies, namely S100β-v-erbB / inK4a-Arf (+/-) and GFAP-V12 HA-ras B8, was carried out. A low tumour penetrance found (16% and 1%, respectively) together with stochastic onset of GEM tumours, made them impractical for use in therapy response studies. The latter and the scarcity of low/intermediate grade brain tumour preclinical models motivated us to attempt to develop a transplantable glial tumour model of low/intermediate grade by disaggregation of a tumour mass from GEM. This should allow us to obtain an increased tumour incidence rate in comparison to GEM animals. Gliospheres from a grade III GEM tumour were successfully generated and displayed more than 60% penetrance, when stereotactically injected into the striatum of C57BL/6 mice. However, the application of freezing and cell culture protocols produced a progression to grade IV GBM, which made the developed transplantable model qualify as potential secondary GBM model in mice. Additionally, this transplantable model was widely characterized using MRI/MRS methods, as well as perturbation-enhanced MRSI (PE-MRSI) for a possible application in the future in therapy strategies and development of tumour therapy response detection classifiers. A restricted genetic evaluation of selected murine tumour models (i.e. GL261 tumours, GL261 cell line, GEM and GEM-derived tumours) was carried out using the Sanger method to check for a possible presence of particular driver mutations commonly occurring in gliomas (IDH1, IDH2 and p53). Finally, the work describes the strategy followed for longitudinal therapy studies follow-up and early response/relapse detection in preclinical brain tumours, through molecular imaging methods based in MRSI. GL261 (glioblastoma) tumour bearing mice were treated with temozolomide (TMZ), based on previously established protocols. The expected transient growth arrest (response to therapy) was detected by MRI. Animals subjected to therapy and control animals were followed up by MRSI and pattern recognition techniques (semi-supervised source extraction) were applied. The sources extracted from the region of interest were able to discriminate between GL261 tumours actively proliferating and tumours responding to therapy, based on their metabolome pattern changes recorded by MRSI. Colour-coded nosological images produced throughout and after the course of therapy allowed convenient tracking of response changes and differentiated the intratumoural heterogeneity of response, hinting the growth arrest and relapse, before changes in tumour volume were observed by MRI. The methodology was validated with histopathological analysis and calculation of proliferation and apoptotic rates and mitotic index.

La diabetis tipus 1 (T1D) és una malaltia autoimmune causada per la destrucció de les cèl·lules productores d’insulina del pàncrees, les cèl·lules β. La T1D esdevé clínicament aparent quan la majoria de les cèl·lules β han estat destruïdes, i restablir la massa de cèl·lules β per tal de mantenir una homeòstasi adequada de la glucosa és un dels principals reptes de la medicina regenerativa. La generació de noves cèl·lules β a partir de la reprogramació d’altres tipus cel·lulars, com per exemple les cèl·lules acinars, és una nova estratègia terapèutica amb un gran potencial. A més, la reprogramació de cèl·lules acinars comporta certs avantatges respecte la reprogramació d’altres tipus cel·lulars diferenciats, ja que n’hi ha una gran abundància al pàncrees, comparteixen un origen comú amb les cèl·lules β durant l’embriogènesi i resideixen al mateix òrgan que les cèl·lules β. Diversos estudis han descrit que l’expressió mitjançant vectors adenovirals de primera generació (FG-Ad) de Pdx1, Ngn3 i Mafa (PNM), tres factors de transcripció específics de cèl·lula β, en cèl·lules acinars aconsegueix reprogramar aquestes cèl·lules cap a cèl·lules productores d’insulina. No obstant, aquests estudis indiquen que la transducció amb vectors FG-Ad és necessària pel procés de reprogramació, i la funcionalitat de les cèl·lules reprogramades no és exactament igual a la de les cèl·lules β madures. Per tal d’aprofundir en els mecanismes moleculars implicats en la reprogramació de cèl·lules acinars a cèl·lules β, en aquest treball s’ha analitzat la capacitat de reprogramació de tres línies cel·lulars acinars (266-6, AR42J i AR42J-B13) al ser transduïdes amb un vector FG-Ad codificant per PNM. S’ha observat que les tres línies cel·lulars responien de manera molt diferent a la sobreexpressió de PNM, i que la línia cel·lular AR42J-B13 (B13) presentava una eficiència de reprogramació major a les demés línies cel·lulars, evidenciada per una major activació de l’expressió de marcadors de cèl·lula β. En una caracterització més detallada del fenotip de les cèl·lules B13 reprogramades, s’ha pogut observar que aquestes presentaven moltes de les característiques de les cèl·lules β diferenciades adultes, com l’expressió de gens processadors de la pro-insulina, l’expressió dels sensors de la glucosa i la producció de la proteïna de la insulina. No obstant, la insulina produïda per aquestes cèl·lules no era secretada d’una manera eficient i tampoc estava regulada per la glucosa. D’altra banda, s’ha estudiat el paper dels vectors adenovirals en el procés de reprogramació, i s’ha demostrat que la transducció adenoviral per se regula negativament l’expressió de gens exocrins, suggerint que aquests vectors produeixen un efecte de desdiferenciació sobre el fenotip acinar. Amb l’objectiu d’identificar microRNAs involucrats en el procés de reprogramació, s’ha realitzat un estudi del perfil d’expressió de microRNAs. S’ha observat que les cèl·lules AR42J i B13 presentaven patrons d’expressió de microRNAs completament diferenciats, identificant-se fins a 60 microRNAs diferentment expressats entre les dues línies cel·lulars. Les cèl·lules B13 presentaven alguns signes de trobar-se en un estat més indiferenciat que les cèl·lules AR42J, com la supressió de l’expressió de la família de miR-200, fet que podria facilitar la seva reprogramació. També s’han identificat 11 microRNAs involucrats en la transducció adenoviral i 8 microRNAs associats a la sobreexpressió de PNM. En resum, en aquest treball s’ha aprofundit en els mecanismes involucrats en la reprogramació de cèl·lules acinars a cèl·lules β, i s’han identificat microRNAs involucrats en aquest procés, els quals podrien ajudar a millorar l’eficiència de reprogramació cap a cèl·lules β pel tractament de la diabetis mellitus. / Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease caused by the destruction of β cells, the insulin producing cells of the pancreas. T1D becomes clinically detectable when most β cells have been destroyed. Restoring the β cell mass in order to maintain a proper glucose control is one of the major challenges in regenerative medicine. The generation of new β cells from other cell types, such as acinar cells, by cellular reprogramming is a new therapeutic strategy with great potential. Furthermore, the use of acinar cells has several advantages over other differentiated cell types: they share a common embryonic origin with β cells, they are abundant and they are located in the pancreas. Several studies have shown that the expression of Pdx1, Ngn3 and MafA (PNM), three β cell specific transcription factors, using first-generation adenoviral vectors (FG-Ad) in acinar cells is able to reprogram said cells into insulin-producing cells. However, these studies indicate that FG-Ad vector transduction is necessary for the reprogramming process, and the functionality of these reprogrammed cells is not exactly the same as mature β cells. To further investigate the molecular mechanisms involved in the reprogramming of acinar cells into β cells, three acinar cell lines (266-6, AR42J and AR42J-B13) were transduced by a FG-Ad vector expressing PNM. We observed that each cell line responded differently to PNM overexpression, and the greater reprogramming efficiency was observed in the AR42J-B13 (B13) cell line, evidenced by higher activation of β cell markers. In a detailed characterization of the phenotype, it was observed that reprogrammed B13 cells presented many of the characteristics of adult β cells, such as the expression of pro-insulin processing genes and glucose sensors, and the production of mature insulin. However, insulin was not secreted efficiently to the culture media and was not regulated by the glucose levels. The role of adenoviral vectors in the reprogramming process was also studied in this work. We found that adenoviral transduction per se negatively regulated the expression of exocrine genes, thus suggesting that these vectors promote a dedifferentiation effect in the acinar phenotype of B13 cells. To identify microRNAs involved in the reprogramming process, a microRNA screening under different experimental conditions was performed. AR42J and B13 cells presented completely different microRNA expression patterns, and 60 microRNA were identified as differentially expressed comparing both cell lines. B13 cells showed signs of being in a more dedifferentiated state than AR42J cells, such as the suppression of the expression of the miR-200 family, which could facilitate their reprogramming. In addition, 11 microRNAs involved in the adenoviral transduction and 8 microRNAs associated with PNM overexpression have been identified. In summary, in this work we have studied the mechanisms involved in the reprogramming of acinar cells into β cells, and microRNAs involved in this process have been identified. Such miRNAs hold great promise for improving the efficacy of reprogramming acinar cells into β cells for the treatment of diabetes

En los últimos años ha habido un creciente interés en la utilización de métodos "in vitro" para la detección del potencial tóxico de compuestos químicos que contribuyan en remplazar, reducir y reformar el uso de animales en experimentación. Distintas organizaciones nacionales e internacionales están trabajando en el desarrollo y la validación de métodos "in vitro" que proporcionen el mismo nivel de información que los modelos in vivo. Se estima que entre el 3-28 % de los compuestos químicos existentes son potencialmente neurotóxicos. Respondiendo a la necesidad de impulsar la utilización de métodos "in vitro" en el campo de la neurotoxicología, el Centro Europeo para la Validación de Métodos Alternativos (ECVAM) propuso la elaboración de una base de datos de métodos alternativos para la detección de compuestos químicos potencialmente neurotóxicos.Los objetivos planteados en este trabajo contemplan estudios bibliométricos y experimentales para (1) la creación de una bases de datos de métodos "in vitro" para la detección de compuestos químicos potencialmente neurotóxicos, (2) para la caracterización de proteínas y la identificación de marcadores de toxicidad mediante herramientas proteómicas utilizando como modelo celular cultivos primarios de células granulares de cerebelo de ratón y como agente tóxico el metilmercurio y (3) la evaluación de los mecanismos de muerte y neuroprotección de células granulares de cerebelo expuestos a metilmercurio.Tras un estudio bibliométrico, se propusieron 6 métodos in vitro para evaluar el potencial tóxico de compuestos químicos capaces de producir axonopatías y neuropatías retardadas, de alterar la transmisión nerviosa a través de los receptores GABAA, de los canales de sodio dependientes de voltaje y de los receptores ionotrópicos de glutamato, y de la utilización de los cultivos reagreagados de cerebro como modelo celular para la evaluación de neurotoxicidad en general. Estos métodos proporcionan información útil para una futura validación de los mismos (consultable en ecvam-dbalm.jrc.cec.eu.int).El metilmercurio (MeHg) es un contaminante ambiental con toxicidad selectiva para el SNC y en particular para las células granulares de cerebelo. El análisis proteómico de extractos proteicos procedentes de cultivos primarios de células granulares de cerebelo de ratón expuestos de forma prolongada a concentraciones subcitotóxicas de metilmercurio permitió identificar dos proteínas, la succinil CoA:3-cetoácido-CoA-transferasa I y la isoforma no muscular de la cofilina, cuya expresión disminuyó e incrementó en presencia de metilmercurio, respectivamente. La exposición prolongada de los cultivos primarios de células granulares de cerebelo a MeHg produce una muerte neuronal apoptótica tiempo y concentración dependiente que cursa por mecanismos no excitotóxicos, independientes de la activación de caspasa 3 y parcialmente dependientes de la liberación de la proteasa lisosomal catepsina D. Además la exposición a MeHg produjo un incremento de la peroxidación lipídica. En nuestro modelo experimental la muerte neuronal fue protegida por antioxidantes de amplio espectro hecho que sugiere que la muerte podría deberse al incremento de ROS intracelular. / "Evaluation and development of alternative methods for prediction of neurotoxicity. Proteomic approach to methylmercury induced neurotoxicity":In the last years there has been a growing interest in using "in vitro" methods to detect toxic potentially chemical compounds, contributing in replacement, reduction and refinement animal use in life science research. Several organizations are working together to develop and validate alternative methods. Responding to the necessity to promote alternative methods in the neurotoxicity field, European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) proposed the elaboration of an alternative methods database to detect chemical compounds potentially neurotoxic.The goals of this thesis include both bibliographic and experimental studies to (1) create a database for "in vitro" methods to detect neurotoxic chemical compounds, (2) to identify toxic biomarkers by using proteomics techniques in primary cultures of mouse cerebellar granule cells exposed to methylmercury (MeHg) and (3) to evaluate cell death and neuroprotection mechanisms involved in long-term MeHg toxicity in primary cultures of mouse cerebellar granule cells.As a result of the bibliographic study, 6 "in vitro" methods were proposed to evaluate neurotoxic potency of chemical compounds capable to produce axonopaties and delayed neuropaties, to affect neurotransmission through GABAA receptors, voltage dependent sodium channels or ionotropic glutamate receptors, or to produce neuronal and glial neurotoxicity. All this methods supplied useful information to a future method validation (now available in ecvam-dbalm.jrc.cec.eu.int).Methylmercury is an environmental contaminant with special toxicity to Central Nervous System (SNC) and in particular to cerebellar granule cells. A proteomic approach revealed that long-term MeHg exposure to primary cultures of cerebellar granule cells induced a subexpression of succinilCoA:3-ketoacidCoA transferase I (SCOT), enzyme implicated in the ketone body catabolism, and an overexpression of non-phosphorylated cofilin, an actin binding protein involved in the regulation of actin dynamics. On the other hand, long-term MeHg exposure to primary cultures of cerebellar granule neurons produced time- and concentration-dependent apoptotic cell death. This cell death was not an excitotoxic death and was independent of caspasse 3 activation but was partially dependent of lysosomal cathepsin D. Moreover, MeHg exposure produced an increased in lipid peroxidation. In this experimental model, neuronal cell death was protected by antioxidants of wide spectrum, suggesting that this apoptotic cell death could be due to the increased of intracellular reactive oxygen species (ROS).

En la isquemia cerebral se desarrolla un proceso inflamatorio que contribuye a incrementar la muerte neural. La presencia de células necróticas promueve la activación de la respuesta inmune innata que contribuye a iniciar el proceso inflamatorio. Las citoquinas actúan de mediadoras de la respuesta inmunitaria e inflamatoria. Durante la reoxigenación después de la isquemia, se generan especies reactivas de oxígeno (ERO) que aumentan el daño por reperfusión. En respuesta a la isquemia cerebral, se activan proteínas de la via de señalización JAK/STAT. Esta vía participa en la respuesta celular a los ERO y a las citoquinas. De modo que la inflamación, la respuesta inmune innata y el estrés oxidativo son los procesos derivados de la isquemia/reperfusión que potencialmente pueden activar la vía JAK/STAT. La vía JAK/STAT utiliza un mecanismo en el cual los factores de transcripción STAT que se hayan en estado latente en el citoplasma son fosforilados en tirosina por las quinasas de la familia Janus, dando lugar a la dimerización y translocación al núcleo de las STATs. Las proteínas STAT modulan la expresión de genes relacionados con la diferenciación, la inflamación y la supervivencia. El objetivo de esta tesis es el estudio de la activación de la vía JAK/STAT en respuesta al estrés oxidativo, la inflamación y la inmunidad innata en astrocitios. La vía Jak2/Stat1 se activa en respuesta a citoquinas proinflamatorias, como IFN-gamma y interleuquina-6, y peróxido de hidrógeno en astrocitos, y promueve la muerte celular a las 24 horas. El tratamiento con el inhibidor de Jak2, AG490, previene de la muerte demostrando la implicación de la vía Jak2/Stat1 en la muerte. La activación de la vía Jak2/Stat1 es específica de peróxidos, ya que tratamientos con otros agentes proxidantes, tales como el sulfato de hierro (donador de iones hidroxilo), el nitroprusiato (donador de óxido nítrico) o el paraquato (donador de aniones superóxido) inducen la generación de EROs pero no activan a Stat1. De manera que el peróxido de hidrógeno induce específicamente la activación de la vía Jak2/Stat1. Paralelamente, los tratamientos con peróxido de hidrógeno y los compuestos antioxidantes trolox y propilgallato, inhiben la generación de EROs pero no detienen la activación de Stat1, mientras que el tratamiento de peróxido de hidrógeno con el antioxidante N-acetil-cisteína no reduce la producción de EROs y si inhibe la activación de Stat1. Estos resultados demuestran que la activación de Stat1 y la generación de EROs son efectos independientes. En el siguiente trabajo se demuestra que los siRNAs (por small interfering RNAs) inducen efectos inespecíficos en determinados tipos celulares de manera dependiente de secuencia e independiente del efecto silenciador. En cultivo glial mixto, el tratamiento con siRNAs aumenta la expresión de Stat1 y de otras moléculas proinflamatorias como iNOS, la citoquina IL-6 y las quimiocinas IP-10 e IP-9. La adición de un grupo O-metilo en la cadena sense del siRNA no impide el silenciamiento de la proteína para la cual es específico, y si inhibe el incremento de la expresión de los marcadores inflamatorios que se han estudiado. La activación de la inmunidad innata se observa en cultivo de glía mixta y en cultivo puro de astrocitos, pero no tiene en cultivo de microglía pura ni en la línea celular no glial 3T3, demostrando que los astrocitos son particularmente sensibles a desarrollar respuestas inmunes innatas frente al tratamiento con siRNAs. En este trabajo se demuestra que los siRNA activan la respuesta inmune innata en astrocitos activando el receptor TLR3, puesto que el tratamiento con siRNA, del mismo modo que el tratamiento con el agonista de TLR3, poly di dC, induce un aumento de la expresión de este receptor. En esta tesis, se pone de manifiesto el papel de la vía JAK/STAT en la modulación del estrés oxidativo, la inflamación y la inmunidad innata.

En este trabajo se ha caracterizado una proteína de la pared celular de maíz, una xiloglucano endotransglucosilasa-hidrolasa, denominada ZmXTH1. Esta clase de enzimas actúa sobre los polisacáridos de la pared celular primaria, favoreciendo procesos como la expansión y el crecimiento de la célula vegetal. El clon de cDNA fue aislado mediante un cribado de una librería de expresión de cDNA de la zona de elongación de la raíz de maíz con anticuerpos producidos contra una fracción enriquecida en proteínas de pared. La búsqueda en base de datos de otras secuencias codificantes (ESTs) de maíz ha permitido la identificación de varias XTHs putativas en esta especie. En maíz, por lo tanto, las XTHs pertenecen a familias multigénicas, así como ocurre en dicotiledóneas y en otras monocotiledóneas gramíneas como arroz y cebada. Este dato sugiere que las XTHs de gramíneas tienen en un papel tan importante como en las dicotiledóneas, a pesar de que los xiloglucanos representan un componente minoritario de la pared celular en gramíneas. El estudio filogenético de ZmXTH1 revela que esta proteína pertenece a un subgrupo filogenético minoritario, el subgrupo 4, que agrupa sólo XTHs ácidas y de gramíneas. Los componentes de este subgrupo presentan algunas características peculiares a nivel de estructura aminoacídica, como el dominio catalítico. Los estudios de expresión espacial y temporal efectuados con las XTHs de la familia multigénica de maíz indican que, así como se ha demostrado para otras familias multigénicas de XTHs, los miembros de esta familia exhiben patrones de expresión distintos y están ampliamente expresados en todos los estadios de desarrollo y en todos los órganos de la planta. Esto sugiere que en maíz, así como sucede en otras especies vegetales, estas proteínas participan en fenómenos morfo-genéticos en todo el ciclo vital de la planta. La expresión preferencial de ZmXTH1 en órganos de plantas jóvenes, en activa elongación y crecimiento, así como su inducción por giberelinas apoya la hipótesis de que la función de ZmXTH1 está relacionada con fenómenos de crecimiento y elongación. Para abordar la caracterización enzimática de ZmXTH1 se ha producido la proteína recombinante tanto en la bacteria E.coli como en la levadura P.pastoris. Los ensayos de actividad XET indican que esta proteína actúa como una xiloglucanoendotransglucosilasa, ya que presenta actividad enzimática XET cuando es expresada en P.pastoris. La actividad XET resulta ser la única actividad que presenta esta proteína, ya que no presenta afinidad para otros sustratos diferentes del xiloglucano, incluidos sustratos que son componentes mayoritarios de la pared celular de maíz. La proteína expresada en E.coli no presenta ningún tipo de actividad. Esto puede ser debido a la ausencia de modificaciones post-traduccionales o a una mala renaturalización de la proteína. Los estudios de localización subcelular indican que el péptido señal de ZmXTH1 es Funcional, ya que dirige la proteína a la ruta de secreción para enviarla al apoplasto.Se ha demostrado la localización de ZmXTH1 en pared en el sistema heterólogo de cebolla. Además su presencia en los fluidos apoplásticos de maíz, junto con los ensayos de plasmolisis de cebolla así como su carácter ácido, sugieren que ZmXTH1 es una proteína apoplástica débilmente asociada a la pared celular. Los análisis funcionales de ZmXTH1, mediante su expresión en Arabidopsis thaliana, indican que ZmXTH1 actúa en la pared celular. Los análisis funcionales de ZmXTH1, mediante su expresión en Arabidopsis thaliana, indican que ZmXTH1 actúa en la pared celular. De hecho, las plantas transgénicas presentan un ensanchamiento a nivel de la pared celular primaria y de la lamina media, sugiriendo, en su conjunto, un rol de ZmXTH1 en el proceso de "wall loosening" en maíz. / Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolases (XTHs) are enzymes involved in the modification of cell wall structure by cleaving and often also re-joining xyloglucan molecules in primary plant cell walls. Using a pool of antibodies raised against an enriched cell wall protein fraction, we have isolated a new XTH cDNA in maize, ZmXTH1, from a cDNA expression library obtained from the elongation zone of the maize root. The presumably full-length cDNA is 1,225 bp long; the predicted protein has 281 amino acids and possesses the typical domains of this enzyme family, such as a putative N terminal transmembrane domain, a catalytic domain that is homologous to that of Bacillus beta-glucanase, a putative N-glycosylation motif and four cysteine residues in the central and C terminal regions of the ZmXTH1 protein. Phylogenetic analysis of ZmXTH1 reveals that it belongs to the small subgroup four, so far only reported from monocot species. The ZmXTH1 has been expressed in Pichia pastoris at low levels; the recombinant enzyme showed XET (xyloglucan endotransglucosylase) activity and represents the first enzyme belonging to subgroup four characterised in maize. Expression data indicate that ZmXTH1 is expressed in elongating tissues, modulated by culture conditions and induced by gibberellins. Finally, transient expression assays in onion cells reveal that ZmXTH1 is directed to the cell wall and its expression in Arabidopsis thaliana produces modifications in the primary cell walls.

INTRODUCCIÓEn l'obesitat, per a contrarestar l'increment de la resistència a insulina i mantenir la normoglucèmia, es produeix un augment de la secreció d'insulina i de la massa de cèl·lula beta. Aquesta plasticitat de la cèl·lula beta és essencial per a evitar l'aparició de la diabetis mellitus tipus 2 però encara no es coneixen amb exactitud els mecanismes moleculars que la regulen. D'altra banda, el teixit adipós, a més de la seva funció d'emmagatzematge d'energia, té la capacitat de secretar un gran nombre de adipocitocines que exerceixen importants efectes en altres teixits. L'objectiu d'aquest estudi ha estat analitzar el paper de les adipocitocines secretades pel teixit adipós en l'augment compensatori de massa de cèl·lula beta que es dona en resposta a l'obesitat. MATERIAL I MÈTODESS'alimentaren rates Wistar amb una dieta de pinso estàndard (CTRL) o de cafeteria (CAF) (65% de l'energia derivada de lípids) durant 30 dies. Transcorreguts aquests 30 dies de dieta, els animals foren sacrificats i es van extreure els pàncrees per a realitzar estudis morfològics. També es va extreure teixit adipós del dipòsit inguinal subcutani (iSUB), de l'epididimari (eWAT) i del mesentèric que envolta el pàncrees (pMES) i es va incubar 4 hores en medi RPMI. Aquest medi condicionat, que contenia els factors alliberats pel teixit adipós, es va emprar posteriorment per a cultivar cèl·lules INS1E i estudiar la proliferació que induïa en elles. Finalment, partint d'un estudi de l'expressió gènica de teixit adipós mesentèric peripancreàtic (pMES) de rates CTRL i CAF mitjançant microarrays, es va dur a terme una cerca dels possibles factors responsables dels efectes del medi condicionat pMES.RESULTATS Els estudis morfomètrics del pàncrees mostraren un augment del percentatge d'àrea d'insulina en pàncrees i de la replicació de la cèl·lula beta en les rates alimentades amb dieta de cafeteria. En cultivar les cèl·lules INS1E amb medi condicionat de teixit adipós pMES, s'observà que el medi procedent de les rates obeses induïa el doble de proliferació que el de les rates control. Aquest efecte únicament es va produir amb el medi condicionat de teixit adipós pMES i quedava anul·lat al desactivar el medi amb calor. Del total de gens diferencialment expressats entre rates CAF i CTRL obtingudes dels microarrays de teixit adipós pMES, 26 codificaven per proteïnes secretables i 10 d'aquests estaven implicats en processos de proliferació. Mitjançant PCR quantitativa es va estudiar l'expressió d'aquests 10 gens en els tres dipòsits de teixit adipós per a seleccionar els que tenien un patró d'expressió específic de teixit adipós pMES obtenint el gen Igfbp3 (insulin-like growth factor binding protein 3) com a possible candidat per a explicar els efectes del medi condicionat. Aquest gen, descrit com a un inhibidor de la proliferació, s'expressava 2 vegades menys en teixit adipós pMES de rates CAF que en el de rates CTRL i no mostrava canvis en els altres dipòsits. En desactivar l'Igfbp3 del medi condicionat de rata CTRL amb un anticòs específic, la proliferació induïda en cèl·lules INS1E s'incrementà en un 66%. En canvi, tractant el medi condicionat de rata CAF amb la proteïna Igfbp3 recombinant es va observar l'efecte contrari i la proliferació de les cèl·lules INS1E disminuí en un 47%. CONCLUSIÓEls resultats obtinguts indiquen que en l'obesitat, certs canvis en el patró de secreció de adipocitocines del teixit adipós que envolta el pàncrees donen lloc a un increment de la proliferació de la cèl·lula beta. Un d'aquests canvis és la disminució de l'expressió d'Igfbp3 i, per tant, aquesta proteïna pot jugar un paper important en l'adaptació de la massa de cèl·lula beta a l'obesitat i en el desenvolupament de la diabetis mellitus tipus 2. / In obesity, an increase in beta cell mass occurs in order to cope with the raise in insulindemand. This beta cell plasticity is essential to avoid the onset of hyperglycemia; however the molecular mechanisms that regulate this process still remain unclear. This study analyzed the role of the adipose tissue in the control of beta cell replication. Using a diet-induced model of obesity, we obtained conditioned media from three different white adipose tissue depots. Only in the adipose tissue depot surrounding the pancreas, the diet induced changes that lead to an increase in INS1E and islet replication rate. In order to identify the factors responsible for this proliferative effect, adipose tissue gene expression analysis was conducted by microarrays and qRT-PCR. From all the differentially expressed proteins, only the secreted ones were studied. Insulin-like growth factor binding protein 3 (IGFBP3) was identified as the candidate of this effect. Furthermore, while the blockage of IGFBP3 in the conditioned media leads to an increase in the proliferation rate; the addition of the protein decreased this rate. Taken together, these data show that obesity induces specific changes in the adipokine secretion profile of the adipose tissue depot surrounding the pancreas leading to a decrease in IGFBP3 expression. This decrease acts in a paracrine manner stimulating beta cell proliferation rate. This cross talk between the visceral-pancreatic adipose tissue and beta cell is a novel mechanism that controls beta cell plasticity.