Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Texto parcialmente liberado pelo autor. / Submitted by samara castro (sammy_roberta7@hotmail.com) on 2010-10-09T18:16:28Z No. of bitstreams: 1 2006-Alverne Passos Barbosa.pdf: 23453 bytes, checksum: 182320723b268eef364d5240cb8f3322 (MD5) / Approved for entry into archive by Carolina Campos(carolinacamposmaia@gmail.com) on 2010-10-11T15:06:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006-Alverne Passos Barbosa.pdf: 23453 bytes, checksum: 182320723b268eef364d5240cb8f3322 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-11T15:06:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006-Alverne Passos Barbosa.pdf: 23453 bytes, checksum: 182320723b268eef364d5240cb8f3322 (MD5) Previous issue date: 2006-09-28 / Lagochilascaris minor (Leiper, 1909) um ascarídeo descrito há quase um século, é o agente etiológico da lagochilascariose humana, uma helmintose emergente, de caráter crônico e às vezes fatal, para a qual ainda não há tratamento satisfatório. Este parasito tem notável capacidade migratória por tecidos do hospedeiro, realizando verdadeiros túneis nos tecidos envolvidos. Neste estudo, a larva de 3o estádio (L3) de L. minor migrou da luz intestinal para musculatura esquelética e tecido subcutâneo de camundongos experimentalmente infectados, atravessando mucosa, membranas basais dos vasos e parênquimas hepático e pulmonar. No hospedeiro definitivo, o parasito realizou incursões pelo tecido de pacientes promovendo tumorações nas regiões retroauricular e cervical, bem como lesões osteolíticas no ouvido médio, mastóide, sistema nervoso central e coluna cervical. Enzimas proteolíticas de helmintos podem facilitar a invasão, migração, evasão da resposta imune, o acesso a nutrientes e o desenvolvimento do parasito no organismo do hospedeiro. A atividade de metaloproteases dos produtos de excreção/secreção (ES) de L3 de L. minor foi avaliada por SDS-PAGE que revelou duas atividades gelatinolíticas principais. A atividade proteolítica ótima ocorreu em pH neutro/alcalino e estava associada à presença de metaloproteases de 59 (SM59Lm) e 114 (SM114Lm) kDa. Posteriormente, os produtos de ES hidrolisaram fibrinogênio e colágeno tipo I em pH neutro, mas não degradaram BSA. Além disto, foi demonstrado que metaloproteases presentes em produtos de ES hidrolisam a estrutura de tripla hélice de fibras de colágeno tipo I (colágeno nativo) presentes em mesentério de camundongo. Estes resultados sugerem que metaloproteases de produtos de ES de L3 podem facilitar a migração de L. minor por tecidos do hospedeiro, através da hidrólise do colágeno da matriz extracelular além de promover a evasão dos mecanismos hemostáticos do hospedeiro, através da degradação do fibrinogênio. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Lagochilascaris minor (Leiper, 1909), an ascarid described almost a century ago, is the causative agent of human lagochilascariosis, an emergent helminthiasis often chronic and sometimes fatal, for which efficacious therapy is not available. This parasite has an impressive migrating capacity through host tissues and its pathways may become real tunnels in the infected tissues. In this study, third stage larvae (L3) of L. minor migrated from intestinal lumen to skeletal muscles and subcutaneous tissues of experimentally infected mice, crossing mucosa, basal membranes of vessels, hepatic and pulmonary parenchyma. In the definitive host, the parasite migrated through patient tissues promoting tumors in the cervical and retroauricular areas and osteolytic lesions in the middle ear, mastoid, central nervous system and cervical spine. Proteolytic enzimes of helminths can facilitate invasion, migration, evasion from immune response, nutrition and parasite development in the host. The activities of metalloprotease in excretory/secretory (ES) products from L3 of L. minor were evaluated by SDS-PAGE, which showed two major gelatinolytic activities. Optimal proteolytic activity was found to occur at neutral/alkaline pH and was associated with two L. minor-secreted metalloproteases of 59 (SM59Lm) and 114 kDa (SM114Lm). It was next showed that ES products of L3 were able to hydrolyze fibrinogen and collagen I at neutral pH, but not BSA. Furthermore, it was demonstrated that ES products of L3 mediate hydrolysis of the triple helical structure of collagen I fibers in mouse mesentery. These results suggest that ES proteases of L3 might facilitate both L. minor migration through host tissues by hydrolyzing collagens of the extracellular matrix and evasion from host hemostatic mechanisms by degrading fibrinogen.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by samara castro (sammy_roberta7@hotmail.com) on 2010-11-20T00:21:50Z No. of bitstreams: 1 2006-Tereza Cristina Vieira de Rezende.pdf: 3693859 bytes, checksum: 931204476ebc225e7238b8afde44e9c0 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-12-03T00:40:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006-Tereza Cristina Vieira de Rezende.pdf: 3693859 bytes, checksum: 931204476ebc225e7238b8afde44e9c0 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-12-03T00:40:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006-Tereza Cristina Vieira de Rezende.pdf: 3693859 bytes, checksum: 931204476ebc225e7238b8afde44e9c0 (MD5) / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico agente causador da paracoccidioidomicosse (PCM), uma micose que afeta 10 milhões de indivíduos na América Latina. A infecção é adquirida pela inalação de propágulos aéreos produzidos pela forma miceliana do fungo, os quais se convertem à morfologia leveduriforme na temperatura do hospedeiro. P brasiliensis expressa in-vivo importantes genes que podem contribuir para a patogênese do fungo. Nós utilizamos a tecnologia do antígeno induzido in-vivo (IVIAT) para identificar novos genes de P. brasiliensis que podem ser expressos durante o processo de infecção. A técnica IVIAT é uma modificação do rastreamento imunológico que evita o uso de modelo animal e permite a identificação de antígenos expressos em vários estágios da infecção. Nós utilizamos a estratégia de IVIAT para identificar genes possivelmente induzidos in-vivo. Usando esta técnica nós selecionamos proteínas imunogênicas que poderiam ser expressas especificamente durante a infecção e não durante o crescimento sob condições padrões do laboratório. O soro de onze pacientes com PCM obtidos em Goiânia, foram combinados e, em seguida, adsorvidos com extratos de células totais e lisados de células leveduriformes cultivadas in-vitro. Esses soros foram utilizados para rastrear proteínas de uma biblioteca de cDNA da fase leveduriforme de P. brasiliensis construída no vetor ZAPII. Clones foram obtidos e caracterizados. O cDNA que codifica para uma proteína de 174 resíduos de aminoácidos foi caracterizado como lumazina sintase (PbLS) de P.brasiliensis (GenBank: DQ081183). Análises comparativas entre a PbLS e outros organismos foram feitas. Essa proteína catalisa o penúltimo passo na síntese de riboflavina em plantas, fungos e bactérias. Para produzir anticorpos contra a PbLS recombinante, uma construção no pGEX-4T-3-LS foi realizada e introduzida dentro das células de Escherichia coli e a expressão e purificação da proteína recombinante foi obtida. A análise da reatividade imunológica da proteína recombinante mostrou que esta é reconhecida por soros de pacientes com PCM e não é reativa com soros de indivíduos controle. Para analisarmos a expressão do gene Pbls nas duas formas de P.brasiliensis utilizamos a técnica RT-PCR semiquantitativo. Os transcritos para LS foram preferencialmente expressos na forma leveduriforme do fungo. Pneumócitos humanos infectados com P.brasiliensis foram utilizados para investigar a expressão dos transcritos num modelo de infecção. O gene Pbls foi detectado em células de pneumócitos humanos infectados com células leveduriformes. A LS representa um alvo atrativo para o desenvolvimento de drogas contra patógenos, visto que, bactérias, fungos e plantas são dependentes da síntese endógena da vitamina B2. Estudos mostram que a LS recombinante são fortemente imunogênicos e elucidam resposta immune celular e humoral, conferindo proteção em camundongos. Esses dados são muito interessantes e despertam o interesse em se estudar essa proteína do fungo P. brasiliensis. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis is a thermally dimorphic fungus causing paracoccidioidomycosis (PCM), a mycosis that affects 10 million individuals in Latin America. The infection is acquired by inhaling airborne propagules produced by the fungal mycelium which transforms into the pathogenic yeast form, when at the body temperature. P brasiliensis expresses invivo many important virulence genes that may contribute to the overall fungus pathogenesis. We utilized in vivo-induced antigen technology (IVIAT) to identify new P. brasiliensis antigens that could be expressed during the infection process. IVIAT is a modified immunoscreening that circumvents the need for animal models and permits identification of antigens expressed at various stages of infection. We used the IVIAT strategy to identify P. brasiliensis genes putatively induced in vivo. Using this technique we selected immunogenic proteins which should be expressed specifically during human infection and not during growth under standard laboratory conditions. Sera from eleven patients with PCM infection obtained in Goiânia were pooled and after that were adsorbed with whole cells and lysates of the in vitro cultured yeast phase. These sera were probed to induced proteins from a cDNA expression library of the yeast phase of P. brasiliensis constructed in ZAPII. Clones were obtained and characterized. Of special note is a cDNA (Pbls) encoding a 174 amino acid residues protein characterized as lumazine synthase (PbLS) homologue of P.brasiliensis (GenBank: DQ081183).This protein catalyzes the penultimate step in the synthesis of riboflavin in plants, fungi, and microrganisms. In order to produce antibodies against the recombinant PbLS the expression construct pGEX-4T-3-LS was introduced into Escherichia coli cells and the expression and purification of the recombinant protein was obtained. The analysis of the immunological reactivity of the recombinant protein showed that this is recognized by sera of patients with PCM and is not reactive with sera of control individuals. To analyze the expression of the Pbls gene in the two forms of P.brasiliensis we use semiquantitative RT-PCR. The transcripts for LS had been preferentially expressed in the yeast form of fungus. Human pneumocytes infected with P.brasiliensis had been used to investigate the expression of transcripts in an infection model. The Pbls gene was detected in yeast cells infecting human pneumocytes. The lumazine synthase represents an attractive targets for the development of drugs against pathogens, since bacteria, fungus and plants are dependent of the endogenous synthesis of the B2 vitamin. Studies shown that recombinant lumazine synthase is strongly immunogenic and elicits both humoral and cellular immune responses confering protection in mice. Those data make very interesting the study of this protein in P. brasiliensis.

Tese (Doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2011-01-18T15:53:22Z No. of bitstreams: 1 2010_AisyBotegaBaldoni.pdf: 10671243 bytes, checksum: fe25bfcdd42b951cc586871607af283e (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-01-19T00:42:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_AisyBotegaBaldoni.pdf: 10671243 bytes, checksum: fe25bfcdd42b951cc586871607af283e (MD5) / Made available in DSpace on 2011-01-19T00:42:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_AisyBotegaBaldoni.pdf: 10671243 bytes, checksum: fe25bfcdd42b951cc586871607af283e (MD5) / A mamona (Ricinus communis L.) é uma oleaginosa de grande importância social e econômica. O óleo extraído de suas sementes é utilizado na produção de biodiesel e como insumo para as indústrias químicas, de cosméticos e de lubrificantes. Além do óleo extraído das sementes, sua cadeia produtiva gera subprodutos, especialmente a torta de mamona, que pode ser utilizada como adubo orgânico de boa qualidade (alta concentração de nitrogênio) ou como alimento animal (alta concentração de proteína). O principal entrave de seu uso como alimento animal é a ricina, uma proteína altamente tóxica, encontrada na semente. A ricina é uma lectina, composta por duas subunidades conhecidas como cadeias A e B. Quando ingerida a cadeia B liga-se à galactose na superfície celular, fazendo com que a proteína penetre na célula. Dentro da célula, a cadeia A, que possui atividade enzimática, inativa a subunidade 60S do ribossomo impedindo a produção de proteínas, levando a célula à morte. Os objetivos desse trabalho foram: avaliar a existência de variabilidade genética para concentração de ricina em sementes de mamona de 20 acessos do banco de germoplasma da Embrapa; estudar a distribuição e acúmulo de ricina durante o desenvolvimento da semente de mamona na cultivar BRS Energia; e realizar a transformação genética visando o silenciamento dos genes que codificam para a ricina em sementes de mamona geneticamente modificadas. Para tanto, foram utilizadas técnicas de ELISA (Enzymelinked immunosorbent assay) para a quantificação da ricina nos extratos protéicos totais das sementes, análises imunocitoquímicas, utilizando microscopia de luz e eletrônica para a localização da ricina nas células do endosperma da semente e transformação genética por biobalística visando o silenciamento dessa proteína na semente de mamona, utilizando a metodologia de RNA interferente. Os resultados obtidos mostraram a existência de variabilidade para a concentração de ricina nos acessos do banco de germoplasma da Embrapa Algodão, sendo possível a seleção de genótipos com alto e baixo teor de ricina. As cultivares comerciais IAC Guarani, BRS Nordestina e BRS Paraguaçu apresentaram as menores concentrações de ricina, sendo, as mais indicadas para trabalhos de melhoramento visando à utilização da torta como ração animal. Dentre as cultivares comerciais, a BRS Energia apresentou o valor mais elevado na concentração dessa proteína. Durante o desenvolvimento das células do endosperma da semente de mamona da cultivar BRS Energia ocorreu um aumento no número de vesículas de reserva (vacúolos de armazenamento de proteínas e corpos lipídicos) e diminuição do volume citoplasmático celular. O acúmulo de ricina na cultivar BRS Energia aumentou com o desenvolvimento da semente, sendo que na semente madura (60DAP) essa concentração foi máxima. A ricina pode ser encontrada também nos cristalóides dos vacúolos de armazenamento de proteínas (PSV) e não só na matriz, contrariando observações bioquímicas anteriores em que os componentes protéicos foram encontrados apenas compartimentalizados dentro dos corpos protéicos. Na etapa relacionada à transformação genética da mamona, em cultura de tecidos, o regulador TDZ foi mais eficiente na indução de brotações que o BAP. A adição ao meio de cultura de IBA e AgNO3 foi importante para o alongamento das brotações e enraizamento dos explantes. O uso de biorreatores visando o alongamento dos explantes foi eficiente por curtos períodos. É possível obter plantas geneticamente modificadas de mamona usando imazapir como agente seletivo. O sistema de transformação genética por biobalística apresentou eficiência similar a outros sistemas de transformação de mamona. Assim, no presente trabalho, além de estudar a variabilidade para a concentração de ricina em diferentes genótipos, foi possível identificar seu acúmulo durante o desenvolvimento da semente de mamona. Foram obtidas também plantas transgênicas, que deverão ser analisadas para confirmar a redução total ou parcial da ricina, bem como avaliar em seus descendentes a herança do silenciamento. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Castor bean (Ricinus communis L.) is an oilseed of great economic and social importance. The oil extracted from its seeds is used in biodiesel production and as raw material for chemicals, cosmetics and lubricants. Besides the oil extracted from the seeds, their production chain generates side-products, which can be used as organic fertilizer of good quality (high nitrogen concentration) or as animal food (with high protein content). The main obstacle to its use for animal feeding is ricin, a highly toxic protein, found in the seed. Ricin is a lectin composed of two subunits known as chains A and B. When ingested, the B chain binds to galactose on the cell surface, penetrating into the cell. Inside the cell, the A chain, which has enzymatic activity, inactivates the 60S subunit of the ribosomes preventing the production of proteins, leading to cell death. The objectives of this study was (1) to assess the existence of genetic variability for the concentration of ricin in castor bean seeds from 20 accessions of germplasm bank of Embrapa, (2) study the distribution and accumulation of ricin during seed development, and (3) perform genetic transformation aimed at silencing the genes coding for ricin in genetically modified castor bean seeds. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) was used to quantify ricin in total protein extracts of seeds, immunocytochemical analysis using light and electron microscopy for the localization of ricin in cells of the endosperm of the seed and genetic transformation by biolistic targeting the silencing of this protein in castor seeds, using the strategy of interfering RNA (RNAi). The results showed the existence of variability for the concentration of ricin in accessions of the germplasm bank of Embrapa Algodão, it is possible to select genotypes with high and low levels of ricin. The cultivars IAC Guarani, BRS Nordestina and BRS Paraguaçu had the lowest concentrations of ricin, and are quite suitable for breeding aiming to use the seed cake to feed animals. Among the commercial cultivars, BRS Energia presented the highest concentration of this protein. During the development of cells in the endosperm of castor seeds of BRS Energia exhibited an increasing number of reserve vesicles (protein storage vacuoles and lipid bodies) and decreased cytoplasmic volume. The accumulation of ricin in the BRS Energia increased with seed development, and in the mature seed (60DAP) the concentration was the maximum. Ricin can also be found in crystalloids of protein storage vacuoles (PSV) and not only in the matrix, contrary to previous biochemical observations that the protein components were found only compartmentalized within the protein bodies. Genetic transformation of castor bean was developed, with the regulator TDZ being more effective in inducing shoots then BAP. In addition, IBA and AgNO3 were important for the elongation of shoots and rooting of explants. The use of bioreactors in order to elongate the explants was effective for short periods. It is possible to obtain genetically modified castor bean using as selective agent the imazapyr. The transformation system based on the biolistic process presented efficiency similar to other protocols.

Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-02-22T17:48:04Z No. of bitstreams: 1 2010_Tiago BenolielRocha.pdf: 1639084 bytes, checksum: b3f6fa5d5ae64ccc7cc41ae94a8b881b (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-03-11T01:04:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_Tiago BenolielRocha.pdf: 1639084 bytes, checksum: b3f6fa5d5ae64ccc7cc41ae94a8b881b (MD5) / Made available in DSpace on 2011-03-11T01:04:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_Tiago BenolielRocha.pdf: 1639084 bytes, checksum: b3f6fa5d5ae64ccc7cc41ae94a8b881b (MD5) / Fontes hidrotermais possuem grande diversidade de microrganismos termo resistentes, que são importantes para as indústrias de conversão de biomassa vegetal. A lignocelulose é o componente mais abundante da biomassa, mas é subutilizado pela indisponibilidade de enzimas de baixo custo que realizem a degradação com eficiência. Neste trabalho, treze bactérias foram isoladas da água de duas fontes termais do Parque Nacional de Caldas Novas, GO. Uma foi selecionada para ser identificada e caracterizada enzimaticamente por suportar a maior temperatura de crescimento e deter maior atividade em placa contra carboximetilcelulose (CMC), celulose ultracritalina (UCel) e xilana. Após análises das sequências gênicas do RNA ribossomal 16S e da subunidade β da RNA polimerase, a bactéria selecionada foi classificada no grupo do Bacillus cereus, mas não foi possível a diferenciação entre o B. cereus e o B. thuringinensis, sendo denominada como Bacillus sp. linhagem FT9. Após a classificação, o Bacillus sp. FT9 foi cultivado em CMC, UCel, xilana oat spelts (XOS), xilana birchwood (XBW) e glicose. Para os substratos complexos, a maior taxa de crescimento específico e os mais elevados rendimentos de indução foram encontrados nas culturas induzidas com XOS, sendo observada atividade de xilanase no sobrenadante dessa cultura igual a 0,537 UI/mL a 50 °C e pH 6,0. No sobrenadante da cultura induzida em CMC, foi encontrada atividade de CMCase e FTPase igual a 0,231 UI/mL e 0,111 UI/mL a 70 °C e pH 7,0, respectivamente. Esse é o primeiro relato de atividade xilanolítica e o segundo de atividade celulolítica para linhagens relacionadas filogeneticamente com o grupo do B. cereus. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Microorganisms from hot springs play an important role at the biomass conversion industries. Lignocellulose is the major component of vegetal biomass, however, it is underused because of the unavailability of cost-effective enzymes that perform efficiently its degradation. In this work, thirteen bacteria were isolated from two hot springs located at Caldas Novas National Park, Brazil. One of them was selected for identification and enzymatic description due to the highest grown temperature and the greatest cellulase and xylanase activity that it shown at preliminary assays. When its rDNA 16S and RNA polymerase’s β subunit sequences were analyzed, the chosen strain presented close phylogeny to Bacillus cereus group, although species classification has not been possible through these techniques, it was named Bacillus sp. strain FT9. Then, it was grown on carboxymetylcellulose (CMC), ultracrystalline cellulose (UCel), xylan oat spelts, xylan birchwood and glucose. Considering the complex substrates, the highest rates of specific grown and yields were found at fermentation on XOS, which had 0,537 UI/mL of xylanase activity at 50 °C and pH 6,0. On CMC grown cultures, 0,231 UI/mL of CMCase activity and 0,111 UI/mL of FTPase were detected, both at 70 °C and pH 7,0. That is the first work describing xylanase activity and the second one to describe cellulase activity at Bacillus cereus close related species.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-16T21:45:32Z No. of bitstreams: 1 2008_AdelsonJoelSilva.pdf: 6538658 bytes, checksum: d53ab6d55ab999a7948e18c47fa70a1c (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-16T21:46:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_AdelsonJoelSilva.pdf: 6538658 bytes, checksum: d53ab6d55ab999a7948e18c47fa70a1c (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-16T21:46:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_AdelsonJoelSilva.pdf: 6538658 bytes, checksum: d53ab6d55ab999a7948e18c47fa70a1c (MD5) / "O inibidor de quimotripsina de Schizolobium parahyba (SPCI) pertence à família Kunitz, inibindo especificamente quimotripsina na proporção molar de 1:1 (Ki = 5,85 x 10-8 M). Este trabalho visa analisar as modificações conformacionais resultantes da associação entre o SPCI e a -quimotripsina por meio de métodos espectroscópicos de fluorescência (estacionária e dinâmica), dicroísmo circular e espalhamento de luz dinâmica (ELD); a cristalização do complexo binário SPCI-quimotripsina também foi realizada utilizando o método da matriz esparsa em gota sentada. O SPCI foi purificado pela precipitação com ácido tricloroacético 1,2% seguido por cromatografia de troca catiônica. A purificação do complexo binário foi realizada por cromatografia de exclusão molecular. O espectro da emissão na interação das moléculas apresentou atenuação da intensidade da fluorescência fixa a max = 332. O gráfico de Stern-Volmer apresentou KSV (103 M-1) praticamente constante em diferentes temperaturas, excluindo a hipótese de atenuação estática ou dinâmica. O decaimento de fluorescência do SPCI ( 1 = 0,67 ns e 1 = 0,52; 2 = 4,98 ns e 2 = 0,45) e da -quimotripsina ( 1 = 0,88 ns e 1 = 0,37; 2 = 4,16 ns e 2 = 0,67) foram melhores ajustadas pelo modelo Discreto e Planck para dois tempos de vida baseado no valor mínimo do 2. Os parâmetros obtidos indicam que a -quimotripsina apresenta duas populações distintas de triptofano: enterrada ( 1) e exposta ( 2); o decaimento bi-exponencial encontrado para o SPCI indica subestados conformacionais do triptofano no estado excitado. A interação do inibidor com a quimotripsina foi analisada através da clássica equação de Stern-Volmer. A interação provocou modificações conformacionais nos micro-ambientes dos triptofanos do complexo, aumentando (redução da hidrofobicidade) e atenuando (aumento da hidrofobicidade) o tempo de vida. Essa modificação foi dependente da concentração da enzima. Os cálculos para Kq (1012 M-1s-1) mostraram que a atenuação registrada pela fluorescência estacionária e dinâmica ocorre por ligação molecular. Os experimentos de ELD mostraram que o SPCI apresenta forma monomérica em solução, independente da concentração, pH e temperatura. Portanto, a atenuação do tempo de vida do complexo é devido provavelmente a estados oligoméricos mais complexos (tetrâmero) da enzima. A presença de NaCl 0,2 M reduziram os valores do tempo de vida para ambas as moléculas separadamente, provavelmente pela redução das interações dos triptofanos com os resíduos circunvizinhos. O sal potencializou a atenuação do tempo de vida acima de 20 M da enzima. A análise do papel das ligações dissulfeto na interação também foi realizada. O gráfico de Stern-Volmer mostrou flutuação ao longo da titulação da quimotripsina, sugerindo flexibilidade conformaconal do SPCI nessas condições. A desnaturação térmica do inibidor não foi possível, mostrando que as ligações dissulfeto não são responsáveis pela estabilidade estrutural do inibidor. As reduções dessas ligações promoveram modificações em valores percentuais na estrutura secundária, o que poderá explicar a flexibilidade conformacional registrada na flutuação gráfica de Stern-Volmer. O cristal do complexo binário do SPCI com -quimotripsina difratando a 2,8 Å foi obtido na condição MES/NaOH 100 mM pH 5.5, PEG 6000 20% (w/v), LiCl2 200 mM e sulfobetaína não-detergente 201 (NDSB-201) como aditivo." . _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / "The inhibitor of chymotrypsin Schizolobium parahyba (SPCI) belongs to the Kunitz family, specifically inhibit chymotrypsin at molar ratio of 1:1 (Ki = 5.85 x 10-8 M). This paper aims to analyze the conformational changes resulting from the association between the SPCI-chymotrypsin and by means of fluorescence spectroscopic methods (stationary and dynamic), circular dichroism and dynamic light scattering (SLS), the crystallization of binary SPCI-chymotrypsin complex was also performed using the sparse matrix method in sitting drop. The SPCI was purified by precipitation with trichloroacetic acid 1.2% followed by cation exchange chromatography. The purification of the binary complex was performed by size exclusion chromatography. The emission spectrum of the interaction of the molecules showed attenuation of the fluorescence intensity of fixed max = 332. The Stern-Volmer plot showed KSV (103 M-1) almost constant at different temperatures, without the possibility of static or dynamic attenuation. The decay of fluorescence of GSI (1 = 0.67 ns and 1 = 0, 52, 2 = 4.98 ns and 2 = 0.45) and-chymotrypsin (1 = 0.88 ns and a = 0.37, 2 = 4.16 ns and 2 = 0.67) were better adjusted by Discreet and Planck model for two life times based on the minimum value of 2. The parameters obtained indicate that a-chymotrypsin shows two distinct populations of tryptophan: buried (1) exposed and (2), the bi-exponential decay found for the GSI indicates conformational substates in the excited state of tryptophan. The interaction of the inhibitor with chymotrypsin was analyzed by the classical Stern-Volmer equation. conformational changes triggered interaction in micro-environments of the tryptophans in the complex, increasing (reducing hydrophobicity) and damping ( increased hydrophobicity) the lifetime. This modification was dependent on the concentration of the enzyme. Calculations for KQ (1012 M-1s-1) showed that the fluorescence decay recorded for stationary and dynamic molecular link occurs.'s experiments showed ELD SPCI presents the monomeric form in solution, independent of concentration, pH and temperature. Therefore, the attenuation of the lifetime of the complex is probably due to more complex oligomeric state (tetramer) of the enzyme. The presence of 0.2 M NaCl reduced values ​​of lifetime for both molecules separately, probably by reducing the interactions of tryptophans with the surrounding residues. Salt enhanced the attenuation of lifetime above 20 M of the enzyme. The analysis of the role of disulfide bonds in the interaction also was performed. The Stern-Volmer plot showed fluctuation along the titration of chymotrypsin, suggesting flexibility conformaconal of SPCI under these conditions. The thermal denaturation of the inhibitor was not possible, showing that the disulfide bonds are not responsible for the structural stability of the inhibitor. The reductions of these links have promoted changes in percentages of the secondary structure, which may explain the conformational flexibility in the fluctuation recorded graphic Stern-Volmer. The crystal of the binary complex with SPCI-chymotrypsin diffracting to 2.8 Å was obtained on condition MES / 100 mM NaOH pH 5.5, 20% PEG 6000 (w / v), 200 mM LiCl2 sulfobetaína non-detergent and 201 (NDSB-201) as an additive. "

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-17T00:58:06Z No. of bitstreams: 1 2010_RicardoCamargo.pdf: 1814504 bytes, checksum: 918ee0ed7e332fdfa90c63a3936aa5f5 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-17T00:58:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_RicardoCamargo.pdf: 1814504 bytes, checksum: 918ee0ed7e332fdfa90c63a3936aa5f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-17T00:58:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_RicardoCamargo.pdf: 1814504 bytes, checksum: 918ee0ed7e332fdfa90c63a3936aa5f5 (MD5) / A proteína citoplasmática de ligação à cauda poli(A) dos RNAs mensageiros eucariotos (PABPC) desempenha papéis fundamentais em várias etapas da expressão gênica. A PABPC atua na biogênese, exportação nuclear, localização citoplasmática, tradução e meia-vida (turnover) dos mRNAs. A sua versatilidade encontra-se fundamentada em uma complexa rede de associações simultâneas entre proteínas e o mensageiro, mantidas por essa única cadeia polipeptídica. A PABPC foi identificada em todos os organismos eucariotos estudados e apresenta elevado nível de conservação da sua sequencia primária, desde levedura até mamíferos. Uma PABPC típica tem uma massa molecular de aproximadamente 70 kDa e até composta por duas regiões estruturalmente bem definidas, N e C-terminal, conectadas por uma sequencia peptídica não-estruturada rica em resíduos de prolina e glutamina. O N-terminal até formado por quatro domínios consecutivos de interação com o RNA (RBD - RNA binding domain), contendo cerca de 90 aminoácidos cada. O domínio C-terminal da PABPC é uma região composta por aproximadamente 75 aminoácidos, bastante estruturada e altamente conservada. Neste trabalho, não investigamos os aspectos estruturais e moleculares envolvidos na interação da proteína citoplasmática de ligação ao poli(A) em uma associação do tipo PABPC-PABPC, tanto na ausência como na presença de um trato de poliadenosinas. Portanto, mostramos pela primeira vez que essa proteína se comporta como um homodímero em solução privada de poli(A). Observamos por experimentos de Pull-down que a interação entre PABPCs independente de poli(A) ocorre entre os seus RBDs (com no mínimo os RBDs 1 e 2) e a sua região intermediária, que compreende o quarto domínio e a região poliprolina. Além disso, também notamos que somente o RBD 4 juntamente com a sequência poliprolina são suficientes para que ocorra a associação PABPC-PABPC em ausência de poli(A). Curiosamente, a interação entre o N-terminal da PABPC e a sua região rica em prolinas foi incrementada na presença de poli(A). Baseados nestes resultados, propormos um modelo teórico no qual a interação PABPC-PABPC é um mecanismo hipotético de inibição a associação precoce de fatores de regulação e iniciação da tradução que utilizem a PABPC como arcabouço. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The cytoplasmatic poly(A) binding protein (PABPC) plays fundamental roles in several steps of gene expression in eukaryotes. The PABPC operates in biogenesis, nuclear export, localization, translation and turnover of mRNAs. Its versatility is anchored in a complex network of simultaneous associations between proteins and the messenger, maintained by this unique polypeptidic chain. PABPC has been identified in all eukaryotes organisms studied showing high level of primary sequence conservation, from yeast until mammals. A typical PABPC has a molecular weight of approximately 70 kDa and It is composed of two well-defined regions, N and C-terminal, connected by an unstructured proline and glutamine-rich linker. The N-terminal is formed by four consecutive RNA binding domains (RBD), each containing approximately 90 amino acids. The C-terminal domain of PABPC is a region comprising approximately 75 amino acids, structured and highly conserved. In this work, we investigated molecular and structural aspects involved in the PABPC-PABPC association, in absence and presence of a poly(A) tract. Therefore, for the first time we showed that this protein behaves as a homodimer in privation of poly(A). We observed by pull-down experiments that the interaction between PABPCs independently of poly(A) occurs between their RBDs (with at least the RBDs 1 and 2) and its intermediary region, which comprises the fourth domain and the proline rich sequence. In addition, we also noted that the RBD 4 together with the polyproline region are sufficient to PABPC-PABPC association in absence of poly(A). Interestingly, the interaction between the N-terminal of PABPC and its proline rich sequence was increased in the presence of poly(A). Based in these results, we proposed a theoretical model that PABPC-PABPC interaction is a hypothetical inhibition mechanism that prevents early association of regulation and translation initiation factors that use PABPC as a scaffold.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2011. / Submitted by Gabriela Ribeiro (gaby_ribeiro87@hotmail.com) on 2011-09-19T14:27:28Z No. of bitstreams: 1 2011__LorenadaSilveiraDerengowski.pdf: 32990320 bytes, checksum: c97d5b1085b1631222dd3fd50cc78787 (MD5) / Approved for entry into archive by Repositorio Gerência(repositorio@bce.unb.br) on 2011-10-25T20:14:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011__LorenadaSilveiraDerengowski.pdf: 32990320 bytes, checksum: c97d5b1085b1631222dd3fd50cc78787 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-10-25T20:14:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011__LorenadaSilveiraDerengowski.pdf: 32990320 bytes, checksum: c97d5b1085b1631222dd3fd50cc78787 (MD5) / Nas últimas décadas, a relevância clínica do Reino Fungi vem aumentando, principalmente em virtude da maior incidência de micoses sistêmicas e do número limitado de fármacos eficazes no tratamento de infecções fúngicas. Dentre os fungos de importância médica podemos destacar o fungo dimórfico e oportunista Candida albicans, o qual é capaz de infectar uma ampla gama de tecidos, além de ser um dos principais agentes causadores de infecções nosocomiais. A maioria das septicemias nosocomiais causadas por esse microrganismo deve-se à formação de comunidades microbianas denominadas biofilmes. A formação de biofilme confere ao patógeno maior resistência a terapias antifúngicas e às defesas do hospedeiro. Nesse contexto, avaliamos o efeito do propranolol, um antagonista beta-adrenérgico, na formação do biofilme de C. albicans. Os resultados indicaram que o propranolol desempenha um efeito inibitório na filamentação e na adesão de C. albicans a superfícies, inibindo assim a formação do biofilme por esse fungo. A inibição da formação de biofilmes por C. albicans também é mediada pelo farnesol, uma molécula autoindutora produzida por esse patógeno. Nesse trabalho foi também demonstrado o potencial antimicrobiano do farnesol no fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis, o qual é descrito como o agente etiológico da paracoccidioidomicose. Nossos resultados mostraram que o farnesol desempenha um significante efeito fungicida em P. brasiliensis, provavelmente por desencadear a degradação de organelas intracelulares. Além disso, o farnesol, assim como o sobrenadante de uma cultura crescida de C. albicans, inibem o processo de transição morfológica de P. brasiliensis, sugerindo um possível envolvimento dessa molécula em interações interespecíficas entre esses fungos. Os resultados obtidos tanto para o propranolol quanto para o farnesol mostramse promissores e devem ser melhor explorados, principalmente tendo-se em mente o alto custo e a alta toxicidade geralmente apresentados pelas drogas antifúngicas atualmente disponíveis. Outro fungo patogênico e oportunista que merece destaque é Cryptococcus neoformans. Esse fungo é capaz de sobreviver e se replicar no interior de macrófagos, revelando a existência de mecanismos que permitem sua adaptação ao ambiente inóspito do fagossomo da célula hospedeira. Uma hipótese é de que os atributos necessários para a sobrevivência de C. neoformans ao ambiente do interior de macrófagos foram previamente selecionados a partir de interações entre esse fungo e predadores ambientais, como amebas. A fim de verificarmos essa hipótese, comparamos a resposta transcricional de C. neoformans ao microambiente de macrófagos e de amebas. Nossos resultados sugerem que, embora o fungo expresse alguns grupos de genes específicos em resposta a um dado fagócito, de modo geral a responda metabólica de C. neoformans a amebas e macrófagos é bastante similar, indicando privação nutricional e estresse oxidativo nesses ambientes. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / In recent decades, the clinical relevance of the Fungi Kingdom is increasing, mainly due to higher incidence of systemic mycoses and the limited number of effective drugs to treat fungal infections. Among the medically important fungi, we can highlight the opportunistic dimorphic fungus Candida albicans, which is able to infect a wide range of host tissues, besides being one of the major causative agents of nosocomial infections. C. albicans is associated to nosocomial infections in part due its ability to adhere to a variety of biomaterials such as catheters, forming biofilms. Biofilms have clinical repercussions mainly due to their notorious resistance to antimicrobials agents and host immune defenses. The difficulty in treating biofilm-associated infections emphasizes the importance of studying drugs that are active against its formation. In this context, we evaluated the effects of propranolol, which has been used clinically as a beta-adrenergic receptor antagonist, in C. albicans adherence and biofilm formation. Here, we demonstrate that propranolol inhibits germ tubes formation and the adherence of C. albicans cells on abiotic surfaces as well as on epithelial cells, resulting in decreased in biofilm formation. C. albicans biofilm development can also be inhibited by the autoinducer farnesol as quorum-sensing mechanism. Moreover, studies revealed that farnesol affect the growth of a number of bacteria and fungi, pointing to a potential role as an antimicrobial agent. In this sense, we evaluated the effects of farnesol on the thermal dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis, the etiologic agent of the most prevalent mycosis in Latin America, paracoccidioidomycosis. Our data indicate that farnesol acts as a potent antimicrobial agent against P. brasiliensis. The fungicide activity of farnesol reduces the viability of this pathogen and delays the dimorphism, suggesting an antimicrobial activity against P. brasiliensis, probably due the massive cytoplasmic organelles degeneration. The results showed by both propranolol and farnesol are particularly interesting, since it could be further explored in order to evaluate the possible use of these compounds as antimicrobial agents. Another pathogenic and opportunistic fungus of clinical relevance is the yeast Cryptococcus neoformans. This fungus is able to survive and replicate within the phagossome of macrophages, revealing that it have evolved mechanisms allowing its survival within the phagocytic cells, which are considered an inhospitable habitat. Since replication in an animal host is not essential as part of C. neoformans life cycle, it was proposed that fungal virulence for mammals originated from selection by environmental predators, such as amoebas. In this perspective, we compared the transcriptional response of C. neoformans after interaction with macrophages and amoebas. Our results suggest a conserved metabolic response of C. neoformans to the environment of both phagocytic cells by the expression of genes related with nutritional and oxidative stress.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2011. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-03-06T14:52:59Z No. of bitstreams: 1 2011_MiguelCampeloMeloFerraz.pdf: 2183258 bytes, checksum: 1c17fabbfdac60368588a51256fe7807 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2012-03-07T12:35:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_MiguelCampeloMeloFerraz.pdf: 2183258 bytes, checksum: 1c17fabbfdac60368588a51256fe7807 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-07T12:35:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_MiguelCampeloMeloFerraz.pdf: 2183258 bytes, checksum: 1c17fabbfdac60368588a51256fe7807 (MD5) / Fonsecaea pedrosoi é um fungo dimórfico, caracterizado pelas formas aprofítica/reprodutiva (micélio/conídio) e infecciosa (corpos escleróticos), pertencente à família Dematiceae. Habita o solo, plantas e matéria orgânica em decomposição. Encontra-se em todos os continentes, mais comumente em regiões tropicais e subtropicais da América, Ásia e África. F. pedrosoi é o principal agente etiológico da cromoblastomicose, uma doença infecciosa crônica da pele e do tecido subcutâneo. No Brasil, essa doença é endêmica na região Amazônica. A infecção ocorre por implantação traumática transcutânea de conídios e fragmentos de hifa do fungo, acometendo principalmente trabalhadores rurais. Poucos são os dados a respeito da biologia molecular de F. pedrosoi disponíveis na literatura científica. Informações a respeito da expressão gênica são essenciais à compreensão do mecanismo de interação patógeno-hospedeiro e para o desenho de novas estratégias terapêuticas e de drogas específicas. Nesse sentido, o objetivo do presente trabalho foi a construção de uma biblioteca de cDNA de F. pedrosoi, seguido do sequenciamento de clones de cDNA dessa biblioteca e da respectiva geração de um banco de sequências expressas (ESTs, Expressed Sequence Tags). Dentre 480 ESTs analisadas, empregando ferramentas convencionais de bioinformática (pipeline disponível on-line: http://helix.biomol.unb.br/phph/index.html), 353 sequências de nucleotídeos distintas foram selecionadas segundo os parâmetros específicos estabelecidos (QV > 20 e extensão > 100 bases). Destas, 139 sequências apresentaram similaridade com sequências depositadas em banco de dados, dentre as quais destacam-se genes de transportadores de íons, transportadores de drogas, enzimas envolvidas na respiração celular, proteínas de parede celular e proteínas de choque térmico. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Fonsecaea pedrosoi is a dimorphic fungus, characterized by saprophytic/reproductive (mycelium/conidia) and infectious forms (sclerotic bodies) belonging to the family Dematiceae. Inhabits soil, plants and decaying organic matter. It is found in all continents, most commonly in tropical and subtropical America, Asia and Africa. F. pedrosoi is the major etiologic agent of chromoblastomycosis, a chronic infectious disease of the skin and subcutaneous tissue. In Brazil, this disease is endemic in the Amazon region. Infection occurs by traumatic transcutaneous implantation of conidia and hyphae fragments of the fungus, affecting mainly rural workers. There are few data regarding the molecular biology of F. pedrosoi available in scientific literature. Information on the gene expression is essential to understanding the mechanism of host-pathogen interaction and for designing new therapeutic strategies and specific drugs. Thus, the purpose of this study was to construct a cDNA library of F. pedrosoi, followed by sequencing of cDNA clones in this library and the generation of a database of expressed sequence tags (ESTs). Of 480 ESTs analyzed, using conventional tools of bioinformatics (pipeline available online: http://helix.biomol.unb.br/phph/index.html), 353 distinct nucleotide sequences were selected according to specific parameters established (QV > 20 and length > 100 bases). Of these, 139 sequences showed similarity to sequences stored in databases, among which stand out genes of ion transporters, drug transporters, enzymes involved in cellular respiration, cell wall proteins and heat shock proteins.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, 2011. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2012-03-20T13:52:59Z No. of bitstreams: 1 2011_LuciliaZeymerAlvesCorrea.pdf: 10461549 bytes, checksum: 5e882c748c15f3ef071faa0b579dec08 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2012-03-21T12:55:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_LuciliaZeymerAlvesCorrea.pdf: 10461549 bytes, checksum: 5e882c748c15f3ef071faa0b579dec08 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-21T12:55:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_LuciliaZeymerAlvesCorrea.pdf: 10461549 bytes, checksum: 5e882c748c15f3ef071faa0b579dec08 (MD5) / O vírus da imunodeficiência humana infecta linfócitos T, que possuem o receptor CD 4 na membrana plasmática. Inicialmente, o CD 4 é responsável pela entrada do vírus na célula hospedeira. Em um segundo momento, ocorre a modulação negativa do CD 4 pela proteína auxiliar Nef do vírus HIV-1, o que possibilita a saída do vírus para infectar outra célula. O antibiótico Ikarugamicina impede a modulação negativa do CD4 pela proteína auxiliar Nef e reestabelece o nível de CD 4 na membrana plasmática, mas é citotóxico em testes in vitro. Inibidores da proteína auxiliar Nef vêm sendo amplamente estudados como possíveis fármacos para o tratamento antirretroviral. O objetivo deste trabalho é a síntese de possíveis inibidores da proteína auxiliar Nef do vírus HIV -1. A partir de estudos de interação molecular, propusemos a síntese de seis moléculas, que contêm os grupos 3-amino-1,2,4-triazol, uracila ou 1,2,3-triazol, como possíveis inibidores da proteína auxiliar Nef do vírus HIV-1. Após análise retrossintética, diversas rotas foram propostas para a síntese das moléculas. Após várias tentativas de síntese, não se obteve sucesso na síntese da molécula com o grupo 3-amino-1,2,4-triazol, e da molécula com o grupo uracila. Um total de quatro moléculas contendo o anel 1,2,3-triazólico foram sintetizadas por rota sintética direta, obtendo-se excelentes rendimentos. A síntese envolveu a preparação do grupo azida, seguida por reação de Huisgen – reação click – e acoplamento com DCC/DMAP. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The human immunodeficiency virus infects T lymphocytes that have the CD4 receptor on the plasma membrane. Initially, CD4 is responsible for virus entry into the host cell. In a second stage, the CD 4 downregulation by the auxiliary protein of HIV-1 Nef occurs, allowing the exit of the virus to infect another cell. The antibiotic Ikarugamycin prevents downregulation of CD 4 by the Nef auxiliary protein and restores the level of CD4 at the plasma membrane, but in vitro tests it is cytotoxic. Nef inhibitors have been investigated as potential drugs for antiretroviral treatment. The aim of this work is the synthesis of potential inhibitors of auxiliary protein HIV-1 Nef. Based on studies of molecular interaction we proposed the synthesis of six molecules, which contain the groups 3-amino-1,2,4-triazole, 1,2,3-triazole or uracil as potential inhibitors of the auxiliary protein HIV -1 Nef. After retrosynthetic analysis, several routes have been proposed for the synthesis of these molecules. Several attempts to synthesize molecules with the 3-amino-1,2,4-triazole and uracil groups, were performed without success. The molecules containing 1,2,3-triazole ring were synthesized by a direct synthetic route with excellent yields. The synthesis involved the preparation of the azide group, followed by the Huisgen reaction – click reaction – and DCC/DMAP coupling.

Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2011 / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-03-29T12:38:55Z No. of bitstreams: 1 2011_TatianeAraujoCosta.pdf: 899665 bytes, checksum: e7e2f53d213af3d0544e32927e5f28f7 (MD5) / Approved for entry into archive by Elzi Bittencourt(elzi@bce.unb.br) on 2012-03-29T14:31:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_TatianeAraujoCosta.pdf: 899665 bytes, checksum: e7e2f53d213af3d0544e32927e5f28f7 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-29T14:31:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_TatianeAraujoCosta.pdf: 899665 bytes, checksum: e7e2f53d213af3d0544e32927e5f28f7 (MD5) / Paracoccidioides brasiliensis, agente etiológico da paracoccidioidomicose, é um fungo termodimórfico e sua patogenicidade está ligada ao processo de transição dimórfica e a alterações na parede celular. Em P. brasiliensis, os principais polímeros que compõem a parede celular são a 1,3-?-glicana e a 1,3-?-glicana, responsáveis pela forma e integridade estrutural. Neste estudo investigou-se a região promotora do gene de 1,3-?-glicana sintase (PbFKS1). Foram encontrados na região regulatória de PbFKS1 dois sítios consensuais para a ligação do fator transcricional CreA, envolvido na repressão por glicose, e dois sítios de interação para o fator PacC, relacionado à regulação da expressão gênica mediada pelo pH extracelular em fungos. Experimentos de retardo de mobilidade eletroforética (EMSA) foram realizados com três sondas fluorescentes distintas: Pbfks1 (I), que apresenta um dos sítios CreA; Pbfks1 (II), que representa um sítio para PacC e Pbfks1 (III), na qual estão presentes um sítio para CreA e um sítio para PacC espaçados por sete nucleotídeos. Foram empregados, nos experimentos de EMSA, proteínas recombinantes contendo os domínios de ligação ao DNA de CreA e de PacC fusionados à glutationa-S-transferase, e extratos protéicos totais de P. brasiliensis nas fases de micélio e de levedura, crescido em pH ácido (5,0), neutro (7,0) ou alcalino (9,0). Os resultados de EMSA indicaram que os sítios de CreA do gene PbFKS1 não foram reconhecidos pela proteína rCreA-GST. Quando da incubação com extratos protéicos totais obtidos de células leveduriformes ou miceliais, houve a formação de complexos DNA-proteína, mas esses não envolviam o sítio de reconhecimento de CreA. Os experimentos realizados com as duas sondas que apresentam o motivo de reconhecimento de PacC indicaram a formação de complexos entre a proteína rPacC-GST e o motivo de reconhecimento específico. Os ensaios feitos com extratos protéicos totais resultaram na detecção de interação DNA-proteína específica no sítio PacC apenas na forma de levedura, cultivada em pH neutro ou alcalino. Os dados obtidos nesse trabalho indicam que o fator transcricional PacC possa estar envolvido na regulação da expressão do gene PbFKS1 quando do crescimento leveduriforme, forma celular em que ocorre no hospedeiro infectado. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis, the etiological agent of paracocciodioidomycosis, is a thermodimorphic funjgs. Pathogenicity is linked to modifications of the cell wall during the dimorphic transition. P. brasiliensis major cell wall polymers are 1,3-β-glican and 1,3-α-glican, which are responsible for structural form and integrity. In this study the promoter region of the 1,3-β-glican synthase (PbFKS1) gene was investigated. In the PBFKS1 regulatory region we found two consensus binding sites for the CreA transcription factor PacC, which is related to the gene expression regulation mediated by extracellular ph in fungi. Electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) were performed with tree distinct fluorescent probes: Pbfs1 (I), which presents one of the CreA recognition sites; Pbfs1 (I), wich represents a PacC are spaced by binding site; and Pbfks 1 (III), in wich one site for CreA and one for PAcC are spaced by seven nucleitides. For the EMSAs, we employed recombinant proteins containing the CreA or the PacC DNA-binding domaun fused to glutathione-S-transfere (rCreA-GST and rPacC-GST, respectively), as well as total proteins extractus obtained from P. brasiliensis mycelium and yeast cells grown in acidic (5.0), neutral (7.0) or alkaline (9.0) Ph. EMSAs results indicated that the CreA binding sites present in the PbFKS1 gene regulatory region were not recognized by the rCreA-GST protein. When probes were incubated with total protein extracts obtained either from yeast or mycelium cells, DNA-protein complxes were formed ; nevertheless, these complexes did not invole the CreA specific recognition site.Experiments performed with the two PacC probes indicated the formation of complexes between rPacC-GST and the Specific DNA_protein interactions in the PAcC binding site only in the yeast phase grown in neutral or alkaline ph.The data obtained in the work indicative that the transcriptions factor PacC can be involved in the regulations of PbFSk1 gene expression during the yeast phase growth, which is the cell form that occurs in the infected host.