La malaltia de l'Alzheimer és la patologia de demència senil més comú en el món occidental. Mutacions en el gen de la presenilina 1 són responsables de l'aparició d'un tipus d'Alzheimer heretable, caracteritzat per aparèixer en persones d'edats joves. La presenilina 1 (PS1), que s'expressa sobretot en neurones però també en baixos nivells en altres teixits estudiats, és una proteïna integral de membrana que és ràpidament endoproteolitzada generant un fragment amino i un altre de carboxiterminal. La PS1 és la subunitat catalítica del complex (gamma)-secretasa. L'activitat (gamma)-secretasa consisteix en processar proteïnes transmembrana tipus I, com la proteïna precursora (beta)-amiloide o el receptor Notch, pel seu domini transmembrana. Com a conseqüència de l'activitat (gamma)-secretasa sobre les proteïnes de tipus I es generen uns fragments corresponents als dominis intracel·lulars d'aquestes proteïnes. També s'ha descrit que la PS1 és un modulador negatiu de l'activitat transcripcional mediada pel complex Tcf-4·(beta)-catenina.L'efecte inhibidor de la PS1 correctament processada sobre l'activitat transcripcional del complex Tcf-4·(beta)-catenina és depenent de l'activitat (gamma)-secretasa. Aquesta inhibició és deguda a la generació d'un fragment que correspon al domini intracel·lular de l'E-cadherina. Aquest fragment es genera per acció de l'activitat (gamma)-secretasa de la PS1 sobre l'E-cadherina. El fragment citosòlic de l'E-cadherina interacciona amb la (beta)-catenina, però no impedeix que aquesta última proteïna pugui translocar al nucli, ni tampoc modifica la interacció entre la (beta)-catenina i el factor transcripcional Tcf-4. Els nostres resultats suggereixen que el mecanisme inhibidor podria ser degut a un augment de la degradació del factor transcripcional CBP, promogut pel fragment citosòlic de l'E-cadherina. Mutacions específiques en el gen de la PS1, presents en alguns casos de l'Alzheimer familiar precoç, impedeixen un correcte processament de la PS1. L'efecte inhibidor de la forma no processada de la PS1 sobre l'activitat del complex Tcf-4·(beta)-catenina, és diferent a l'efecte produït per la forma processada de la PS1. En aquest cas, la inhibició de l'activitat transcripcional és independent tant de l'activitat (gamma)-secretasa com de la interacció directe amb la (beta)-catenina. La PS1 no processada interacciona amb la placoglobina amb una afinitat similar a la (beta)-catenina, però la interacció no està mediada pels mateixos residus en les dues catenines. A més, la PS1 no processada quan està associada a la placoglobina, augmenta la interacció entre aquesta proteïna i el Tcf-4 impedint que aquest factor transcripcional s'uneixi al DNA. Com a conseqüència hi ha una repressió de l'activitat transcripcional mediada pel complex Tcf-4·(beta)-catenina. / Alzheimer's disease is the most neurodegenerative pathology in Western countries. Presenilin 1 gene mutations are responsible for most cases of early-onset familial Alzheimer's disease. Presenilin 1 product is a transmembrane protein which is processed and detected in many adult tissues, not only in brain. Presenilin 1 (PS1) is a negative modulator of Tcf-4·(beta)-catenin activity. However, the mechanism underlying this effect is not well understood.We show that the effects of processed PS1 on the activity of this complex are dependent of its (gamma)-secretase activity. This repression of unprocessed PS1 is due the cytosolic domain of E-cadherin generated by the PS1 dependent (gamma)-secretase activity. The cytosolic domain of E-cadherin interacts with ?-catenin, but does not avoid that (beta)-catenin translocate to the nucleus and also, not modified the interaction between (beta)-catenin and Tcf-4. The inhibitory effect is due to promote degradation of the transcription factor CBP.One PS1 mutation associated with familial Alzheimer's disease does not processed PS1. We show that the effects of unprocessed PS1 of Tcf-4·(beta)-catenin dependent transcription its different than processed PS1. The effect of unprocessed PS1 on the transcriptional activity is independent of its (gamma)-secretase activity and its interaction with (beta)-catenin. Unprocessed PS1 also binds plakoglobina with similar affinity as (beta)-catenin, although this interaction does not involve equivalent residues in the two catenins. Moreover, unprocessed PS1 association with plakoglobina enhances the interaction of this molecule with Tcf-4 and prevents its binding to DNA.These results provide a new explanation for the effects of processed and unprocessed PS1 on gene transcription mediated by (beta)-catenin.

La β-catenina és una proteïna acobladora de factors transcripcionals i també de factors involucrats en la formació de les unions adherents en cèl·lules epitelials. En la primera part del treball es presenta un estudi de β-catenina i placoglobina,en el que s'ha caracteritzat la interacció d'aquestes proteïnes amb els seus cofactors. La β-catenina i la placoglobina estan composades per dos extrems N-i C-terminals i un domini central de repeticions armadillo, per on interaccionen amb la majoria de cofactors. De la mateixa manera com passa amb la β-catenina, els extrems de placoglobina també interaccionen amb el domini armadillo i regulen la capacitat de la placoglobina per unir-se als diferents factors. A més, els extrems terminals, i no el domini armadillo, són els que confereixen l'especificitat d'interacció a la β-catenina i a la placoglobina amb els seus cofactors. En la segona part de la tesi s'ha aprofundit en la interrelació entre dues vies de senyalització, la de β-catenina i la ruta de NF-κB. S'havia descrit una regulació negativa de β-catenina sobre l'activitat transcripcional del factor NF-κB. Per primera vegada s'ha detectat la formació de complexes de NF-κB amb E-cadherina i amb altres components implicats en adhesió cel·lular, amb una colocalització d'aquests factors en la membrana plasmàtica de la cèl·lula. De manera similar a com passa amb β-catenina, l'activitat transcripcional de NF-κB també estaria regulada per E-cadherina, evitant així la transcripció de gens mesenquimals. / β-catenin is a coupling protein for transcription factors and proteins involved in adherent junctions formation in epithelial cells. In the first chapter a study of β-catenin and plakoglobin is presented. The interaction of these two proteins with their cofactors has been characterized. βcatenin and plakoglobin are composed of two N-and C-terminal tails and an armadillo-like repeat containing central domain, surface that interacts with most of the cofactors. As it has been described for β-catenin, plakoglobin terminal tails interact with the armadillo domain and regulate the binding with different factors. Moreover, the terminal tails, and not the armadillo domain, are the domains responsible for determining β-catenin and plakoglobin specificity of interaction with their cofactors. In the second chapter of this thesis the crosstalk between β-catenin and NF-κB signaling pathways has been studied in deep. For the first time the complexes formed by NF-κB and E-cadherin, among other intercellular adhesion molecules, have been detected. These complexes were localized at the cellular membrane. As it has been described for β-catenin, NF-κB transcriptional activity is controlled by E-cadherin, avoiding the expression of mesenchymal genes.

L'LDL electronegativa (LDL(-)) és una fracció modificada d'LDL present a la circulació. Hi ha varies evidències que suggereixen el seu paper aterogènic ja que es troba augmentada en patologies d'alt risc cardiovascular, com en la hipercolesterolèmia familiar o en la diabetis mellitus. A més, presenta propietats inflamatòries, una major susceptibilitat a l'agregació i afinitat disminuïda pel receptor d'LDL. En la present tesi s'han estudiat algunes propietats aterogèniques d'aquesta partícula modificada, en concret s'han avaluat els següents aspectes:1) Propietats inflamatòries. L'LDL(-) va induir una major expressió de citoquines (IL-6), quimioquines (IL-8, MCP-1 i GRO) i factors de creixement (GM-CSF) en cèl·lules endotelials de vena i d'artèria, i monòcits i limfòcits. La resposta de les cèl·lules endotelials arterials va ser major a nivell de producció total de citoquines i, a més, també van alliberar PDGF-B. No obstant, els monòcits i limfòcits, en resposta a l'LDL(-) també van expressar la citoquina anti-inflamatòria IL-10 la qual va disminuir la secreció de les altres citoquines pro-inflamatòries, modulant la resposta inflamatòria.2) Activitat fosfolipolítica tipus fosfolipasa C associada. S'han descrit noves activitats enzimàtiques presents en l'LDL(-) que degraden eficientment fosfolípids amb colina. S'ha relacionat aquesta activitat fosfolipolítica amb la major susceptibilitat a l'agregació de l'LDL(-). Es desconeix l'origen d'aquesta activitat enzimàtica, tot i que s'ha descartat que sigui deguda al contingut augmentat en apoE, apoC-III o PAF-AH, i s'ha suggerit que en podria ser responsable una proteïna encara no identificada o la pròpia apoB-100.3) Unió a proteoglicans de la matriu extracel·lular. Una subfracció de partícules d'LDL(-) van presentar una major unió a proteoglicans aïllats d'artèria humana. Aquesta subfracció de partícules estaven més agregades i tenien una elevada activitat fosfolipolítica. Fets que es van relacionar i, en conseqüència, es va hipotetitzar que la major activitat fosfolipolítica podria provocar l'agregació de les partícules i, al mateix temps, que aquestes s'unissin amb major afinitat als proteoglicans.En conclusió, l'LDL(-) sembla una partícula potencialment aterogènica degut a que té la capacitat d'induir l'alliberament de molècules inflamatòries en diferents tipus cel·lulars, i presenta una major agregació i afinitat pels proteoglicans, fent-la propensa a la retenció subendotelial. / Electronegative LDL (LDL(-)) is a modified fraction of LDL present in circulation. Growing evidence suggests an atherogenic role. LDL(-) proportion is increased in diseases with high cardiovascular risk, as familial hypercholesterolemia or diabetes mellitus. Furthermore, it presents inflammatory properties, high susceptibility to aggregation and decreased LDL receptor affinity. In the current thesis some atherogenic properties of this modified particle have been studied, specifically, the following points have been evaluated:1) Inflammatory properties. LDL(-) induced increased expression of cytokines (IL-6), chemokines (IL-8, MCP-1 and GRO) and grown factors (GM-CSF) on venous and arterial endothelial cells, monocytes and lymphocytes. Arterial endothelial cells produced a high amount of cytokines and, moreover, they also stimulated PDGF-B. On the other hand, monocytes and lymphocytes also expressed the anti-inflammatory cytokine IL-10, who decreased the secretion of the other pro-inflammatory cytokines, thereby counteracting the inflammatory response.2) Phospholipase C-like phospholipolytic activity associated to LDL(-). Novel enzymatic activities present on LDL(-) that hydrolyze choline-containing phospholipids have been described. These activities have been involved in increased susceptibility to aggregation. A role for apoE, apoC-III and PAF-AH has been ruled out and our results suggest that apoB-100 could be involved. However, the exact origin remains unknown.3) Binding to proteoglycans from the extracellular matrix. A subfraction of LDL(-) presented increased binding to proteoglycans isolated from human artery. This subfraction has increased aggregation and phospholipolytic activity. Both properties are related, suggesting that phospholipolytic activity promotes aggregation and favours binding to proteoglycans.In summary, LDL(-) is a potentially atherogenic particle since promotes inflammatory molecules release in several cell types and its increased aggregation and binding to proteoglycans suggests increased subendothelial retention.

L'E-cadherina és una proteïna transmembrana que constitueix el nucli de les unions adherents, aquesta uneix proteïnes idèntiques en cèl·lules epitelials veïnes. La funció de l'E-cadherina és controlada per una altra família de proteïnes anomenades catenines. Dins d'aquesta família, β-catenina és necessària pel reclutament del citoesquelet d'actina. A part de ser un component estructural de les unions adherents, β-catenina és un element central de la ruta de senyalització de Wnt. Quan s'allibera de les unions adherents, β-catenina es transloca al nucli on interacciona amb factors de transcripció de la família Tcf i regula l'expressió de diferents gens. Aquesta translocació al nucli de β-catenina és estimulada pels lligands Wnt, que prevenen la degradació citoplasmàtica de β-catenina. La ruta de Wnt té diferents papers en el desenvolupament embrionari així com també en malalties humanes tals com el càncer.Una altra proteïna associada a l'E-cadherina és la p120-catenina. Aquesta catenina uneix el domini citoplasmàtic d'E-cadherina en una regió diferent de β-catenina i és necessària per a l'estabilització d'E-cadherina a la membrana plasmàtica. A més, p120-catenina està també involucrada en la regulació de la transcripció. Aquesta catenina interacciona amb el repressor transcripcional Kaiso i allibera la repressió causada per Kaiso en gens diana de Wnt. Tot i que la modificació de varis residus tirosina, serina i treonina han estat descrits en p120-catenina, només en uns pocs casos es coneix la rellevància d'aquestes modificacions en la interacció de p120-catenina amb diferents cofactors.En aquest treball es descriu com CK1ε es troba constitutivament unida i fosforila a p120-catenina. CK1ε fosforila les serines 268 i 269 de p120-catenina, disminuint-ne l'afinitat per E-cadherina. Aquesta fosforilació de CK1ε en el residu Ser268 de p120-catenina s'estimula pels lligands de Wnt. Aquest estudi també mostra com p120-catenina esta involucrada en la formació del signalosoma de Wnt, degut a que aquesta proteïna interacciona amb LRP5/6 i és necessària per a l'activació de CK1ε induïda per Wnt. Aquesta interacció està mitjançada per E-cadherina, establint-se així una unió física inesperada entre les unions adherents i el receptor de Wnt. La depleció de p120-catenina impedeix la unió de CK1ε a LRP5/6 i disminueix l'activació d'aquesta quinasa en resposta a l'estimulació per Wnt. L'eliminació de p120-catenina també bloqueja les respostes primerenques de Wnt, tals com la fosforilació de Dvl-2, així com també l'estabilització de β-catenina.En aquest treball es descriu com aquesta modificació també incrementa l'associació de p120-ctn a Kaiso, impedint els efectes d'aquest repressor transcripcional en els seus gens diana. A més, la fosforilació de p120-catenina induïda per Wnt incrementa la unió a Kaiso, prevenint la interacció i inhibició de Kaiso sobre el factor de transcripció Tcf4. Tot i així, p120-catenina no modifica la unió de Kaiso al DNA metilat. L'efecte de la sobreexpressió de p120-catenina en la localització subcel·lular de Kaiso és depenent de la línia cel·lular; mentre que algunes línies responen amb l'export nuclear de Kaiso, en altres aquest export no es troba alterat. La localització de Kaiso al nucli és sensible als lligands Wnt en les cèl·lules que responen a p120-catenina; per exemple, en la línia cel·lular SW480 l'estímul de Wnt provoca una translocació gairebé completa de Kaiso al citoplasma; aquesta translocació és sensible a la depleció de p120-catenina o CK1ε. Aquests resultats indiquen que l'efecte repressor de Kaiso sobre el factor de transcripció Tcf4 és regulat per Wnt a través de la fosforilació de p120-catenina per CK1ε. Es mostra doncs un paper nou i crucial de p120-catenina en la senyalització de Wnt descobrint punts addicionals de regulació per aquest factor de l'activitat transcripcional de β-catenina diferents de l'estabilitat d'aquesta catenina. / The transmembrane protein E-cadherin constitutes the core of adherens junctions, through its interaction with identical proteins from neighbor cells. E-cadherin function is controlled by a family of proteins named catenins that bind to its cytosolic domain. Among these, β-catenin is required for recruiting the actin cytoskeleton. In addition to its function in cell adhesion, β-catenin is a central player in the Wnt pathway. When released from the junctional complex, β-catenin translocates to the nucleus, where it interacts with the Tcf-family of transcriptional factors and regulates the expression of a variety of genes. The translocation of β-catenin to the nucleus is stimulated by Wnt ligands that prevent the degradation of cytosolic β-catenin. The Wnt pathway plays diverse roles in embryonic development and is implicated in human diseases including cancer.Another E-cadherin-associated protein, p120-catenin, binds to a distinct site of the cytosolic E-cadherin domain than β-catenin and is necessary for the stabilization of E-cadherin in the cell membrane. Moreover, p120-catenin is also involved in the regulation of transcription. p120-catenin interacts with the transcriptional repressor Kaiso and relieves the repression caused by Kaiso on Wnt target genes. Although the modification of many different tyrosine, serine and threonine residues has been described, only in a few cases the relevance of these modifications in the interaction of p120-catenin with the different cofactors is known. We have described that CK1ε is constitutively bound and phosphorylates p120-catenin. CK1ε phosphorylates p120-catenin in serines 268 and 269, decreasing its affinity for E-cadherin. Phosphorylation of p120-catenin Ser268 by CK1ε is stimulated by Wnt ligands. We also show that p120-catenin is necessary for the formation of the Wnt signalosome since it interacts with LRP5/6 and is required for CK1ε activation by Wnt. This interaction is mediated by E-cadherin, showing an unexpected physical link between adherens junctions and the Wnt receptor. Depletion of p120-catenin abolishes CK1ε binding to LRP5/6 and greatly decreases CK1ε activation upon Wnt stimulation. Elimination of p120-catenin also prevents some early responses to Wnt, such as Dvl-2 phosphorylation, as well as β-catenin stabilization.We have also reported that this modification increases binding of p120-catenin to Kaiso, preventing part of the effects of this transcriptional repressor on target genes. Therefore, Wnt-induced phosphorylation of p120-catenin up-regulates its association with Kaiso, preventing Kaiso interaction and inhibition of Tcf-4 transcriptional factor. However, p120-catenin does not modify Kaiso binding to methylated DNA. The effect of p120-catenin over-expression on Kaiso subcellular localization is cell dependent and some cell lines respond with a Kaiso translocation to the cytosol, whereas others are not affected. Kaiso localization in the nucleus is sensitive to Wnt ligands in p120-catenin-responsive cells; for instance SW-480 cells respond to this stimulus with an almost complete translocation of this factor, sensitive to CK1ε or p120-catenin depletion. These results indicate that Kaiso repressive effect on Tcf-4 transcriptional factor is regulated by Wnt ligands through the phosphorylation of p120-catenin by CK1ε. Therefore, these results demonstrate a novel and crucial function of p120-catenin in Wnt signaling and unveil additional points of regulation by this factor of β-catenin transcriptional activity different of β-catenin stability.

Les Ribonucleotidil Reductases (RNR) són metal·loenzims que catalitzen la reducció dels ribonucleòtids (NTP) als seus corresponents desoxiribonucleòtids (dNTP), que són els monòmers principals per a la síntesi del DNA. S'han descrit tres classes de RNR (I, II i III) atenent la seva estructura, metall, radical i cofactors necessaris per a la síntesi del DNA.En aquest treball s'ha dut a terme l'estudi de diverses RNR bacterianes pertanyent a les tres classes d'RNR des del punt de vista enzimàtic, genètic i evolutiu.Les RNR de classe III (NrdDG) tant sols són actives en condicions d'anaerobiosis estricta, estudiant-se en Escherichia coli i Lactococcus lactis. En ambdós casos mutants pels gens nrdD i nrdG, resulten ser imprescindibles en condicions d'anaerobiosi estricta. La sobreexpressió i purificació de les proteïnes NrdDG de Ll ha posat de manifest que la reducció dels NTPs es du a terme en dos etapes, una primera produint-se l'activació de NrdD i una segona on es produeix la reducció del ribonucleòtid. Per primera vegada s'ha observat que la unió de l'ATP segueix una cinètica sigmoidal amb un alt grau de cooperativitat entre els dos llocs involucrats en la regulació al·lostèrica de l'enzim.Les RNR de classe II (NrdJ) s'han purificat i seqüenciat els seus gens en bacteris filogenèticament primitius com Thermotoga maritima i Deinococcus radiodurans presentant aquestes proteïnes, tots els aa relacionats en la regulació al·lostèrica i activitat catalítica. Podem hipotitzar que ha d'existir una gran relació estructural entre les proteïnes d'aquesta classe amb les de classe I. El gen nrdJ de Dr presenta una inteïna en l'extrem 5' que es processada durant la traducció del gen i absent en la proteïna madura.En els anys 80 es va caracteritzar parcialment la RNR de Corynebacterium ammoniagenes assignant-la a una nova classe (IV), ja que depenia la seva activitat de manganès. En aquest treball hem purificat i seqüenciat la RNR activa, classificant aquesta RNR la ja descrita classe Ib (nrdHIEF). L'anàlisi transcripcional d'aquesta regió demostra l'existència de dos promotors independents pels trànscrits nrdHIE i pel nrdF. Mitjançant RT-PCR semiquantitativa es va detectar la presència de 10 vegades més trànscrit nrdF que de nrdHIE. Aquests gens veuen incrementada la seva expressió en presència d'hidroxiurea, peròxid d'hidrogen y de manganès en el medi, involucrant d'aquesta manera un possible paper de reguladors transcripcionals que regulen el cicle cel·lular, FUR/DtxR y per reguladors que responen a l'estrès oxidatiu.Per primera vegada s'ha observat l'existència de les tres classes de RNR (I, II i III) en un mateix organisme com passa en Pseudomonas aeruginosa, detectant-se l'expressió simultània de les RNR de classe I i II.L'estudi filogenètic i evolutiu a partir d'un alineament de totes les seqüències proteiques disponibles en la base de dades revela que la RNR més ancestral és la classe III que per divergència evolutiva hauria donat lloc a la classe II i posteriorment a la classe I. / Deoxyribonucleotides (dNTP) are synthesized in all organisms from ribonucleotides (NTP), in a reaction catalyzed by the enzyme Ribonucleotide Reductase (RNR). There are three classes of RNR that differ in their protein structure. All operate via a free radical mechanism involving protein radicals but differ in the way in which the protein radical is generated. Class I enzymes require oxygen and are coded either by the nrdAB genes (class Ia) or nrdEF genes (class Ib). Class II enzymes are independent of oxygen and depend on adenosyl cobalamin (B12). Class III enzymes are poisoned by oxygen and are coded by the nrdD and nrdG genes.In the present work we studied diverse RNR classes from different bacterial species from the enzymatic, genetic and evolution point of view.We show that knock-out mutants of either nrdD and nrdG from E. coli and L.lactis were essential during anaerobic growth. The LL nrdD and nrdG were sequenced, cloned and overproduced in E. coli. NrdD and NrdG catalyze the reduction of NTP to the corresponding dNTP in the presence of SAM, a reducing system, potassium ions, DTT and formate. EPR experiments demonstrated a [4Fe-4S] cluster in NrdG and a glycyl radical in NrdD. Allosteric effectors bound to two separate sites on NrdD. The two sites showed an unusually high degree of cooperativity.RNR from the ancient eubacteria, Thermotoga maritima, Deinococcus radiodurans and Chloroflexus. aurantiacus were found to belong a class II enzyme. TM and DR genes were cloned by PCR using peptide sequence information. From the conservation of substrate- and effector-binding residues between class I and this class II sequences we propose that class II enzymes contain a similar 3D structure in the active site.We have purified the active RNR of Corynebacterium ammoniagenes, (CA) previously claimed to represent a fourth RNR class. Peptide and gene sequence analyses clearly indicate that the active RNR is a generic class Ib enzyme, with a diferric metal cofactor.Transcriptional analysis of this nrd region shows the presence of three different mRNA (nrdHIE, nrdF and the ORF). Presence of manganese in the medium stimulate the transcription of both nrdHIE and nrdF genes through a DtxR-like system. Furthermore, oxidative stress and hidroxiurea induce the expression of these genes. Surprisingly, the genomic sequence of Pseudomonas aeruginosa (PA) contains sequences for each of the three classes. Extracts from PA grown aerobically or microaerobically contain active class I and II enzymes simultaneously. The occurrence of the different classes among species of the g-Proteobacteria. Class III are present in all species tested, but the presence of the other classes varies. Phyllogenetic analyse of all known RNR sequences support the hypothesis that the three RNR classes diverged from a common ancestor currently represented by the anaerobic class III.

CARACTERIZACIÓN DE LA REACCIÓN CITOQUÍMICA DE Mycobacterium tuberculosis CON ROJO NEUTRO. CORRELACIÓN CON EL CONTENIDO DE SULFOLÍPIDOLa virulencia de M. tuberculosis se ha relacionado con diversas características fenotípicas y entre las menos exploradas se encuentran las reacciones citoquímicas con diferentes colorantes básicos. Los estudios más prometedores en este campo han sido los que describen la tinción de las cepas virulentas de M. tuberculosis con rojo neutro (RN). El principal objetivo de este trabajo ha sido evaluar el papel desempeñado por los glicolípidos de pared, especialmente sulfolípidos (SL), en la tinción de las cepas virulentas de M. tuberculosis con RN. Además, se planteó conocer la región genómica de la cepa virulenta H37Rv implicada en la fijación de RN (RN+).Se compararon los perfiles glicolipídicos de la superficie de cepas RN+ y RN- de M. tuberculosis mediante cromatografía en columna de intercambio iónico (DEAE) y de capa fina (CCF). También se purificaron diferentes fracciones glicolípidicas de la superficie y se analizó su capacidad de fijar RN (NRA). No se encontró una relación directa entre el contenido de SL, PL y PIM, y el carácter RN+ de M. tuberculosis. Simultáneamente se buscaron las condiciones óptimas para la tinción de micobacterias con RN en tubo de ensayo, y se desarrolló un método para fijar colonias de micobacteria en placas de agar Middlebrook 7H10-OADC modificado. Una combinación de los dos anteriores permitió desarrollar una técnica para la tinción con RN de colonias de micobacteria en placa de cultivo. Adicionalmente se desarrolló un método para la detección rápida de SL en cepas de M. tuberculosis por medio de cromatografía en capa fina de dos dimensiones (CCF-2D), y otro para diferenciar M. tuberculosis H37Ra, de H37Rv y aislados clínicos mediante tinción citoquímica.Por otra parte se construyó una genoteca M. tuberculosis H37Rv en el cósmido "shuttle" pYUB18, la que se transformó en la cepa RN- Mycobacterium smegmatis mc2155 y se cribó mediante tinción con RN en placas de cultivo. Se identificaron tres colonias RN+ de M. smegmatis mc2155, a partir de las cuales se dedujo mediante secuencia nucleotídica, complementación de M. smegmatis mc2155 y análisis de restricción, que la región del genoma de M. tuberculosis H37Rv comprendida entre los marcos abiertos de lectura Rv0570 a Rv0577 estarían posiblemente implicados en el carácter RN+ de las cepas de M. smegmatis mc2155 que fijaron RN. / The M. tuberculosis virulence has been correlated with different phenotypic markers, being the cytochemical reactions with basic dyes the less explored. In this field, the most promising studies have been the staining of M. tuberculosis virulent strains with neutral red (RN).The main objective of this work has been to study the role of cell-surface glycolipids, mainly sulfolipids (SL) in the staining of the virulent strains of M. tuberculosis with NR. Additionally, the genomic region possibly involved in the RN+ phenotype of M. tuberculosis H37Rv was searched.The glycolipidic cell-surface profiles of M. tuberculosis strains that fix or not RN (RN+, or RN-) were compared through ionic interchange column chromatography (DEAE) and thin layer chromatography (CCF). Also, different cell-surface glycolipidic fractions were purified, and their ability for NR fixation (NRA) was analyzed. No direct correlation between the RN+ phenotype and the SL, phospholipids and phosphatidilinositolmannosides (PIM) content were found.The best conditions for NR staining of M. tuberculosis cells in screw-cap tubes were optimized. At the same time a method for fixation of mycobacterial colonies in Middlebrook 7H10-OADC modified agar was developed. These results allowed the design a technique for NR staining of colonies growth in agar plates. In addition, a method for rapid detection of SL in M. tuberculosis strains by two-dimensional thin layer chromatography (CCF-2D), and other for the differentiation between M. tuberculosis H37Ra from H37Rv and clinical isolates, were developed.By the other hand, a library of M. tuberculosis H37Rv was constructed in the "shuttle" cosmid pYUB18 and transformed in the (RN-) Mycobacterium smegmatis mc2155 strain. Three RN+ colonies of M. smegmatis mc2155 (pYUB18::H37Rv) were found by NR staining. Using DNA sequence, complementation of M. smegmatis mc2155, and enzyme restriction analysis, that the M. tuberculosis H37Rv genomic region within the open reading frames Rv0570 to Rv0577 could be possibly involved in the RN+ phenotype of the M. smegmatis mc2155 (pYUB18::H37Rv) that fixed NR.

El PCI, la hirudina i el LCI formen part de la família de proteïnes petites i riques en ponts disulfur, que conté un gran nombre de biopèptids amb potencials aplicacions biotecnològiques, com són els factors de creixement, les toxines, els inhibidors de proteases o desintegrines.A causa de la presència dels ponts disulfur l'expressió recombinant d'aquestes proteïnes és complexa. En el primer treball de la tesi s'estudien tres sistemes de producció recombinant: un sistema eucariota (Pichia pastoris) i dos sistemes procariotes (Escherichia coli). S'optimitzen diversos paràmetres per tal de millorar el seu nivell de producció i es busquen sistemes que permetin simplificar el seu procés de purificació. S'aconsegueix desenvolupar un sistema en E.coli amb una producció final de proteïna que és 10 cops superior al sistema de partida.En el segon treball s'analitza el paper de les regions precursores del PCI en el plegament de la forma madura. S'analitza el procés de replegament oxidatiu in vitro de les diverses pro-formes del PCI per tal de caracteritzar la seva influència sobre la velocitat o la eficiència del plegament de la forma madura. També s'estudia la influència de la pro-regió N-terminal sobre el procés de plegament in vivo en E.coli del PCI madur i d'una sèrie de mutants que presenten un mal plegament o un baix nivell d'expressió recombinant. Finalment es duu a terme una caracterització estructural de la forma corresponent al PCI amb la pro-regió N-terminal a través d'estudis de bescanvi protó/deuteri, exoproteòlisi limitada, espectroscopia de dicroïsme circular i ressonància magnètica nuclear.En l'últim treball s'analitza el procés de plegament proteic de la hirudina i del LCI a través de l'estudi de les reaccions de bescanvi protó/deuteri seguides per espectrometria de masses MALDI-TOF. Es caracteritza l'adquisició d'estabilitat conformacional al llarg del procés de plegament de les dues proteïnes. S'aïllen una sèrie d'intermediaris de plegament i es determina la seva estabilitat; la qual cosa ens permet estudiar les diferències existents entre les vies de plegament de les dues proteïnes. Finalment s'estima la contribució de les interaccions covalents i no-covalents en l'estabilitat final de la proteïna nativa. / PCI, hirudin and LCI belong to the familly of small disulfide-rich proteins, which also contains other biologically important biopeptides like growth factors, desintegrins, toxins or protease inhibitors.These proteins cannot be usually produced at high levels by recombinant DNA approaches due to the presence of the disulfide bridges. To deal with this, we selected three different systems for heterologous expression: one based in external secretion by the yeast Pichia pastoris and two others based in the periplasmic secretion in Escherichia coli, using powerful promoters in all cases. Several parameters were optimized to improve PCI production and to simplify the purification protocol. Finally, a new method was developed, which lead to a final PCI production 10-fold higher than the previously described system. In the second work of the thesis, the role of the PCI pro-regions on the mature peptide folding was analyzed. The in vitro oxidative refolding of mature PCI was compared with that of the pro-forms to characterize their influence on mature PCI folding rates and folding efficiency, using RP-HPLC to analyze the acid-trapped disulfide intermediates collected during the refolding process. The influence of the N-terminal pro-region on the expression or folding of several PCI variants reported to give a low expression yield or a low folding efficiency in vivo in E.coli was also studied. In addition, the presence of ordered structural elements in the N-terminal extension of PCI was investigated by deuteron to proton exchange, limited exoproteolysis, circular dicroism spectroscopy and nuclear magnetic ressonance. In the last work, the folding process of hirudin and LCI was analyzed by deuteron to proton exchange monitored by MALDI-TOF mass spectrometry. The comparison of the number of slow exchanging protons of different samples along the folding pathway provided an easy and fast way to follow the protein folding process. Additionally, the deuteron to proton exchange experiments on purified folding intermediates allowed us to characterize the differences between the two folding pathways and to measure the contribution of the disulfide bonds versus the non-covalent forces to the stability of the native protein.

Una de las aplicaciones de la ingeniería de proteínas es el desarrollo de biosensores moleculares como herramientas para la detección de sustancias mediante la interacción de una macromolécula y su ligando. De acuerdo a este principio se han generado una serie de prototipos de biosensores enzimáticos que han surgido a partir de la ingeniería de proteínas tales como la fosfatasa alcalina, b-galactosidasa, b-lactamasa y la proteína TSP del bacteriófago P22. En todas estas enzimas modificadas se han insertado péptidos inmunoreactivos que actúan como sondas, en aquellos sitios permisivos de las superficies expuestas al solvente de cada enzima. La unión con anticuerpos anti-péptido da como resultado un aumento o una disminución en la actividad enzimática en una forma dependiente del título, lo que a su vez constituye un método simple para la detección y cuantificación de especies moleculares dentro de una mezcla compleja.Hasta el momento los únicos activadores descritos de los biosensores basados en enzimas son los anticuerpos y aún se desconoce el mecanismo por el cual se produce esta regulación enzimática. El principal objetivo de este trabajo ha sido determinar el tipo de interacciones moleculares que son necesarias para que se lleve a cabo la modulación de la actividad b-galactosidasa. Especialmente, se pretendía evaluar la necesidad de una unión bivalente para la reactivación y explorar la adaptación de los biosensores b-galactosidasa a la detección de ligandos monovalentes, como antígenos.Se evaluó la interacción molecular entre un péptido RGD recombinante del virus de la fiebre aftosa, expuesto en la superficie de una proteína portadora y sus receptores en la superficie celular. Como ligandos se utilizaron las integrinas avb3 y a5b1 solubles, así como células BHK21. Los resultados indicaron que ni las integrinas solubles ni aquellas expuestas en las células son capaces de modificar la actividad de sensores enzimáticos que por el contrario son activados por la unión de anticuerpos dirigidos contra el motivo RGD. Adicionalmente, se realizaron otros ensayos para determinar el impacto que podía tener la presentación múltiple de péptidos sobre la eficiencia de la unión a células. En este caso se observó que aumentando el número de segmentos virales mejoraba la unión de las proteínas recombinantes a las células.Se llevó a cabo el clonaje y producción en Escherichia coli de un fragmento scFv recombinante del anticuerpo monoclonal SD6, dirigido contra un péptido vírico antigénico, expuesto en un modelo de biosensor basado en la enzima b-galactosidasa. Los resultados indicaron que la unión del scFv no causaba ninguna respuesta enzimática mientras que la presencia simultánea del scFv y del fragmento Fab del SD6 daba como resultado una respuesta eficiente pero no aditiva del sensor, cuya actividad enzimática aumentaba hasta en un 200%. Este efecto cooperativo que también se pudo observar cuando se combinaban el scFv y el fragmento Fab de un anticuerpo no homólogo denominado 4C4, nos permitió postular que la reactivación enzimática requiere contactos múltiples y probablemente heterogéneos entre el sensor molecular y los analitos, y que no es necesaria la interacción con ligandos moleculares bivalentes para que se produzca dicha modulación de actividad.Por último, se evaluaron diferentes sitios tolerantes de la enzima b-galactosidasa para generar enzimas híbridas funcionales que presentaran el fragmento recombinante scFv del anticuerpo monoclonal SD6. La caracterización de las proteínas híbridas obtenidas indicó que al fusionar dicho fragmento al extremo amino-terminal de la enzima, la proteína era estable, mantenía su actividad específica e interactuaba con el antígeno hacia el cual estaba dirigido el fragmento de anticuerpo fusionado. Además la quimera scFv-enzima era activa aún cuando se encontraba unida al antígeno y por lo tanto, se demostró su utilidad como reactivo en ELISA. / One of the applications of protein engineering is the development of molecular biosensors as tools for the detection of substances by means of the interaction between a macromolecule and its ligand. According to this principle, a series of prototypes of enzymatic biosensors have been generated through the engineering of proteins such as alkaline phosphatase, b-galactosidase, b-lactamase and TSP protein from P22 bacteriophage. In all these modified enzymes, immunoreactive peptides acting as probes have been inserted in those permissive sites of solvent-exposed surfaces of each enzyme. Binding with anti-peptide antibodies gives rise to an increase or a decrease in the enzymatic activity in a titre dependent way, what in turn constitutes a simple method for the detection and quantification of molecular species within a complex mixture. Until now, antibodies are the only described activators of enzyme based biosensors and the mechanism by which this enzymatic regulation takes place is still unknown. The main objective of this work was to determine the type of molecular interactions necessary for the up-regulation of b-galactosidase activity. Specially, it was sought to evaluate the need of a bivalent union for activity modulation and to explore the adaptation of b-galactosidase biosensors to the detection of monovalent ligands, as antigens. The molecular interaction between a recombinant RGD peptide from foot-and-mouth disease virus displayed on the surface of a carrier protein and its receptors on the cell surface was evaluated. Soluble integrins avb3 and a5b1, as well as BHK21 cells were used. The results indicated that both soluble integrins and cell linked ones were not able to modify the activity of enzymatic sensors that on the contrary are activated by binding of antibodies directed against the RGD motif. Additionally, other assays were carried out to determine the impact that multiple peptide presentation could have on cell-binding efficiency. In this case it was observed that increasing the number of viral segments cell binding to recombinant proteins was improved.Cloning and production in Escherichia coli of a recombinant SD6 scFv fragment directed against a sensing peptide, displayed on a model b-galactosidase-based biosensor was carried out. The results indicated that scFv-binding did not cause any enzymatic response while the simultaneous presence of scFv and the SD6 Fab fragment results in a non-additive, efficient sensor response, enhancing the enzyme activity up to about 200%. This cooperative effect, which also could be observed by combining SD6 scFv and the non-homologous anti-peptide 4C4 Fab fragment, allowed us to postulate that enzyme up-regulation requires multiple and probably heterogeneous contacts between the sensor molecule and the analytes, and that interaction with bivalent molecular ligands is not necessary for activity modulation to take place. Lastly, different permissive sites in b-galactosidase enzyme were evaluated to generate functional hybrid enzymes displaying the SD6 scFv antibody fragment. Characterization of the resultant hybrid proteins indicated that when fusing this fragment to the amino terminus of the enzyme, the protein was stable, it maintained its specific activity and interacted with the target antigen against which the fused antibody fragment was directed. The scFv-enzyme chimera was enzymatically active while bound to the antigen and therefore, it was demonstrated its possible application as single-molecule reagent in ELISA.

Molts enzims i proteïnes fisiològicament actives se sintetitzen en forma de precursors inactius o zimògens. La seva activació per proteòlisi limitada és un mecanisme de regulació enzimàtica. En aquesta treball s'ha estudiat el fragment alliberat en l'activació proteolítica d'un proenzim pancreàtic, la procarboxipeptidasa A (PCPA) monomèrica de pàncrees porcí. La caracterització estructural d'aquest segment es va portar a terme estudiant-lo aïllat i unit a l'enzim actiu amb la finalitat d'esbrinar si la conformació que presenta és la mateixa en els dos casos. Els resultats indicaren que un cop alliberat de l'enzim el segment d'activació de la PCPA presenta una conformació diferent amb un elevat grau de flexibilitat conformacional. El segment d'activació aïllat presentà una elevada termoestabilitat, molt superior a la del proenzim, essent el seu procés de desnaturalització reversible i presentant un únic domini estructural. Estudis per ressonància magnètica nuclear indicaren que aquest segment presenta una estructura globular, la qual es manté en un ample marge de valors de pH, i confirmaren l'elevada flexibilitat conformacional. La estructura primària del segment d'activació de la PCPA presentà una similitud important amb proteïnes fixadores de calci de la família EF-hand amb dos potencials regions fixadores de calci. Estudis teòrics de predicció de la seva estructura secundària corroboraren la presència d'aquestes dues regions. A fi de comprovar si aquest segment pertanyia a l'esmentada família proteica es comprovà experimentalment la seva capacitat per a fixar calci. Els resultats indicaren una feble unió de calci, per tant, no es podia considerar aquest segment com a membre de la família de proteïnes fixadores de calci de tipus EF-hand. No obstant, sí que la seva estructura es troba relacionada amb aquesta família de proteïnes ja que es va observar que presentava una sèrie de característiques que també acompleixen les proteïnes d'aquesta família. Va presentar capacitat per a fixar Tb3+, metall que pot substituir al Ca2+ i un comportament en interaccionar amb el colorant Stains-all semblant a la calmodulina, una proteïna que pertany a la família de proteïnes fixadores de calci tipus EF-hand. Els resultats, per tant, permeteren concloure que el segment d'activació de la PCPA de pàncrees porcí està estructuralment relacionat amb les proteïnes fixadores de calci de la família EF-hand. Aquest aspecte és interessant atesa la longitud del segment d'activació estudiat (94 aminoàcids) ja que permet hipotetitzar un possible origen evolutiu d'aquest segment. No és fàcil comprendre que un segment d'aquestes dimensions pugui tenir com a única funció actuar d'inhibidor d'un enzim. / Muchos enzimas y proteínas fisiológicamente activas se sintetizan en forma de precursores inactivos o zimógenos. Su activación por proteólisis limitada es un mecanismo de regulación enzimática. En este trabajo se ha estudiado el fragmento liberado en la activación proteolítica de un proenzima pancreático, la procarboxipeptidasa A (PCPA) monomérica de páncreas porcino. La caracterización estructural de este segmento se llevó a cabo estudiándolo aislado y unido al enzima activo con la finalidad de discernir si la conformación que presenta es la misma en los dos casos. Los resultados indicaron que, un una vez liberado del enzima, el segmento de activación de la PCPA presenta una conformación diferente con un elevado grado de flexibilidad conformacional. El segmento de activación aislado presentó una elevada termoestabilidad, muy superior a la del proenzima, siendo su proceso de desnaturalización reversible y presentando un único dominio estructural. Estudios de resonancia magnética nuclear indicaron que este segmento presenta una estructura globular, la cual se mantiene en un amplio margen de valores de pH, y confirmaron la elevada flexibilidad conformacional. La estructura primaria del segmento de activación de la PCPA presentó una similitud importante con secuencias de proteínas fijadores de calcio de la familia EF-hand con dos potenciales regiones fijadores de este metal. Estudios teóricos de predicción de su estructura secundaria corroboraron la presencia de estas dos regiones. Con la finalidad de comprobar si este segmento pertenecía a la citada familia de proteínas se comprobó experimentalmente su capacidad para a fijar calcio. Los resultados indicaron una débil unión de este metal, por tanto, no se podía considerar este segmento como un miembro de la familia de proteínas fijadores de calcio del tipo EF-hand. No obstante, sí que su estructura se halla relacionada con esta familia de proteínas ya que se observó que presentaba una serie de características que también se dan en les proteínas de esta familia. Presentó capacidad para fijar Tb3+, metal que puede sustituir al Ca2+ y un comportamiento al interaccionar con el colorante Stains-all muy similar al que presenta la calmodulina, una proteína que pertenece a la familia de proteínas fijadoras de calcio tipo EF-hand. Los resultados, permitieron concluir que el segmento de activación de la PCPA de páncreas porcino está estructuralmente relacionado con les proteínas fijadores de calcio de la familia EF-hand. Este aspecto es interesante, teniendo en cuenta la longitud del segmento de activación estudiado (94 aminoácidos), ya que permite hipotetizar un posible origen evolutivo del mismo. No es fácil comprender que un segmento de estas dimensiones pueda tener como única función actuar de inhibidor de un enzima. / Many enzymes and physiological active proteins are synthesized as inactive precursors or zymogens. Their activation by limited proteolysis is a mechanism of enzymatic regulation. In the present work, it has been studied the fragment released in the proteolytic activation of a porcine pancreatic zymogen, monomeric procarboxypeptidase A (PCPA). Its structural characterization was carried out studying the segment isolated and linked to the active enzyme forming the zymogen in order to test whether its conformation was the same in both cases. The results showed that, once released from the zymogene, the activation segment of PCPA presented a different conformation with a high conformational flexibility. The isolated activation segment showed a significant thermostability, higher than that presented by the proenzyme. Its thermal unfolding was completely reversible and it was observed that the protein was composed by single domain. NMR studies indicated that this segment is a globular protein, which structure is maintained in wide range of pH values, and confirmed its high degree of conformational flexibility. The activation segment of PCPA showed a significant degree of sequence homology with members of the EF-hand calcium binding protein family, with two potential sites for metal binding. Theoretical studies on the secondary structure prediction confirmed the presence of these two regions on its structure. To test whether this segment belonged to the above mentioned protein family, its ability to bind calcium was experimentally tested. The results showed a weak binding of this metal. Thus, it was not possible to consider this protein as a member of the EF-hand calcium binding protein family. Nevertheless, its structure was indeed related to this family of proteins because it was observed that the segment presented a set of characteristics typical of members of this family. It presented ability to bind Tb3+, a metal that can substitute Ca2+, and when its interaction with the dye Stains-all was tested, a similar behaviour to that presented by calmodulin, a protein that belongs to the calcium binding EF-hand protein family, was observed. In a whole the results allowed to conclude that the activation segment of monomeric porcine PCPA is structurally related to the members of the calcium binding EF-hand protein family. This finding is very interesting taking into account the length of this segment (94 residues. A possible evolutive origin can be envisaged. It is not easy to understand that such a long segment has as a unique function to act as inhibitor of an enzyme.

Els últims avenços en biologia molecular i cel·lular no tan sols han contribuït al coneixement de la base molecular de moltes malalties, sinó que també han proporcionat una tecnologia amb potencial de manipulació de gens in vivo. La teràpia gènica sorgeix com una estratègia terapèutica basada en la transferència de material genètic per al tractament de malalties d'origen genètic o infecciós, substituint, reparant o potenciant la funció biològica dels teixits o sistemes lesionats. Els principals estudis en aquesta línia d'investigació estan dirigits al desenvolupament de vectors eficients en la transferència gènica. En els últims anys, l'ús de vectors no vírics en teràpia gènica ha anat prenent importància, ja que tot i que s'ha demostrat que els vectors vírics són eines molt eficients en la transferència de DNA, presenten limitacions associades, com ara la difícil obtenció de títols elevats de partícules víriques, la inducció de respostes immunològiques i riscs de seguretat biològica com la mutagènesi insercional i la possible reversió a vectors recombinants competents en replicació. És molt important assegurar dins del ús de sistemes no vírics, processos de transferència gènica mediada per receptor, no tan sols per dirigir el procés d'internalització cel·lular eficientment, sinó per poder mantenir l'especificitat per un tipus cel·lular diana. Les proteïnes quimèriques recombinants són candidats molt interessants en la transferència gènica no vírica. La generació d'aquests vehicles ha estat poc explorada dins la teràpia gènica, i es basa en la combinació de diverses proteïnes o dominis proteics bioactius en una sola cadena polipeptídica. Aquestes regions heteròlogues combinades, aporten capacitat d'unir molècules de DNA, el reconeixement i la internalització cel·lular i possibles funcions potenciadores de la transferència cel·lular com ara la llisi d'endosomes i el transport nuclear. Els senzills processos de producció i purificació a gran escala i la seva naturalesa modular, fan que siguin vehicles fàcilment optimitzables i adequables a noves aplicacions de teràpia gènica i amb un elevat potencial com a vectors alternatius als sistemes vírics. En aquesta Tesi Doctoral s'han desenvolupat un grup de proteïnes quimèriques prototip, basades en l'enzim b-galactosidasa d'Escherichia coli, que presenten en la seva superfície una cua de lisines com a domini d'unió a DNA i la regió de reconeixement cel·lular del virus de la febre aftosa basada en motius RGD. A més a més, l'enzim b-galactosidasa funciona com a domini de purificació del constructe resultant i permet detectar i quantificar les proteïnes quimèriques mitjançant assaigs colorimètrics senzills. La presència de forma natural en aquest enzim d'una seqüència de localització nuclear críptica permet a aquestes proteïnes dirigir eficientment la transferència de DNA en cèl·lules de mamífer. La primera construcció obtinguda va ser anomenada 249AL i es va demostrar que unia i condensava DNA eficientment i era capaç de dirigir específicament, mitjançant el reconeixement de la integrina avb3, la seva transferència en cultius cel·lulars. Després d'optimitzar el procés de transferència gènica in vitro es van realitzar aproximacions in vivo injectant complexes de proteïna-DNA intracerebralment en rates. Els resultats mostraven que la proteïna 249AL és un prototip de vector alternatiu al ús de vectors vírics en el SNC, especialment en aplicacions terapèutiques a zones lesionades en les que es produeix un increment de l'expressió dels gens de les integrines avb3. Derivats de la proteïna 249AL, com la proteïna NLSCt, demostren que mitjançant la incorporació de nous dominis com ara altres senyals de localització nuclear, com la del Antigen-T de SV40, és poden obtenir nivells d'expressió gènica més elevats. Aquests resultats conviden a aprofundir en l'aproximació modular al disseny de vectors recombinants no vírics per a teràpia gènica. / Recent advances in molecular and cellular biology have contributed to the knowledge of the molecular bases of some diseases and have provided new technologies for gene manipulation in vivo. Thus, gene therapy arises as a therapeutic strategy for gene delivery applied to the genetic and infectious diseases treatment, replacing, repairing or stimulating the biological function of affected tissues. The main studies in gene therapy have focused on the development of gene transfer vectors to ensure the efficiency in gene delivery processes.Some engineered viruses have been largely explored as such transfer vehicles with an important degree of success. However, a set of adverse reactions such as the difficult production of high viral particles titres, the induction of immune response and the associated biological risks such as insertional mutagenesis and the generation of replication competent viral particles, have strongly encouraged the use of non-viral vehicles for gene transfer. In the context of non-viral vectors, it is important to maintain receptor mediated gene transfer processes to ensure an efficient cellular internalisation and specificity. Chimerical recombinant proteins are interesting candidates in non-viral gene transfer and they have been constructed by combining bioactive proteins, or proteins domains, from different origins in a single polipeptidic chain. These joined regions supply DNA-condensing, cell-binding, internalisation and eventually endosome-disrupting and nuclear targeting activities. Although this family of constructs is still in an early stage of development, its intrinsic flexibility, the simplicity in the production and purification processes and the possibility of further improvement by protein engineering offers wider perspectives in gene therapy. In this Thesis it has been developed a new set of prototype chimerical proteins based on Escherichia coli b-galactosidase enzyme carrying a polylisine-based DNA binding domain and an integrin-targeting RGD cell binding peptide from Foot and Mouth Disease Virus (FMDV). The b-galactosidase acts as a purification domain of the final construct and permits its detection and quantification by simple colorimetric assays. The natural presence in this enzyme of a cryptic nuclear localisation signal (NLS) contributes to the efficiency of gene transfer to mammalian cells. The protein 249AL was the first construction obtained and it showed DNA binding and condensing abilities and led cellular gene transfer through the recognition of avb3 cellular integrins. After in vitro optimisation of gene delivery processes, in vivo approaches were carried out by injecting P9 rats intracerebrally with DNA-protein complexes. The results showed that 249AL protein is a promising alternative to viral vectors for CNS gene therapy, mainly in injured areas where the avb3 gene expression is increased. The 249AL derivatives, such as NLSCt protein, demonstrate that the incorporation of new functional domains such as other NLS, like that from SV40 T-antigen, could improve the obtained gene expression levels and invites explore in more detail this modular approach for the design of non-viral vectors in gene therapy.