Tenint en compte que l’edat és el principal factor de risc per patir deteriorament cognitiu, elucidar si els factors que prolonguen la vida també poden prevenir, retardar o contrarestar la disfunció neuronal associada a l’envelliment o a processos neurodegeneratius esdevé un gran repte amb importants implicacions terapèutiques. Així doncs, en el context d’aquesta tesi centrada en la búsqueda de factors neuroprotectors per retardar la progressió del deteriorament cognitiu associat a l’edat, i en particular hem caracteritzat l’expressió de Klotho, un gen anti-­‐envelliment, en cervell. Per fer-­‐ho, s’ha estudiat el perfil d’expressió de klotho en cervell tant en condicions d’envelliment normal com en condicions patològiques. En aquest sentit, s’han analitzat els nivells d’expressió de les dos isoformes de klotho (m-­‐KL i s-­‐KL) en diferents àrees cerebrals: còrtex prefrontal, còrtex cerebral, hipocamp i cerebel. D’aquesta manera, s'ha pogut comprovar que durant l’envelliment cerebral fisiològic els nivells d'expressió de las dos isoformes de klotho es veuen reduïts significativament. També s'ha observat que aquesta disminució es veu accelerada en condicions d'envelliment patològic, gràcies als estudis fets en el ratolí 3xTg-­‐AD. A més, els resultats obtinguts suggereixen que donat que els nivells de klotho en aquest model es troben disminuïts significativament als 6 mesos d’edat, en etapes primerenques de la progressió de la malaltia, podria tenir un ús potencial com a biomarcador de diagnòstic precoç d'Alzheimer. Per contra, s'ha vist que l'exposició a uns hàbits de vida saludable, com la pràctica d’ exercici físic moderat continuat durant l’etapa adulta, alenteix la baixada en els nivells d’expressió de klotho en cervell. De manera important, per primer cop, s’ha detectat la proteïna secretada de klotho produïda per splicing alternatiu (s-­‐KL) utilitzant un nou anticòs dissenyat i generat en aquest treball (K113). S’ha pogut observar que malgrat l’mRNA de s-­‐KL s’expressa de manera similar en cervell que en ronyó, a nivell de proteïna s-­‐KL és 9-­‐10 vegades més abundant en cervell que en ronyó, suggerint que el seu paper principal és a SNC. És més, els resultats del nostre estudi mostren que s-­‐KL presenta un perfil d'expressió espacio-­‐temporal diferent del de m-­‐KL, suggerint que ambdues isoformes poden tenir funcions diferents en cervell. Per últim, s’han estudiat els efectes de la sobreexpressió/inhibició de klotho en SNC (utilitzant estratègies de teràpia gènica amb vectors adenoassociats de tropisme neuronal) sobre les capacitats cognitives de ratolins adults i ancians. . S’ha vist que la modificació dels nivells de les dues isoformes de klotho (m-­‐KL i s-­‐KL) també té efectes sobre els símptomes neuropsiquiàtrics associats a la demència (BPSD). A més, la sobreexpressió de klotho (sobretot m-­‐KL) també presenta un cert efecte ansiolític, i la seva inhibició, l’efecte contrari. Finalment, destacar que també s'ha pogut comprovar que, independentment de l’edat, la sobreexpressió de m-­‐KL i s-­‐KL permet millorar les capacitats cognitives dels animals en relació a la memòria de treball (T-­‐maze) i als processos d’aprenentatge i memòria espacial (Morris Water Maze). Aquests resultats suggereixen que Klotho podria ser una diana amb potencial terapèutic pel tractament dels dèficits cognitius associats a l’envelliment. / Given that the aging process is susceptible to change, and taking into account that age is the main risk factor for the development of age-­‐related cognitive decline, elucidate whether the factors that prolong lifespan also can prevent, delay or counteract neuronal dysfunction associated to aging or neurodegenerative processes becomes a challenge with important therapeutic implications. For this reason, we decided to focus in the search for neuroprotective factors to slow the progression of cognitive decline associated to aging , particularly we have analyzed and characterized Klotho brain expresion , an anti-­‐aging gene. To this end , we have studied Klotho expression profile in brain both in normal aging and in pathological conditions . In this regard, we have characterized the expression levels of the two isoforms Klotho (m-­‐KL and s-­‐KL ) in different brain areas : prefrontal cortex, cerebral cortex , hippocampus and cerebellum. Thus, we have seen that during physiological aging expression levels of the two Klotho isoforms in brain are significantly reduced. We have also found that this decrease is accelerated during pathological brain aging in our studies in the 3xTg -­‐AD micel. Since the levels of Klotho in this model are significantly decreased at 6 months of age, before b-­‐ amyloid plaques formation , Klotho could be used as a biomarker for early diagnosis of the disease Alzheimer. Conversely , exposure to healthy lifestyle habits , such as the practice of moderate continuois exercise during adulthood significantly slows the decrease in t Klotho levels in the brain. Importantly , for the first time, we have detected the secreted Klotho protein produced by alternative splicing (s-­‐KL) using a new antibody designed and generated in this work (K113). We have observed that despite s-­‐KL mRNA is expressed similarly brain and in kidney, at protein level, s-­‐KL is 9-­‐10 times more abundant in brain than in kidney, suggesting that its main role could be in Central Nervous System. Furthermore, the results of our study show that s-­‐ KL isoform presents a different spatio-­‐temporal expression profile from m-­‐KL, suggesting that both isoforms may have different functions in the brain. We have also studied the effects of Klotho overexpresion/ inhibition in CNS (using gene therapy strategies with AAV vectors with neuronal tropism) on cognitive abilities of adult and old mice. We have seen that modifying the levels of both Klotho isoforms (m-­‐KL and s-­‐KL) also has effects on neuropsychiatric symptoms associated with dementia (BPSD). Thus, its overexpression increased exploration activity in adult mice, while silencing it made animals become less active. In addition, overexpression of Klotho (especially m-­‐KL also has a certain anxiolytic effect, and its inhibition the opposite. Finally, it’s important to highlight that, regardless of the age, overexpression of m-­‐KL and s-­‐KL can improve cognitive abilities of animals in relation to both working memory (T -­‐ maze) and spatial learning and memory (Morris Water Maze). These results suggest that Klotho could be a potential therapeutic target for the treatment of age-­‐related cognitve impairments.

Davant la necessitat de nous enfocaments en el tractament de determinades malalties, en els darrers anys s’han desenvolupant sistemes nanoestructurats no virals com a vehiculitzadors d’agents terapèutics -entre els que es troben els àcids nucleics- com a alternativa tant a les formes farmacèutiques clàssiques com als sistemes virals, els quals presenten riscos associats que no compensen els eventuals beneficis. Entre els diversos tipus de sistemes no virals per a transfecció d’àcids nucleics (DNA i RNA) dirigits a la regulació de l’expressió gènica, es troben les nanopartícules polimèriques catiòniques de quitosan-TPP i les nanopartícules lipídiques sòlides catiòniques (cSLN). El diàmetre mitjà de les nanopartícules i el potencial superficial obtingut (entès com a potencial Z) són variables clau per determinar la seva idoneïtat per a l’ús previst. Les nanopartícules polimèriques catiòniques de quitosan-TPP s’obtenen majoritàriament pel mètode de gelificació ionotròpica. En aquest treball, s’han optimitzat certs paràmetres operacionals del mètode per tal de reduir el temps de síntesi i aconseguir nanopartícules de mida i potencial Z adients. Enfront la variabilitat que presenta aquesta classe de sistema nanoparticulat, i molt particularment a causa de la puresa i grau de desacetilació de la matèria primera, es proposa l’estudi d’un sistema alternatiu per a transfecció d’àcids nucleics. Aquest sistema d’elecció són les nanopartícules lipídiques sòlides catiòniques (cSLN), obtingudes pel mètode la microemulsificació en calent. A partir d’una formulació original, i per tal de reduir al màxim els components de la formulació i per tant, els riscos de citotoxicitat, s’avaluen diferents components i la quantitat mínima necessària a la formulació, sense comprometre ni la mida de partícula ni el potencial Z. La caracterització dels components i les seves interaccions, així com la determinació de les propietats de la formulació resultant per mitjà de diverses tècniques instrumentals, indiquen la idoneïtat de les cSLN per a l’ús previst. Els estudis de citotoxicitat en les línies cel·lulars HEK293T i HeLa demostren que la viabilitat cel·lular no es veu compromesa per la presència de cSLN en determinades quantitats. A partir de plasmidis d’expressió eucariota, es determina per mitjà d’assajos de retardament en gel la relació òptima cSLN:pDNA per a un 100% d’eficiència d’unió. A partir d’aquesta dada, es porten a terme estudis d’expressió funcional d’un fragment del gen que codifica per al factor de transcripció TCERG1 per mitjà d’immunoblotting, i del gen Luc que codifica per a l’enzim luciferasa per mitjà d’un assaig de bioluminescència, que demostren l’expressió proteica a partir de la transfecció de lipoplexos cSLN:pDNA. Així mateix, i a partir d’un fragment de siRNA contra TCERG1, s’estableix la relació òptima cSLN:siRNA per a un 100% d’eficiència d’unió. En aquest cas, l’estudi es complementa amb l’avaluació de l’eficiència de transfecció dels lipoplexos cSLN:siRNA. Es pot concloure que el siRNA és capaç d’arribar a la cèl·lula quan s’utilitzen cSLN com a agent de transfecció, obrint la porta a la possibilitat de regulació de l’expressió gènica a partir de lipoplexos cSLN:siRNA. / Nanostructured non-viral delivery systems have recently being developed for transfection of therapeutic agents such as nucleic acids. Cationic polymeric nanoparticles of chitosan-TPP and cationic solid lipid nanoparticles (cSLN) are two of these delivery systems. In this work, several key operational parameters linked to the ionotropic gelation method were optimized to develop cationic polymeric chitosan-TPP nanoparticles. Because of the variability of the methodology and the raw material in the properties of nanoparticles, cationic solid lipid nanoparticles (cSLN) were chosen as an alternative system for delivery of various nucleic acids such as plasmid DNA. To this goal, the first specific aim was to decrease the components of a starting formulation to minimize the risk of cell toxicity. The components of the formulation were qualitatively and quantitatively assessed to achieve the minimum amount necessary for obtaining cSLN, while maintaining a proper particle size and Z potential. The suitability of the cSLN was studied through the characterization of the components, their interactions, and the properties of the resulting formulation. The optimal ratio for cSLN:pDNA lipoplexes was determined by using gel retardation assays, with an achievement of 100% binding efficiency. Minimal toxicity of the cSLN was observed in cell cultures using the established HEK293T and HeLa cell lines. More importantly, the cSLN were able to transiently express proteins from transfected DNA, which were detected by using bioluminescence assays. In addition, the optimal ratio for cSLN:siRNA (a 21-oligonucleotide targeting a transcription factor) was established to achieve 100% binding efficiency. The transfection efficiency of the cSLN:siRNA lipoplexes was confirmed in HEK293T and HeLa cells. The results demonstrate the efficacy of the developed cSLN-based lipoplexes for delivery of nucleic acids to regulate gene expression.

Aquesta tesi és part d’un projecte d’investigació més general que té com a objectiu estudiar el paper de la serina/treonina quinasa CK2 en el desenvolupament de les plantes, utilitzant Arabidopsis thaliana com a model. Malgrat ser una de les primeres quinases identificades, les vies de senyalització en què participa la CK2 encara no estan completament caracteritzades. En la primera part d’aquesta tesi es descriu la implicació de la quinasa CK2 en la via de senyalització de l’àcid salicílic (SA) i, el control exercit per aquesta hormona en l’expressió dels gens que codifiquen per les proteïnes PIN (exportadores d’auxina), i per a la quinasa reguladora d’aquests transportadors, la proteïna PINOID (PID). Antics membres del laboratori on s’ha realitzat aquesta tesi havien previament obtingut un mutant dominant negatiu de la CK2 (CK2mut) en Arabidopsis (Moreno-Romero et al., 2008). En aquest treball mostrem que aquestes plantes contenen nivells elevats de SA i que l’acumulació de SA a les arrels és el responsable del fenotip radicular alterat (disminucio de la longitud de l’arrel i absència d’arrels lateral). També demostrem que tractaments amb SA exogen redueixen la transcripció dels gens que codifiquen per als transportadors PIN1-PIN4 i PIN7, mentre que estimulen la transcripció del gen que codifica per la quinasa PID. Aquest efecte és similar a l’observat en les arrels de les plantes CK2mut, exceptuant als gens PIN4 i PIN7 que es mostren sobreexpressats. Aquest resultat, suggereix que l’efecte repressor de SA en l’expressió de PIN4 i PIN7 requereix que la quinasa CK2 sigui funcional. D’altra banda, SA estimula l’expressió de les subunitats de CK2, mentre que la pèrdua d’activitat CK2 a les plantes CK2mut produeix un augment de la transcripció de gens relacionats amb la biosíntesi de SA. Aquests resultats suggereixen l'existència d’un loop de retroalimentació negatiu entre la CK2 i el SA, necessari per mantenir la homeostasi de SA. En aquest capítol també es mostra que la sobreexpressió d’una subunitat CK2α catalíticament activa provoca un increment del sistema radicular de les plantes. En la segona part d’aquesta tesi, ens hem centrat en la recerca i caracterització de substrats de la CK2 en Arabidopsis. Amb aquest objectiu, vam realitzar un assaig de doble híbrid en llevat, que ens va permetre identificar, entre d’altres, a la proteïna NPH3 com a possible substrat de la CK2. NPH3 és un element essencial de la via de senyalització del fototropisme; la seva activitat en aquesta via depèn del seu estat de fosforilació i del seu paper com a adaptador de substrat d’un complex d’ubiquitinació del tipus Cullin3-Ring E3 lligasa (CRL3NPH3). Aquest complex ubiquitina al fotoreceptor de llum blava phototropin 1, el qual es troba associat a la membrana plasmàtica. En la foscor, la proteïna NPH3 està fosforilada i inactiva, mentre que en condicions de llum, està defosforilada i activa, i dirigeix la ubiquitinació de phot1. Recentment, s’ha proposat que la ubiquitinació de phot1 promou la seva internalització des de la membrana cap al citoplasma. Els resultats obtinguts en aquest treball demostren que la quinasa CK2 fosforila NPH3 in vitro i que l’activitat d’aquesta quinasa és necessària per a la fosforilació in vivo en condicions de foscor. A més, la fosforilació de NPH3 per part de la CK2 és important per a mantenir la proteïna NPH3 inactiva. D’altra banda, la manca d’activitat CK2 provoca l’internalització de phot1, inclús en foscor, fet que podria estar relacionat amb el fenotip no fototròpic de les plantes sense activitat CK2. Aquesta internalització és independent de la presència de NPH3 i, per tant, independent d’ubiquitinació. Sorprenentment, la internalització de phot1 observada en condicions de llum, també és independent de la presència de NPH3. / This thesis is part of a research project that aims to study the role of the serine/threonine protein kinase CK2 in plant development, using Arabidopsis thaliana as a model. Despite being one of the first kinases identified, the signaling pathways in which CK2 is involved are not yet fully characterized. The first part of this thesis describes the involvement of CK2 in the signaling pathway of salicylic acid (SA), and the control exercised by this hormone in the expression of genes coding for auxin membrane transporters (the PIN proteins) and their regulatory kinase PINOID (PID). Former members of the group where this thesis was carried out had obtained a dominant negative mutant of CK2 (CK2mut plants). These plants showed altered root phenotypes (decrease of the main root length and absence of lateral root formation) and changes in the transcription levels of genes encoding several of the PIN proteins (PIN1-PIN4 and PIN7) and of the kinase PINOID (PID) (Marques-Bueno et al., 2011). Here, we show that CK2mut plants contain high levels of salicylic acid, which are responsible for the root phenotype of CK2mut plants. We also demonstrate that treatment of Arabidopsis wild-type plants with exogenous SA inhibits the transcription of genes coding for proteins PIN1-PIN4 and PIN7, while it stimulates the transcription of the PID encoding gene. This effect is similar to that observed in roots of CK2mut plants, except for PIN4 and PIN7 genes, which are overexpressed, suggesting that the repressive effect of SA on PIN4 and PIN7 expression requires a functional CK2. Moreover, SA stimulates the expression of CK2 subunits, whereas the loss of CK2 activity in CK2mut plants produces an increase in the transcript levels of genes related to SA biosynthesis. We propose the existence of a negative feedback loop between CK2 and SA, needed to maintain the homeostasis of SA. This chapter also shows that overexpression of a catalytically active α subunit of CK2 improves the root system of Arabidopsis plants. The second part of this thesis focuses on the searching and characterization of plant CK2 substrates. For this purpose, we performed a large scale yeast two-hybrid screen that resulted in the identification of 28 potential CK2 substrates. Among them, we found four members of the same protein family, called NPH3/RPT2 (NRL), including NPH3, the founder member of the family. NPH3 is an essential element of the phototropic signaling pathway, and its activity in this pathway depends on its phosphorylation state and on its role as a substrate adapter within the Cullin3-Ring E3 ligase (CRL3NPH3) ubiquitination complex. CRL3NPH3 ubiquitinates the membrane-associated blue light photoreceptor phototropin 1. In the dark, NPH3 is phosphorylated and inactive, while in light conditions it is defosforilated and active and directs ubiquitination of phot1. Recently, it has been proposed that ubiquitination of phot1 promotes its internalization from the plasma membrane into the cytoplasm. Here we show that CK2 phosphorylates NPH3 in vitro, and that CK2 activity is required for the in vivo NPH3 phosphorylation in darkness. In addition, phosphorylation of NPH3 by CK2 is important to keep the protein inactive. Moreover, we observe that the lack of CK2 activity causes internalization of phot1 even in darkness, which could be responsible for the aphotrotropic phenotype of plants without CK2 activity. This internalization is, however, independent of the presence of NPH3 and therefore independent of ubiquitination. Surprisingly, internalization of phot1 observed in light conditions is also independent of the presence of NPH3.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques de Barcelona (IIBB-CSIC) / El meduloblastoma es un tumor cerebral maligno localizado en la fosa posterior del cráneo, con una muy alta incidencia en niños. Hasta cuatro distintos subgrupos de meduloblastomas pueden ser definidos en base a su huella genética y sus características clínicas: Wnt, Shh, Grupo 3 y Grupo 4. El origen celular del meduloblastoma Wnt había sido cuestión de debate hasta recientemente, cuando estudios con modelos animales linaje específicos demostraron que los meduloblastomas del subtipo Wnt, a diferencia de los otros subtipos, surgen de los progenitores del romboencéfalo. En meduloblastomas Wnt, mutaciones en el dominio de fosforilación de GSK-3β de la secuencia de β-Catenina (residuos 33-37), generan formas meta-estables de β-Catenina (sβ-Catenina). La estructura de β-Catenina le confiere la capacidad de ejercer una doble función celular, transcripcional y estructural. Por un lado, β-Catenina regula la actividad de la ruta canónica de Wnt mediante la estimulación de la transcripción dependiente de Tcf (función transcripcional), y por otro lado, forma parte estructural de las uniones adherentes a través de su asociación a Cadherinas clásicas (función estructural). Sin embargo, no está definida la contribución de cada una de estas funciones de β-Catenina en el mecanismo oncogénico del meduloblastoma Wnt. En la presente tesis hemos desarrollado un modelo in vivo para estudiar los estadios iniciales de este tumor que consiste en la electroporación de una forma estable de β-Catenina (sβ-Catenina) en los progenitores del tubo neural de pollo. De esta forma conseguimos reproducir los crecimientos preneoplásicos observados en el modelo de ratón del meduloblastoma Wnt. Tomando ventaja de este modelo in vivo, observamos que en los crecimientos aberrantes inducidos por sβ-Catenina las células se mantienen como progenitores Sox2+ con un ratio de proliferación bajo, debido a una extensión de la fase M del ciclo celular. Estos crecimientos aberrantes comenzaban con una formación excesiva de complejo apical (AC) que causaba una alteración de la mitosis concomitante con el inicio de invaginaciones en la cara apical del neuroepitelio. Mediante diferentes experimentos que nos permitían diseccionar la función estructural y transcripcional de β-Catenina demostramos que mientras la actividad transcripcional de β-Catenina inducía la expresión de aPKC, un componente clave del complejo apical (AC), la interacción entre β-Catenina y N-Cadherina era requerida para conducir el transporte apical de los componentes del AC. Además demostramos que la pérdida del AC era requisito esencial para la diferenciación de los K274W neuroblastos y que la expresión de los mutantes, N-CadherinΔβCat o aPKCι , los cuales desestabilizan el AC, reducían significativamente la aparición de malformaciones inducidas por β-Catenina. Por lo tanto, concluimos que sβ-Catenina mantiene el estado progenitor de los neuroblastos mediante la formación excesiva de AC que conduce a malformaciones en el neuroepitelio que son el origen de las malformaciones preneoplásicas inducidas por β-Catenina durante el desarrollo del SNC. Estos datos ofrecen una novedosa visión de los mecanismos subyacentes a la generación de meduloblastomas. / Medulloblastoma is a highly malignant primary brain tumor located in the posterior fossa, representing the most common malignant brain tumor in childhood. Up to four distinct molecular subgroups of medulloblastomas can be defined by their specific mRNA expression signatures: the WNT, SHH, Group 3 and Group 4. The cellular origin of Wnt-subtype medulloblastoma had remained unclear until recently, when data from lineage-restricted mouse models indicated that WNT-subtype arises from hindbrain progenitors. In Wnt-subtype medulloblastoma, the majority of mutations that activate the Wnt pathway target residues 33-37 of β-Catenin, the GSK-3β phosphorylation domain, rendering meta-stable forms of β-Catenin (sβ-Catenin). β- Catenin mediates canonical Wnt pathway stimulating Tcf dependent transcription (transcriptional function), and also plays structural role in adherens junctions by associating with classic cadherins via its armadillo domains. Accordingly, it remains unclear whether the oncogenic role of β-Catenin in Wnt-type medulloblastomas is due to its transcriptional activity, its structural role, or both. Here we have developed an in vivo model to study the initiation of the Wnt- subtype of medulloblastoma that involves the electroporation of a stable form of β- Catenin (sβ-Catenin) into the chick neural tube. This genetic manipulation largely reproduced the aberrant cell collections previously observed in a mouse model of Wnt-subtype medulloblastoma. Taking advantage of this in vivo model, we observed that cells in the aberrant growths induced by sβ-Catenin maintained the stemness of neuroblasts and showed a low proliferation rate due to an extension in the M phase of cell cycle. These aberrant growths initiated with an excessive formation of apical complex (AC) causing an alteration during mitosis concomitant with the beginning of invaginations in the apical side of the neuroepithelium. Distinct experiments allowed us to dissect the structural and transcriptional function of β-Catenin, and showed that while the transcriptional function of β-Catenin induced expression of aPKC, a key component apical complex (AC), the interaction between β-Catenin and N-Cadherin was required to drive the apical transport of AC components. We also demonstrated that loss of apical complex was essential for neuroblast differentiation and that K274W expression of the mutants, N-CadherinΔβCat or aPKCι , which destabilize the AC, significantly reduced the appearance of malformations induced by sβ-Catenin. Therefore, we conclude that sβ-Catenin maintains the progenitor state of neuroblasts by an excessive formation of AC, which leads to malformations in the neuroepithelium that are the origin of preneoplastic malformations induced by β-Catenin during CNS development. These data offer a novel insight into the mechanisms underlying the generation of medulloblastoma.

Los pequeños ARNs son ARNs cortos no codificantes que regulan la expresión génica en la mayoría de eucariotas. Las plantas tienen dos clases de pequeños ARNs, los microARNs (miRNAs) y los pequeños ARNs de interferencia (siRNAs), que se diferencian por su biogénesis y su modo de acción. Actualmente se estima que las pérdidas debidas a patógenos y plagas alcanzan el 50-80%, siendo uno de los factores limitantes de la producción y causando graves pérdidas económicas. Tenemos pues la necesidad de mejorar el conocimiento de los mecanismos de defensa y desarrollar nuevas estrategias para la protección de los cultivos. Con el fin de ampliar los conocimiento en este sector, se han llevado a cabo estudios con Arabidopsis y arroz, los dos sistemas modelo usados en genómica funcional en plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas. En el primer capítulo, se analizaron las alteraciones en la acumulación de pequeños ARNs, incluyendo miRNAs, en respuesta al tratamiento con elicitores en plantas de Arabidopsis. Entre los miRNAs regulados por elicitores se encuentra miR168, que regula ARGONAUTE1, el componente principal del complejo RISC (RNA-induced silencing complex) de la maquinaria de funcionamiento de miRNAs. Los microarrays permitieron, además de analizar miRNAs conocidos, la identificación de un pequeño ARN incorrectamente anotado como miRNA en el registro miRBase. Se demostró que este pequeño ARN es un pequeño ARN heterocromático (hc-siRNA) denominado siRNA415. En el segundo capítulo, se usaron librerías de secuenciación masiva de pequeños ARNs para la identificación global de miRNAs de arroz regulados por elicitores fúngicos. Esto permitió también describir 9 miRNAs no caracterizados previamente. Combinando dichas librerías con el análisis de nuestros degradomas, se identificaron sus respectivos targets y se observó la existencia de redes reguladoras enriquecidas en miRNAs regulados por elicitores. Específicamente, se identificó un número importante de miRNAs y sus genes diana, implicados en las rutas de biosíntesis de pequeños ARNs, incluyendo miRNAs, hc-siRNAs y “trans-acting siRNAs” (ta-siRNAs). Así mismo se presentan evidencias de miRNAs y sus genes diana implicados en la señalización mediada por hormonas así como en la interacción entre rutas hormonales, demostrando así un gran potencial en la regulación de la inmunidad del arroz. Asimismo se describe la regulación de genes de arroz que contienen “Conserved-Peptide upstream Open Reading Frame” (CPuORF) mediada por miRNAs. Esto sugiere la existencia de una red reguladora nueva que integra la función de miRNAs y CPuORF en plantas. El conocimiento adquirido en este estudio ayudará al la comprensión de los mecanismos de defensa mediados por miRNAs, así como a desarrollar estrategias apropiadas a la protección del arroz. En el tercer capítulo, se uso la combinación de herramientas bioinformáticas y experimentales para el análisis de miRNAs policistrónicos en arroz, observando la existencia de 23 loci con la habilidad de formar la típica estructura de horquilla de los precursores de miRNAs. Se presentan evidencias experimentales de 7 miRNAs policistrónicos que contienen tanto miRNAs homólogos como miRNAs no homólogos. Se demostró también un patrón de conservación en diferentes especies de arroz (Oryza sativa) cuyo genoma es AA, no presente en especies primitivas de arroz. Conjuntamente, los resultados obtenidos en este trabajo apoyan la idea que los miRNAs pueden ser considerados como componentes de la respuesta de las plantas a la infección por patógenos, posiblemente actuando como nodos de regulación de diferentes procesos fisiológicos durante la adaptación de las plantas a la infección. / Small RNAs (sRNAs) are short non-coding RNAs that guide gene silencing in most eukaryotes. Plants have two main classes of sRNAs, microRNAs (miRNAs) and small interfering RNAs (siRNAs), which are distinguished by their mode of biogenesis and mechanisms of action. In this day and age, crop losses due to pathogens and pests are estimated from 50% to 80%, factors limiting crop production and causing important economical losses. There is then an imperative need to improve our knowledge in defense mechanisms and to develop novel strategies for crop protection. To improve the understanding in this field, we carried out studies in Arabidopsis and rice plants, the two model systems used for functional genomic studies in dicot and monocot plant species. In the first chapter, we analyzed alterations on the accumulation of smRNAs in response to elicitor treatment, including miRNAs, in Arabidopsis plants. Among the elicitor-regulated miRNAs was miR168 which regulates ARGONAUTE1, the core component of the RNA-induced silencing complex involved in miRNA functioning. In addition to known miRNAs, microarray analysis allowed the identification of an elicitor-inducible small RNA that was incorrectly annotated as a miRNA in the miRBase registry. We demonstrated that this smRNA, is a heterochromatic-siRNA (hc-siRNA) named as siRNA415. In the second chapter, we used deep sequencing of small RNA libraries for global identification of rice miRNAs that are regulated by fungal elicitors. We also describe 9 previously uncharacterized miRNAs. Combined small RNA and degradome analyses revealed regulatory networks enriched in elicitor-regulated miRNAs supported by the identification of their corresponding target genes. Specifically, we identified an important number of miRNA/target gene pairs involved in small RNA pathways, including miRNA, heterochromatic and trans-acting siRNA pathways. We present evidence for miRNA/target gene pairs implicated in hormone signaling and cross-talk among hormone pathways having great potential in regulating rice immunity. Furthermore, we describe miRNA-mediated regulation of Conserved-Peptide upstream Open Reading Frame (CPuORF)-containing genes in rice, which suggests the existence of a novel regulatory network that integrates miRNA and CPuORF functions in plants. The knowledge gained in this study will help in understanding the underlying regulatory mechanisms of miRNAs in rice immunity and develop appropriate strategies for rice protection. In the third chapter, we used a combination of bioinformatic tools and experimental analyses for the discovery of new polycistronic miRNAs in rice, revealing 23 loci with the ability to form the typical hairpin structure of miRNA precursors in which two or more mature miRNAs mapped along the same structure. Evidence is presented on the polycistronic nature of 7 miRNA precursors containing homologous or non-homologous miRNA species. We also demonstrated a pattern of conservation in the genome of rice (Oryza sativa) species that have an AA genome, but not in primitive rice species. Collectivelly, results obtained in this work support the notion that miRNAs might be considered as components of the plant response to pathogen infection, possible acting as regulatory nodes of different physiological processes during plant adaptation to infection conditions.

A les cèl·lules eucariotes el checkpoint de la fase S, un dels mecanisme de vigilància de la cèl·lula, respon a agressions genotòxiques per protegir la integritat genòmica. Com a part de la resposta a estrès replicatiu i dany al DNA, aquest checkpoint impedeix el pas a mitosi fins que l’agressió hagi estat superada, evitant així la inestabilitat genòmica conseqüència de la segregació de cromosomes danys o que no han acabat de ser replicats. El cicle cel·lular i els seus mecanisme de control, com el checkpoint de la fase S, han estat identificats i estudiats inicialment en organisme model com Schizosaccharomyces pombe (llevat de fissió) i Saccharomyces cerevisiae (llevat de gemmació). Cal tenir present que els mecanismes identificats i els factors implicats en els organisme model són conservats en humans. En el llevat de fissió, l’entrada a mitosi en presència d’estrès genotòxic és impedida per la fosforilació inhibitòria de la tirosina 15 de Cdk1 per Wee1. Cdk1 és la única quinasa encarregada de dirigir la cèl·lula a través del cicle cel·lular en llevat de fissió i gemmació. En canvi, en llevat de gemmació, Swe1, l’ortòleg de Wee1, i la fosforilació de la tirosina 19 de Cdk1 semblen ser totalment prescindibles en el control de l’entrada a mitosi en presència d’estrès genotòxic. El model actual en llevat de gemmació pel control de la mitosi en presència d’estrès genotòxic contempla com a únic punt de control l’estabilització de Pds1/Securina, evitant així l’activació de Esp1/Separasa que promou el tall de la cohesina que manté unides les cromàtides germanes. En humans, malgrat Wee1 i la seva fosforilació inhibitòria sobre Cdk1 es conserven, no són suficients per impedir totalment l’entrada a mitosis en una fase S compromesa per estrès genotòxic. Els nostres resultats mostren que en Saccharomyces cerevisiae, l’activitat Cdk1 que dirigeix la mitosi està inhibida en presència d’estrès genotòxic. La dispensabilitat de Swe1 i de la fosforilació de la tirosina 19 de Cdk1 s’explica per que l’activitat Cdk1 mitòtica és inhibida, en aquestes condicions, de forma redundant per Swe1 i Rad53, la quinasa efectora del checkpoint de fase S. A més, hem observat que Swe1 està controlada pel checkpoint de la fase S en aquestes condicions. Tanmateix, en presència d’estrès genotòxic, les cèl·lules amb l’activitat Cdk1 mitòtica desregulada o nul·les per Pds1/Securina, segueixen essent competents per impedir la mitosi. Ara bé, quan el control redundant de l’activitat Cdk1 de fase M (necessària per l’elongació del fus mitòtic) és combinant amb la deleció de Pds1/Securina, les cèl·lules són incapaces d’evitar la segregació dels cromosomes no acabats de replicar o danyats. / The S phase checkpoint is a surveillance mechanism in eukaryotic cells that preserve genomic integrity in response to genotoxic insults. This checkpoint inhibits mitosis onset till the stress has been solved, avoiding genomic instability that results from the segregation of damaged or not fully replicated chromosomes. Eukaryotic cell cycle and its regulation mechanisms, like the S phase checkpoint, have been initially identified and studied in model organisms like Schizosaccharomyces pombe (fission yeast) and Saccharomyces cerevisiae (budding yeast) and these mechanisms and factors are conserved in humans. Mitosis control in fission yeast in the presence of replication stress relies on the inhibition of mitotic Cdk1 through tyrosine 15 Wee1 mediated phosphorylation. However, in budding yeast, Wee1 ortholog Swe1 and its phosphorylation over Cdk1, seems unnecessary in this control. The present model for budding yeast control of mitosis in the presence of DNA damage relies on the stabilization of Pds1/securin. This chaperone inhibits Esp1/separase which cleaves cohesin, the protein that keeps sister chromatids together. In humans, Wee1 and its phosphorylation over Cdk1 are conserved but they are not enough to inhibit mitotic Cdk1 activity and completely avoid mitosis onset in the presence of genotoxic stress. Our results show that in budding yeast, mitotic Cdk1 is inhibited in the presence of genotòxic stress. Swe1 dispensability is explained by a redundant mechanism regulating mitotic Cdk1 mediated by Swe1 and Rad53, the effector kinase of the S phase checkpoint. Moreover, Swe1 levels stabilization in the presence of genotoxic stress is mediated by the S phase checkpoint. Mitotic Cdk1 deregulation or pds1Δ is not enough to observe DNA segregation in the presence of genotoxic stress. Only cells that cannot regulate mitotic Cdk1 activity together with pds1Δ are able to segregate not fully replicated or damaged chromosomes.

El neuroblastoma (NB) es un cáncer pediátrico que representa ~15% de muertes en cánceres infantiles. Los NBs de alto riesgo se caracterizan por una gran heterogeneidad e agresividad, que conlleva un mal pronóstico para el paciente. A pesar de las mejoras alcanzadas con las estrategias estándar en los últimos 20 años, la prevalencia de supervivencia después de cinco años continua por debajo del 50%. Esta situación pone de manifiesto la necesidad del desarrollo de nuevas estrategias para afrontar este problema. La activación de los receptores de muerte (DR) se ha propuesto como una alternativa a los tratamientos clásicos de quimio- y radio-terapia en distintos tipos de cáncer. En el caso de los NBs, esta aproximación fue descartada por el hecho de que entre un 50 y 70% de ellos no presentan expresión de caspasa-8. A pesar de ello, un grupo significativo de pacientes de NB se podrían beneficiar de un tratamiento que promoviera la muerte a través de la activación de los DR. Se conoce poco de la vía de señalización activada por los DR (especialmente Fas y TNFR1) y de su regulación en NBs, por ello consideramos básico su estudio antes de testar su posible relevancia terapéutica. Dado a que se ha descrito que la citoquina TNFα induce la expresión de Fas en diferentes tipos de cáncer, nosotros decidimos abordar el co-tratamiento de TNFα con FasL como estrategia terapéutica para el tratamiento de NB. Para llevar a cabo nuestro estudio, caracterizamos la señalización intracelular y la inducción de muerte a través de TNFR1 y Fas en ocho líneas celulares clínicamente representativas de NB. Observamos que el tratamiento con TNFα induce la expresión de Fas a través de la activación de la vía NF- κB e sensibiliza a la muerte inducida por FasL. A demás, el tratamiento con TNFα promueve la citotoxicidad de agentes genotóxicos, como cisplatino y etoposido, a través de la activación de la caspasa-8. La caracterización más en detalle que realizamos nos llevó a la conclusión que la heterogeneidad presente en neuroblastomas también se hace patente en los niveles de expresión de Fas y en su modulación por TNFα. La sensibilización a la muerte inducida por FasL, cisplatino o etoposido mediada por TNFα solo se podía observar en aquellos NBs donde TNFα era capaz de inducir la expresión de Fas. En conclusión, nuestros resultados evidencian que TNFα sensibiliza NBs a la muerte inducida por FasL a través de la inducción de la transcripción de FAS mediada por NF- κB. A demás, el pre-tratamiento con TNFα incrementa la muerte inducida por cisplatino y etoposido. Nuestros resultados revelan un nuevo mecanismo que pude mejorar los tratamientos que actualmente se utilizan para la erradicación de los NBs. / Neuroblastoma (NB) is a pediatric solid tumor that accounts for ~15% of all cancer-related deaths in infants. High-risk NBs are hallmarked by a high degree of heterogeneity and aggressiveness, which results in poor patient outcome. Despite the improvement of standard therapies in the last twenty years, five-year survival rates are still below 50%, which impels the development of new treatment strategies for this condition. Activation of death receptors (DRs) has been proposed as an alternative to standard chemo- and radio-therapies for various types of cancer. In NB, this approach has been largely disregarded, possibly due to the silencing of caspase-8 in 50-70% of the cases. Nevertheless, a significant group of NB patients could benefit from treatment that induces cell death through DR activation. Characterization of DR signaling (especially Fas and TNFR1) and their regulation in NB has been limitedly studied, but is a prerequisite for assessing their therapeutic relevance. Given that the cytokine TNFα has been described to induce Fas expression in various types of cancer, we addressed whether TNFα and FasL co-treatment could be a valid therapeutic strategy in NB. For the purpose of the study, TNFR1- and Fas-mediated signaling and cell death induction was characterized in a set of eight clinically representative NB cell lines. TNFα treatment was shown to induce Fas expression through NF-κB-mediated transcription of FAS and primed for FasL-induced cell death. Moreover, TNFα treatment enhanced the cytotoxic effects caused by DNA-damaging agents (i.e. cisplatin and etoposide) through caspase-8 activation. Further characterization revealed that the high degree of heterogeneity between NBs is also visible at the levels of Fas expression and modulation thereof by TNFα. TNFα-mediated priming for FasL-, cisplatin-, and etoposide-induced cell death was only observed for NBs that induced TNFα-mediated Fas expression. In conclusion, our findings reveal that TNFα primes NB for FasL-induced cell death through the NF-κB-mediated induction of Fas expression. Moreover, TNFα pre-treatment enhanced cisplatin- and etoposide-induced cell death. These findings unveil a novel mechanism that could improve the efficacy of treatment regimens currently used for the eradication of NB tumors.

Tesi realitzada a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / Changes in diet and life style caused an alarming increase in the incidence of obesity, which is considered a major risk factor for the onset of the metabolic syndrome. One of the initial events in obesity is adipocyte hypertrophy, a stressful condition that triggers cellular responses like inflammation that eventually lead to insulin resistance (IR) and hyperinsulinemia, which may be the link between obesity and other obesity-associated disorders such as T2D, cardiovascular diseases, atherosclerosis and cancer. The major goal of this thesis was to unravel novel molecular mechanisms underlying the development of obesity and the associated IR and hyperinsulinemia. We pursued this goal performing two different studies: 1. Analysis of the role of the p53/p21 tumour suppressor pathway in obesity. 2. Analysis of the effect of JNK activation in pancreatic beta-cells in obesity-associated systemic IR and hyperinsulinemia. p21 gene and protein expression was upregulated in the adipose tissue (AT) of different models for obesity: the leptin-deficient (ob/ob) and the diet-induced obese (DIO) mice, whereas p21-deficiency protected from the development of adiposity and IR induced by a high fat diet (HFD). Functional genomics analysis showed that p21 deficiency did not affect adipogenic genes but highlighted an inverse correlation between p21 and leptin receptor (LepR) expression in the AT of p21-knockout (KO) compared to wild type (WT) mice. Furthermore, mice KO for both p21 and leptin developed obesity to the same extent as the ob/ob mice. Overall, these results indicated that the mechanism by which p21-deficiency protects from obesity depends on a properly working leptin/LepR signalling. Furthermore, LepR protein levels were also increased in the AT of p53 KO mice. So, our hypothesis to explain at the molecular level the obesity-protective phenotype of the p53 and p21 KO mice on HFD conditions, was that these animals have an increased leptin sensitivity due to increased LepR levels in the AT, considering that the overexpression of LepR specifically in AT protects from diet-induced obesity. In vivo experiments to investigate leptin sensitivity in p21 KO animals showed a slightly greater percentage of weight decrease compared to WT, with no differences in food intake. In order to establish a mechanistic link between LepR expression and the p53/p21 pathway, we performed an in silico analysis to identify putative binding sites for the E2F transcription factor in the LepR gene. p21 can modulate gene transcription through the regulation of pRB, which in turn negatively regulates the activity of E2F. Supporting this idea, pRB deletion in AT also protects from DIO. Moreover, E2F has a role in metabolism independently of its function in cell cycle: E2F may regulate metabolic genes and we propose that the LepR gene would be one of them. Regarding our second study, JNK activation induces IR locally but no systemically in MKK7D mice on HFD. At the same time obesity and obesity-induced inflammation, generated at the AT, did not suffice to induce systemic IR. Preserving skeletal muscle sensitivity to insulin seemed to be sufficient to prevent systemic IR. In addition, our data in the MKK7D mice on HFD suggest that a chronic exposure to increased plasma insulin levels are required for the development of systemic IR. / Cambios en dieta y estilos de vida han causado un incremento en la incidencia de la obesidad, uno de los factores de riesgo para el síndrome metabólico. Uno evento inicial en la obesidad es la hipertrofia de los adipocitos, una condición de estrés que desencadena respuestas celulares como la inflamación que pueden conducir al desarrollo de resistencia a insulina (IR) e hiperinsulinemia, que constituyen la principal conexión de la obesidad a otras patologías asociadas a obesidad como la T2D, enfermedades cardiovasculares, aterosclerosis y cáncer. El principal objetivo de esta tesis fue desvelar nuevos mecanismos moleculares a la base del desarrollo de obesidad y de la IR e híperinsulinemia a esa asociadas. Perseguimos este objetivo a través del: 1. Análisis del papel de la ruta supresora tumoral p53/p21 en obesidad. 2. Análisis del efecto de la activación de JNK en células beta- pancreáticas en la IR sistémica e híperinsulinemia asociadas a obesidad. El déficit de expresión de p21 en ratones (sujetos a dieta grasa) genera resistencia al incremento de peso corporal y grasa, y a la alteración de la homeóstasis glucídica inducidos por obesidad. La dieta grasa desencadena un mecanismo de respuesta relacionado al déficit de p21, conectado a la señalización de leptina: la ausencia de p21 provoca un incremento significativo de los niveles del receptor de leptina. Además, la simple ausencia de p21 no es suficiente para el mejoramiento del fenotipo obeso y tiene que será acompañada por una funcional señalización de leptina. La activación de JNK induce IR a nivel local pero efectos contrarios en la sensibilidad sistémica a insulina. Al mismo tiempo la obesidad y la inflamación inducida por obesidad, generada a nivel periférico, no son suficientes para inducir IR sistémica. Preservar la sensibilidad a insulina en músculo esquelético es suficiente para prevenir la IR sistémica. Así que es posible que para la IR sistémica se requiera la exposición crónica a incrementados niveles de insulina plasmática.

Tesi realitzada al Centre Tecnològic LEITAT / Els avenços en la recerca oncològica han obert la possibilitat d’introduir noves estratègies terapèutiques basades en un major enteniment dels mecanismes i processos subjacents al desenvolupament tumoral. Aquestes noves aproximacions han desviat el focus d’atenció de la cèl·lula tumoral, per actuar sobre aquells components de l’estroma que, mitjançant, entre d’altres, una comunicació paracrina on intervenen multitud de factors, donen suport al creixement de la cèl·lula maligna. Entre aquests factors, ha cobrat protagonisme la família de proteïnes d’unió a calci S100, i, en concret, la proteïna S100A7. Està descrit que aquesta proteïna té funcions relacionades amb la mobilitat cel·lular, correlacionant la seva expressió amb un major creixement tumoral i una major capacitat metastàtica. A més, algunes dades clíniques han mostrat una relació directa entre la seva presència i un pitjor pronòstic per als pacients amb càncer de mama o amb càncer de cap i coll. Per últim, la S100A7 s’ha trobat en biofluids com la sang o l’orina de pacients amb càncer de pulmó, bufeta o melanoma, de manera que s’ha proposat com un possible biomarcador tumoral. Aquest treball fa front a la necessitat existent d’aprofundir en el mecanisme d’acció de la S100A7, per tenir una visió integradora de la seva funció en els diferents compartiments cel·lulars dins el tumor. A més, l’absència d’inhibidors específics contra la proteïna obre l’oportunitat de desenvolupar anticossos monoclonals dirigits a bloquejar la seva funció extracel·lular, com una nova estratègia terapèutica per al tractament del càncer. A nivell cel·lular, s’ha demostrat que la proteïna S100A7 indueix la migració de la cèl·lula endotelial, immune, fibroblàstica i tumoral, actua com a molècula d’adhesió i afavoreix la unió dels monòcits a l’endoteli, suportant el seu possible paper en el reclutament de les cèl·lules inflamatòries cap al tumor. A més, indueix la secreció de múltiples citoquines i factors de creixement que contribueixen, junt amb la pròpia S100A7, a la creació d’un microentorn proangiogènic i proinflamatori que afavoreix, en darrer terme, la progressió de la malaltia. Per últim, la proteïna participa en la formació del nínxol premetastàtic, augmentant la fibrosi del teixit. Els anticossos monoclonals obtinguts són eficaços bloquejant la interacció de la S100A7 amb el seu receptor RAGE. A més, en estudis in vitro, inhibeixen la funció extracel·lular de la proteïna a nivell de migració cel·lular i de secreció de metal·loproteïnases. Per últim, en estudis d’eficàcia utilitzant un model subcutani de creixement tumoral, el tractament amb els anticossos seleccionats redueix significativament el volum tumoral, així com la seva vasculatura, provocant un augment de la necrosi dins del teixit. Aquests resultats demostren, per primer cop, la prova de principi de la teràpia antitumoral basada en anticossos monoclonals contra la S100A7. D’altra banda, es va estudiar el valor diagnòstic de la proteïna, utilitzant mostres derivades de models animals, demostrant que pot ser considerada com un bon biomarcador sanguini de diagnòstic i de pronòstic. Els resultats d’aquest treball demostren que la proteïna S100A7 extracel·lular té una funció important en el desenvolupament tumoral, de manera que el seu bloqueig, mitjançant els anticossos monoclonals obtinguts, pot ser una bona estratègia terapèutica pel tractament del càncer. / The tumor microenvironment supports the malignant cells growth, secreting a wide variety of growth factors and cytokines. The identification and regulation of those key factors in this crosstalk has opened the opportunity to develop new therapeutic strategies that not only act on tumor cells, but also on the stroma. Among these factors, S100A7 protein has gained interest in the last years. It is described that this protein is related to cell mobility, correlating its expression with an increased tumor growth and metastatic potential. Furthermore, S100A7 is found in biofluids derived from some cancer patients, so that it has been proposed as a possible tumor biomarker. In this study we have deepened the mechanism of action of S100A7 protein on different cell lines, representative of each of the compartments within the tumor (endothelial, immune, fibroblast and tumor), demonstrating its role in cell migration and adhesion, as well as in creating a proangioganic and proinflammatory environment, that favors the disease progression. Also, due to the absence of protein inhibitors, we have obtained specific monoclonal antibodies, that have shown to be effective in blocking its extracellular function in several in vitro models. Furthermore, in an in vivo tumor growth model, the treatment with the selected monoclonal antibodies induced a decrease in disease progression, as well as a decrease in tumor vasculature and an increase in tumor necrosis. Finally, additional data were obtained on its role as a blood biomarker, using samples derived from animal models. The results of this study evidence that extracellular S100A7 protein has an important role in tumor development, so that blocking, by using specific monoclonal antibodies, could be a good therapeutic strategy for cancer treatment.

L'objectiu dels dos primers capítols va ser l'aplicació de la tècnica "Bimolecular fluorescent protein complementation" (BIFC) per a detectar interaccions intracel·lulars proteiques de caràcter dèbil in vivo. Durant l'estudi s'ha demostrat que es pot acoblar a la citometria de flux creant una eina d'anàlisi proteòmica. D'altra banda, també es demostra que l'emissió de fluorescència depèn de la força de la interacció. A més a més, el mètode BIFC pot ser aplicat per a obtenir informació sobre la superfície d'interacció. D'altra banda, es descriu l'ús de BIFC com a mètode per a detectar compostos que bloquegen la interacció de proteïnes diana in vivo. Es demostra que la inhibició de una interacció va unida a una disminució en la fluorescència detectada. En el tercer capítol, s'ha investigat el grau de co-agregació in vivo entre dues proteïnes amb tendència a agregar (el pèptid amiloide Aβ42 i la proteïna VP1 que constitueix la càpside viral) co-expressades en E.coli. D'altra banda, l'estructura dels agregats intracel·lulars ha estat investigada per desxifrar si les fibres amiloides i els cossos d'inclusió comparteixen característiques estructurals. Les dades obtingudes indiquen que l'agregació proteica in vivo presenta una remarcable especificitat que depèn de l'establiment d'interaccions selectives i resulta en la formació d'estructures oligomèriques i fibrilars que presenten propietats amiloides En el quart capítol, es descriu un nou mètode per a estudiar l'agregació proteica en llevat. Es basa en la fusió de la proteïna d'interès a un enzim, concretament la di-hidrofolat reductasa (DHFR). L'activitat d'aquest enzim és essencial per al llevat. D'aquesta manera, sota la presència d'un inhibidor d'aquest enzim (anomenat metotrexat), la tendència a agregar de la proteïna diana queda directament lligada a la supervivència i creixement del llevat. En altres paraules, si la proteïna agrega, la DHFR no serà funcional i el llevat serà susceptible a la presència del metotrexat en el medi. Al contrari, si la proteïna no agrega, la DHFR es trobarà soluble en el medi intracel·lular conferint resistència al llevat. Degut al fet que l'agregació està relacionada al creixement, no es necessita cap assaig funcional per a detectar-la. A més a més, l'ús d'un derivat fluorescent del metotrexat permet confirmar l'estat d'agregació o solubilitat de la proteïna diana. D'altra banda, les propietats anti-agregacionals de diferents compostos químics que s'uneixen al pèptid Aβ42 també varen ser avaluades emprant el mètode juntament amb l'efecte de la deleció o la sobre expressió de xaperones en l'agregació de Aβ42. / The aim of the two first chapters was to test the ability of Bimolecular Fluorescence complementation (BIFC) to detect in vivo weak intracellular protein interactions. In this technique, the binding partners are fused to two fragments of a fluorescent protein, which recovers its function upon binding of the interacting proteins. In addition, the application of BIFC was able to map the regions involved in a given interaction without need of previous structural knowledge of the binding mechanism. It was also proven that the fluorescence was dependent on the strength of the interaction, in such a way that it could be used, at least qualitatively, to screen for best binding candidates. This problem was solved with the coupling of BIFC to flow cytometry (FC) providing a highly sensitive method to validate weak protein interactions and to screen and identify optimal ligands in libraries. On the other hand, we studied the application of BIFC to the detection of antagonists of protein interactions in vivo turning the strength of the inhibition being linked to the fluorescence signal. In the third chapter, we investigated the degree of in vivo co-aggregation between two self-aggregating proteins co-expressed in E.coli: Aβ42 amyloid peptide and foot-and-mouth disease virus VP1 capsid protein fused to fluorescent proteins. Our data demonstrated that, in vivo, different classes of proteins, which became associated in aggregates, exhibited distinct molecular interactions and did not necessarily co-aggregate. Also, the presence of abundant fibrillar structures with amyloid properties connecting apparently amorphous regions was observed Overall, this study suggested the existence of evolutionary conserved adaptations in living systems towards restricting non-specific aggregation of misfolded proteins. In the fourth chapter, a general method to assess the intracellular solubility of proteins in eukaryotic background (particularly in yeast) was developed. It consisted in the application of an "aggregation reporter", in which the test protein was expressed as N-terminal fusion with the enzyme dihydrofolate reductase (DHFR). Due to the fact that the aggregation state of the fused protein was linked directly to yeast cells survival in the presence of methotrexate, protein solubility was monitored in vivo without the requirement of a functional assay for the target protein. In addition, the intracellular anti-aggregational properties of two chemical compounds that bind Aβ peptide were also evaluated together with the effect of a series of knockouts of yeast chaperones as well as the impact of the over expression of their genes.