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Espécies reativas de oxigênio (ROS) são geradas como produto final da respiração mitocondrial. Quando ROS são produzidas em excesso geram estresse oxidativo e induzem citotoxicidade via uma variedade de mecanismos, incluindo dano ao DNA, lipídeos e proteínas. Neste trabalho avaliamos a capacidade do lantanídeo gadolínio em produzir estresse oxidativo com a finalidade de aproveitar o potencial citotóxico de ROS para o tratamento de tumores. Utilizamos dois modelos experimentais: o primeiro modelo utilizado foi duas linhagens de glioblastoma humano, T98 status p53 mutante e U87 status p53 selvagem para avaliar a citotoxicidade do gadolínio sobre o metabolismo celular e também alterações morfológicas, nucleares e produção de ROS. O segundo modelo utilizado foi 8 linhagens da levedura Saccharomyces cerevisae, selvagem e mutantes relacionadas ao estresse oxidativo, para avaliar o efeito do gadolínio e para obter informações sobre seu possível mecanismo de ação. Os resultados mostram que o gadolínio foi capaz de induzir citotoxicidade e diminuir a viabilidade celular em ambas as linhagens de glioblastoma humano, além de provocar alterações nucleares e produzir ROS. A adição de radiação (Gd159) aumentou todos os efeitos citotóxicos provocados pelo gadolínio. Ambas as linhagens obtiveram mesmas respostas frente ao gadolínio sugerindo que as alterações observadas foram independentes de p53. Na levedura Saccharomyces cerevisiae o gadolínio foi capaz de inibir o crescimento celular, sendo a mutante Δsod1 a mais sensível. As leveduras foram capazes de incorporar gadolínio de maneira dose-dependente. A mutante Δsod1 incorporou mais gadolínio quando comparado à linhagem selvagem. As células testadas não possuem receptores específicos de interação com este metal na membrana celular. Ao incorporar gadolínio existe uma extrusão de potássio da célula. A presença de gadolínio não foi capaz de induzir peroxidação de lipídeos, ao contrário, diminuiu a quantidade de lipídeos peroxidados. Este metal foi capaz de diminuir, significantemente, a quantidade de grupamentos tióis livres, indicando um possível alvo em proteínas do sistema de controle redox celular. A presença deste metal aumentou a geração de ROS, apresentando maior intensidade nas mutantes Δskn7, Δsod2 e Δcta1. Além disso, provocou a diminuição da viabilidade celular. Todos estes achados levam a concluir que o gadolínio pode ser um metal de escolha para o desenvolvimento de novas drogas para o tratamento de câncer. / Reactive oxygen species (ROS) are generated as end products of mitochondrial respiration. When ROS are produced in excess generates oxidative stress and induce cytotoxicity via a variety of mechanisms, including damage to DNA, lipids and proteins. In this work we evaluate the ability of the lanthanide gadolinium in producing oxidative stress in order to used the cytotoxic potential of ROS to the treatment of tumors. We used two experimental models: the first model used was two strains of human glioblastoma, T98 status p53 mutant and U87 status p53 wild type to evaluate the cytotoxicity of gadolinium on cell metabolism and also morphological changes, nuclear and ROS production. The second model was used eight strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae, wild type and mutant related to oxidative stress, to assess the effect of gadolinium and for obtains same information about the possible mechanism of action. The results show that gadolinium was able to induce cytotoxicity and decrease cell viability of both strains of human glioblastoma, and cause nuclear changes and produce ROS in a dose dependent way. The addition of radiation (Gd159) increased all cytotoxic effects caused by gadolinium. Both of strains had the same response to gadolinium suggesting that the observed changes were independent of p53. In the yeast Saccharomyces cerevisiae gadolinium was able to inhibit cell growth, and the mutant Δsod1 was the most sensitive. The yeasts were able to incorporate gadolinium in a dose-dependent way. The mutant Δsod1 incorporate more gadolinium compared to the wild type. The cells tested do not have specific receptors for interaction with this metal in the cell membrane. By incorporating gadolinium there is an extrusion of potassium from the cell. The presence of gadolinium was not able to induce lipid peroxidation, in contrast, decreased the amount of lipid peroxidate. This metal was able to decrease significantly the amount of free thiol groups, indicating a possible target protein in the cellular redox control system. The presence of this metal increased the generation of ROS, with higher intensity in the mutant Δskn7, Δsod2 and Δcta1. In addition, Gd produced significant decreased on cell viability. All these findings led us to conclude that gadolinium may be a metal of choice for developing new drugs for cancer treatment.

As radiações ionizantes são provenientes tanto de fontes naturais como de fontes antropogênicas. A radioterapia emergiu como uma das terapias mais comuns no combate ao câncer. Irradiadores de Co-60 (aceleradores lineares de cobalto- 60) são usados para tratamento de tumores malignos rotineiramente em hospitais de todo o mundo. Exposições às radiações ionizantes podem induzir alterações nas macromoléculas celulares e afetar suas funções, pois causam radiólise da molécula de água gerando espécies reativas do oxigênio, que podem causar danos a praticamente todas as organelas e constituintes da célula, conhecidos como danos oxidativos, que podem culminar no estresse oxidativo. O estresse oxidativo é a situação na qual foi rompido o equilíbrio entre oxidantes e antioxidantes, com excessiva produção de espécies reativas, não acompanhada do aumento da capacidade antioxidante, inviabilizando assim, a neutralização das mesmas. O selênio é um micronutriente considerado antioxidante e antiinflamatório, que poderia prevenir o câncer. No sistema biológico o selênio existe na forma de selenoproteínas. Até o presente momento, 25 selenoproteinas humanas já foram identificadas, entre elas a enzima Glutationa peroxidase, uma enzima antioxidante. Leveduras têm a capacidade de incorporar diversos metais tais como ferro, cádmio, zinco e selênio, assim como todos os organismos biológicos. A levedura Saccharomyces cerevisiae, ao contrário das células de mamíferos é desprovida de selenoproteínas, sendo considerada como um modelo prático para estudos de toxicidade do selênio, sem qualquer interferência do metabolismo de selenoproteínas. Além disso, células de leveduras proliferam-se por meio de da fermentação, o equivalente microbiano da glicólise aeróbia em mamíferos que é o processo utilizado por tumores. Vários relatos mostram que os efeitos pró-oxidantes e tóxicos induzidos por compostos de selênio ocorrem em doses mais baixas em células malignas quando comparadas às células normais dando ao selênio um grande potencial terapêutico no tratamento do câncer. Nosso objetivo foi verificar se o selênio desempenha função radiossenbilizadora em células de levedura ao serem desafiadas com radiação ionizante (60Co) . Para isso foi avaliado se o selênio causa danos oxidativos para a célula e morte celular. Em seguida foi avaliado se ocorre diferença nos danos oxidativos após as células serem tratadas com selênio e irradiação gama. Nossos resultados demonstraram que o selênio exerce função radiossensibilizadora e tem papel oxidante nas células de levedura. / Ionizing radiations are from both natural sources such as from anthropogenic sources. Recently, radiotherapy has emerged as one of the most common therapies against cancer. Co-60 irradiators (cobalt-60 linear accelerators) are used to treat of malignant tumors routinely in hospitals around the world. Exposure to ionizing radiation can induce changes in cellular macromolecules and affect its functions, because they cause radiolysis of the water molecule generating reactive oxygen species, which can cause damage to virtually all organelles and cell components known as oxidative damage that can culminate in oxidative stress. Oxidative stress is a situation in which the balance between oxidants and antioxidants is broken resulting in excessive production of reactive species, it is not accompanied by the increase in antioxidant capacity, making it impossible to neutralize them. Selenium is a micronutrient considered as antioxidant, antiinflammatory, which could prevent cancer. Selenium in biological system exists as selenoproteins. Nowdays, 25 human selenoproteins have been identified, including glutathione peroxidase, an antioxidant enzyme. Yeasts have the ability to incorporate various metals such as iron, cadmium, zinc and selenium, as well as all biological organisms. The yeast Saccharomyces cerevisiae, unlike mammalian cells is devoid of selenoproteins, being considered as a practical model for studies on the toxicity of selenium, without any interference from the metabolism of selenoproteins. Moreover, yeast cells proliferate through the fermentation, the microbial equivalent of aerobic glycolysis in mammals and the process is also used by tumors. Several reports show that the pro-oxidante effects and induced toxic selenium compounds occur at lower doses and in malignant cells compared with benign cells. Therefore selenium giving a great therapeutic potential in cancer treatment .Our objective was to determine whether selenium is capable to sensitize yeasts cells when they are challenged with ionizing radiation produced by 60Co. For this, we assessed whether selenium causes oxidative damage to cell and cell death. After that, we assessed whether differences in the oxidative damage occurs after the cells be treated with selenium and gama irradiation. Our results showed that selenium has a rdiosensitizing function playing a oxidant role in yeast cell.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Alguns metais e metalóides são componentes celulares essenciais em quantidades vestigiais. E assim, desempenham vários papéis importantes em processos bioquímicos nos organismos. Possuem também um importante papel na medicina, sendo utilizados a milhares de anos para tratar vários tipos de doenças. O selênio é um micronutriente considerado um antioxidante, que poderia prevenir o câncer. No sistema biológico, o selênio existe na forma de selenoproteínas. Até o presente momento, 25 selenoproteínas humanas já foram identificadas, entre elas a enzima antioxidante glutationa peroxidase. A levedura Saccharomyces cerevisiae, ao contrário das células de mamíferos, é desprovida de selenoproteínas, sendo considerada como um modelo prático para estudos de toxicidade do selênio, sem qualquer interferência do metabolismo de selenoproteínas e possuem a capacidade de incorporar diversos metais tais como ferro, cádmio, zinco e selênio, assim como todos os organismos biológicos. Além disso, células de leveduras proliferam através da fermentação, o equivalente microbiano da glicólise aeróbia em mamíferos que é o processo utilizado por tumores. Vários relatos mostram que os efeitos pró-oxidantes e tóxicos induzidos por compostos de selênio ocorrem em doses mais baixas em células malignas quando comparadas às células normais dando ao selênio um grande potencial terapêutico no tratamento do câncer. O arsênio (As), na forma de trióxido de arsênio, tem sido amplamente usado como o tratamento mais efetivo para pacientes com leucemia promielocítica aguda. Contudo, o arsênio é bem conhecido como um agente tóxico e carcinogênico. Ele é um elemento amplamente distribuído no meio ambiente, presente na água, no ar e no solo e a exposição crônica a este metalóide aumenta a incidência de doenças como o câncer. Entre os efeitos tóxicos está a produção das Espécies Reativas de Oxigênios (ROS), causando estresse oxidativo e conseqüentemente danos às proteínas, aos lipídeos e ao DNA. O arsênio no ambiente ocorre nas formas orgânica e inorgânica e nos estados de oxidação trivalente e pentavelente. O objetivo deste trabalho foi analisar os efeitos da combinação entre o selênio e o arsênio nas células destas leveduras, além de estudar também o metabolismo do arsênio, usando linhagens mutantes da levedura S. cerevisiae que possuem deleções nos genes responsáveis pelo transporte do arsênio nas células (ARR1, ARR2 e ARR3) e a linhagem BY4741 WT, como referência. Os resultados obtidos indicaram que a linhagem com deleção no gene ARR1 sofreu danos oxidativos maiores causados pelo arsenato quando comparado com as outras linhagens. Estes danos foram evidenciados pelo aumento da peroxidação aos lipídios, diminuição dos resíduos SH e considerável produção de ROS, levando as células à apoptose. Em relação às células que foram previamente suplementadas com selenito e posteriormente incubadas com arsenato, o selênio foi capaz de diminuir a incorporação de As, porém, contribuiu para o aumento do estresse oxidativo aumentando os níveis de lipídeos peroxidados, diminuindo os níveis de SH livres, contribuiu para a formação de ROS e causou perda da integridade da membrana, levando as células também à apoptose. O conjunto destes resultados indica que, para as células da levedura S. cerevisiae, o selênio atua como um pró-oxidante e não como um antioxidante. / Some metals and metalloids are essential cellular components in trace amounts, which play important roles in various biochemical processes in organisms. They also have an important role in medicine, being used for thousands of years to treat various diseases. Selenium is a micronutrient considered an antioxidant that could prevent cancer. In biological systems, the selenium is in the form of selenoproteins. To date, 25human selenoproteins have been identified, including the antioxidant enzyme glutathione peroxidase. The yeast Saccharomyces cerevisiae, in contrast to mammalian cells, is devoid of selenoproteins, considered as a practical model for studies of toxicity of selenium, without any interference with the metabolism of selenoproteins and have the ability to incorporate various metals such as iron, cadmium , zinc and selenium, as well as all biological organisms. Additionally, yeast fementing the microbial equivalent of aerobic glycolysis in mammals that is the process used by tumors. Several reports have shown that the pro-oxidant-induced toxicity and selenium compounds occurring in lower doses of malignant cells to normal cells as compared to selenium giving a great therapeutic potential in the treatment of cancer. Arsenic (As), more precisely, as arsenic trioxide, has been widely used as the most effective treatment for patients with acute promyelocytic leukemia. However, the arsenic is well know as an agent toxic and carcinogenic. It is an element widely distributed in the environment, present in water, air and soil and chronic exposure to this metalloid increases the incidence of diseases like cancer. Among the toxic effects is the production of Reactive Oxygen Species (ROS) causing oxidative stress and consequently damage to proteins, to lipids and DNA. Arsenic in the environment occurs in the organic and inorganic forms and trivalent and pentavalent oxidation states. The objective of this study was to analyze the effects of combination between selenium and arsenic in these yeast cells, and also study the metabolism of arsenic, using mutant strains of yeast S. cerevisiae that have deletions in the genes responsible for the transport of arsenic in the cells (ARR1, ARR2 e ARR3) and the strain BY4741 WT as reference. The results indicated that the strains with a deletion in the gene ARR1 suffered more oxidative damage caused by arsenic compared with other strains. This damage was evidenced by increased peroxidation of lipids, reduction of SH residues and considerable ROS production, leading cells to apoptosis. In relation to cells that were previously supplemented with selenium and subsequently incubated with arsenic, selenium was able to decrease the incorporation of As, however, contributed to the increased oxidative stress by increasing levels of lipid peroxidation with arsenic, decreasing levels of free SH, contributed to the formation of ROS and caused loss of membrane integrity, leading also to cell apoptosis. Together, these results indicated that, for cell of the yeast S. cerevisiae, selenium acts as a pro-oxidant and not as an antioxidant.

Submitted by Claudinei Pracidelli (cpracide@ipen.br) on 2015-03-03T14:44:05Z No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2015-03-03T14:44:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Dissertação (Mestrado em Tecnologia Nuclear) / IPEN/D / Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo, São Paulo

No / Patients with acute vitiligo have low epidermal catalase expression/activities and accumulate 10 -3 M H 2O 2. One consequence of this severe oxidative stress is an altered calcium homeostasis in epidermal keratinocytes and melanocytes. Here, we show decreased epidermal calmodulin expression in acute vitiligo. Since 10 -3M H 2O 2 oxidises methionine and tryptophan residues in proteins, we examined calcium binding to calmodulin in the presence and absence of H 2O 2 utilising 45calcium. The results showed that all four calcium atoms exchanged per molecule of calmodulin. Since oxidised calmodulin looses its ability to activate calcium ATPase, enzyme activities were followed in full skin biopsies from lesional skin of patients with acute vitiligo (n = 6) and healthy controls (n = 6). The results yielded a 4-fold decrease of ATPase activities in the patients. Computer simulation of native and oxidised calmodulin confirmed the loss of all four calcium ions from their specific EF-hand domains. Taken together H 2O 2-mediated oxidation affects calcium binding in calmodulin leading to perturbed calcium homeostasis and perturbed L-phenylalanine-uptake in the epidermis of acute vitiligo.

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