Los modelos de cáncer colorrectal (CCR) generados mediante inyección ortotópica de líneas celulares de CCR humano, cultivadas extensamente in vitro, tienen escasa eficiencia metastásica. Únicamente un porcentaje bajo de las líneas inyectadas generan metástasis, mientras que aquellas que generan metástasis, reproduciendo el patrón de diseminación linfática, hematológica y transcelómica observado en clínica, las generan de un tamaño microscópico, de modo que, a diferencia de lo que ocurre en pacientes, los animales mueren por crecimiento del tumor primario, y no por la diseminación metastásica. En esta tesis, nos propusimos el desarrollo y la evaluación de dos nuevas estrategias para aumentar la eficiencia metastásica en los modelos de CCR. El primer abordaje consistió en la movilización de células madre de la médula ósea, para promover la formación del nicho premetastásico, previamente a la inyección ortotópica de la línea de CCR HCT116, y aumentar la capacidad de diseminación. No obstante, esta aproximación obtuvo un efecto contrario al esperado. Observamos una disminución del volumen tumoral, así como de la diseminación metastásica linfática y hematógena. La segunda estrategia que utilizamos fue la implantación subcutánea de líneas celulares de CCR, previa inyección ortotópica, en base al aumento de la diseminación tumoral mediante pases sucesivos in vivo, descrita previamente por otros autores y confirmada en nuestro laboratorio. Para desarrollar este objetivo, utilizamos la línea celular de CCR HCT116, de la que conocemos su capacidad metastásica. Esta línea genera un número significativo de micrometástasis a nivel linfático, hepático y pulmonar, y únicamente un pequeño número de macrometástasis circunscritas a ganglios linfáticos mesentéricos y a la cavidad peritoneal. El condicionamiento subcutáneo previo a la inyección ortotópica (SC+ORT) supuso una mejora en la eficiencia metastásica, respecto a la microinyección ortotópica directa (ORT), aumentando tanto el número de animales afectados por metástasis como el número y tamaño de los focos metastásicos en ganglios linfáticos, hígado y pulmón. Y, especialmente, un desarrollo de metástasis hepáticas visibles en el grupo SC+ORT que invadían el 90-95% del parénquima hepático mejorando considerablemente los modelos de metástasis actuales ya que son las metástasis hepáticas las que comprometen la vida de los pacientes. La mejora de la eficiencia metastásica en el grupo SC+ORT se asocia, a nivel molecular, con un aumento de VEGF-A, activación de AKT e infrarregulación de la integrina beta-1. Una vez validado el modelo, se estudió el papel de las mutaciones del oncogen K-RAS más frecuentes en cáncer, en metastagénesis, utilizando la línea celular de CCR SW48 que expresaba el mutante de K-RAS Valina 12 (K12V) o el mutante con aspártico 13 (K13D). Esta estrategia se basó en resultados previos de nuestro grupo que demostró distinta capacidad tumorigénica de los diferentes mutantes del oncogén K-ras, asociada a una activación diferencial de vías distales a K-RAS en sarcomas. La expresión de los oncogenes K12V o K13D aumentó el tamaño de los tumores generados y disminuyó la supervivencia de los animales respecto al grupo control (SW48 parental, K-ras WT). En los tres grupos comparados, se aplicó el condicionamiento subcutáneo previo a la microinyección ortotópica para aumentar la escasa tasa de metastásis por inyección ortotópica directa de la línea SW48. Únicamente, K12V aumentó significativamente la tasa de injerto tumoral respecto al grupo WT, pero ambos oncogenes aumentaron la tasa de metástasis. Como se esperaba, cada oncogén se asoció con efectos distintos sobre las metástasis. K12V generó metástasis linfáticas en un número mayor de animales, generando, a su vez, metástasis microscópicas y visibles de mayor tamaño que K13D. En cambio, la expresión de K13D generó micrometástasis pulmonares de mayor tamaño que K12. La diferente eficiencia metastásica de los mutantes del oncogén K12V y K13D en los distintos órganos, se asoció con un patrón de expresión molecular distinto. Mientras K12V presenta mayor activación de la vía de AKT y mayor expresión de integrina beta-5 y VEGF-A, K13D mostró mayor expresión de integrina beta-1 y angiopoyetina-2. El condicionamiento subcutáneo previo de líneas celulares de CCR humano permitirá aumentar la eficacia metastásica de los modelos actuales, facilitando el estudio de los mecanismos implicados en metastagénesis. Por otra parte, el conocimiento de las alteraciones moleculares asociadas con la distinta capacidad metastásica y agresividad de los distintos oncogenes K-RAS facilitará el estudio de los mecanismos asociados con la agresividad de los tumores portadores de mutaciones específicas en este oncogén y posteriores estudios dirigidos a determinar su capacidad pronóstica en CCR humano. / Colorectal cancer (CRC) models generated by orthotopic injection of human CRC lines, which have grown extensively in vitro, display a low metastatic efficiency. Thus, most cell lines do not metastasize; and, those that generate metastatic foci achieve only a microscopic size, despite of reproducing the pattern of lymphatic, hematological and transcoelomic spread observed in patients. Consequently, unlike what happens in patients, animals die because of primary tumor growth rather than metastatic growth. In this dissertation, we proposed the development and evaluation of two new strategies to increase the metastatic efficiency of CRC models. The first approach involved the mobilization of stem cells from bone marrow in an attempt to promote the premetastasic niche formation, prior to the HTC116 CRC cell line orthotopic microinjection, in an attempt to enhance metastasis formation. However, this approach achieved the opposite effect to the expected one. As a second strategy, we used the subcutaneous implantation of the HCT116 cell line prior to their orthotopic microinjection, on the basis of previous reports, which we have confirmed in our laboratory, of an increase in tumor dissemination through successive in vivo passages. The subcutaneous passage prior to its orthotopic injection (SC+ORT) significantly enhanced the metastatic efficiency, as compared to its direct orthotopic microinjection (ORT). This procedure increased the number of affected animals as well as the number and size of metastatic foci in lymph nodes, liver and lung, and was associated with the activation of the VEGFA and AKT pathways, and the downregulation of integrin β1. This approach especially improved hepatic dissemination, since tumor foci in the liver grew to achieve a visible metastasis size that invaded 90-95% of the hepatic parenchyma leading to animal death. This is a significant improvement of current metastatic models, since it reproduces not only the dissemination from the primary tumor to the liver, but also the compromise of the patient's life by the growth of the hepatic metastases. Once we validated, we applied this procedure to study the role of different point mutants of the K-ras oncogene in metastagenesis, using the SW48 CRC cell line which was engineered to express the K-rasG12V (K12V) or K-rasG13D (K13D) oncogenes. The subcutaneous passage prior to the orthotopic microinjection of SW48 recombinants enhanced metastatic efficiency of current models, therefore, facilitating the study of the mechanisms associated with metastatic dissemination by oncogene expression. In particular, the enhanced metastatic capacity of the K12V oncogene, as compared to K13D, is associated with the activation of the integrin β5, serpine-1, VEGFA, CXCR4 in tumour emboli and AKT pathway. Consequently, knowledge on the molecular alterations associated with the different metastatic ability of the CRC tumors, expressing different K-ras oncogenes, will facilitate the study of the mechanisms underlying their aggressiveness and will also facilitate a more accurate assessment of their prognostic capacity in human CRC.

La calcificació vascular és una complicació de la malaltia renal crònica i una de les principals causes de l’augment de morbiditat i mortalitat en els pacients. Aquests pacients presenten una disminució en els nivells de vitamina D (1,25(OH)2D3) i desenvolupen hiperparatiroïdisme secundari. Per aquest motiu, pacients amb MRC són tractats amb calcitriol o altres anàlegs. La 25-hidroxivitaminaD també s'utilitza, però sense cap coneixement de la seva eficàcia i toxicitat. Les recomanacions actuals indiquen que s’ha de suplementar amb 25D per assolir un llindar determinat que pugui afectar les accions clàssiques i no clàssiques de la vitamina D en l'organisme. No obstant això, l’ incidència directa en l'homeòstasi del calci (sense convertir-lo en calcitriol) no s’entèn. En el present treball, s’ha determinat l'efecte de la urèmia en la regulació de gens del metabolisme de la vitamina D i el paper de la síntesi local de calcitriol en la urèmia sobre la calcificació vascular utilitzant els ratolins KO per la 1αhidroxilasa. També, hem estudiat l'eficàcia i la seguretat del tractament amb 25D en el metabolisme mineral en un model de reducció del 75% de la massa renal en ratolins que no tenen la 1αhidroxilasa i el seu possible efecte toxic en ratolins wild-type. Resultats inicials en rates mostren que la urèmia desregula l’expressió de proteïnes implicades en el metabolisme de la vitamina D en cèl•lules de múscul llis vascular (VSMC), augmentant l'expressió de la 1αhidroxilasa. Aquesta regulació és específica de teixit i és diferent en el ronyó. Ratolins wild-type amb un model de MRC tractats amb altes dosis diàries de calcitriol (400ng/Kg) durant dues setmanes mostren una pèrdua de pes significativa, mentre que els 1αKO no perden pes. Nivells sèrics de calci, fòsfor, BUN i 1,25D augmenten i són similar en els dos grups tractats. D'altra banda, els nivells de PTH disminueixen en ambdòs grups per sota dels valors normals. La calcificació vascular augmenta de forma significativa en els ratolins WT en comparació amb ratolins 1αKO. Resultats similars s'observen amb tinció de vermell d’alizarina i l’immunohistoquímica de Runx2, que augmenta només en ratolins WT. In vitro, les CMLV WT tractades amb sèrum urèmic també mostren un augment significatiu de la calcificació i del runx2, que no s'observa en les cèl·lules 1αKO. Quan les CMLV de rata s’obrexpressen la 1αhidroxialsa també calcifiquen més en comparació amb les cèl•lules control. Aquests resultats indiquen que la 1αhidroxilasa actuaria com a mediador de la calcificació vascular en la urèmia incrementant la síntesis local de 1,25(OH)2D3. Fet que és d’especial interès en els pacients amb malaltia renal que són tractats amb 25OHD3. Per a estudiar l'efecte de la 25D, es va realitzar un estudi dosi-respostaen ratolins 1αKO nefrectomitzats amb 25, 50 i 100 ng/g de 25(OH)D3 per comparar-ho amb una dosi única de 1,25(OH)2D3 (50pg/g). L’administració de 25(OH)D3 pot normalitzar el Ca, P i PTH en sèrum amb una potència semblant a la de la 1,25D en un model de ratolí 1αKO amb MRC, un ratolí incapaç d’activar la 25D a 1,25D. Confirmant una unió directa i activació del VDR per la 25D. La 25D també pot activar el VDR per imitar la 1,25D en la up-regulació de gens i proteïnes que medien el transport transcellular de calci en el ronyó (TRPV5, Calbindin-D28k, PMCA1b) i en el duodè (TRPV6, Calbindin D9k i PMCA1b) en els 1αKO nefrectomitzats. Les dosis de 25D necessàries per imitar la 1,25D en la correcció de les anomalies en el transport de calci transcel·lular a nivell renal i duodenal causen un augment en els nivells de 25D en sèrum per sobre dels nivells recomanats en pacients amb MRC. La calcificació vascular que s'observa en ratolins WT mostra un efecte tòxic del tractament. També, hem observat que la 25D és capaç d'activar la 24hidroxilasa i el VDR en CMLV, mostrant la capacitat de la 25D d’activar directament el VDR a l'artèria. En conclusió, tots aquests resultats suggereixen que la producció local de calcitriol per la 1αhidroxilasa en l'artèria mediaria la calcificació vascular observada en la urèmia. Resultats que indiquen que els tractaments amb 25D en pacients amb MRC han de fer-se de forma controlada tant pel seu efecte directe activant el VDR com a causa de l’increment de la 1αhidroxilasa en la urèmia la qual afavoriria la seva transformació a 1,25(OH)2D3 produint toxicitat. / La calcificación vascular es una complicación de la enfermedad renal crónica y una de las principales causas del aumento en la morbilidad y mortalidad en los pacientes. Estos pacientes presentan una disminución en los niveles de vitamina D (1,25(OH)2D3) y desarrollan hiperparatiroidismo secundario. Por esta razón, los pacientes con ERC son tratados con calcitriol u otros análogos. También se utiliza la 25-hidroxivitamina D, pero sin ningún conocimiento de su eficacia y toxicidad. Las recomendaciones actuales sugieren que se complemente con 25D para alcanzar un cierto umbral que pueda afectar las acciones clásicas y no clásicas de la vitamina D. Sin embargo, el impacto directo en la homeostasis del calcio (sin convertirlo en calcitriol) no se conoce. En el presente estudio, se determinó el efecto de la uremia en la regulación de genes del metabolismo de la vitamina D y el papel de la síntesis local del calcitriol en la uremia y su efecto sobre la calcificación vascular utilizando ratones KO para la 1αhidroxilasa. También, se estudió la eficacia y la seguridad del tratamiento con 25D en el metabolismo mineral en ratones que carecen de la 1αhidroxilasa con una reducción del 75% de la masa renal y el efecto en ratones WT de la dosis efectiva para reducir los niveles de PTH en ratones KO. Los primeros resultados en ratas demuestran que en la uremia se desregula la expresión de las proteínas implicadas en el metabolismo de la vitamina D en las células musculares lisas vasculares (CMLV), aumentando la expresión de la 1αhidroxilasa. Esta regulación es específica del tejido y es diferente de la del riñón. Los ratones wild type con un modelo de ERC tratados con dosis elevadas de calcitriol (400ng/Kg) muestran una pérdida significativa de peso, mientras que los 1αKO no pierden peso. Los niveles séricos de calcio, fósforo, BUN y 1,25D suben y son similares en los dos grupos. Por otro lado, los niveles de PTH caen por debajo de los valores normales en ambos grupos. La calcificación vascular aumenta significativamente en los ratones WT en comparación con los 1αKO. Resultados similares fueron observados con la tinción rojo de alizarina y la immunohistoquímica de Runx2, aumentando sólo en los ratones WT. In vitro, las CMLV WT tratadas con suero urémico también muestran un aumento significativo de la calcificación y de la expresión de runx2, que no se observa en las células 1αKO. Cuando las CMLV de rata sobrexpresan la 1αhidroxilasa calcifican más en comparación con las células control. Estos resultados indican que la 1αhidroxilasa actuaria como mediador de la calcificación vascular en la uremia incrementando la síntesis local de la 1,25(OH)2D3. Hecho que es de especial interés en los pacientes con enfermedad renal tratados con 25OHD3. Para estudiar el efecto de la 25D, se realizó un estudio de dosis-respuesta con ratones 1αKO nefrectomizados y tratados con 25, 50 y 100 ng/g de 25(OH)D3 y se compararon con una sola dosis de 1,25(OH)2D3 (50pg/g). La administración de 25(OH)D3 puede normalizar el Ca, P y PTH en suero con una potencia similar a la del 1,25D en un modelo de ratón 1αKO con ERC. Confirmando un efecto directo y activador de la 25D sobre el VDR. La 25D también puede activar el VDR para imitar la 1,25D en la regulación de genes y proteínas que median el transporte transcelular de calcio en el riñón (Calbindin-D28k, TRPV5, PMCA1b) y en el duodeno (Calbindin D9k y TRPV6, PMCA1b) en ratones 1αKO nefrectomizados. Las dosis de 25D necesarias para imitar la 1,25D en la corrección de las alteraciones en el transporte de calcio transcelular a nivel renal i duodenal producen un aumento en los niveles de 25D en el suero por encima de los niveles recomendados en pacientes con ERC. Además, esta dosis causa calcificación vascular en ratones WT. También hemos observado que la 25D es capaz de activar la 24hidroxilasa i el VDR en las CMLV, mostrando la capacidad de la 25D de activar de forma directa el VDR en la arteria. En conclusión, estos resultados sugieren que la producción local de calcitriol por la 1αhidroxilasa en la arteria mediaría la calcificación vascular observada en la uremia. Además los tratamientos con 25D en pacientes con ERC deben hacerse de forma muy controlada / Vascular calcification is a complication of chronic kidney disease and one of the main predictors of increased morbidity and mortality in patients. These patients present a decrease in vitamin D levels (1,25(OH)2D3) leading to secondary hyperparathyroidism. For these reasons CKD patients are usually treated with calcitriol or other analogues. 25-hydroxyvitaminD is also used without any knowledge of its efficacy and toxicity. Current recommendations are to supplement with 25D to achieve a certain threshold that could affect both, classical and nonclassical actions of vitamin D in the body. However, its direct effect on calcium homeostasis (without conversion in calcitriol) is not fully understood. In the present work, we determined the effect of uremia in the regulation of vitamin D metabolism genes, and the role of the local synthesis of calcitriol on uremia-induced vascular calcification using 1αhidroxilaseKO mice. Also, we studied the efficacy and safety of 25D treatment on mineral metabolism in a model of 75% nephron mass reduction in mice lacking 1αhidroxilase and the effect in WT mice of the dose found to be effective reducing PTH levels in KO mice. Initial results in rats show that uremia deregulates proteins involved in vitamin D metabolism in vascular smooth muscle cells (VSMC), increasing the expression of 1αhydroxylase. This regulation is tissue specific and is different from the one in the kidney. Wild type mice with a CKD model treated with high daily doses of calcitriol (400ng/Kg) for two weeks show a significant weight loss, while 1αKO do not lose weight. Serum calcium levels, phosphorus, BUN, and 1,25D increase and are similar in both calcitriol-treated groups. Furthermore, PTH levels decrease in both groups below normal values. Vascular calcium content significantly increased in the WT mice compared to 1αKO mice. Similar results are observed with alizarin red staining and immunohistochemical detection of Runx2, which increase only in WT mice. In vitro, WT VSMC treated with uremic serum also show a significant increase in calcification and runx2 expression that is not observed in 1αKO cells. When VSMC from rat overexpressed 1αhydroxyalse also calcify more compared with the control cells. These results show that 1αhidroxilase acts as a mediatior of vascular calcificaton in uremia, increasing local synthesis of 1,25(OH)2D3. This fact is important in patients with renal disease treated with 25OHD3. To study the effect of 25D, a dose response study was carried out in 1αKO nephrectomized using 25, 50 and 100 ng/g of 25(OH)D3 to compare with a single dose of 1,25(OH)2D3 (50pg/g). 25(OH)D3 administration can normalize serum Ca, P, and PTH with a potency similar to that of 1,25D in the 1αKO mouse model of CKD, confirming a direct binding and activation of the VDR by 25D. Also, 25D can activate the VDR to mimic 1,25D in the up-regulation of genes and proteins mediating transcellular calcium transport in the kidney (TRPV5, Calbindin-D28k, PMCA1b) and in the duodenum (TRPV6, Calbindin-D9k, and PMCA1b) in the nephrectomized 1αKO. The doses of 25D required to mimic 1,25D in correcting the abnormalities in renal and duodenal transcellular calcium transport cause elevation in serum 25D levels far beyond the recommended levels in CKD patients. Furthermore this dose causes vascular calcification in WT mice. Also, we observed that 25D is able to activate 24hydroxylase and VDR in VSMC, showing the capacity of 25D to direct activate VDR in the artery. In conclusion, all these results suggest that local production of calcitriol by 1αhydroxylase in the artery may mediate vascular calcification observed in uremia. Furthermore, 25D treatments in patients with CKD should be done in a very controlled manner.

En los últimos años se ha tratado de profundizar en el estudio de los mecanismos moleculares a nivel hipotalámico responsables de regular el balance energético. En la actualidad se conoce que el metabolismo de los ácidos grasos a nivel hipotalámico juega un papel muy importante en el control del apetito. Más concretamente, se ha descrito que los niveles de malonil-CoA o de aciles-CoA son reconocidos por las neuronas del hipotálamo como señales intracelulares del estado nutricional del organismo. Las enzimas carnitina palmitoiltransferasa 1 (CPT1), tienen como sustrato los aciles-CoA y como inhibidor fisiológico el malonil-CoA, situándose así como enzimas clave en la regulación de los niveles intracelulares de estos metabolitos. Las isoformas CPT1A i B, localizadas en la membrana mitocondrial externa, se encargan de internalizar los aciles-CoA a la mitocondria para que sean oxidados. Así, efectivamente, el papel de CPT1A hipotalámica en el control del apetito y de la homeostasis de la glucosa fue demostrada por varios grupos de investigación. Por otro lado, más recientemente, en 2002, se descubrió una isoforma exclusivamente neuronal, CPT1C, que se localiza en retículo endoplasmático y con afinidades similares al sustrato acil-CoA y al inhibidor malonil-CoA, a pesar de no tener actividad carnitina palmitoiltransferasa. Desde entonces se ha demostrado que CPT1C modula los niveles de otra familia de lípidos intracelulares, las ceramidas, y que éstas son necesarias para la acción neuroendocrina de las hormonas leptina i grelina. Además, el papel de CPT1C en el control dela homeostasis energética se hizo evidente en varios estudios que muestran un fenotipo hipometabólico de ratones deficientes de CPT1C en situación de ayuno y de dieta rica en grasas. En esta tesis se ha estudiado qué papel tiene CPT1C en el control de la homeostasis energética. Para ello se han realizado dos aproximaciones distintas. En primer lugar se ha estudiado qué vías del metabolismo intermediario periférico están reguladas por CPT1C en ratones deficientes de esta proteína en distintas situaciones de estrés metabólico. En segundo lugar se ha estudiado el papel de CPT1C en el metabolismo lipídico neuronal y en los procesos necesarios para la regulación hipotalámica de la homeostasis energética. Los resultados obtenidos demuestran que CPT1C es necesaria para la adaptación metabólica al ayuno y al torpor y producir el switch a nivel periférico hacia la oxidación de las grasas frente a la de carbohidratos. Por otro lado, la deficiencia de CPT1C perjudica el metabolismo energético mitocondrial y el flujo de lípidos intracelulares a nivel hipotalámico. Asimismo, hemos podido demostrar que en conjunto, estas alteraciones tienen un efecto acumulativo a largo plazo, produciendo obesidad asociada a la edad y un envejecimiento global precoz. Por consiguiente, los resultados confirman el importante papel de CPT1C en la regulación de la homeostasis energética. Del mismo modo que aportan nuevos datos sobre los mecanismos que deben ocurrir, tanto a nivel central como periférico, de forma adecuada para evitar la aparición de un desequilibrio en el balance energético. Situando a CPT1C como posible diana terapéutica en el tratamiento de la obesidad.

La transtirretina (TTR) és una proteïna tetramèrica amiloidogènica (55 kDa) present al plasma humà i responsable del transport de la hormona T4 i del retinol a través de la proteïna d’unió a retinol (RBP). La proteïna TTR està associada amb diverses amiloïdosis, concretament la polineuropatia amiloide familiar (FAP), la cardiomiopatia amiloide familiar (FAC) i l’amiloïdosi senil sistèmica (SSA). La variabilitat associada a la TTR es deu tant a mutacions puntuals al gen codificant per aquesta com a modificacions post-traduccionals (PTMs) al residu Cys-10. Les PTMs més comuns associades a la Cys-10 de la TTR són la S-Sulfonació (S-Sulfo), la S-Glicinilcisteinilació (S-CysGly), la S-Cisteinilació (S-Cys) i la S-Glutationilació (S-GSH). Es creu que dites PTMs associades a la Cys-10 podrien jugar un paper biològic important en l’inici i procés patològic de les diferents amiloïdosis lligades a TTR. Hem tractat les amiloïdosis lligades a TTR des de dues perspectives diferents i) Intervencions terapèutiques i ii) Diagnòstic i monitorització de FAP. Referent a la primera part del projecte, hem portat a terme el cribratge de 41 possibles inhibidors de fibril·logènesis seleccionats mitjançant estratègies bioinformàtiques de repurposing de fàrmacs. Com a resultat de l’estudi, s’han trobat 4 nous estabilitzadors del tetràmer de TTR i, per tant, nous candidats pel tractament d’amiloïdosis lligades a TTR. Pel que fa a l’aproximació diagnòstica d’aquest treball, hem desenvolupat una metodologia per a la quantificació de PTMs en mostres de sèrum, així com per a la determinació dels nivells de TTR en aquest, tant en individus sans (wt) com en individus portadors de TTR amiloïdogènica (mutació V30M). Dita metodologia consisteix en una primera etapa d’enriquiment en TTR mitjançant immunoprecipitació, seguit de l’anàlisi de la TTR per espectrometria de masses de i) la proteïna intacta i ii) els pèptids de TTR portadors de les PTMs d’interès mitjançant l’anàlisi dirigit per LC-MS. L’anàlisi de les mostres de sèrum per la combinació d’ambdues estratègies aporta informació sobre la quantificació relativa i absoluta de les diferents PTMs presents a la TTR. Ha sigut possible mostrar que els mètodes basats en proteïna intacta es troben esbiaixats per algunes de les PTMs, donat que assumeixen un factor de resposta constant per les diferents isoformes. Contràriament, el nou mètode de LC-MS dirigit permet la quantificació absoluta de les diferents PTMs i els nivells totals de TTR (wt i mutant). La metodologia reportada ha sigut aplicada en l’anàlisi de dos grups de mostres clíniques. Com a resultat de l’estudi de mostres humanes de pacients de FAP en els diferents estadis de la malaltia, suggerim de forma preliminar les isoformes S-GSH i S-CysGly com a biomarcadors de progressió de la malaltia, permetent la diferenciació entre pacients en estadi 0 i 1 i, per tant, indicant l’aparició de la malaltia. Mitjançant l’anàlisi de mostres de pacients de FAP a diferents temps després de sotmetre’s a un transplantament de fetge (LT) i de pacients receptors de transplantament de fetge dominó provinent d’individus portadors de la mutació V30M, hem caracteritzat la progressió de la relació wt:V30M, així com l’evolució dels nivells de PTMs a la Cys-10, des de la intervenció fins a 9 anys després. Addicionalment, hem observat diferències significatives en els nivells de S-GSH i S-CysGly en comparar pacients de LT i DLT, resultats anàlegs als obtinguts en la comparació d’individus wt (sans) i pacients de FAP en estadi 0. / La transtirretina (TTR) es una proteína tetramérica amiloidogénica (55 kDa) presente en el plasma humano y la responsable del transporte de la hormona T4 y el retinol, a través de la proteína de unión al retinol (RBP). La proteína TTR está asociada con varias amiloidosis, concretamente la polineuropatía amiloide familiar (FAP), la cardiomiopatía amiloide familiar (FAC) y la amiloidosis senil sistémica (SSA). La variabilidad encontrada en la TTR se debe tanto a mutaciones puntuales encontradas en el gen que codifica para ésta como a modificaciones post-traduccionales (PTMs) en el residuo Cys-10. Las PTMs más comunes asociadas a la Cys-10 de la TTR son la S-Sulfonación (S-Sulfo), la S-Glicinilcisteinilación (S-CysGly), la S-Cisteinilación (S-Cys) y la S-Glutationilación (S-GSH). Se cree que dichas PTMs asociadas a la Cys-10 podrían jugar un papel biológico importante en el inicio y proceso patológico de las distintas amiloidosis ligadas a TTR. Hemos abordado las amiloidosis ligadas a TTR desde dos perspectivas distintas i) Intervenciones terapéuticas y ii) Diagnóstico y monitorización de FAP. Respecto a la primera parte del proyecto, hemos llevado a cabo el cribado de 41 posibles inhibidores de fibrilogenesis seleccionados mediante estrategias bioinformáticas de repurposing de fármacos. De este modo, se han encontrado 4 nuevos estabilizadores del tetrámero de TTR y por tanto, nuevos candidatos para el tratamiento de amiloidosis ligadas a TTR. En relación a la aproximación diagnóstica de este trabajo, hemos desarrollado una metodología para la cuantificación de PTMs en muestras de suero, así como para la determinación de los niveles de TTR en éste, tanto en individuos sanos (wt) como en individuos portadores de TTR amiloidogénica (mutación V30M). Dicha metodología consiste en una primera etapa de enriquecimiento en TTR mediante immunoprecipitación, seguido por el análisis de ésta mediante espectrometría de masas de i) la proteína TTR intacta y ii) de los péptidos de TTR portadores de las PTMs de interés mediante análisis dirigido por LC-MS. El análisis de muestras de suero mediante la combinación de ambas estrategias aporta información sobre la cuantificación relativa y absoluta de las distintas PTMs en TTR. Ha sido posible mostrar que los métodos basados en proteína intacta se encuentran sesgados para algunas de las PTMs, dado que asumen un factor de respuesta constante para las distintas isoformas. Por el contrario, el nuevo método de LC-MS dirigido permite la cuantificación absoluta de las distintas PTMs y los niveles totales de TTR (wt y mutante). La metodología reportada ha sido aplicada en el análisis de dos grupos de muestras clínicas. Como resultado del estudio de muestras humanas de pacientes de FAP en los distintos estadios de la enfermedad, sugerimos de forma preliminar las isoformas S-GSH y S-CysGly como biomarcadores de progresión de la enfermedad, permitiendo la diferenciación entre pacientes en estadio 0 y 1 y, por lo tanto, indicando la aparición de la enfermedad. Mediante el análisis de muestras de pacientes de FAP a distintos tiempos después de someterse a un trasplante de hígado (LT) y de pacientes receptores de trasplante de hígado dominó proveniente de individuos portadores de la mutación V30M, hemos caracterizado la progresión del ratio wt:V30M así como la evolución de los niveles de PTMs en la Cys-10, des de la intervención hasta 9 años después. Adicionalmente, hemos observado diferencias significativas en los niveles de S-GSH y S-CysGly en comparar pacientes de LT y DLT, resultados análogos a los obtenidos en la comparación de individuos wt (sanos) y pacientes de FAP en estadio 0. / Transthyretin (TTR) is an amyloidogenic tetrameric protein (55kDa) present in human plasma, transporting T4 hormone and retinol, through the retinol binding protein (RBP). TTR is associated with several amyloidosis, namely familial amyloidotic polyneuropathy (FAP), familial amyloidotic cardiomyopathy (FAC) and senile systemic amyloidosis (SSA). Variability of TTR is not only due to point mutations in the encoding gene but also to post-translational modifications (PTMs) at Cys-10, the most common PTMs being the S-Sulfonation (S-Sulfo), S-Glycinylcysteinylation (S-CysGly), S-Cysteinylation (S-Cys) and S-Glutathionylation (S-GSH). It is thought that PTMs at Cys-10 may play an important biological role in the onset and pathological process of amyloidosis related to TTR. We have aimed TTR amyloidosis from two different perspectives i) Therapeutic interventions and ii) FAP diagnosis and monitoring. Regarding the first branch of the project, we have performed the screening of a library of 41 possible fibrillogenesis inhibitors selected by a bioinformatic repurposing workflow, finding 4 new TTR tetramer stabilizers and thus, new potential candidates for TTR amyloidosis treatment. Concerning the clinical approach of this work, we have developed a methodology for quantification of PTMs in serum samples, as well as for the determination of serum TTR levels, from healthy (wt) and TTR-amyloidotic (V30M mutation) individuals. It involves an enrichment step by immunoprecipitation followed by mass spectrometry analysis of (i) the intact TTR protein and (ii) targeted LC-MS analysis of peptides carrying the PTMs of interest. Analysis of serum samples by the combination of the two methods affords complementary information on the relative and absolute amounts of the selected TTR PTM forms. It is shown that methods based on intact protein are biased for specific PTMs since they assume constant response factors, whereas the novel targeted LC-MS method provides absolute quantification of PTMs and total TTR variants. The reported methodology has been applied to two different sets of clinical samples. As a result of the study of human samples of FAP patients at different disease stages, we preliminary pointed out S-GSH and S-CysGly isoforms as biomarkers of disease progression, allowing the differentiation between FAP stage 0 and 1 and therefore indicating disease onset. Through the analysis of a time series from FAP patients having undergone liver transplantation (LT) and from domino liver transplantation (DLT) recipients from V30M carriers, we have characterized the progression of the wt:V30M ratios, as well as the evolution of the Cys-10 PTMs, from transplantation and up to 9 years after. Additionally, we have observed significant differences in the levels of S-GSH and S-CysGly when comparing liver and domino liver transplanted patients, analogous to the results obtained in the comparison of wt individuals and FAP stage 0 patients.

Fungi is the eukaryotic group with a largest amount of completely sequenced species and therefore it is particularly well suited for comparative genomics analyses. A species tree is often an important part of phylogenomics analysis. Concern about its reliability led us to design several methods by which we could identify nodes in the species tree that were poorly supported by a whole phylome. We determined that the species tree was mostly well supported but some nodes showed large discrepancies to most genes.These results could partly be attributed to evolutionary events that result in topological changes in gene trees. Our analyses have shown that HGT plays an important role in fungal evolution. Gene duplications followed by differential loss are also often the cause of incongruence. The OXPHOS pathway, despite being formed by multi-protein complexes, has been affected by this process at similar levels than the rest of the genome. / Els fongs són el grup d'espècies eucariotes amb un major nombre de genomes completament seqüenciats. Per això són un grup ideal on aplicar tècniques filogenòmiques. L'arbre de les espècies és un punt clau en molts anàlisis filogenòmics i com a tal necessitem saber si és fiable. Hem dissenyat diferents mesures que aprofiten la informació d'un filoma per identificar aquells punts en l'arbre de les especies que no estan ben suportats. Les discrepàncies que hem trobat poden ser degudes a successos evolutius (transferència horitzontal, duplicacions,...). Hem demostrat que la transferència horitzontal juga un paper important en l'evolució de fongs. També hem estudiat els efectes de duplicacions en l'evolució de la via metabòlica de la fosforilació oxidativa.Podem concloure que l'arbre de les especies és majoritàriament robust, però que necessitem ser capaços d'identificar nodes subjectes a variacions. Successos evolutius poden ser la causa de les discrepàncies observades en els arbres gènics.

La proteïna quinasa CK2 és una Ser/Thr fosfotransferasa que participa en les rutes de transducció de senyal relacionades amb la proliferació cel.lular. En la forma més freqüentment descrita, és un enzim oligomèric format per subunitat catalítica alfa i subunitat reguladora beta, que s'organitzen en un tetràmer actiu del tipus alfa2beta2. L'objectiu d'aquesta tesi doctoral fou l'estudi a nivell bioquímic i funcional de la proteïna quinasa CK2 de sistemes vegetals, especialment en relació a la proliferació cel.lular.Es va purificar per cromatografia líquida la CK2 de plantes d'Arabidopsis thaliana. En aquesta espècie, com en la majoria de les plantes, es va demostrar que coexisteixen isoformes monomèriques (alfa) amb formes oligomèriques (alfa 2beta 2), ambdues actives enzimàticament i que mostren propietats bioquímiques diferents.Per a l'estudi de la regulació de la CK2 durant la divisió cel.lular es va utilitzar com a sistema biològic la línia cel.lular BY-2 de tabac, que és altament sincronitzable. L'expressió global de les subunitats alfa i beta era constitutiva al llarg del cicle cel.lular. L'activitat enzimàtica oscil.lava al llarg del cicle i mostrava pics a la transició G1/S i a Mitosi. Es proposa que les poliamines, els moduladors al.lostèrics més importants de l'activitat CK2, podrien ser en part responsables de les oscil.lacions d'activitat. La inhibició in vivo de la CK2, amb l'inhibidor específic 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole, va corroborar els pics d'activitat. El bloqueig del cicle cel.lular a les fases S i G2 provocava la mort de les cèl.lules en un interval curt de temps. El bloqueig a la fase G1 no impedia que aquestes iniciessin la replicació en el moment previst, si bé no eren capaces de completar-la perquè condensaven prematurament la cromatina. Es discuteix la possible funcionalitat de la CK2 en l'acompliment del checkpoint G2/M.L'anàlisi de l'expressió i l'activitat de la CK2 a la corba de creixement de les cèl.lules BY-2, juntament amb l'establiment del patró d'expressió de la CK2 en diferents òrgans vegetals d'A. thaliana i Raphanus sativus per hibridació in situ, va revelar que aquestes augmentaven quan s'entrava a un estadi de proliferació. A més, l'activitat CK2 es regula a través de la interacció al.lostèrica amb les poliamines, així com per la presència de la subunitat beta , controlada a nivell post-transcripcional. Per hibridació in situ, es va observar una expressió coordinada de les dues subunitats, la qual era alta en tipus cel.lulars en divisió, com els meristems, els diferents primordis vegetals i el pericicle. El cribatge d'una biblioteca de cDNA de tabac va permetre aïllar dos cDNAs per a la subunitat alfa i un per a la subunitat beta, la seqüència dels quals conservava els motius estructurals característics. Postulem que la presència d'una extensió d'uns 80 aminoàcids a l'extrem N-terminal del polipèptid beta, exclusiva de les plantes, pot ser determinant pel plegament de la forma tetramèrica activa. Protein kinase CK2 is a widely distributed Ser/Thr phosphotransferase, that participates in signal transduction pathways involved in cell proliferation. The classical reported structure is that of a tetrameric enzyme, alfa 2beta 2, where _lfa is the catalytic subunit and beta is the regulatory subunit. The aim of this PhD was the study of the protein kinase CK2 in plant systems, specially in relation to cell proliferation process, at both biochemical and functional levels. Protein kinase CK2 from Arabidopsis thaliana seedlings was purified by liquid chromatography. In this plant, as it is described in other plant systems, two active isoforms coexist, one of them being monomeric (alfa) ant the other oligomeric (alfa 2beta 2), that show different biochemical properties.In order to investigate whether protein kinase CK2 is regulated during the cell division process in higher plants, the highly synchronizable tobacco BY-2 cell line was used. The expression of both alfa and beta subunits was constitutive throughout the cell cycle, while enzymatic activity showed oscillations, peacking at G1/S transition and Mitosis. The putative role of poliamines, the most important allosteric modulators of CK2, in the post-transcriptional regulation of CK2 activity during the cell cycle, is discussed. In vivo inhibition of CK2 by using the specific inhibitor 4,5,6,7-tetrabromobenzotriazole, corroborated the peaks of activity. Moreover, the blocking of the cell cycle at S and G2 phases, with the CK2 specific inhibitor, lead to the arrest of the cells in that phases and to its death shortly afterwards. In contrast, when the cells were blocked in G1, they iniciated the replication in the normal timing but they couldn't accomplish the process because the cromatin had condensed. A putative role of CK2 in the control of the G2/M checkpoint is postulated.Analysis of expression and activity of CK2 in the BY-2 growth curve, together with in situ hybridization data in different tissues in development from A. thaliana and Raphanus sativus, showed that it exists a transcriptional regulation of gene expression of both subunits when cells enter a proliferative state from a resting state. In addition, at the growth curve of the BY-2 cells, CK2 activity is regulated by controlling the _eta subunit levels by a post-transcriptional mechanism, and also by allosteric interaction with polyamines. By in situ hybridization, a coordinated expression of alfa and beta subunits in actively dividing cells, such as meristems, different organ primordia and pericicle, was observed.The screening of a tobacco cDNA library lead to the isolation of two cDNAs with homology to the alfa subunit, and one cDNA for the beta subunit. The sequences conserved the characteristic structural motifs of these proteins. The presence of an extension of aproximately 80 aminoacids at the N-terminal site of the beta subunit, which is only found in plant beta polypeptides, might be crucial for the correct folding of the active tetrameric protein.

L´LDL electronegativa (LDL(-)) és una fracció modificada de l´LDL total present en circulació. Vàries evidències indiquen que l´LDL(-) pot presentar característiques aterogèniques, ja que se suggereix que podria estar mínimament oxidada. En la present tesi s´han estudiat les propietats de l´LDL(-) procedent d´individus normolipèmics (NL) i hipercolesterolèmics (HF). Es van avaluar els següents aspectes:1) Característiques fisico-químiques. La proporció d´LDL(-) en HF va ser major, aproximadament el doble, que en NL. No es van trobar evidències de que l´LDL electronegativa fos una forma oxidada, si no que la seva càrrega negativa es pot generar pel seu major contingut en àcid siálic, en àcids grassos lliures (NEFA) i en apoliproteïnes E i CIII. D´altra banda, s´observà heterogeneïtat de l´LDL(-) quant al seu origen, ja que, entre l´LDL(-) de NL i HF es van observar diferències en grandària, densitat, i composició. 2) Interacció amb els receptors celulars. L´LDL(-) presentà menor afinitat pel receptor de LDL (rLDL) en fibroblasts que la forma nativa. Tanmateix, no va ser reconeguda pel receptor scavenger, ja que no va induir la formació de ésters de colesterol en macròfags. Això implicaria un major temps de permanència en circulació de la partícula i, per tant, la possibilitat d´estar sometsa a modificacions. A més, aquest fet deu estar relacionat amb l´elevada proporció d´LDL(-) en pacients HF.3) Contingut en NEFA de l´LDL. L´LDL enriquida en NEFA "in vitro" a nivells similars als de l´LDL(-) reproduí en gran part las propietats d´aquesta partícula, incloent una major càrrega negativa, canvis en la susceptibilitat a l´oxidació i una menor afinitat pel rLDL.4) Potencial inflamatori de la partícula. L´LDL(-) d´ambdos tipus de subjecte presentà propietats inflamatòries, ja que, a concentracions fisiològiques, va induir, sense producció de citotoxicitat, l´expressió de les quimioquines MCP-1 i IL-8 per part de cèlul.les endotelials. Aquesta inducció es podria atribuir a un major contingut en NEFA i/o en fosfolípids fragmentats per part de l´LDL(-). No obstant això, no va produir un augment significatiu en PAI-1 ni VCAM respecte a la fracció nativa. En conclusió, l´LDL(-) és una partícula potencialment aterogènica degut a que presenta una densitat alterada, una menor afinitat pel rLDL i té la capacitat d´induir MCP-1 i IL8 en cèlul.les endotelials. / The electronegative fraction of plasma low-density lipoproteins (LDL(-)) is a modified form of native plasma LDL. Several lines of evidence suggest that LDL(-) could display atherogenic characteristics as it could be found minimally oxidized. In the present Thesis the physico-chemical and biological properties of plasma LDL(-) isolated from normolipemic (NL) and familial hypercholesterolemic (FH) subjects have been studied. The following goals were evaluated:1) Physico-chemical characteristics of LDL(-). The relative proportion of LDL(-) in plasma of FH subjects was significantly increased (~2 fold) compared with that observed in plasma of NL subjects. No evidences of differential oxidative status were found in LDL(-) compared with native LDL. The negative charge of this LDL fraction could be generated by its greater content in sialic acid, non-esterified fatty acid (NEFA) and apolipoproteins E and CIII. On the other hand, LDL(-) were heterogeneous in their origin, size, density and chemical composition, depending on whether they were isolated from plasma of NL or FH subjects.2) LDL(-) binding to cellular receptors. In vitro LDL(-) showed lower affinity for the LDL receptor (LDLr) than the native LDL form. Moreover, LDL(-) was not recognized by the scavenger receptor, which resulted in reduced formation of esterified cholesterol in cultured macrophages. These observations could involve a higher residence time in circulation of LDL(-), which raises the possibility to be modified. Furthermore, this can be associated with an increased proportion of LDL(-) in plasma of FH subjects.3) Content in NEFA of LDL(-). The in vitro enrichment of native LDL in NEFA at levels similar to that present in LDL(-) reproduced the majority of the properties of this particle, including a higher negative charge, changes in susceptibility to oxidation and lower affinity for the LDLr.4) Imflammatory potential of LDL(-). Plasma LDL(-) isolated from plasma both FH and NL subjects presented inflammatory properties. At physiological concentrations and in the absence of citotoxicity, LDL(-) induced in vitro the expression of chemokines MCP-1 and IL-8 by endothelial cells. This induction could be caused by a higher content in NEFA and/or fragmented phospholipids of LDL(-). By contrast, no changes could be observed in the expression of PAI-1 or VCAM by endothelial cells incubated with LDL(-) compared with that observed with the native LDL counterpart.In conclusion, these results suggest that the LDL(-) is a potentially atherogenic particle because it presents an altered density, lower affinity for the LDLr and it is capable of inducing MCP-1 and IL-8 expression by cultured endothelial cells.

b-catenina y plakoglobina (también llamada g-catenina) son dos proteínas homólogas esenciales para la formación y el mantenimiento de los contactos célula-célula entre células epiteliales. En las uniones adherentes, b-catenina y plakoglobina interaccionan de forma independiente con el dominio citoplasmático de los receptores de adhesión celular de la familia de las cadherinas, uniéndolos al citoesqueleto de actina mediante la asociación con a-catenina. Plakoglobina también es un componente de la capa submembranal de los desmosomas.Además de su papel estructural en las uniones adherentes, b-catenina interviene en señalización celular actuando como miembro de la vía Wnt. Está menos claro si su homóloga plakoglobina también presenta esta papel en señalización.El objetivo principal de este trabajo ha consistido en caracterizar las analogías y diferencias de b-catenina y plakoglobina en su interacción con el factor de transcripción Tcf-4 y con componentes de las uniones adherentes y los desmosomas.Hemos determinado que Tcf-4 es fosforilado in vitro por la proteína quinasa CK2 en los amino ácidos Ser-58-Ser-59-Ser-60. Hemos comprobado que la fosforilación de estos residuos no modifica la interacción del Tcf-4 con b-catenina pero si reduce su asociación con plakoglobina. Se han comparado los sitios de unión de estas dos proteínas con el Tcf-4; mientras que b-catenina requiere los primeros 50 amino ácidos del Tcf-4, plakoglobina interacciona principalmente con los residuos 51-80. Se han detectado in vitro complejos ternarios formados por b-catenina/Tcf-4/plakoglobina, indicando que es posible la unión simultánea de las dos proteínas armadillo al Tcf-4. Se han llevado a cabo experimentos utilizando una forma mutada del Tcf-4 cuya interacción con plakoglobina se encuentra disminuída y se ha comprobado que la unión de plakoglobina afecta negativamente a la actividad transcripcional del Tcf-4. Estos resultados indican que el Tcf-4 contiene dos sitios de unión diferentes para b-catenina y plakoglobina y que la interacción de esta última regula la actividad transcripcional del complejo.Había evidencias de que la fosforilación en residuos tirosina de los componentes de los complejos de adhesión regulaba la estabilidad de estos complejos. Hemos caracterizado que la fosforilación de b-catenina en los residuos Tyr-142 y Tyr-654 disminuye la interacción de esta proteína con a-catenina y E-cadherina, respectivamente. La identificación de las tirosina quinasas que catalizan estas modificaciones indica que la Tyr-142 de b-catenina es un buen sustrato de las quinasas Fer y Fyn, mientras que la Tyr-654 es modificada por el receptor de EGF o proteínas relacionadas.Una regulación similar se ha propuesto para plakoglobina en los desmosomas y uniones adherentes. Nuestros resultados indican que, aunque b-catenina y plakoglobina son dos proteínas homólogas, las mismas tirosina quinasas fosforilan diferentes residuos en las dos proteínas. Además, la fosforilación de residuos equivalentes causa efectos totalmente diferentes en la interacción de plakoglobina y b-catenina con sus cofactores celulares. Por ejemplo, Src que fosforila principalmente la Tyr-86 en b-catenina, modifica la Tyr-643 en plakoglobina disminuyendo su interacción con E-cadherina y a-catenina y aumentando su asociación con la proteína equivalente a a-catenina en los desmosomas, la desmoplakina. Por otro lado, la tirosina quinasa Fer, que modifica la Tyr-142 de b-catenina disminuyendo su asociación con a-catenina, fosforila la Tyr-549 de plakoglobina y ejerce el efecto contrario: aumenta la unión plakoglobina-a-catenina. Estos resultados sugieren que tirosina quinasas como Src o Fer modulan de forma diferente los desmosomas y las uniones adherentes y promueven el paso de plakoglobina de un tipo de complejo de adhesión a otro. Nuestros resultados también sugieren que la interacción de plakoglobina con los miembros de las uniones adherentes previene la translocación de plakoglobina al núcleo y su inhibición de la actividad del Tcf-4. / b-catenin and plakoglobin (also known as g-catenin) are two closely related proteins essential for the establishment and maintenance of cell-cell contacts among epithelial cells. In adherens junctions, b-catenin and plakoglobin independently bind to the cytoplasmic domain of cell-cell adhesion receptors of the cadherin family, linking them to the actin cytoskeleton by an association with a-catenin. Plakoglobin is also a component of the submembranal plaque of desmosomes.In addition to its structural role in adherens junctions, b-catenin has a signaling activity as a member of the Wnt pathway. It is still unclear whether its close homologue, plakoglobin, also has a signaling role.In this work we have studied the similarities and differences on the interaction of b-catenin and plakoglobin with the transcription factor Tcf-4 and members of the adherens junctions and desmosomes.We show that Tcf-4 can be phosphorylated in vitro by protein kinase CK2 in amino acids Ser-58-Ser-59-Ser-60. Phosphorylation of these residues does not modify the interaction of Tcf-4 with b-catenin but reduces its association to plakoglobin. The binding sites of Tcf-4 for these two proteins were compared; whereas b-catenin requires the N-terminal first 50 amino acids, plakoglobin interacts mainly with residues 51-80. Ternary complexes composed by b-catenin/Tcf-4/plakoglobin could be detected in vitro, demonstrating that simultaneous binding of the two armadillo proteins to Tcf-4 is posible. Experiments performed using a Tcf-4 mutant with decreased interaction to plakoglobin demonstrated that binding to this protein negatively affected the transcriptional activity of Tcf-4. These results indicates that Tcf-4 contains two different sites for binding b-catenin and plakoglobin, and the interaction of the latter hinders the transcriptional activity of the complex.Phosphorylation in tyrosine residues of components of adhesion complexes regulates the stability of these complexes. We have described that phosphorylation of b-catenin residues Tyr-654 and Tyr-142 specifically decreases the interaction of this protein with E-cadherin and a-catenin, respectively. The identification of the Tyr kinases that catalyze these modifications indicates that b-catenin Tyr-142 is a good substrate of Fer and Fyn kinases, whereas Tyr-654 is modified by EGF receptor or related proteins.A similar modulation has been proposed for plakoglobin action on desmosomes and adherens junctions. Our results indicate that, although b-catenin and plakoglobin are two closely related proteins, the same protein kinase phosphorylate different residues in the two proteins. Moreover phosphorylation of equivalent residues cause totally different effects on the interaction of plakoglobin and b-catenin with their cellular partners. For instance, Src that phosphorylates mainly Tyr-86 in b-catenin, modifies Tyr-643 in plakoglobin decreasing the interaction with E-cadherin and a-catenin and increasing the interaction with the a-catenin-equivalent protein in desmosomes, desmoplakin. On the other hand, the tyrosine kinase Fer, that modifies b-catenin Tyr-142 lessening its association to a-catenin, phosphorylates plakoglobin Tyr-549 and exerts the contrary effect: augmentates plakoglobin-a-catenin binding. These results suggest that tyrosine kinases as Src or Fer modulate desmosomes and adherens junctions differently and promote the switch of plakoglobin from one type of adhesion complex to the other. Our results also suggest that interaction of plakoglobin to members of the adherens junctions prevents the translocation of plakoglobin to the nucleus and its inhibition of Tcf-4 action.

Las uniones adherentes son un tipo de unión que se establece entre células adyacentes. A través de ellas, contactan sus citoesqueletos y el tejido gana en resistencia. En las uniones adherentes, las proteínas transmembrana que establecen contactos homotípicos son las cadherinas. La principal cadherina en tejido epitelial es la E-cadherina. El dominio citosólico de E-cadherina interacciona con el citoesqueleto de actina a través de unas proteínas citosólicas denominadas b-catenina y a-catenina respectivamente. a-catenina interacciona directamente con componentes del citoesqueleto. Otra catenina, la p120-catenina, también interacciona con la facción citoplásmica de la E-cadherina.La alteración de la adhesión celular mediada por cadherina, se asocia con frecuencia con la fosforilación en tirosinas de p120 y b-catenina. Hemos examinado el papel de esta modificación en el control de la asociación b-catenina/E-cadherina utilizando ensayos in vitro con proteínas recombinantes. La quinasa Src recombinante fosforila eficientemente ambas cateninas. La fosforilación por Src, disminuye la unión b-catenina/E-cadherina y aumenta la asociación p120/E-cadherina. A pesar de ello, ambas cateninas pueden interaccionar independientemente con la cadherina. De las tirosinas de b-catenina fosforiladas por Src, es la fosforilación de la 654 la responsable, tanto in vitro como in vivo, de la pérdida de asociación con la cadherina. Otras quinasas como el EGFR o su homólogo erbB2 catalizan la fosforilación de la tirosina 654 con gran eficiencia.A parte de su interacción con E-cadherina, b-catenina interacciona con a-catenina. En este trabajo mostramos como esta interacción entre a y b también se regula por fosforilación en tirosinas. Concretamente, la fosforilación de la tirosina 142 de b-catenina inhibe la asociación entre ambas proteínas, tanto in vitro como in vivo. Esta tirosina puede ser fosforilada in vitro por las quinasas Fer y Fyn. En células intestinales transfectadas con K-ras, hay muy poca asociación entre a- y b-catenina y Fer y Fyn quinasas se encuentran activadas. Ambas quinasas se asocian con p120-catenina en un complejo multiproteico que implica también otras quinasas como Src y Yes. La fosforilación de p120 aumenta su asociación a E-cadherina, reclutando a su vez a las quinasas asociadas hasta los complejos de adhesión. La presencia de las quinasas en las uniones adherentes, posibilitaría la fosforilación de las tirosinas 142 y 654 de b-catenina, lo que provocaría su liberación de a-catenina y E-cadherina respectivamente, y la presencia de b-catenina en forma libre en el citosol.A parte de su papel estructural en las uniones adherentes, b-catenina también funciona como coactivador transcripcional de genes implicados en proliferación celular. Para ello interacciona con factores nucleares como el Tcf-4 o la TATA-box binding protein (TBP).La fosforilación de la tirosina 654 de b-catenina, afecta positivamente a su asociación con TBP, lo que se correlaciona con una mayor actividad transcripcional mediada por b-catenina.Intramolecularmente, los dominios terminales de b-catenina interaccionan con su rígido dominio central y la fosforilación de la tirosina 654, produce la inhibición de la asociación entre el dominio central y el C-terminal. La ausencia de dominios terminales, favorece la interacción de b-catenina con factores como E-cadherina o la TBP. Luego, los extremos terminales de la proteína controlan la unión de los distintos cofactores a b-catenina y, al menos la fosforilación de la tirosina 654 participa en la regulación de estos procesos. / Adherens junctions are a kind of cell-cell contacts between neighbouring cells. They allow the cytoeskeletons to interact confeering tissue resistance. In adherens junctions, cadherins are the transmembrane proteins that establish homotypic interactions. In epithelial tissues, E-cadherin is the main cadherin. The citosolic domain of E-cadherin binds the cytoeskeleton through b-catenin and a-catenina respectively. a-catenin can bind directly to cytoeskeleton proteins. Another catenin, p120-catenin, also binds to E-cadherin.Alteration of cadherin-mediated cell-cell adhesion is frequently associated to tyrosine phosphorylation of p120- and b-catenins. We have examined the role of this modification in the control of b-catenin/E-cadherin binding using in vitro assays with recombinant proteins. Recombinant Src-kinase efficiently phosphorylates both catenins. Src phosphorylation, reduces b-catenin/E-cadherin binding and increases p120/E-cadherin association. However, both catenins can indepently interact with E-cadherin. Among the tyrosines phosphorylated by Src, phosphorylation of Tyr-654 is responsible, both in vitro or in vivo, of b-catenin/E-cadherin decrease. Other tyrosine-kinases as EGFR or its homologue erbB2 can phosphorylate tyrosine 654 with high efficiency.Moreover of its interaction con E-cadherin, b-catenin also interacts with a-catenin. In this work we show that a-catenin/b-catenin binding is regulated by tyrosine phosphorylated, too. Concretely, phosphorylation of b-catenin tyrosine 142, decreases the association between these proteins, both in vitro or in vivo. This residue can be in vitro phosphorylated by Fer and Fyn kinases. In K-ras transfected epithelial cells, very few a- and b-catenin association is detected and Fer and Fyn kinases are found in an activated manner. Both kinases associate with p120-catenin in a multiprotein complex. Other kinases as Yes or Src are also present in the complex. p120 phosphorylation increase its association with E-cadherin, recruiting the kinases to the adhesion complexes. The presence of kinases in adherens junctions enables the phosphorylation of b-catenin tyrosines 142 and 654. This produces b-catenin liberation from a-catenin and E-cadherin respectively, and its translocation to the cytosol.A part of its structural role in adherens junctions, b-catenin also acts as a transcriptional coactivator of pro-proliferative genes. So, b-catenin interacts with nuclear factors as Tcf-4 or TATA-box binding protein (TBP).Phosphorylation of b-catenin Tyr-654, icreases its association with TBP, wich correlates with an increase in b-catenin dependent transcriptional activity.Intramolecularly, terminal domains of b-catenin interact with its central domain and Tyr-654 phosphorylation, produces the inhibition of central domain/C-terminal association. In the absence of terminal domains, b-catenin interaction with factors like E-cadherin or TBP is augmented. Then, the protein terminal domains control cofactors binding to b-catenin and, at least Tyr-654 phosphorylation is implicated in the regulation of this process.

Ets-1 y USF1 son factores de transcripción implicados en muchos procesos fundamentales del desarrollo y la diferenciación celular. Defectos en su regulación se han asociado con desórdenes patológicos e infecciones virales. Ets-1, en particular, es un paradigma del mecanismo de regulación transcripcional en virtud del cual la capacidad de Ets-1 para unir DNA y, por tanto, de transactivación, están silenciadas constitutivamente (autoinhibición). La desrepresión de Ets-1 se puede lograr por medio de interacciones proteína-proteína, que desenmascaran el dominio de unión a DNA de Ets-1 y conducen a la formación de un complejo ternario de gran afinidad entre Ets-1, una proteína compañera y el sitio de unión combinado para ambos factores de transcripción.En este trabajo, emprendimos la elucidación estructural del mecanismo de autoinhibición de Ets-1. Comenzamos con la clonación, expresión y purificación de Ets-1 y las proteínas compañeras USF1 y MafB. A medida que íbamos enfrentando nuevos desafíos, diseñamos métodos y aproximaciones que facilitaran la producción eficaz de proteínas de unión a DNA para biología estructural. Uno de los conceptos fundamentales que ha reaparecido en el presente estudio es la necesidad de proporcionar a cada proteína un entorno lo mas parecido posible al que disfrutan en su contexto biológico. Por ejemplo, la estabilización de Ets-1 no fue posible hasta que se añadió el complejo USF1/DNA , que semeja las condiciones fisiológicas en las que USF1, unido a DNA, recluta Ets-1 sobre su sitio de unión. Hemos producido con éxito un conjunto de complejos ternarios Ets-1/USF1/DNA para los cuales hemos buscado condiciones de cristalización. Hemos obtenido cristales, que hemos probado contienen Ets-1, USF1 y DNA. El refinamiento (optimización) de esas condiciones de cristalización preliminares debería conducir en definitiva a la obtención de cristales de suficiente calidad para difracción. Estos cristales ofrecen la posibilidad de profundizar nuestro conocimiento en un mecanismo de regulación que tiene una importancia capital en enfermedades como el síndrome de inmunodeficiencia adquirida o muchos tipos de leucemias. / Ets-1 and USF1 are transcription factors involved in many key processes in development and differentiation. Defects in their regulation have been associated with pathological disorders and viral infections. Furthermore, Ets-1 is a paradigm of a regulation mechanism in transcriptional control whereupon its DNA-binding activity and, thereby, its transactivation properties, are constitutively silenced (autoinhibition). Derepression of Ets-1 can be achieved by protein-protein interactions, which unmask Ets-1's DNA binding domain and lead to the formation of a high affinity ternary complex onto DNA between Ets-1, the partner protein and the combined site for both transcription factors.In this work, we undertook the structural elucidation of the autoinhibitory mechanism of Ets-1. We started off by cloning, expressing and purifying Ets-1 and the partner proteins USF1 and MafB. As new challenges were met in this part of the project, we devised methods and approaches directed towards the efficient production of DNA-binding proteins for structural biology. A key concept turn out to be the necessity to provide proteins with an environment closest to their biological contexts in order to stabilise them. For example, Ets-1 stabilisation could not be attained until a pre-formed USF1/DNA complex was added to it, resembling the in vivo situation, where USF1, bound to their composite binding site, recruits Ets-1 onto DNA.We successfully produced a number of Ets-1/USF1/DNA ternary complexes and have partially screened the vast space of crystallisation conditions. Crystals have been obtained, and they have been proved to contain both protein partners plus DNA. Refinement of these preliminary crystallisation conditions will ultimately render crystals of sufficient quality for diffraction experiments. We are excited about the possibilities open up by these crystal for deeper insight into a not well understood regulatory mechanism, but which underlies such important diseases as the human immunodeficiency syndrome and many different types of leukaemia.