El propòsit d’aquesta tesis que porta com a títol “Estudi de l’estabilitat de plegament i l’agregació mitjançant l’ús de proteïnes globulars petites” és el de contribuir al coneixement de com les proteïnes globulars adquireixen la seva estructura nativa i funcional o, alternativament, despleguen i agreguen donant lloc a assemblatges tòxics. Les malalties conformacionals inclouen un número important de desordres humans com la malaltia del Parkinson i Alzheimer, les quals estan relacionades amb canvis conformacionals d’espècies solubles no tòxiques a agregats tòxics. A més, la sobrexpressió de proteïnes recombinants normalment promou l’acumulació d’agregats proteics, essent un gran blocatge en diversos processos biotecnològics. D’aquesta manera, el desenvolupament d’estratègies per reduir o evitar aquestes reaccions aberrants s’ha convertit en un problema molt important tant a la indústria biomèdica com biotecnològica. En la present tesis hem utilitzat una bateria de tècniques biofísiques i computacionals per analitzar el plegament, l’estabilitat conformacional i la tendència a agregar de diverses proteïnes globulars. La combinació d’aproximacions experimentals (in vivo i in vitro) i bioinformàtiques ha proveït nous coneixements sobre les propietats intrínseques i estructurals, incloent la presència de ponts disulfurs i d’estructura quaternària, que modulen aquests processos sota condicions fisiològiques. En general, aquests resultats demostren com l’establiment de contactes natius que promouen la formació d’intermediaris de plegament, estructures natives o interfases proteiques amb estabilitat termodinàmica significativa és un procés crucial tant en la conducció del plegament proteic com de l’agregació. / The purpose of the thesis entitled “Using small globular proteins to study folding stability and aggregation” is to contribute to understand how globular proteins fold into their native, functional structures or, alternatively, misfold and aggregate into toxic assemblies. Protein misfolding diseases include an important number of human disorders such as Parkinson’s and Alzheimer’s disease, which are related to conformational changes from soluble non‐toxic to aggregated toxic species. Moreover, the over‐expression of recombinant proteins usually leads to the accumulation of protein aggregates, being a major bottleneck in several biotechnological processes. Hence, the development of strategies to diminish or avoid these aberrant reactions has become an important issue in both biomedical and biotechnological industries. In the present thesis we have used a battery of biophysical and computational techniques to analyze the folding, conformational stability and aggregation propensity of several globular proteins. The combination of experimental (in vivo and in vitro) and bioinformatic approaches has provided insights into the intrinsic and structural properties, including the presence of disulfide bonds and the quaternary structure, that modulate these processes under physiological conditions. Overall, the data illustrates how the establishment of native‐like contacts providing folding intermediates, native structures or protein interfaces with significant thermodynamic stability is a crucial process both to drive protein folding and to compete toxic aggregation.

Durante los últimos años la agregación proteica se ha convertido en un tema de elevada importancia en biología, biotecnología y medicina. Un número creciente de evidencias demuestran fehacientemente que el mal plegamiento de proteínas y su agregación, muchas veces en forma de fibras amiloides, conlleva la formación de depósitos celulares insolubles que son los responsables finales de un creciente número de enfermedades humanas. Este tipo de enfermedades, agrupadas bajo el concepto de enfermedades conformacionales, engloban una gran diversidad de afecciones tanto neurodegenerativas como sistémicas de las que cabria destacar enfermedades con una gran relevancia socioeconómica como pueden ser la enfermedad de Alzheimer, Parkinson, Huntington o la diabetes tipo II entre otras. La producción recombinante en células bacterianas de las proteínas implicadas en este tipo de enfermedades da lugar, muchas veces, a la formación de agregados proteicos, denominados cuerpos de inclusión (IBs), que obstaculizan la obtención de éstas en su forma nativa. Aunque inicialmente se creyó que estos IBs eran simplemente agregados de proteínas plegadas de forma amorfa a causa de interacciones básicamente hidrofóbicas, recientes estudios han demostrado que éstos están compuestos mayoritariamente por proteínas recombinantes producidas que agregan adquiriendo conformaciones amiloides similares a las obtenidas en humanos. Este hecho hace que el estudio de estos IBs bacterianos pueda ser de vital importancia para la comprensión de las enfermedades conformacionales en humanos. Esta tesis está centrada en el estudio de los procesos de agregación proteica y en la caracterización de los agregados formados tanto in vitro como in vivo utilizando como modelo varias proteínas y péptidos sin ningún tipo de homología secuencial ni estructural en un intento de abarcar un amplio abanico conformacional que ilustre el universo conformacional de las proteínas. Son muchos los factores, tanto intrínsecos como extrínsecos a la cadena polipeptídica, que pueden influir en el proceso de formación de fibras amiloides in vitro. El estudio de la influencia de estos determinantes nos permite conocer las interacciones que dirigen la deposición proteica y proponer posibles mecanismos de agregación. Los resultados obtenidos nos han permitido estudiar en detalle el efecto que tienen algunos de estos factores esenciales sobre la agregación proteica, y como su efecto puede variar dependiendo de las características conformacionales de las proteínas. El estudio del efecto de estos determinantes nos ha permitido obtener información sobre las interacciones moleculares que dirigen la formación de las fibras amiloides y de los posibles mecanismos que pueden seguir las proteínas, inicialmente solubles, para adquirir la estructura común en hoja β altamente ordenada. Puesto que las células procariotas se han convertido en sistemas sencillos pero fisiológicamente relevantes para el estudio de la formación de estos agregados, la segunda parte de esta tesis se ha centrado en el estudio biofísico in vivo de los agregados formados en el interior celular utilizando células procariotas como modelo. Los resultados obtenidos demuestran que las proteínas presentes en IBs bacterianos muestran estructuras amiloides comparables a las obtenidas tanto in vitro como en organismos eucariotas, y que los factores estudiados in vitro también pueden afectar, de forma similar, a la formación amiloide in vivo. / In recent years, protein aggregation has become a topic of great importance in biology, biotechnology and medicine areas. A growing body of evidences show conclusively that the protein misfolding and aggregation, often in the form of amyloid fibrils, leading to the formation of insoluble cellular deposits that are ultimately responsible for an increasing number of human diseases. Such diseases, grouped under the concept of conformational diseases, encompass a wide variety of neurodegenerative and systemic disorders which can be highlighted with a large socioeconomic importance such as Alzheimer's disease, Parkinson's diseases, Huntington's diseases and type II diabetes among others. The recombinant production of proteins involved in these diseases in bacterial cells leads often to the formation of protein aggregates, called inclusion bodies (IBs), hindering the obtaining of these in their native form. Although it was initially believed that these IBs were simply folded protein aggregates amorphous basically because of hydrophobic interactions, recent studies have shown that these IBs are mainly composed of recombinant proteins acquiring amyloid conformations similar to those in humans. This fact makes the study of these bacterial IBs can be of vital importance for the understanding of conformational diseases in humans. This thesis is based on the study of protein aggregation processes and in the characterization of the aggregates formed in vitro and in vivo using as model various proteins and peptides without any structural or sequence homology. Many factors, both intrinsic and extrinsic to the polypeptide chain, can influence the process of amyloid fibril formation in vitro. The study of the influence of these determinants allows us to understand the interactions that direct protein deposition and suggest possible mechanisms of aggregation. The results obtained have allowed us to study in detail the effect of some of these factors in protein aggregation, and their effect may vary depending on the conformational characteristics of proteins. The study of the effect of these determinants has allowed us to obtain information about the molecular interactions that direct the formation of amyloid fibers and possible mechanisms that may follow the protein, soluble initially to acquire the common structure in highly ordered β sheet. Since prokaryotic cells have become simple but physiologically relevant systems for the study of the formation of these aggregates, the second part of this thesis has focused on biophysical study in vivo of the aggregates formed within the cell using prokaryotic as a model. The results demonstrate that the proteins in bacterial IBs show amyloid-like structures comparable to those obtained in vitro and in eukaryotes, and in vitro study factors can also affect similarly to amyloid formation in vivo.

Throughout its lifespan, eukaryotic cells steadily consume free cytoplasmic orthophosphate to produce phospholipids and mRNA. However, during DNA synthesis, in a matter of minutes, cells require large amount of phosphate molecules to be incorporated in dNTPs. It is not known whether this high consumption produces a sharp variation in cellular orthophosphate levels, or alternatively, a homeostatic system exists to prevent any variation. Polyphosphate (polyP) is a linear chain made of hundreds of Pi residues present in all living organisms, with a still unclear molecular function. In the present study we show that degradation of polyP is cell cycle regulated and, also, an important process to sustain the synthesis of dNTPs in S. cerevisiae. Mutants that cannot synthesise polyP (vtc4) or cannot hydrolyse it (ppn1 ppx1) present a lower rate of dNTP synthesis and it takes longer time to duplicate DNA. Recovery after UV stress also requires high levels of dNTPs, and here we show that mutants bearing low levels of polyP are more sensitive to UV, while cells overexpressing VTC4 are more resistant. Finally, we demonstrate that human dermal fibroblasts with reduced levels of polyP are also more sensitive to UV damage, suggesting that the protective role of polyP against UV damage might be conserved. In conclusion, this work identifies a new and important player during the synthesis of the building blocks of DNA.

Aquesta tesi s'emmarca en els àmbits la biologia de sistemes i l'enginyeria metabòlica, és a dir, en l'anàlisi quantitatiu de sistemes biològics complexes. En aquest estudi s'ha utilitzat el llevat metilotròfic Pichia pastoris com a organisme model, el qual ha adquirit durant els darrers anys una importància creixent en l'àmbit de la biotecnologia, mostrant una gran capacitat com a sistema de producció de proteïnes recombinants. L'objectiu principal de l'estudi ha estat establir tècniques i metodologies experimentals i computacionals d'anàlisi quantitativa de la fisiologia cel·lular al sistema de P. pastoris. L'anàlisi quantitativa (i modelització matemàtica) dels processos cel·lulars és una eina molt valuosa per al redisseny racional del metabolisme cel·lular amb l'objectiu d'optimitzar els sistemes vius per a determinades aplicacions biotecnològiques (enginyeria metabòlica), així com per al disseny i optimització racional de processos de cultiu i expressió de proteïnes recombinants. Aquests objectius depenen de l'elucidació de la xarxa de bioreaccions, concretament de la recopilació de dades experimentals disponibles sobre els components de la xarxa, una estimació dels fluxos in vivo i la descripció teòrica (modelització) de la xarxa. Aquest treball ha estat centrat en l'estudi sistemàtic in vivo del metabolisme central del carboni de P. pastoris. El creixement del llevat sobre el sucre glucosa o d'altres compostos com la glicerina o metanol, substrats àmpliament utilitzats en processos de cultiu de P. pastoris, implica a un conjunt o xarxa de reaccions bioquímiques. La comparació de les variacions de fluxos metabòlics in vivo d'aquesta xarxa en cèl·lules de llevat creixent sota diferents condicions ambientals proporciona valuosa informació sobre el seu comportament i regulació. En aquesta tesi, s'han realitzat una sèrie de cultius en bioreactors operant en continu (quimiostat), els quals permeten mantenir les cèl·lules en condicions fisiològiques controlades i constants (estat metabòlic estacionari). Es varen realitzar estudis metabòlics de cèl·lules de llevat a diferents estats fisiològics, canviant el tipus de substrat disponible per a les cèl·lules o bé utilitzant barreges dels mateixos en diferents proporcions, i/o variant la velocitat específica de creixement cel·lular, per aleshores analitzar les variacions en la topologia de la xarxa metabòlica (rutes metabòliques actives) i les variacions en les fraccions de fluxos metabòlics. L'estimació de les variacions de fluxos metabòlics es realitzà experimentalment mitjançant tècniques de marcatge isotòpic dels substrats amb 13C, combinades amb tècniques de Ressonància Magnètica Nuclear (RMN). En aquest treball, s'ha adaptat una metodologia prèviament desenvolupada per a l'anàlisi de metabolisme de bactèries, i posteriorment estesa a l'anàlisi d'organismes eucariotes utilitzant el llevat S. cerevisiae com a model. Aquesta metodologia permet determinar quines rutes metabòliques del metabolisme central del carboni estan actives i quantificar els fluxos de metabòlits a través d'aquestes. Els resultats obtinguts han mostrat en primer lloc que les rutes metabòliques per a la biosíntesi d'aminoàcids en Pichia pastoris són essencialment les mateixes que les descrites al llevat model Saccharomyces cerevisiae. A més, s'han detectat diferències significatives a nivell del cicle dels àcids tricarboxílics i de les reaccions anapleròtiques al comparar el creixement cel·lular a les diferents condicions del cultiu (diferents substrats i diferents velocitats específiques de creixement).Aquesta metodologia pot ser emprada en un futur de manera sistemàtica en l'estudi d'altres paràmetres clau dels processos de cultiu i producció de proteïnes recombinants en llevats com Pichia pastoris, tant genètics, com ambientals, així com la caracterització dels fluxos metabòlics per a estats d'estrès fisiològics de rellevància en el disseny del procés de cultiu/expressió. / The present thesis can be framed within the Systems Biology and Metabolic Engineering research areas, i.e. in the quantitative analysis of complex biological systems. The model biological system used in this work has been the methylotrophic yeast Pichia pastoris. This organism is becoming increasingly employed as a host system for the production of a wide variety of heterologous proteins. The quantitative analysis and the mathematic modelling of cellular processes has been shown to be a very valuable tool in the area of Biotechnology and Bioengineering, both for the rational design of cellular metabolism (metabolic engineering) and for the rational design and optimization of culture processes and expression of foreign proteins.The present work has been focused on the in vivo study of the Pichia pastoris' central carbon metabolism. Growth of this yeast on glucose and other carbon sources such as glycerol or methanol involves a network of biochemical reactions (metabolic pathways) that take place in the cytoplasm and/or in different subcellular compartments (organelles).The comparison between the in vivo variations of the topology (active metabolic pathways) and the in vivo variations of the metabolic fluxes (metabolic reaction rates) of this network under different environmental conditions and different genotypes, generate important information about its behaviour and regulation.In this work, a series of chemostat cultures have been performed at different growth conditions. Chemostat cultivations allow maintaining the cells at a controlled and constant physiological state (stationary metabolic state). In this way, it was possible to study different cellular metabolic steady states corresponding to different physiological states. These were achieved by growing cells under different environmental conditions, namely different carbon sources at growth rates. The measurement of the metabolic flux variations was done experimentally using isotopic tracer techniques involving substrates labelling with 13C, combined with Nuclear Magnetic Resonance (NMR) techniques. The methodology used in this study had been previously developed for the analysis of bacterial metabolism and subsequently extended to the analysis of eukaryotic organisms using Saccharomyces cerevisiae as a model. Such methodology has been adapted to P. pastoris cells growing on glycerol and/or methanol as carbon sources, thus allowing the identification of the active metabolic pathways of the central carbon metabolism of this organism and the quantification of the flux metabolites through them.The results obtained show, first of all, that the metabolic pathways for the amino acid biosynthesis in Pichia pastoris are essentially the same as the ones described for the model yeast S. cerevisiae. In addition, significant differences were detected at the level of the tricarboxylic acids cycle (TCA) and the anaplerotic reactions when comparing the cellular growth at different culture conditions (i.e. different carbon sources and different specific growth rates).The methodology employed in this work can be useful in the future for the systematic study of the influence of other key culture parameters (genetic or environmental) to the heterologous protein production with P. pastoris. It can also be useful for the characterization of the metabolic fluxes under different physiological stress states relevant for heterologous protein expression and overall process culture design.

El objetivo fundamental de esta tesis fue valorar la utilidad de las concentraciones plasmáticas de las proteínas de fase aguda (PFAs) como biomarcadores de enfermedades e indicadores de los parámetros productivos en la especie porcina. Las PFAs son parámetros bioquímicos que incrementan su concentración en respuesta a diferentes tipos de agresiones que afectan al organismo. En la especie porcina las tres PFAs más importantes son: haptoglobina (Hp), Pig Major Acute Phase Protein (Pig-MAP) y Proteína C-reactiva (CRP). En el estudio 1 se realizó la validación de un método inmunoturbidimétrico utilizado para la determinación de CRP humana para su uso con muestras porcinas. Se concluyó que el método de humana debido a su buena precisión, al empleo de calibrador trazable y a que es fácilmente automatizable, se puede utilizar con muestras porcinas mientras no existan métodos específicos de referencia ni materiales de referencia específicos de especie. En el estudio 2 se evaluó la cinética de las concentraciones plasmáticas de Hp, CRP y Pig-MAP a lo largo de todo el ciclo productivo en una explotación porcina de engorde. No se detectaron diferencias en la concentración de estas proteínas en función del sexo y se observó que la concentración de Pig-MAP disminuye con la edad. A la semana 8 de vida se detectó una infección subclínica producida por el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) que no causó incremento de la concentración de PFAs. En cambio, al final del período de este estudio, las tres PFA incrementaron considerablemente debido a un brote clínico con problemas respiratorios graves. En el estudio 3 se determinaron los niveles de Hp y Pig-MAP en cerdos de la misma granja comercial del estudio 2 en donde a un grupo de animales se les incorporó en su dieta un inmunomodulador, los cerdos del estudio 2 sirvieron de grupo control. Los animales que recibieron en la dieta este aditivo mostraron niveles más bajos de Hp tras tres semanas de tratamiento y presentaron un mayor incremento de peso y de ganancia media diaria. Por el contrario, las concentraciones de Pig-MAP no mostraron cambios a lo largo del estudio. Las concentraciones de Hp se incrementaron en ambos grupos tras la administración de la vacuna de Aujeszky. En conclusión, este estudio demuestra que la haptoglobina en un buen biomarcador para monitorizar los parámetros productivos y la respuesta a la vacuna de Aujeszky. En el estudio 4 se llevó a cabo una infección experimental con seis cepas diferentes del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), cuatro de ellas pertenecientes al genotipo I y dos al genotipo II. Hp y CRP resultaron ser las PFAs que se incrementaron de forma más acusada tras la infección, en cambio, la concentración sérica de Pig-MAP no se alteró de forma significativa. Por último, en el estudio 5 se investigó la relación entre la presencia de lesiones pulmonares y la concentración sérica de Hp, CRP y Pig-MAP en cerdos de matadero. Los cerdos procedían de 24 granjas clasificadas en función del grado de lesión característica de pleuritis (pleuritis negativa: P-, o pleuritis positiva: P+) y de consolidación pulmonar cráneo-ventral (CVPC negativa: M- y CVPC positiva: M+) observadas en matadero. Se obtuvieron muestras de suero de 20 animales de cada granja en las que se analizaron las concentraciones de las tres PFAs. Las tres proteínas incrementaron claramente en las granjas M+, pero sólo Hp y Pig-MAP incrementaron significativamente en las P+. Los análisis ROC realizados concluyeron que la PFA que mejor discriminaba entre los grupos P+/P- y M+/M- era la Pig-MAP. / The main goal of this thesis was to evaluate the usefulness of serum concentrations of acute phase proteins (APPs) as biomarkers of disease and indicators of growth performance in pigs. The APPs are plasma protein that increase its concentration in response to different types of attacks that affect the organism. In pigs the three major APPs are: haptoglobin (Hp), Pig Major Acute Phase Protein (Pig-MAP) and C-reactive protein (CRP). Study 1 was conducted to validate an immunoturbidimetric method used for the determination of human CRP for use with porcine samples. It was concluded that the human method due to its good precision, traceable calibrator and satisfactory overlap performance, can be used with porcine samples meanwhile there is neither a reference method nor a reference material for determination of CRP in pig. In study 2, the kinetic profile of haptoglobin, C-reactive protein (CRP) and Pig-MAP were evaluated in pigs throughout the productive cycle in a fattening farm. No significant differences were observed in haptoglobin, Pig-MAP and CRP concentrations between males and females. The concentration of Pig-MAP decreased progressively until 13 weeks of age. At week 8, a PRRS virus recirculation took place but the serum concentration of any APPs did not increase. By contrast, at the end of the period of this study, all three proteins increased concomitantly to a clinical outbreak with severe respiratory problems. In study 3, the serum concentration of Hp and Pig-MAP were analyzed in a group of pigs receiving a feed additive with immunomodulatory properties. These animals were from the same commercial farm than those in study 2 and raised in parallel. For this reason, pigs of Study 2 were used as control group. Animals receiving this additive in the diet showed lower levels of Hp after three weeks of treatment and had an improvement in total body weight and average daily gain. By contrast, the concentrations of Pig-MAP were unchanged throughout the study. Hp concentrations increased in both groups after administration of Aujeszky vaccine. In conclusion, this study shows that the haptoglobin in a good biomarker to monitorize production parameters and for monitoring Aujeszky vaccine in pigs reared under standard commercial conditions. In study 4, an experimental infection was performed with six different strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), four of them belonging to genotype I and two to genotype II. Hp and CRP were found to be the APPs which increased more markedly after infection, however, the serum concentration of Pig-MAP did not change significantly. Finally, study 5 investigated the relationship between the presence of lung lesions in pigs at the slaughterhouse and serum concentration of Hp, CRP and Pig-MAP. The pigs came from 24 farms classified according to the level of pleuritis lesions (pleuritis negative: P-, or pleuritis positive: P+) and cranio-ventral pulmonary consolidation (CPVC negative: M-and CPVC positive: M+) observed in slaughterhouse. Serum samples from 20 pigs from each farm were collected and testedfor APPs. All three proteins clearly increased on farms M+, but only Hp and Pig-MAP increased significantly in the P+. ROC analysis concluded that the best APP to discriminate between groups P+ / P- and M+ / M-was Pig-MAP.

L’enzim convertidor d’angiotensina (ECA) promou la formació de l’angiotensina II (Ang-II). Contràriament, l’ECA2, una monocarboxipeptidasa que presenta un 40% d’homologia amb l’ECA, degrada l’Ang-II (accions vasoconstrictores) a angiotensina 1-7 (Ang-(1-7) (accions vasodilatadores). L’eix ECA2/Ang-(1-7) desencadena accions oposades a les de l’eix ECA/Ang-II. A nivell clínic, el tractament amb inhibidors de l’ECA i/o bloquejants dels receptors d’angiotensina en pacients amb nefropatia diabètica (ND) ha demostrat disminuir l’albuminúria i frenar la progressió cap a malaltia renal crònica (MRC). Donat aquest fet i que l’ECA2 és un regulador negatiu del sistema renina angiotensina (SRA), hipotetitzem que la manca d’ECA2 contribuirà a un augment de l’aparició de la diabetis i a una major progressió de la ND en un model experimental espontani de diabetis tipus 1, la soca no obesa diabètica (NOD). Amb aquesta finalitat s’ha generat la nova línia de ratolins NOD.ACE2-/- i els respectius controls. L’estudi de la diabetis en els animals NOD.ACE2-/- s’ha observat: 1) viabilitat, fertilitat i, fenotípicament, una alteració de la coloració del pelatge i menor pes corporal, 2) major aparició de diabetis acompanyada d’una alteració en l’homeòstasi de la glucosa i 3) augment en la sensibilitat a la insulina exògena. En l’estudi de la ND, els animals NOD.ACE2-/- mostren: 1) hipertrofia glomerular, expansió de la matriu mesangial i pèrdua podocitària sense alteracions en la filtració glomerular ni l’albuminúria, 2) menor activitat renal cortical d’ECA. En resum, la manca d’ECA2 en la soca NOD contribueix a un empitjorament en l’homeòstasi de la glucosa i de la insulina així com alteracions estructurals a nivell del glomèrul que inclouen: augment de l’àrea glomerular, expansió de la matriu mesangial i pèrdua podocitària. / Angiotensin converting enzyme (ACE) promotes angiotensin II (Ang II) formation. Conversely, ACE2, a monocarboxipeptidase that shares 40% homology with ACE, degrades promotes angiotensin 1-7 (Ang- (1-7) (vasodilator actions) formation from Ang-II (vasoconstrictor actions). ACE2/Ang-(1-7) axis actions opposite ACE/Ang-II axis actions. ACE inhibitors and/or angiotensin receptor blockers treatment in patients with diabetic nephropathy (DN) have shown to blunt albuminuria progression to chronic kidney disease (CKD). Given this and the fact that ACE2 acts as a negative regulator of the renin angiotensin system (RAS), we hypothesize that ECA2 loss contribute to an increase in diabetis development and a greater progression of DN in an experimental model of spontaneous type 1 diabetes, the non obese diabetic (NOD) mice. With this aim, we have generated a new experimental model, the NOD.ACE2-/- mice and their respective controls. The study of diabetes onset in NOD.ACE2-/- showed: 1) viability, fertility and, phenotypically, a change in coat color and lower body weight, 2) higher diabetis incidence accompanied by altered glucose homeostasis and 3) increase in exogenous insulin sensitivity. Within the DN study, NOD.ACE2-/- mice showed: 1) glomerular hypertrophy, mesangial matrix expansion and podocyte loss without changes in glomerular filtration rate nor albuminuria, 2) lower renal cortical activity.In summary, loss of ACE2 in the NOD strain contributes to a glucose homeostasis and insulin impairment involving structural alterations within the glomerulus, including: increased glomerular area, mesangial matrix expansion and podocyte loss.

Tesi realitzada al Centro de Investigaciones Biológicas (CIB - CSIC) / En algunos organismos Archaeas, la vía glicolítica presenta modificaciones entre las que destaca las enzimas quinasas que fosforilan glucosa y fructosa 6-fosfato utilizando ADP en vez de ATP como dador de grupo fosforilo. Estas enzimas pertenecen a la superfamilia riboquinasa, puntualmente a la familia de quinasas dependientes de ADP, y están conformadas por un dominio menor y un dominio mayor el cual presenta un plegamiento tipo riboquinasa, común a todos los miembros esta superfamilia. La mayoría de estas quinasas han sido descritas en arqueas hipertermófilas como Thermococcus litoral (TlGK), metanogénicas bifuncionales, con actividad glucoquinasa (GK) y fosfofructoquinasa (PFK), de Methanococcus jannaschii o Methanococcus maripaludis, aunque también se han encontrado en organismo eucariontes como humano y ratones. En esta tesis se estudió la enzima glucoquinasa de TlGK como modelo de una quinasa hipertermófila dependiente de ADP pata conocer los determinantes estructurales en el mecanismo cinético y la especificidad por ADP o ATP mediante cristalografía de rayos –X y estudios cinética enzimática. Los resultados confirmaron que la TlGK experimenta cambios en su conformación como consecuencia de la unión de sus ligandos demostrado en las estructuras de la proteína, donde se distinguió que la proteína en su forma apo (2.0 Å) presenta una mayor distancia entre sus dominios (conformación abierta), mientras que en la estructura en complejo ternario (2.5 Å) esta distancia se reduce mostrando una estructura cerrada. Estos resultados se relacionan con el mecanismo cinético ordenado en secuencia, donde la unión de MgADP, induce el primer cambio conformacional en la enzima, seguido por la unión de glucosa provocando el cierre de los dominios de la enzima. Dichos cambios conformacionales son estabilizados por una serie de interacciones que se coordinan entre los dominios menor y mayor. La especificidad por el nucleótido fue evaluada generando una versión permutante de la TlGK (perGK), que imita la topología de la región β-meandro de las quinasas dependientes de ATP, que constituye casi por completo el sitio de unión del nucleótido. Los resultados indican que la enzima perGK utiliza ADP, en vez de a ATP como dador de grupo fosforilo, revelando que la permutación no es suficiente para el cambio en la especificidad del nucleótido. Estudios cinéticos señalan que el mecanismo de perGK es ordenado en secuencia, no obstante, el orden de unión de los sustratos varió, respecto a lo observado para la enzima TlGK. Estos cambios fueron apoyados con las estructuras cristalinas de la proteína perGK en su forma apo (2.14 Å), en complejo con glucosa (1.95 Å) y el complejo ternario (2.44 Å), generadas por cristalografía de rayos-X, donde se infiere que la enzima perGK sufre un cambio en su conformación luego que se une glucosa, no así con la unión de MgADP, en claro contraste con TlGK. Por tanto, este cambio en la topología, posiblemente, haya sido uno de los cambios estructurales que experimentaron estas enzimas, de la superfamilia de riboquinasas, a lo largo de su historia evolutiva para transformarse a quinasas dependientes de ADP. La enzima dependiente de ADP, MjPfk/GK, que posee las dos actividades PFK y GK en la misma cadena polipeptidica, es la única enzima caracterizada de este tipo del orden de las Methanococcales, por lo que se desconoce si este carácter bifuncional de la enzima es un rasgo particular de MjPfk/GK, o si es una característica común de los miembros de este orden. En este estudio se determinó que el mecanismo cinético de la enzima MjPfk/GK es secuencial para ambas reacciones, y solo tiene la capacidad de fosforilar glucosa y fructosa-6-fosfato, siendo muy específica de la vía glicolítica. Además, se confirmó que la enzima fosfofructoquinasa del mesófilo M. maripaludis presenta actividad GK además de actividad PFK sugiriendo que este carácter bifuncional sea un rasgo compartido por otras enzimas homologas del orden Methanococcales. Finalmente, se dilucidó que la actividad GK en ambas enzimas bifuncionales se ve afectada por las concentración libre de Mg2+ y AMP, lo que nos lleva a pensar que estos metabolitos pueden ser claves para promover la vía glicolítica actuando como un sensor de la disponibilidad de energía celular aportada por ADP o ATP. / In some Archaea, the glucose degradation proceeds through a modified version of glycolytic pathway where phosphorylation of glucose and fructose 6-phosphate is performed by kinases that use ADP instead ADP as phosphoryl donor. These enzymes belong to ribokinase superfamily due to share ribokinase folding type. Also these enzymes are found in Archaea from Thermococcales and Methanococcales orders. In these studies we reported that the glucokinase of T.litoralis (TlGK) undergoes changes in its conformation due to the binding of its ligands shown in the structures of the protein in the absence and presence of their ligands. These structural changes are relate to sequentially ordered kinetic mechanism, where MgADP binding induces the firth conformational change, followed by binding of glucose, causing the approach of the domains of the enzyme. These conformational changes are stabilized by a series of interactions that are coordinated between the smallest and largest domains. Also, it was revealed that the permutation in the β- meander regions of TlGK, which is almost entirely the nucleotide binding site, is not sufficient to change the specificity of the nucleotide. The kinetic studies indicated that the kinetic mechanism perGK is ordered in sequence, however, the order of binding of the substrates varied with respect to that observed for the enzyme TlGK. These changes were supported by the crystal structures of the perGK protein in their apo form, with glucose and the ternary complex, generated by crystallography X-rays. Therefore, this change in topology possibly has been one of the structural changes experienced by these enzymes, riboquinasas superfamily, along their evolutionary history to transform ADP-dependent kinases. On the other hand, we study on the ADP-dependent MjPfk/GK kinase, which owns both phosphofructokinase and glucokinase activity in the same polypeptide chain, it was determined that the enzyme has a sequential mechanism for both reactions and that this enzyme is specific for glucose and fructose 6P, being highly specific in the glycolytic pathway. Furthermore, it was confirmed that the enzyme phosphofructokinase mesophyll M. maripaludis GK also has activity PFK activity suggesting that this bifunctional character is shared by other homologous enzymes enforcement Methanococcales order. Finally, it was elucidated that the GK activity in both bifunctional enzyme is affected by the free concentration of Mg2 + and AMP, which leads us to believe that these metabolites may be key to promoting glycolytic pathway acting as a sensor of energy availability cell provided by ADP or ATP.

En aquesta tesi he investigat diversos camps de la biologia que podrien englobar-se en la disciplina general dels sistemes no lineals de replicadors. Els treballs presentats en aquesta tesis investiguen diversos fenomens dinàmics i processos evolutius per virus de RNA, pels anomenats hipercicles i per models generals de replicadors antagonistes. Específicament he investigat les anomenades quasiespècies, utilitzades per a modelitzar poblacions de RNA. Els treballs sobre hipercicles exploren diversos fenomens previs a l'origen de la vida i a l'aparició de la primera cèl.lula vivent. Mitjançant models ecològics com també utilitzant diferents eines computacionals he estudiat l'anomenada hipòtesi de la Reina Roja per entitats replicadores simples amb mutació. Aquests estudis tenen un interès en el contexte de l'evolució prebiòtica i l'ecologia teòrica. / In this thesis I have investigated several fields of biology that can be classified in the general subject of replicator nonlinear systems. The works presented in the thesis investigate several dynamical phenomena and evolutionary processes for RNA viruses, for hypercycles and for general models on antagonistic replicator dynamics. I have specifically investigated the dynamics of so-called quasispecies, used for the modelization of RNA populations. The works on hypercycles explore several phenomena related to previous events to the origin of life and to the appearance of the first living cell. By means of some ecologically-based mathematical models as well as of some computational models we also investigate the so-called Red Queen hypothesis for small, replicating-mutating entities. These studies are of interest in the context of prebiotic evolution and theoretical ecology.

El càncer és una malaltia dinàmica durant la qual les cèl·lules proliferen, es diferencien i migren accedint a programes genètics i epigenètics reminiscents de l’embriogènesis. Aquest procés està dirigit per la comunicació bidireccional entre les cèl·lules cancerígenes i el microambient tumoral que està format per una matriu extracel·lular (ECM) tridimensional (3D) i cèl·lules de l’estroma, incloent fibroblasts, cèl·lules del sistema immune i del sistema vascular. Moltes biomolècules i enzims (ex. citoquines, factors de creixement i proteases) són contínuament secretades per les cèl·lules cancerígenes i de l’estroma, influenciant-se entre elles i modificant l’estructura i composició de l’ECM. Aquests canvis ambientals provoquen plasticitat i heterogeneïtat cel·lular. En el camp d’enginyeria de teixits, els investigadors intenten deconstruir el microambient tumoral en models cel·lulars 3D més simples i predictius que permetin analitzar el paper de senyals químics, mecànics i/o físics en la progressió de la malaltia. L’etapa més crítica de la progressió tumoral és la invasió i metàstasis, la qual provoca aproximadament el 90% de morts de càncer. Durant la present tesis, es van desenvolupar models 3D per recapitular la transició des d’un microambient 2D a un 3D que experimenten les cèl•lules cancerígenes quan s’escapen de la monocapa epitelial i envaeixen el teixit connectiu mesenquimal. Els experiments van demostrar que els cultius 3D van ser capaços de trencar l’organització epitelial, induint diferents fenotips tipus-mesenquimal dependent de la composició i rigidesa de la matriu. Per tant, les cèl·lules mostraven capacitat per adaptar-se a entorns canviants. A més, els cultius 3D provocaven la disminució de l’expressió de l’E-cadherina, suggerint la dissociació de les adhesions epitelials cèl·lula-cèl·lula i la conseqüent activació dels primers estadis de la transició epitelial-mesenquimal. Aquest patró d’expressió estava molt influenciat per la presencia i concentració dels motius d’unió de la ECM. Els mecanismes de regulació d’E-cadherina es van caracteritzar a nivell epigenètic i transcripcional. Els cultius 3D també poden contribuir al descobriment i avaluació terapèutica de nous tractaments anti-cancerígens. Part d’aquesta tesis es va focalitzar en investigar la teràpia fotodinàmica. En concret, els cultius 3D van emergir com valuoses plataformes per processos de cribratge de fotosensibilitzadors ja que van aconseguir recrear els gradients moleculars del fàrmac i l’oxigen. Aquestes condicions van crear un microambient protector per les cèl·lules localitzades en la part interior central del cultiu, causant una baixa eficàcia terapèutica i, per tant, mimetitzant les limitacions actuals de la pràctica clínica. En una altra part de la tesis, es va estudiar l’activitat de fàrmacs anti-cancerígens dirigits a inhibir determinats receptors de tirosina quinases. Els resultats van evidenciar que les cèl·lules desenvolupaven diferents estratègies de supervivència per escapar-se o evadir de l’efecte dels fàrmacs depenent de la composició de la matriu. Es va formular la hipòtesis que la ECM podia proporcionar a les cèl·lules accés a una gran i redundant xarxa de cascades de senyalització que complementaven l’activitat dels receptors bloquejats. Per tant, les cèl·lules cancerígenes presentaven un comportament adaptatiu sostingut gràcies al dinàmic i complex microambient tumoral. Aquesta sèrie de descobriments reforçava la necessitat de desenvolupar cultius 3D per estudiar els mecanismes de resistència dels fàrmacs. / El cáncer es una enfermedad dinámica en la cual las células proliferan, se diferencian y migran accediendo a programas genéticos y epigenéticos reminiscentes de la embriogénesis. Este proceso está dirigido por la comunicación bidireccional entre las células cancerígenas y el microambiente tumoral que está formado por una matriz extracelular (ECM) tridimensional (3D) y células del estroma, incluyendo fibroblastos, células del sistema inmune y células del sistema vascular. Muchas biomoléculas y enzimas (ej. citoquinas, factores de crecimiento y proteasas) son continuamente secretadas por las células cancerígenas y del estroma, influenciándose entre ellas y modificando la estructura y composición de la ECM. Esta serie de cambios ambientales provocan plasticidad y heterogeneidad celular durante el cáncer. En el campo de la ingeniería de tejidos, los investigadores intentan deconstruir el complejo microambiente tumoral en modelos celulares 3D más simples y predictivos con el objetivo de analizar el papel específico de señales químicas, mecánicas y/o físicas en la progresión de la enfermedad. La etapa más crítica de la progresión tumoral es la invasión y metástasis, la cual provoca aproximadamente el 90% de muertes. Durante la presente tesis, se desarrollaron modelos 3D para recapitular la transición desde un microambiente 2D a uno 3D que experimentan las células cancerígenas cuando se escapan de la monocapa epitelial e invaden el tejido conectivo mesenquimal. Los experimentos demostraron que los cultivos 3D eran capaces de romper la organización epitelial, induciendo diferentes fenotipos tipo-mesenquimales dependiendo de la composición y rigidez de la matriz. Por lo tanto, las células mostraban capacidad para adaptarse a entornos cambiantes. Los cultivos 3D provocaban la disminución de la expresión de la E-cadherina, sugiriendo la disociación de las adhesiones epiteliales célula-célula y la activación de los primeros estadios de la transición epitelial-mesenquimal. Este patrón de expresión estaba influenciado por la presencia y concentración de motivos de unión de la ECM. Los mecanismos de regulación de E-cadherina se caracterizaron a nivel epigenético y transcripcional. Los cultivos 3D también pueden contribuir al descubrimiento y evaluación terapéutica de nuevos tratamientos. Parte de esta tesis se focalizó en investigar la terapia fotodinámica. Los cultivos 3D emergieron como valiosas plataformas en procesos de cribado de fotosensibilizadores ya que pudieron recrear los gradientes moleculares de fármaco y el oxígeno. Estas condiciones crearon un microambiente protector para las células localizadas en la parte interior central del cultivo, causando una baja eficacia terapéutica y, por lo tanto, mimetizando las limitaciones actuales de la práctica clínica. En otra parte de la tesis, se estudió la actividad de fármacos anticancerígenos dirigidos a inhibir determinados receptores de tirosina quinasas. Los resultados evidenciaron que las células desarrollaron distintas estrategias de supervivencia para escaparse o evadir el efecto de los fármacos dependiendo de la composición de la matriz. Se formuló la hipótesis que la ECM podía proporcionar a las células acceso a una gran y redundante red de cascadas de señalización que complementan la actividad de los receptores bloqueados. Por lo tanto, las células cancerígenas presentaron un comportamiento adaptativo sostenido gracias al dinámico y complejo microambiente tumoral. Estos descubrimientos reforzaban la necesidad de desarrollar cultivos 3D para estudiar los mecanismos de resistencia a los fármacos. / Cancer is a dynamic disease in which cells proliferate, differentiate and migrate by accessing to reminiscent genetic and epigenetic programs of embryogenesis. This process is driven by the crosstalk between cancer cells and tumor microenvironment, which comprises a three-dimensional (3D) extracellular matrix (ECM) and stroma cells including fibroblasts, vasculature and immune system cells. Effector biomolecules and enzymes (e.g. cytokines, growth factors and proteases) are continuously secreted by cancer and stroma cells, influencing each other and modifying the structure and composition of ECM. These environmental changes lead to cell plasticity and heterogeneity during cancer. In tissue engineering field, researchers try to deconstruct this complex tumor microenvironment into simpler and predictable 3D cell models in order to analyze the role of specific chemical, mechanical and/or physical signals in disease progression. The most critical tumor stage is local invasion and metastasis, which accounts for approximately 90% of all cancer deaths. In the present thesis, 3D cell models were developed to recapitulate the transition from a 2D to a 3D milieu that cancer cells experience when they escape from epithelial layer and invade mesenchymal connective tissue. Experiments revealed that 3D cultures compromised epithelial organization, inducing different mesenchymal-like phenotypes depending on composition and stiffness of scaffold. Therefore, cells showed the capacity to adapt to changing microenvironmental conditions. Moreover, 3D cultures induced E-cadherin downregulation, suggesting the disruption of epithelial cell-cell adhesions and the activation of early stages of epithelial to mesenchymal transition. Its expression pattern was influenced by the presence and concentration of ECM binding motifs. E-cadherin regulatory mechanisms were characterized at epigenetic and transcriptional level. 3D cultures can also help in the discovery and therapeutic assessment of cancer medicines. Part of this thesis work was focused in photodynamic therapy research. In particular, 3D cultures emerged as powerful platforms for photosensitizers screening processes since they could recreate molecular gradients for drug and oxygen. These conditions induced the development of a protective microenvironment for cells located in the core of the culture, accounting for the low therapeutic efficacy found in clinical practice. In a different part of the thesis, cancer drugs targeted to inhibit receptor tyrosine kinases activity were studied. Significantly, results evidenced that cells developed different survival strategies to evade or escape from drugs action depending on the composition of scaffold. We hypothesized that ECM could provide cells with access to a large and redundant spectrum of signaling pathways, complementing the activity of the blocked cellular receptors. Therefore, cancer cells presented an adaptive behavior supported by the dynamic and complex tumor microenvironment. These findings reinforced the necessity to develop 3D cultures to study cell resistance mechanism.

El conjunt de treballs duts a terme en aquesta tesi tenen per objectiu aprofundir en els mecanismes bioquímics de la comunicació feromonal dels insectes, agafant com a model els lepidòpters nocturns i estudiant-ne tant els aspectes que concerneixen la biosíntesi de llurs feromones com els relacionats amb la seva detecció. Tot i que ambdós processos (biosíntesi i detecció) estan estretament relacionats, s'ha considerat convenient dividir la tesi en dos capítols diferenciats. Així, després d'una introducció general i un capítol de metodologia comú, es presenta un primer capítol destinat a l'estudi d'enzims biosintètics i un segon destinat a l'estudi dels enzims responsables del metabolisme de la feromona un cop aquesta ha activat el receptor olfactiu. Els treballs duts a terme en el primer capítol formen part de la participació del grup en el projecte “Biosynthetic Infochemical Communication” (iCHEM, contracte EC: FP6-032275). L'objectiu del projecte era el disseny i implementació d'un dispositiu artificial capaç de mimetitzar la comunicació química dels insectes, agafant com a organisme model l'arna S. littoralis. La participació del nostre grup en el projecte es va centrar en el disseny i la implementació del dispositiu emissor, que pretenia reproduir una part de la ruta biosintètica de la feromona mitjançant la immobilització dels enzims biosintètics en un microreactor. Més enllà d'aquest propòsit, però, es va considerar interessant identificar els ortòlegs de l'insecte utilitzat com a model, la “S. littoralis”, i estudiar la seva influència en la proporció final dels compostos feromonals. Dels enzims de la ruta biosintètica que han estat postulats com a principals responsables de la proporció dels compostos feromonals, la reductasa d'àcids grassos i l'alcohol acetil transferasa no havien estat encara identificats en “S. littoralis” i se'n disposava d'escassa informació en altres insectes. Per aquest motiu es va considerar interessant centrar l'atenció en aquests dos enzims, que d'altra banda eren també els més rellevants per a l'assoliment dels objectius del projecte iCHEM. En el segon capítol es descriuen els treballs duts a terme amb l'objectiu d'aprofundir en el coneixement de les esterases antenals de lepidòpters nocturns, potencialment implicades en la finalització de l'estímul provocat per la feromona. Per a la realització d'aquests estudis es van escollir dues arnes de la família “Noctuidae”. La primera d'elles, “S. nonagrioides”, constitueix una important plaga dels conreus del blat de moro. La utilització d'inhibidors d'esterases havia resultat prometedora en assajos “in vitro” utilitzant homogeneïtzats de l'antena, així com en assajos d'electrofisiologia duts a terme pel grup (Quero et al. 2003; Quero et al. 2004), però l'absència d'una major informació sobre els enzims diana limitava la millora i optimització d'aquestes molècules amb activitat inhibidora. Pel que fa a la segona espècie escollida (“S. littoralis"), a més de constituir una important plaga arreu del món, oferia l'avantatge de poder ésser criada fàcilment en captivitat, així com el fet de disposar d'abundant informació sobre la seva biologia. Les tasques d'identificació i caracterització d'esterases en les dues espècies es va dur a terme en paral•lel, però degut a les diferències en la quantitat d'informació disponible sobre les dues arnes, es va considerar interessant utilitzar estratègies diferents per a cada insecte. / The set of works presented in this thesis aim to deepen the biochemistry of pheromone communication in insects, taking the moth as a model and investigating the biochemistry aspects of both pheromone biosynthesis and pheromone degradation. Although biosynthesis and degradation are closely related in pheromone biology, the thesis has been divided in two different chapters, the first one concerning the enzymes involved in pheromone biosynthesis and the second one concerning the antennal esterases, involved in pheromone degradation of many moth species. The tasks carried out in the first chapter were part of the European project “Biosynthetic Infochemical Communication” (iCHEM, contract EC: FP6-032275). The main role of our group in the iCHEM project was the implementation of an artificial pheromone emitter, that attempted to reproduce part of the biosynthetic route of the pheromone through the immobilization of biosynthetic enzymes in a microreactor. However, beyond this aim, it was considered to be interesting the identification of the orthologues enzymes of “S. littoralis”, and to study the influence of these enzymes in the final proportion of the pheromonal compounds. To this end, the most interesting enzymes of the biosynthetic pathway were selected for DNA isolation, recombinant expression of the protein and biochemical characterisation of the obtained enzyme. The second chapter describes the work carried out in order to deepen the knowledge of antennal esterases of moth, potentially involved in the termination of the stimulus caused by the pheromone. To this end, two moths of Noctuidae family were chosen. The first one, “Sesamia nonagrioides”, is an important pest of corn crops. The use of inhibitors of esterases had promising results “in vitro” assays previously performed using antenna homogenized, however the absence of further information on the target enzymes limited the improvement and optimization of these molecules with inhibitory activity. The second chosen species, “S. littoralis”, besides being a major pest worldwide, offered the advantage of being easily raised in captivity and the availability of abundant information about its biology. The tasks of identification and characterization of esterases in the two species was carried out in parallel, but due to the differences in the information available about two moths, it was considered interesting to use different strategies for each insect.