Trois types d'eau du fjord Saguenay ont été échantillonnés: de l'eau douce de la rivière Saguenay au niveau de Chicoutimi et de l'eau saumâtre et marine du fjord au niveau de Ste-Rose-du-Nord. Après filtration sur filtre Millipore, 0.45 um, les échantillons ont été élues séquentiellement sur trois ou quatre colonnes chromatographiques contenant du gel Séphadex G-10, G-15, G-25, et G-50. La distribution de la matière organique dissoute en fonction du poids moléculaire nominal a ainsi été obtenue pour ces types d'eau. En général, la limite supérieure du poids moléculaire nominal de ces distributions se situe autour de 5000. L'analyse des données chromatographiques semble démontrer l'agglomération possible de la matière organique dissoute provenant des eaux douces, lorsque ces eaux entrent en contact avec les eaux marines du fjord. Dans le cas des eaux saumâtres et marines, la présence de sel marin et de bicarbonate invalide le dosage de la matière organique.

HIP1R (Huntingtin interacting protein 1-related) a des rôles dans l'endocytose médiée par la clathrine, l'apoptose et la mitose. Elle induit l'assemblage de la clathrine, régule la polymérisation de l'actine, contribue au clivage de la caspase-9 et aide l'ancrage des chromosomes sur les microtubules lors de la métaphase. Les domaines protéiques responsables de ces contributions et les facteurs permettant à HIP1R de changer de rôle ne sont pas encore bien connus. Nous avons utilisé la technique du knock-down et nous avons réintroduit des versions mutées ou tronquées d'HIP1R pour caractériser ses rôles en modifiant ses liaisons avec ses partenaires. Les résultats indiqueraient qu'HIP1R participe principalement à l'internalisation des plaques de clathrine et qu'HIP1R n'induit pas l'activation de la caspase-3. Finalement, nous avons montré que la liaison d'HIP1R avec la clathrine lui confère son rôle lors de la mitose lui permettant ainsi de se localiser sur les microtubules pendant la métaphase.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / L'apoptose est un processus de mort cellulaire contrôlé génétiquement qui joue un rôle fondamental dans la maintenance de l'homéostasie cellulaire. Des deregulations de l'apoptose sont impliquées dans la tumorigénèse et la progression des cellules tumorales. Dans le traitement des cancers, la plupart des drogues utilisées en chimiothérapie induisent la mort des cellules tumorales par apoptose. Par conséquent, les gènes impliqués dans le contrôle de l'apoptose peuvent déterminer la réponse et la sensibilité des cellules tumorales aux drogues utilisées en chimiothérapie. Un contrôle défectif de l'apoptose représente une nouvelle forme de résistance aux traitements. Les gènes de la famille des ced9/egl-l/bcl jouent un rôle déterminant dans la phase d'engagement de l'apoptose. Parmi les produits de ces gènes, certains uihibent et d'autres stimulent l'apoptose et de nombreux travaux suggèrent que le niveau d'expression des protéines Ced-9/Egl-l/Bcl modulent la sensibilité des cellules tumorales aux agents cytotoxiques utilisés en chimiothérapie. Dans le but d'étudier la fonction et le mode d'action de certains membres de la fainille des Ced-9/Egl-l/Bcl, nous avons exprimé dans les cellules tumorales humaines Namalwa et U937, les protéines Bcl-xL et Bax-a ainsi que deux nouvelles isof ormes, Bcl-xES et Bax-o, que nous avons identifiées et clonées. Les cinétiques de fragnientation de l'ADN associée à l'apoptose, dans les cellules témoins et transfectées, montrent que Bcl-xL et Bcl-xES protègent les cellules face à l'apoptose induite par différentes drogues anticancéreuses telles que la camptothécine, l'étoposide, la vinblastine, le cisplatine et le taxol. En revanche, Bax-a ainsi que Bax-a, sensibilisent les cellules à l'effet cytotoxique de certaines de ces drogues. La quantification des complexes de clivage induits par la camptothécine ainsi que les mesures du taux d'inhibition de la synthèse de l'ADN dans les cellules transfectées et les cellules témoins, indiquent que Bcl-xL et Bax-a n'interfèrent pas avec le mécanisme d'action primaire de la drogue. Les mitochondries jouent un rôle central dans l'activation de l'apoptose. Suite à un dommage à l'ADN, la libéradon du cytochrome e par les mitochondries conduit à l'activation des caspases impliquées dans l'exécution du processus de mort cellulaire. L'utilisation d'un système acellulaire, la mesure des activités des caspases à l'aide de substrats fluorescents spécifiques ainsi que des analyses par buvardage Western, nous ont permis de démontrer que Bcl-xL et Bcl-xES retardent la libération du cytochrome e et l'activation subséquente des caspases alors que Bax-a et Bax-o exercent l'effet opposé. Nous montrons également que l'expression de la protéine Bcl-xL dans les cellules Namalwa modifie la réponse cellulaire face aux dommages induits par la camptothécine d'une part, en inhibant l'activation du programme apoptotique et d'autre part en permettant la restauration d'un point-contrôle du cycle cellulaire à la transidon G2/M. Des expériences de co-immunoprécipitations in vivo montrent que Bcl-xL interagit avec les complexes cdc2/cdkl-cycline A/B1 impliqués dans la progression S/G2 et la régulation de la transition G2/M du cycle cellulaire. De plus, la protéine recombinante Bcl-xL(ATM) inhibe de façon dose-dépendante l'activité kinase de cdc2/cdkl in vitro. Des expériences de compétition in vitro avec des peptides correspondant à des séquences spécifiques de Bcl-xL, ont permis de détenniner un domaine d'interaction de Bcl-xL avec les complexes cdkl/cdc2-cycline A/B1, localisé dans la région flexible de Bcl-xL. Ces résultats suggèrent, qu'en plus de son activité anti-apoptotique au niveau des mitochondries, Bcl-xL participe à un point-contrôle du cycle cellulaire en réponse à un doiiunage à l'ADN.

Les rétrovirus appartiennent à une famille de virus où les protéines virales sont codées par un transcrit sens pleine longueur suite à un épissage alternatif. Récemment, notre équipe a contribué à démontrer pour la première fois la présence d'une transcription antisens chez le rétrovirus HTLV-1 (Human T-cell Leukemia Virus). Ce transcrit antisens épissé a été caractérisé et semble être initié dans le LTR 3' (Long Terminal Repeat), permettant ainsi la production d'une nouvelle protéine virale, nommée HBZ (HTLV-1 bZIP factor). Cette dernière est une protéine nucléaire et a été décrite comme étant capable de réguler négativement la transcription virale dépendante de Tax en dimérisant avec des facteurs de transcription cellulaires tels que CREB-2 et certains membres de la famille Jun. Aussi, nous avons découvert et caractérisé des transcrits antisens chez HTLV-2, HTLV-3, HTLV-4 et VIH-l (Virus d'Immunodéficience Humaine). Ce projet de maîtrise avait pour objectif de caractériser les nouvelles protéines APH-3 et APH-4 codées par les transcrits antisens de HTLV-3 et HTLV-4 respectivement. Il s'agissait donc d'étudier leur localisation ainsi que leurs fonctions dans la réplication rétrovirale. D'abord, une comparaison de séquence avec HBZ a permis d'identifier deux régions basiques ainsi qu'un motif « bZIP-like ». Des études de localisation cellulaire de ces protéines ont ensuite été réalisées par microscopie confocale. Ainsi, nous avons démontré que APH-3 et APH4 apparaissent nucléaires, sous la forme de granules et, dans le cas d'APH-3 partiellement cytoplasmique. Ces granules co-localisent en partie avec HBZ et la nucléoline. Par la suite, des mutants de délétion dépourvus des motifs BR2, BR1 et DBD ont permis de conclure que APH-3 et APH-4 contrairement à HBZ délété se rendent au noyau. Aussi, des études faisant appel au gène rapporteur luciférase précédé d'un promoteur de collagénase (site AP-l), ont démontré que ces deux protéines contrairement à HBZ, activent la transcription dépendante de tous les membres des facteurs de transcription de la famille Jun. De plus, les mutants de délétions ont démontré que le motif « leucine zipper » atypique de ces protéines est impliqué dans cette régulation. Toutefois, une étude utilisant ces mutants de délétions et un gène rapporteur contenant le LTR 5' de HTLV-1 ont suggéré que le motif « leucine zipper » atypique ne semble pas être impliqué dans l'inhibition de la trans-activation par Tax. Finalement, ces travaux ont clairement mis en évidence que les transcrit antisens de HTLV-3 et HTLV-4 sont traduits tout comme chez d'autres rétrovirus. Ces protéines jouent d'importants rôles dans la réplication rétrovirale mais semblent avoir des fonctions différentes de celles de HBZ. Ces études ont permis d'approfondir la biologie moléculaire concernant la famille des rétrovirus et ainsi ouvrir de nouvelles perspectives dans ce domaine. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : APH, rétrovirus, HTLV, transcription antisens, HBZ, Jun, Tax.

L'épidermolyse bulleuse simplex (EBS) est caractérisée par un décollement intra-épidermique au niveau de la couche basale de Pépiderme aboutissant à la formation de bulles et de cloques cutanées. L'EBS est causée par des mutations au niveau des gènes qui codent pour la kératine 5 (K5) ou la kératine (K14), qui sont transmises majoritairement selon un mode autosomique dominant. L'EBS affecte environ 1/50 000 à 1/30 000 personnes dans le monde et elle est considérée comme une maladie orpheline. Dans cette étude, les kératinocytes ont été isolés de biopsies de la peau de patients atteints d'EBS ayant des mutations dans le gène KRT14 et de témoins non atteints. Des essais thérapeutiques utilisant l'interféron gamma (IFN-y) ont été réalisés afin de stimuler la production de la Kl5. Les résultats ont révélé que l'IFN-y réduit l'expression et la production de la Kl5 contrairement à ce que suggérait la littérature. Cette discordance pourrait s'expliquer par un effet « régulateur » de l'IFNy sur la Kl 5 lorsque les cellules seraient activées. Cette hypothèse a été validée par l'augmentation de l'expression de la KRT16 qui est considérée comme un marqueur de préactivation des kératinocytes. Ainsi, l'IFN-y ne semble pas être une cible thérapeutique potentielle pour l'EBS causée par une mutation de KTR14 (R125S).

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est une maladie multisystémique dominante qui représente la myopathie la plus fréquente chez l’adulte. Le muscle squelettique est particulièrement affecté : il s’atrophie et perd 1 à 3 % de sa force maximale par année. Les interventions cliniques sont sécuritaires en DM1 et certaines études rapportent même des augmentations de force musculaire. Toutefois, les dosages optimaux et les mécanismes physiologiques expliquant ces gains demeurent inconnus. Afin d’élucider ces questions, ce mémoire se divise en deux volets. Le premier volet (objectif 1) présente une revue systématique de type scoping review, qui résume les connaissances portant sur l’effet des interventions cliniques sur le muscle squelettique chez les personnes affectées par la DM1 et qui identifie les manques d’évidences scientifiques à ce sujet. Le second volet (objectif 2) étudie l’effet de l’exercice excentrique aigu sur les voies de signalisation de synthèse et de dégradation protéique dans le muscle squelettique. Pour ce second volet, 10 hommes atteints de DM1 ont accepté de participer à une séance unique d’exercice excentrique et de subir une biopsie musculaire avant et après l’exercice. La revue systématique rapporte que des gains de force sont possibles chez des individus atteints de DM1, cependant les résultats rapportés sont très hétérogènes. De plus, il existe de grandes lacunes au sujet de la compréhension des mécanismes physiologiques sous-jacents. Les résultats obtenus dans la réalisation du second volet de ce mémoire démontrent également une grande hétérogénéité dans les réponses observées chez les patients atteints de DM1. Par contre, ceux-ci suggèrent que, malgré le défaut génétique, les mécanismes impliqués dans l’hypertrophie semblent similaires à ceux rapportés chez le sujet sain. L’ensemble de ces connaissances aidera à guider les professionnels de la santé dans la prescription d’exercice à cette population dans le but d’améliorer la qualité de vie des personnes atteintes.

Le paludisme est une maladie tropicale due au parasite P. falciparum. Avec le grand nombre de victimes qui lui sont imputées chaque année, cette maladie demeure la plus grande parasitose tropicale et il est primordial de la combattre. Ce combat passe aussi bien par la sensibilisation des populations que par la recherche. Plusieurs échecs thérapeutiques, dus à la résistance du parasite aux médicaments déjà disponibles, sont recensés. L’émergence de cette résistance pousse la recherche à identifier de nouvelles molécules antipaludiques. Ces travaux de thèse s'inscrivent dans le cadre d'une meilleure connaissance de la biologie du parasite dans le but d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et de déterminer de nouvelles stratégies antipaludiques. Les protéines kinases, dont la protéine kinase A (PKA), sont connues pour avoir des rôles clé dans la régulation du cycle cellulaire. La régulation spatiale et temporelle de la PKA est assurée par des protéines d'ancrage appelées AKAP (A Kinase Anchoring Protéines). Nous avons identifié par homologie de séquences la première protéine AKAP putative chez P. falciparum (PfAKAP). Associant des études de biologie moléculaire (RT-PCR, interruption génique), de biologie cellulaire (immunofluorescence), de biochimie (« pull-down », « peptide array »), et de protéomique (spectrométrie de masse), nous avons caractérisé la PfAKAP. Cette protéine, majoritairement exprimée aux stades matures du développement érythrocytaire, semble importante pour le développement du parasite mais n'interagit pas directement avec la PKA du parasite. Elle fait intervenir des partenaires protéiques tels que la protéine Pf14-3-3I. En effet, la Pf14-3-3I pourrait être un substrat de la PfPKA et cependant jouer un rôle dans sa localisation. Par ailleurs, comme son proche homologue humain l’AKAP18, la PfAKAP interagit avec les nucléotides comme l’AMP et l’AMPc. Cela suggère entre autres que cette protéine peut interagir avec la voie de l'AMPK ou avec celle des phosphodiestérases chez le parasite. Nos premiers résultats sont encourageants et révèlent l’importance de la PfAKAP pour le développement parasitaire. Des recherches complémentaires permettront à l'avenir de développer et concevoir des nouvelles stratégies thérapeutiques comme celle des peptides interférents. / Pas de résumé

L'épidermolyse bulleuse simplex (EBS) est caractérisée par un décollement intra-épidermique au niveau de la couche basale de Pépiderme aboutissant à la formation de bulles et de cloques cutanées. L'EBS est causée par des mutations au niveau des gènes qui codent pour la kératine 5 (K5) ou la kératine (K14), qui sont transmises majoritairement selon un mode autosomique dominant. L'EBS affecte environ 1/50 000 à 1/30 000 personnes dans le monde et elle est considérée comme une maladie orpheline. Dans cette étude, les kératinocytes ont été isolés de biopsies de la peau de patients atteints d'EBS ayant des mutations dans le gène KRT14 et de témoins non atteints. Des essais thérapeutiques utilisant l'interféron gamma (IFN-y) ont été réalisés afin de stimuler la production de la Kl5. Les résultats ont révélé que l'IFN-y réduit l'expression et la production de la Kl5 contrairement à ce que suggérait la littérature. Cette discordance pourrait s'expliquer par un effet « régulateur » de l'IFNy sur la Kl 5 lorsque les cellules seraient activées. Cette hypothèse a été validée par l'augmentation de l'expression de la KRT16 qui est considérée comme un marqueur de préactivation des kératinocytes. Ainsi, l'IFN-y ne semble pas être une cible thérapeutique potentielle pour l'EBS causée par une mutation de KTR14 (R125S).

Le contrôle de l'aérocontamination fongique est devenu un objectif majeur pour préserver la santé humaine et animale. L'évaluation de l'aérocontamination fongique fait classiquement appel aux techniques de mise en culture ou de dosage de composants fongiques présents dans l'air. Ces techniques présentent des inconvénients. C'est la raison pour laquelle, nous nous sommes fixés comme objectif de mettre au point des méthodes d'analyse alternatives utilisant des outils de biologie moléculaire. Dans un premier temps, nous avons comparé plusieurs techniques de prélèvements d'air dans des environnements intérieurs présentant une contamination plus ou moins élevée. Nous avons, par la suite, optimisé les conditions d'extraction de l'ADN fongique à partir de prélèvements d'air. L'ADN extrait a été amplifié par PCR à semi-nichée ? avec des amorces universelles permettant d'amplifier une partie de l'ARNr 18S de champignons. Par la suite, nous avons utilisé la TTGE (Temporal Temperature Gradient Electrophoresis) et la D-HPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography) pour séparer les amplificats. Chaque produit de PCR a été identifié par séquençage direct après purification. La comparaison des espèces identifiées par ces techniques avec celles qui sont obtenues par la méthode classique (culture) apporte de meilleurs renseignements sur la qualité fongique d'un même prélèvement d'air. L'application de ces techniques dans des environnements à diff'rents niveaux de contamination a permis de déduire que l'étude de l'évaluation de l'aérocontamination fongique se fait par l'association de la culture et des méthodes moléculaires / Fungal spores represent a significant part of the biological contaminants that could be detected in air. Exposure to fungi has been associated with several types of human or animal health problems (mycosis, allergy, mycotoxicosis). To evaluate the relationship between airborne fungi potential and adverse health effect, the fungal types and their relative frequencies in air need to be investigated. Traditional methods for fungal identification (culture and microscopy analysis) are laborious, time-consuming and require expertise. To replace cultivation, several techniques have been proposed. This study showed that molecular techniques (PCR-TTGE or Temporal Temperature Gradient Electrophoresis and PCR-DHPLC or Denaturing High Performance Liquid Chromatography) allowed the separation of amplificons corresponding to distinct fungal species that may be encountered in air. Both methods were proved to be appropriate for analysis of complex fungal communities. The detection and the molecular identification techniques were adapted for the evaluation of indoor airborne fungal contamination. The cultivation method and culture-independent techniques were further compared for the analysis of fungal aerosols from different sites

De nombreux individus consomment une, ou plusieurs, substances psychoactives au cours de leur vie. Alors que la majorité des consommateurs maintient une utilisation épisodique et contrôlée, certains perdent le contrôle sur l’usage de la substance ; symptôme majeur d’une addiction. Comprendre les mécanismes psychobiologiques, qui sous-tendent cette vulnérabilité à passer d’un usage contrôlé à un usage compulsif, constituerait une étape décisive dans la compréhension de la pathologie et l’identification de cibles thérapeutiques pertinentes. En effet, malgré un intense effort de recherche au cours des 40 dernières années, les thérapies disponibles se révèlent d’une efficacité limitée. Il faut probablement en chercher la cause dans la complexité de la pathologie, mais aussi dans l’inadéquation des préparations expérimentales à la définition clinique de l'addiction. Dans ce contexte, une étape décisive a été franchie il y a 5 ans lorsque des chercheurs de notre équipe ont développé le premier modèle pluri-symptomatique d’addiction à la cocaïne chez le rat. Grâce à ce modèle, il est possible d’identifier des animaux qui développent un comportement similaire à l’addiction, alors que d’autres maintiennent un usage contrôlé, et ce, malgré une consommation préalable de drogue équivalente. S'appuyant sur ce modèle d'addiction chez le rat, le but de nos travaux de thèse était d’identifier des différences neurobiologiques entre usagers addicts et non-addicts et d’aborder les mécanismes neurobiologiques qui sous-tendent la transition vers l’addiction. Pour ce second point, nous avons considéré les différences majeures identifiées et étudié leur évolution de l’usage précoce de cocaïne (avant l'addiction) à l'usage tardif (après développement de l’addiction) en fonction des sujets (addicts versus non-addicts). Nous avons utilisé une approche multidisciplinaire associant les principales méthodes des neurosciences comportementales, moléculaires et des systèmes. Nous avons comparé addicts et non-addicts au moyen d’une stratégie ciblée et d’une stratégie non ciblée. La stratégie non ciblée a consisté à évaluer l'expression des gènes à grande échelle, dans des structures cérébrales clés, au moyen d’une technique de gene profiling (environ 28 000 gènes testés simultanément). L'approche ciblée a consisté à analyser des facteurs connus pour être modifiés par l'usage ou l’administration chronique de cocaïne. Nous nous sommes concentrés sur une structure majeure, le noyau accumbens, et avons étudié : i. l'expression de gènes cibles au moyen de la qPCR, ii. plusieurs formes de plasticité synaptique à l'aide de l’électrophysiologie in vitro, iii. l'activité des neurones dopaminergiques de l’aire tegmentale ventrale (VTA) (projetant vers le noyau accumbens) au moyen de l’électrophysiologie in vivo, iv. la libération de dopamine dans le noyau accumbens au moyen de la microdialyse in vivo. Nous avons montré que les rats addicts et non-addicts s'adaptent très différemment à la cocaïne. Les usagers non-addicts paraissent en mesure de contrecarrer les changements neurobiologiques précoces provoqués par la cocaïne, tandis que les addicts ne le sont pas. Ils présentent des réponses neurobiologiques similaires à celles d'animaux naïfs vis-à-vis de la cocaïne ou d'animaux ayant été exposés à la drogue sur une très courte période. En résumé, les données obtenues au cours de ce travail de thèse modifient drastiquement la perception commune de la psychopathologie de l’addiction. L'addiction résulterait moins de modifications produites par la drogue (comme on le pense depuis 40 ans) que de l'incapacité à lutter contre ces modifications. / Numerous individuals consume one, or several, psychoactive substances during their lifetime. Although most consumers make only occasional and controlled use of a substance, some lose control of their use, which constitutes a major symptom of addiction. Understanding the psychobiological mechanisms which underlie this vulnerability to the transition from controlled drug use to addiction would constitute a decisive step forward in our understanding of the pathology and in our identification of the relevant therapeutic targets. Indeed despite intense research efforts during the last 40 years, the therapies available are of limited efficacy. This is probably related to the complexity of the pathology, as well as to the unsuitability of experimental preparations to the clinical definition of addiction. In such a context, there was a significant breakthrough 5 years ago when our research team developed the first pluri-symptomatic model of cocaine addiction in the rat. Thanks to this model it is possible to single out animals that develop an addiction-like behavior from others that, despite equivalent prior drug consumption, keep their use under control. The aim of our doctoral research, based on this rat addiction model, was to identify the neurobiological differences between addicted and non-addicted users, and then to start investigating neurobiological mechanisms that could underly transition to addiction. For this latter point we considered the major differences identified between addicts and non-addicts, and we studied their evolution from early (before addiction) to late cocaine use (after addiction development). We used a multidisciplinary approach associating behavioral, molecular and systems neuroscience. We compared addicts and non-addicts by means of a targeted strategy and a non-targeted strategy. The non-targeted strategy consisted in evaluating large-scale gene expression by means of a gene–profiling technique (approximately 28,000 genes tested simultaneously). The targeted approach consisted in analysing factors known to be modified by the use or chronic administration of cocaine. Concentrating on one main structure, the nucleus accumbens, we studied: (i) the expression of targeted genes by means of qPCR; (ii) several forms of synaptic plasticity using in vitro electrophysiology; (iii) the activity of the dopaminergic neurons of the ventral tegmental area (VTA) (projecting towards the nucleus accumbens) using in vivo electrophysiology; (iv) the liberation of dopamine in the nucleus accumbens by means of in vivo microdialysis. We showed that addict and non-addict rats adapt to cocaine in very different ways. Non-addict users seem able to counteract the early neurobiological changes triggered by cocaine, while addict users are not. Addict users present neurobiological responses to cocaine that are similar to those of naive animals or of animals having been exposed to the drug for a very short period. In conclusion, the data obtained during this PhD work radically modify the general perception of the psychopathology of addiction. Addiction would be less due to modifications produced by the drug (as thought for the last 40 years) than to the inability to fight against those modifications.