Orientador: Mario de Oliveira Neto / Resumo: A biomassa lignocelulósica pode ser usada para a produção de energia ou de novos bioprodutos potenciais substitutos de químicos convencionais. Porém a conversão dos polissacarídeos estruturais presentes na parede celular vegetal das células que compõe a biomassa não é simples. Isto se deve principalmente pela presença da lignina, que juntamente com a hemicelulose, formam uma estrutura coesa de microfibrilas que entrelaçam a celulose. Compostos que inibem as enzimas celulolíticas, incluindo fenólicos solúveis (derivados da lignina), açúcares solúveis, aldeídos de furano e ácidos fracos são gerados durante os diversos pré-tratamentos utilizados atualmente. Neste estudo, observamos como os fenólicos solúveis interagem com -glicosidases. Para isso, combinamos simulações de ensaio enzimático, docking molecular e dinâmica molecular para descrever o processo de ligação. Notavelmente, o ácido tânico, um dos fenólicos solúveis estudados, foi a molécula com maior poder inibitório em comparação com todos os demais fenólicos. Possivelmente devido ao seu comprimento e suas substituições de grupos químicos. A alta presença de anéis aromáticos e grupos hidroxilas no ácido tânico, leva a maior interação entre as moléculas e consequente inibição/desativação das β-glicosidases bacterianas, enquanto os grupos carboxílicos presentes nos demais fenólicos alteram os efeitos físico-químicos aumentando a hidrofobicidade; criando cargas eletrostáticas e aumentando a ligação de hidrogênio, afetando a... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Lignocellulosic biomass can be transformed to chemicals or energy products. However converting polysaccharides present on the cell wall can be limitated due to the high recalcitrance caused by the presence of lignin. Compounds that inhibit enzymes, including lignin-derived phenolics, soluble sugars, furan aldehydes, and weak acids, are generated during the various pre-treatments currently used. In this study was observed how the soluble phenolics generated significantly impede the enzymatic hydrolysis of cellulose. For this were combine enzymatic assay, molecular docking and molecular dynamics simulations to describe the binding process between soluble phenolics and bacterial β-glycosidases. Notably, tannic acid, one of the soluble phenolics generated, was the strongest inhibitory molecule in comparison with all phenolics studied. Possibly because of its length and its substitutions of chemical groups. The high presence of aromatic rings and hydroxyl groups in tannic acid leads to greater interaction between the molecules and consequent inhibition / deactivation of bacterial β-glycosidases. Taken together, our studies of the interaction suggest that there is a high correlation between exposed hydrophobic surface areas and the number of binding sites on the inhibition of βglucosidases. These data may provide a useful basis for future biotechnological applications of microbial β-glucosidases, especially in the field of biofuel production. / Doutor

A biomassa lignocelulósica é uma fonte abundante de açúcares simples passíveis de serem fermentados em uma variedade de bioprodutos de maior valor agregado, além do etanol de segunda geração. Tal diversidade é relevante ao desenvolvimento e aprimoramento do conceito de biorrefinarias e da bioeconomia, em um viés mais amplo. Todavia, a elevada recalcitrância dos lignocelulósicos dificulta a sua sacarificação enzimática, resultando em bioprocessos mais onerosos. Por isso, coquetéis com diferentes enzimas ativas em carboidrato (CAZymes) são desenvolvidos, em busca de uma maior eficiência e melhor relação custo/benefício, para processos em larga escala. Dentre as CAZymes estudadas, encontram-se as mono-oxigenases líticas de polissacarídeo (LPMOs), tendo em vista a sua atestada capacidade de otimizar a hidrólise da lignocelulose, quando em sinergismo com diversas hidrolases. Levando isto em conta, selecionou-se, ao atual estudo, o ascomiceto termofílico Thermothelomyces thermophila (anteriormente denominado Myceliophthora thermophila), pois este tem se mostrado capaz de expressar e secretar ampla gama de LPMOs ativas em diferentes substratos. Objetivando-se estudar duas LPMOs derivadas deste organismo, as mesmas foram expressas, heterologamente, por Aspergillus nidulans linhagem A773, utilizando-se o vetor de expressão pEXPYR construído para viabilizar a secreção de altas concentrações de proteínas recombinantes. As proteínas heterólogas aqui analisadas foram denominadas TtLPMO1A9 e TtLPMO2A9. Embora ambas tenham sido capazes de gerar peróxido de hidrogênio na presença de oxigênio molecular e de um doador de elétrons, apenas TtLPMO2A9 apresentou atividade contra substratos celulósicos e bagaço de cana pré-tratado hidrotermicamente, atuando, em associação com hidrolases homemade e o preparo enzimático comercial Celluclast 1.5L, a degradação de tais materiais. / The lignocellulosic biomass is an abundant source of simple sugars that can be fermented to various value-added bio-based products. This diversity is seen as relevant to the improvement of biorefinery and bioeconomy concept. Nevertheless, the significant recalcitrance of lignocellulose imposes dificulties to its enzymatic saccharification, resulting in onerous bioprocessing. This scenario stimulates studies based on the development of efficient and cost-effective customizable carbohydrate-active enzyme (CAZymes) cocktails for large-scale processes. Among the available CAZymes, there are the lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs), a set of oxidative proteins capable of optimizing the lignocellulose hydrolysis, when acting in synergism with various hydrolases. Based on this fact, in the current study, the thermophilic ascomycete Thermothelomyces thermophila (previously known as Myceliophthora thermophila) was adopted, because of its ability of expressing and secreting large amounts of LPMOs. Thus, two LPMOs derived from this fungus was heterologously produced by an expression system composed by Aspergillus nidulans strain A773 and the vector pEXPYR: an expression vector built to increase the secretion of recombinant proteins. The heterologous proteins herein analysed were termed as TtLPMO1A9 and TtLPMO2A9. Although both enzymes were able to produce hydrogen peroxide in the presence of molecular oxygen and an electron donor, only the second one was active in reactions with cellulosic substrates and hydrothermally pre-treated sugar cane bagasse. When tailor-made hydrolases and the commercial enzymatic mixture Celluclast 1.5L were supplemented with TtLPMO2A9, it was noticed na improvement of the deconstruction of the aforementioned substrates.

Renewable energy sources have been proposed as a viable option to mitigate the consumption and the dependence of fossil fuels. Among the available alternatives, lignocellulosic biomass has shown great potential for bioenergy generation, and biofuels as ethanol can be obtained by fermentation from sugars present in cellulosic and hemicellulosic fractions of biomass. However, for the efficient release of fermentable sugars during the enzymatic hydrolysis step, a pretreatment process is required to modify the material in its structure and composition. In this context, hydrodynamic cavitation (HC) was proposed in this work as a new and promising alternative for pretreatment of sugarcane bagasse. Firstly, the variables NaOH concentration, solid/liquid (S/L) ratio and HC process time were optimized in HC assisted pretreatment. In optimized conditions (0.48 mol/L of NaOH, 4.27% of S/L ratio and 44.48 min), high lignin removal (60.4%) and enzymatic digestibility of cellulose fraction (97.2%) were obtained. Based in those results, new variables (inlet pressure, temperature, alkali concentration) were included for evaluation in a second stage of the study aiming to reduce the HC pretreatment time. In this case, temperature and álcali concentration showed more significance on lignin removal and hydrolysis yield of carbohydrate fraction in pretreated biomass. No significant difference in pretreatment efficiency was observed in 20 and 30 min of process time in the best conditions (70 °C, 3 bar of inlet pressure and 0.3 mol/L of NaOH). The dimensionless cavitation number influence also was evaluated in two levels (0.017 and 0.048), resulting higher efficiency using low cavitation number which was obtained using orifice plate with 16 holes (1 mm of diameter). Using the last optimized conditions and lower temperature (60 °C instead 70 °C) in order to avoid the foam formation when black liquor is reused, other alkalis (Ca(OH)2, Na2CO3, KOH) were evaluated in combination with HC and compared to the use of NaOH. High enzymatic conversions of carbohydrate fraction were observed in biomass pretreated using KOH-HC and NaOH-HC; additionally, NaOH black liquor was reused in 10 sequential batches. The pretreated biomass using fresh and reused black liquor were mixed and used for simultaneous saccharification and fermentation process (SSF) in interconnected column reactors, resulting in 62.33% of hydrolysis of total carbohydrate fractions and 17.26 g/L of ethanol production (0.48 g of ethanol/g of glucose and xylose consumed). Finally, the addition of oxidant agent (H2O2) in the alkali HC-process was optimized. In selected conditions (0.29 mol/L of NaOH, 0.78 % v/v of H2O2 and 9.8 min), 95,43% and 81.34% of enzymatic hydrolysis yield of cellulose and hemicellulose fraction were achieved respectively, using 5% of solid loading (S/L) in the hydrolysis process. When packed bed flow-through column reactor using 20% of S/L was used, 74.7% cellulose hydrolysis yield was reached. Sugars present in hydrolysate were also fermented into ethanol in bubble column reactor resulting in a yield value of 0.49 g/g and 0.68 g/L.h of productivity. By analyzing the results as a whole, HC was shown as a promising technology to accelerate the pretreatment time under mild conditions, showing advantages as simplicity of system and possibility to application in industrial scale. / O uso de fontes de energia renováveis tem sido proposto como uma alternativa viável para reduzir o consumo e a dependência de combustíveis fósseis. Entre as alternativas disponíveis, a biomassa lignocelulósica apresenta grande potencial para geração de bioenergia, sendo que biocombustíveis como o etanol podem ser obtidos por fermentação a partir de açúcares presentes em suas frações celulósicas e hemicelulósicas. No entanto, para a liberação eficiente de açúcares fermentáveis na etapa de hidrólise enzimática, é necessário um processo prévio de pré-tratamento para modificar a estrutura e composição do material. Neste contexto, no presente trabalho a cavitação hidrodinâmica (CH) foi proposta como uma nova e promissora alternativa para o pré-tratamento do bagaço de cana-de-açúcar. Em uma primeira etapa, as variáveis concentração de NaOH, relação sólido/líquido (S/L) e tempo de processo foram otimizadas no pré-tratamento assistido por CH. Em condições otimizadas (0,48 mol/L de NaOH, 4,27% de relação S/L e 44,48 min), elevados valores de remoção de lignina (60,4%) e digestibilidade enzimática da fração de celulose (97,2%) foram obtidos. Com base nesses resultados, novas variáveis (pressão à montante, temperatura e concentração de álcali) foram incluídas para avaliação em uma segunda etapa do estudo com o objetivo de reduzir o tempo de pré-tratamento com CH. Neste caso, a temperatura e a concentração de álcalis foram as mais importantes na remoção de lignina e influenciaram na hidrólise das frações carboidrato da biomassa pré-tratada. Não houve diferença significativa na eficiência do pré-tratamento em 20 e 30 minutos de tempo de processo nas melhores condições (70 ° C, 3 bar de pressão a montante e 0,3 mol/L de NaOH). A influência do adimensional -número de cavitação? também foi avaliada em dois níveis (0,017 e 0,048), resultando em maior eficiência usando o número de cavitação mais baixo, que foi obtido usando placa de orifício com 16 furos (1 mm de diâmetro). Usando estas condições otimizadas e menor temperatura (60 ° C ao invés de 70 ° C) para evitar a formação de espuma quando o licor negro é reutilizado, outros álcalis (Ca (OH)2, Na2CO3, KOH) foram avaliados em combinação com CH e comparados com o uso de NaOH. Conversões enzimáticas elevadas das frações carboidrato foram observadas em material pré-tratado utilizando KOH-CH e NaOH-CH; além disso, o licor negro de NaOH foi reutilizado em 10 bateladas sequenciais. As biomassas pré-tratadas com licor negro reutilizado e fresco foram misturadas e utilizadas em processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF) em reatores de coluna interligados, resultando em 62,33% de hidrólise das frações carboidrato e 17,26 g/L de produção de etanol (0,48 g de etanol/g de glicose e xilose consumidos). Finalmente, a adição de agente oxidante (H2O2) no processo alcalino-CH foi otimizado. Nas condições selecionadas (0,29 mol/L de NaOH, 0,78% v/v de H2O2 e 9,8 min), 95,43% e 81,34% de rendimento de hidrólise enzimática das frações de celulose e hemicelulose, respectivamente, foram obtidos utilizando 5% de carregamento de sólidos (S/L) no processo de hidrólise. Quando foi utilizado reator de coluna de leito fixo com 20% de S/L, atingiu-se 74,7% de rendimento de hidrólise de celulose. Os açúcares presentes no hidrolisado também foram fermentados em etanol em um reator de coluna de bolhas, resultando em um valor de rendimento de 0,49 g/g e 0,68 g/L.h de produtividade. Analisando-se os resultados de uma forma global, demonstrou-se que a CH é uma tecnologia promissora para acelerar o tempo de pré-tratamento em condições amenas, mostrando vantagens como simplicidade do sistema e possibilidade de aplicação em escala industrial.

Para tornar a biomassa disponível para aplicações em biocombustíveis, produtos químicos e materiais, algumas propriedades indesejáveis, como alto teor de umidade e baixa densidade, devem ser corrigidos. Uma solução para estes problemas seria a densificação da biomassa. O processo de densificação da biomassa e seus resíduos, como a briquetagem e a peletização, são muito conhecidos e utilizados, entretanto, não existe um consenso sobre os mecanismos de ligação que ocorre entre as partículas da biomassa densificada e a influência que as variáveis da matéria-prima e do processo de densificação exerce sobre eles. Compreender os mecanismos de ligação entre as partículas da biomassa densificada é fundamental para determinar os parâmetros da matéria-prima e do processo de densificação, assim como os ensaios que devem ser realizados para medir a qualidade do produto densificado. Este trabalho teve como objetivo principal analisar o efeito das variáveis do material e do processo de densificação da serragem de madeira nas propriedades do produto densificado e a sua influência sobre os mecanismos de ligação entre as partículas do material. O material utilizado neste trabalho foi a serragem de Eucalyptus sp. Foram analisados o efeito do teor de umidade do material e a temperatura do processo de densificação na densidade e resistência mecânica do produto densificado, como também a influência da composição química da serragem na transição vítrea do material. A serragem de eucalipto foi caracterizada por análise termogravimétrica (TGA), caracterização química e espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR). A caracterização de serragem densificada foi realizada por densidade aparente, expansão volumétrica, ensaio mecânico de compressão, microscopia eletrônica de varredura (MEV), microscopia ótica (MO), espectrometria de massa de íons secundários por tempo de voo (ToF-SIMS) e análise dinâmico-mecânica (DMA). Os resultados mostraram que no processo de densificação sem aquecimento, o teor de umidade ideal da serragem de eucalipto foi o de aproximadamente 10%, favorecendo as forças intermoleculares entre as partículas do material. Na densificação da serragem de eucalipto em diferentes temperaturas, a lignina agiu como um aglutinante natural, formando pontes sólidas entre as partículas do material em temperaturas superiores à 140°C. A transição vítrea encontrada para a lignina da serragem de eucalipto foi da ordem de 135°C. Em conclusão, as variáveis do material e do processo de densificação influenciaram nos mecanismos de ligação, afetando as propriedades da serragem de madeira densificada. Os principais mecanismos de ligação encontrados na serragem de madeira densificada foram interações intermoleculares e pontes sólidas. / Making biomass available for investments in biofuels, chemicals and materials, some undesirable properties as high moisture content and low density must be corrected. One solution to these problems would be densification of biomass. The densification process of biomass and waste materials, such as briquetting and pelletizing, are well known and used, however, there is no consensus about the connection mechanism occurs between the particles of the densified biomass and the influence of the variables of raw material and densification process has on them. Understanding the connection mechanism between the particles of the densified biomass is critical in determining the parameters of the raw material and the densification process, as well as the tests that should be performed to measure the quality of densified product. This study aimed to analyze the effect of varying the material and the densification process of sawdust in the densified product features and their influence on the binding mechanism between the particles of the material. The material in this work was the sawdust Eucalyptus sp. It was analyzed the effect of the material moisture content and temperature of the densification process in the density and mechanical strength of the densified product, but also the influence of the chemical composition of sawdust on the glass transition of the material. The eucalyptus sawdust was characterized by thermogravimetric analysis (TGA), chemical analysis and Fourier transform infrared spectroscopic (FTIR). The characterization of densified sawdust was performed by bulk density, volumetric expansion, compression mechanical testing, scanning electron microscopy (SEM), optical microscopy (OM), mass spectrometry of secondary ions time of flight (ToF-SIMS) and dynamical mechanical analysis (DMA). The results showed that without the heat densification process, the ideal moisture content eucalyptus sawdust was about 10%, favoring the intermolecular forces between particles of the material. In eucalyptus sawdust densification at different temperatures, lignin acted as a natural binder to form solid bridges between particles of the material at temperatures higher than 140°C. The glass transition temperature of the lignin found to eucalyptus sawdust was of the order of 135°C. In conclusion, the variables of material and densification process influenced the binding mechanism affecting the properties of the densified wood sawdust. The main binding mechanism found in densified wood sawdust were intermolecular interactions and solid bridges.

Petroleum and its derivatives make up the largest portion of Brazil’s current energy matrix. It is well known that these are non-renewable and pollution-causing sources of energy; as such, the last decades have been marked by research and development of new, cleaner technologies. One of them being the hydrolysis of lignocellulosic materials to produce bioethanol. Brazil has an ample variety and large volumes of lignocellulosic biomass like corn husk and corncob. However, these biomass sources have complex structures which give rise to difficulties during the posterior stages of hydrolysis. Thus, it becomes necessary to conduct a pretreatment in order to alter these complex structures and make them more accessible to attack by microorganisms and enzymes. This work investigated two pretreatment methods for biomass coming from corn husk and corncob: pretreatment with dilute sulfuric acid and hydrothermal pretreatment; aiming to determine which method was more suitable for the given experimental conditions. An experimental design method was used to determine the best operating conditions for the acid pretreatment. Chemical characterization was used to evaluate the efficiency of the hydrothermal pretreatment. Both biomass sources were analyzed via Superior Calorific Power (SCP) resulting in17.276,5 J/g for corn husk and 17.872,0 J/g for corncob. Regarding the hydrothermal pretreatment, results showed reduction of the three components of biomass: cellulose, hemicellulose and lignin. Ideally, cellulose should not be degraded during the pretreatment. Therefore, the conditions leading to the lowest cellulose removal were determined: corn husk pretreatment at 170°C for 15 minutes and corncob pretreatment at 195°C for 10 minutes. The factors evaluated during the sulfuric acid pretreatment were: concentration, heating time and temperature. The two-variable factorial experiment with three replicates suggested that the highest reduced sugar percentages are obtained with low acid concentrations and high temperatures. Moreover, time was not a significant factor. Test 3 and 12 yielded the best results for both sources of biomass. The conditions for test 3 were: 120°C, a 15 minutes heating time and 0,5% sulfuric acid which resulted in 50,9% reduced sugars for corn husk and 42,6% for corncob. The conditions for test 12 were: 110°C, a 7 minutes heating time, and 2% sulfuric acid which resulted in 59,4% reduced sugars for corn husk and 61,5% for corncob. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / No panorama energético atual, nota-se que a utilização do petróleo e seus derivados ainda têm representado a maior fonte de energia em nosso país. Visto que essas fontes são não renováveis e poluentes, a necessidade de utilização de outras rotas, que sejam mais limpas, tem crescido ao longo dos anos. Quando se trata de materiais lignocelulósicos para a produção do bioetanol, encontra-se uma ampla variedade de biomassas, como é o caso da palha e do sabugo do milho. Porém essas biomassas possuem uma estrutura complexa, que dificulta as etapas posteriores de hidrólise. Logo, torna-se imprescindível a realização de um pré-tratamento que irá alterar essa estrutura, tornando-a mais acessível ao ataque de microrganismos e enzimas. Nesse trabalho, dois tipos de pré-tratamentos foram estudados, o pré-tratamento com ácido sulfúrico diluído e o pré-tratamento hidrotérmico, com o intuito de avaliar o mais viável, levando em conta todos os fatores envolvidos. O planejamento experimental foi uma ferramenta utilizada para a escolha das melhores condições operacionais do pré-tratamento com ácido diluído. Uma caracterização química foi realizada para avaliar a eficiência do pré-tratamento hidrotérmico. Análises de poder calorífico superior (PCS) também foram realizadas com as duas matérias-primas e os resultados do PCS foram de 17.276,5 J/g para a palha de milho e de 17.872,0 J/g para o sabugo. Em relação ao pré-tratamento hidrotérmico realizado, os resultados mostraram redução nos três componentes: celulose, hemicelulose e lignina. O¬¬¬¬ ideal é que a celulose sofra desorganização, contudo que não seja degradada, porém aqui se avaliou a melhor condição pela menor remoção de celulose, que foi dada com o pré-tratamento da palha de milho sob as condições de 170°C por 15 minutos e com o pré- tratamento do sabugo sob as condições de 195°C por 10 minutos. Já com relação ao pré-tratamento ácido, que ocorreu com utilização dos fatores: concentração de ácido sulfúrico, temperatura e tempo de aquecimento, um planejamento experimental em estrela com triplicata no ponto central mostrou que maiores percentuais de ART são dados quando se trabalha com baixas concentrações de ácido e elevadas temperaturas, na faixa investigada. O fator tempo não se mostrou significativo. As melhores condições foram obtidas nos ensaios 3 e 12 para ambas as biomassas. Com a temperatura de 120°C, tempo de 15 minutos e 0,5% de concentração de ácido sulfúrico, condição 3, obteve-se 50,9% de ART para a palha e 42,6% para o sabugo. Já com a temperatura de 110°C, tempo de 7 minutos e 2% de ácido, que foi a condição 12, obteve-se 59,4% de ART para a palha e 61,5% para o sabugo.

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In this context, Bioethanol is a good option and lignocellulosic biomass is an interesting way of obtaining it. The enzymatic conversion of lignocellulosic biomass in fermentable sugars still is a costly process, which makes characterization mechanisms indispensable to make it economically viable. Being of great importance in the lignocellulosic biomass convertion, β-glucosidases catalyzed reaction is the last step in the saccharification processes. Beta glucosidase hydrolyze non-reduced β-D-glycoside terminals, releasing β-D-glucose. GH 1 and GH 3 are the families of those most studied enzymes. However, structural and functional data from this GH 3 family of enzymes are still scarce. This work aimed at the biochemical and structural characterization of β-glucosidase from Bifidobacterium adolescentis (BaBgl). This enzyme has a catalytic domain (CCD) and a fibronectin III-like domain (FnIII) whose function is still unknown. Biochemical data showed optimal conditions for enzyme activity at pH from 6.0 to 6.5, temperature at 45 ° C and synthetic substrate specificity of 4-nitrophenyl- -Dglucopyranoside (pNPG). The values of kinetic parameters, KM and Vmax, were 0.32±0.03 mM e 0.37±0.01 nmol/min, respectively. The enzyme doesn’t have transglycosylation mechanisms, indicating only hydrolytic activity. Some monosaccharides such as xylose and galactose increased the enzyme activity significantly, while glucose and arabinose inhibited it. The crystal structural model of the BaBgl revealed an N-terminal domain with fold like a TIM barrel, an intermediate sandwich α / β domain and a third C-terminal like FnIII domain. In this work we also studied the transglycosylation mechanisms of two β-glucosidases from Trichoderma harzianum (ThBgl1 and ThBgl2). Both enzymes exhibit transglycosylation reaction but the ThBgl1 showed a hydrolysis/transglycosylation ratio lower than the one for ThBgl2. Crystallographic structures shows a typical folding for GH family 1 β-glucosidases, folding in the form of a TIM barrel (α / β)8. However, ThBgl2 has a more polar active site and therefore, favorites the interaction with water molecules, promoting better the hydrolysis reaction when compared to ThBgl1. / A preocupação ambiental e com a qualidade de vida da população aliados com o esgotamento dos combustíveis fósseis, tem aumentado a busca por energias alternativas e sustentáveis. Neste contexto, a hidrólise da biomassa lignocelulósica é uma opção interessante para obtenção de bioetanol. A utilização de enzimas para conversão da biomassa lignocelulósica a açúcares fermentescíveis ainda é um processo de custo elevado, o que torna imprescindível os estudos de caracterização dos mecanismos dessas enzimas afim de torná-las economicamente mais viáveis. A reação catalisada por β-glicosidases é a última etapa da sacarificação da celulose, sendo de grande relevância na conversão da biomassa ignocelulósica. β- glicosidases hidrolisam terminais não reduzidos β-D-glicosil liberando β-D-glicose e GH 1 e GH 3 são as famílias dessas enzimas mais estudadas. Entretanto dados estruturais e funcionais das enzimas da família GH 3, ainda são escassos. O presente trabalho apresenta a caracterização bioquímica e estrutural de uma β-glicosidase de Bifidobacterium adolescentis (BaBgl). Essa enzima possui um domínio catalítico (CCD) e um domínio do tipo fibronectina III (FnIII) cuja função ainda é desconhecida. Os dados bioquímicos revelaram condições ótimas para atividade da enzima em pH entre 6,0 e 6,5, temperatura de 45 °C e especificidade pelo substrato sintético 4- nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo (pNPG). Os parâmetros cinéticos KM e Vmáx apresentaram valores de 0,32±0,03 mM e 0,37±0,01 nmol/min respectivamente. A enzima não apresentou mecanismos de transglicosilação, indicando apenas atividade hidrolítica. Ensaios com monossacarídeos como xilose e galactose aumentaram significativamente a atividade enzimática enquanto que glicose e arabinose inibiram sua atividade. O modelo da estrutura cristalográfica da BaBgl revelou um domínio Nterminal enovelado como um barril TIM, um domínio intermediário na forma de sanduíche α/β e um terceiro domínio C-terminal do tipo FnIII. Neste trabalho também foram estudados os mecanismos de tranglicosilação de duas β-glicosidases de Trichoderma harzianum (ThBgl1 e ThBgl2), sendo que ambas realizam reação de transglicosilação, porém a ThBgl1 possui relação hidrólise/tranglicosilação menor que a ThBgl2. As estruturas cristalográficas demonstram um enovelamento típico para as β-glicosidases da família GH 1, com o enovelamento na forma de um barril TIM (α/β)8. Contudo, a ThBgl2 apresenta sítio ativo mais polar e portanto propício à interação com moléculas de água, favorecendo a reação de hidrólise quando comparada à ThBgl1.

Submitted by VIVIANE CRISTINA PADILHA LOPES null (vivianelops@gmail.com) on 2016-12-05T17:47:42Z No. of bitstreams: 1 tese vivi BIBLIOTECA.pdf: 2903583 bytes, checksum: d8537b21926462f650e1ff21b8ca9c26 (MD5) / Rejected by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo a orientação abaixo: O arquivo submetido não contém o certificado de aprovação. Corrija esta informação e realize uma nova submissão com o arquivo correto. Agradecemos a compreensão. on 2016-12-07T12:15:05Z (GMT) / Submitted by VIVIANE CRISTINA PADILHA LOPES null (vivianelops@gmail.com) on 2016-12-12T19:24:22Z No. of bitstreams: 1 tese vivi repositório.pdf: 3145051 bytes, checksum: 8c5d16d927b1c2cbac9b9320e9e9b7ce (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-12-13T12:41:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lopes_vcp_dr_rcla.pdf: 3145051 bytes, checksum: 8c5d16d927b1c2cbac9b9320e9e9b7ce (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-13T12:41:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lopes_vcp_dr_rcla.pdf: 3145051 bytes, checksum: 8c5d16d927b1c2cbac9b9320e9e9b7ce (MD5) Previous issue date: 2016-11-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A degradação biológica da lignina pode ser realizada por fungos de podridão branca, parda e mole, os quais produzem enzimas oxidativas especialmente lacases, manganês peroxidase (MnP) e lignina peroxidase (LiP). Neste trabalho, foi investigada a interação entre diferentes fungos filamentosos para formar consórcios capazes de remover a lignina de resíduos agroindustriais. Após triagens enzimáticas realizadas para LiP, MnP, Lacase e glioxal oxidase (GLOX), 8 isolados apresentaram potencial para aplicação de degradação lignocelulósica e 5 fungos foram selecionados como os melhores produtores das enzimas estudadas. As capacidades de interação e inibição de crescimento dos isolados selecionados foram estudadas para posterior montagem dos consórcios. Desta maneira, 6 diferentes consórcios foram estruturados e submetidos a testes de degradação de lignina utilizando três diferentes resíduos derivados da agroindústria: sabugo de milho, casca de arroz e bagaço de cana. Dados de seletividade (celulose/lignina) foram também utilizados como parâmetro de avaliação dos consórcios. Os consórcios C5 (Tinctoporellus sp. e Marasmiellus sp. e Aspergillus sect. flavi) e C6 (Tinctoporellus sp. e Marasmiellus sp. Fusarium sp.) apresentaram resultados mais coerentes de degradação de lignina, seletividade e atividades enzimáticas no bagaço de cana após 7 dias a 28ºC. A casca de arroz apresentou menor degradabilidade devido a uma maior resistência ao ataque microbiano. O sabugo de milho foi melhor degradado por consórcios que apresentaram habilidade em reduzir a lignina e os polissacarídeos. Sendo assim, os consórcios C5 e C6 foram submetidos aos experimentos de degradação do bagaço de cana por 15 dias. Os resultados revelaram que o consórcio C5 foi mais eficiente no processo de deslignificação e apresentou melhores resultados de seletividade. Para aumentar o rendimento da deslignificação, 3 experimentos de otimização do processo foram realizados utilizando o planejamento experimental do tipo Plackett-Burman (PB). Aumentos sequenciais da deslignificação foram observados a cada experimento, onde as duas melhores condições de cultivo encontradas (PB3) apresentavam: i) inóculo fúngico (7), 8 mM de CuSO4, 0,4 g/L de KH2PO4 e 2,5 g de bagaço de cana (ensaio 10) e ii) inóculo fúngico (7), 20 g/L de glicose, 2 g/L de extrato de levedura, 8 mM de CuSO4 e 2,5 g de bagaço de cana (ensaio 5). As condições de cultivo dos ensaios 10 e 5 permitiram uma porcentagem de deslignificação correspondente a 57,65% e 49,73%, respectivamente. Os melhores resultados de seletividade (celulose/lignina e xilana/lignina) foram, de maneira geral, condizentes com os melhores resultados de deselignificação. Experimentos adicionais foram conduzidos visando avaliação da influência do sulfato de cobre no crescimento dos fungos dos consórcios e nos fungos de maneira isolada, e avaliação da deslignificação em cultivos contendo extrato de malte e bagaço de cana. Os resultados revelaram que a presença do sulfato de cobre não interferiu na eficiência dos consórcios frente à deslignificação. Na presença do sulfato de cobre a porcentagem de seletividade da lignina do bagaço de cana pelo consórcio C5 (53,18%) foi muito próxima à obtida no PB3. Neste teste, houve produção de LiP e MnP, enquanto a lacase foi detectada na ausência do sulfato de cobre. Os resultados da deslignificação dos experimentos em meio malte e bagaço de cana foram inferiores aos resultados com o meio otimizado, destacando a importância da aplicação do planejamento experimental para a otimização de processos. Os resultados do presente trabalho evidenciam o potencial do consórcio C5 para a deslignificação do bagaço de cana em 7 dias de cultivo. / Biological lignin degradation can be performed by white rot, brown, and soft fungi, which are able to produce oxidative enzymes such as lignin peroxidase (LiP), manganese peroxidase (MnP) and Laccase. In this work, the interaction between different filamentous fungi (isolated from different environments) was investigated aiming to the structuration of consortia able to remove the lignin from agro-industrial wastes. After the enzymatic screening accomplished to LiP, MnP, laccase, and glyoxal oxidase (GLOX), 8 isolates presented potential application to lignocellulose degradation and 5 were selected as the best producers of the studied enzymes. The interaction and inhibition growth ability of the selected isolates was investigated for the subsequent consortia assembling. In this way, 6 different consortia were pooled and subjected to lignin degradation tests using 3 different waste materials derived from agro-industry: corn cobs, rice husks, and sugarcane bagasse. Data related to selectivity (cellulose/lignin) were also used for the consortia´s evaluation. The consortia C5 (Tinctoporellus sp., Marasmiellus sp., and Aspergillus sect. Flavi) and C6 (Tinctoporellus sp., Marasmiellus sp., and Fusarium sp.) presented more coherent results of lignin degradation, selectivity, and enzymatic activities in sugarcane bagasse after 7 days incubation at 28°C. The rice husk showed lower degradability due to the higher resistance to the microbial attack. The corncob was better degraded by the consortia that showed ability to reduce the amount of lignin and polysaccharides (cellulose and xylan). In this sense, the consortia C5 and C6 were subjected to the experiments related to sugarcane bagasse degradation during 15 days. Results showed that the consortium C5 was more efficient during the delignification process and showed better results of selectivity. In order to increase the delignification efficiency, three experiments related to the process optimization were conducted using Plackett-Burman (PB) experimental design. Sequential improvements in delignification were observed to each experiment and the two better culture conditions found comprised: i) inoculum disks (7), 8 mM CuSO4, 0.4 g/L of KH2PO4, and 2.5 g of sugarcane bagasse (assay 10), and ii) inoculum (7), 20 g/L glucose, 2 g/L yeast extract, 8 mM CuSO4, and 2.5 g of sugarcane bagasse (assay 5). The culture conditions of assay 10 and 5 allowed a delignification corresponding to 57.65% and 49.73%, respectively. In general, the better results of selectivity (cellulose /lignin and xilan/lignin) were consistent with the better results of delignification. Additional experiments were conducted in order to evaluate the effect of copper sulfate on the growth of the consortia fungal strains and the each single fungus, and to evaluate the delignification in cultures containing malt extract and sugarcane bagasse. Results reveal that the presence of copper sulphate did not interfere in the consortia delignification efficiency. In the presence of copper sulphate the percentage of sugarcane bagasse delignification by the consortium C5 (53.18%) was almost the same that one obtained in the PB3. In general, in the presence of copper sulphate LiP and MnP were produced, while laccase was detected in the absence of this compound. Results related to the delignification in medium containing malt extract and sugarcane bagasse were lower than that ones with the optimized medium, highlighting the relevance of the experimental design to the process optimization. Results from the present study show the potential of the consortium C5 for the delignification of sugarcane bagasse in 7 days of cultivation.

Submitted by MARÍLIA GABRIELA DE SANTANA COSTA null (mariliagabrielasc@hotmail.com) on 2017-06-01T19:21:17Z No. of bitstreams: 1 TESE_MARILIA_GABRIELA_SANTANA_COSTA.pdf: 4170522 bytes, checksum: 8ff9e42b797cdb58ebfce7e345bfe167 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-06-02T13:34:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 costa_mgs_dr_jabo.pdf: 4170522 bytes, checksum: 8ff9e42b797cdb58ebfce7e345bfe167 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-02T13:34:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 costa_mgs_dr_jabo.pdf: 4170522 bytes, checksum: 8ff9e42b797cdb58ebfce7e345bfe167 (MD5) Previous issue date: 2017-04-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A indústria de papel e celulose brasileira ocupa uma posição de destaque no mercado mundial. O Eucalyptus grandis é a espécie mais plantada pelo setor florestal e a principal fonte de matéria-prima para a indústria de papel e celulose. Contudo, seu crescimento em regiões de baixa temperatura é limitado. Contrariamente, a espécie Eucalyptus globulus apresenta melhor crescimento em baixas temperaturas, tornando-se cada vez mais interessante para a indústria nacional de papel e celulose. Tendo em vista que a temperatura é um modulador chave no metabolismo das plantas, uma análise global do proteoma foi realizada em plântulas cultivadas em temperaturas controladas, visando a identificação de proteínas diferencialmente reguladas entre as espécies e entre as diferentes condições de cultivo, detecção de vias metabólicas estimuladas pela temperatura e detecção de alterações no metabolismo antioxidante e de lignificação. A estratégia adotada permitiu a identificação de 3.111 proteínas caulinares, representando aproximadamente 9% do proteoma predito para a espécie modelo E. grandis. O perfil de expressão gênica, em termos de número de proteínas identificadas, corroborou com o padrão de densidade gênica para os cromossomos de Eucalyptus. Foram identificadas proteínas envolvidas em diversas vias metabólicas, com destaque para as vias relacionadas com o metabolismo energético, de aminoácidos e nucleotídeos, de lipídeos e carboidratos. Com relação às proteínas diferencialmente reguladas, 16 proteínas apresentaram alteração em sua abundância somente em E. grandis, 38 somente em E. globulus e 12 apresentaram alterações em ambas as espécies. Além disso, um total de 103 proteínas antioxidantes foram detectadas nos caules de ambas as espécies. O perfil de regulação frente ao estímulo térmico, revelou que as alterações nas proteínas antioxidantes são mais proeminentes quando as mudas de Eucalyptus foram expostas a altas temperaturas. Com relação à biossíntese de lignina, a nossa abordagem proteômica resultou na identificação de 27 das principais enzimas envolvidas neste metabolismo, corroborando com as predições de genes e o “toolbox” de lignificação proposto. A análise quantitativa revelou diferenças na abundância de isoformas específicas dependendo do estímulo térmico em que as plantas foram expostas; contudo, o tratamento a alta temperatura foi aquele que induziu mais diferenças entre os proteomas relacionados com a lignificação de E. globulus e de E. grandis. A partir dos resultados obtidos, conclui-se que o estímulo térmico promove alterações importantes no proteoma caulinar jovem de Eucalyptus, evidenciando aumento na atividade antioxidante em plantas expostas ao calor e expressão diferencial mais proeminente em plantas submetida ao frio. / The Brazilian pulp and paper industry occupies a prominent position in the world market. The Eucalyptus grandis is the most used species in the forest sector and the main source of raw material for Brazilian industry. However, its growth in low temperature regions is limited. In contrast, the Eucalyptus globulus species shows a better growth at low temperatures, for whom interest has increased within the national pulp and paper industry. Since temperature is a key modulator in plant metabolism, a global proteome analysis was performed on seedlings grown at controlled temperatures, aimed at the identification of differentially regulated proteins between the species and between the different culture conditions, detection of metabolic pathways stimulated by temperature and detection of alterations in antioxidant metabolism and lignification. The strategy used here allowed the identification of 3,111 stem proteins, representing approximately 9% of the predicted proteome of the E. grandis model species. The gene expression profile, in terms of the number of proteins identified, corroborated with the gene density pattern for the Eucalyptus chromosomes. Proteins involved in several metabolic pathways have been identified, especially the pathways related to energy metabolism, and metabolism of amino acids, nucleotides, lipids and carbohydrates. Regarding the differentially regulated proteins, 16 proteins showed alterations in their abundance only in E. grandis, 38 only in E. globulus and 12 presented alterations in both species. In addition, a total of 103 antioxidant proteins were detected in the stems of both species. The regulation profile upon thermal stimulus revealed that changes in antioxidant proteins are more prominent when Eucalyptus seedlings were exposed to high temperatures. Regarding the biosynthesis of lignin, our proteomic approach resulted in the identification of 27 of the main enzymes involved in this metabolism, corroborating with the gene predictions and the proposed lignin toolbox. Quantitative analysis revealed differences in the abundance of specific isoforms depending on the thermal stimulus to which the plants were exposed; however, the high temperature treatment was the one that induced more differences between the proteomes related to the lignification of E. globulus and E. grandis. The results demonstrate that thermal stimuli cause important alterations in the Eucalyptus stem proteome, evidenced by the increase in the antioxidant activity in plants exposed to heat and the most prominent differential expression in plants submitted to cold environments.

Para tornar a biomassa disponível para aplicações em biocombustíveis, produtos químicos e materiais, algumas propriedades indesejáveis, como alto teor de umidade e baixa densidade, devem ser corrigidos. Uma solução para estes problemas seria a densificação da biomassa. O processo de densificação da biomassa e seus resíduos, como a briquetagem e a peletização, são muito conhecidos e utilizados, entretanto, não existe um consenso sobre os mecanismos de ligação que ocorre entre as partículas da biomassa densificada e a influência que as variáveis da matéria-prima e do processo de densificação exerce sobre eles. Compreender os mecanismos de ligação entre as partículas da biomassa densificada é fundamental para determinar os parâmetros da matéria-prima e do processo de densificação, assim como os ensaios que devem ser realizados para medir a qualidade do produto densificado. Este trabalho teve como objetivo principal analisar o efeito das variáveis do material e do processo de densificação da serragem de madeira nas propriedades do produto densificado e a sua influência sobre os mecanismos de ligação entre as partículas do material. O material utilizado neste trabalho foi a serragem de Eucalyptus sp. Foram analisados o efeito do teor de umidade do material e a temperatura do processo de densificação na densidade e resistência mecânica do produto densificado, como também a influência da composição química da serragem na transição vítrea do material. A serragem de eucalipto foi caracterizada por análise termogravimétrica (TGA), caracterização química e espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR). A caracterização de serragem densificada foi realizada por densidade aparente, expansão volumétrica, ensaio mecânico de compressão, microscopia eletrônica de varredura (MEV), microscopia ótica (MO), espectrometria de massa de íons secundários por tempo de voo (ToF-SIMS) e análise dinâmico-mecânica (DMA). Os resultados mostraram que no processo de densificação sem aquecimento, o teor de umidade ideal da serragem de eucalipto foi o de aproximadamente 10%, favorecendo as forças intermoleculares entre as partículas do material. Na densificação da serragem de eucalipto em diferentes temperaturas, a lignina agiu como um aglutinante natural, formando pontes sólidas entre as partículas do material em temperaturas superiores à 140°C. A transição vítrea encontrada para a lignina da serragem de eucalipto foi da ordem de 135°C. Em conclusão, as variáveis do material e do processo de densificação influenciaram nos mecanismos de ligação, afetando as propriedades da serragem de madeira densificada. Os principais mecanismos de ligação encontrados na serragem de madeira densificada foram interações intermoleculares e pontes sólidas. / Making biomass available for investments in biofuels, chemicals and materials, some undesirable properties as high moisture content and low density must be corrected. One solution to these problems would be densification of biomass. The densification process of biomass and waste materials, such as briquetting and pelletizing, are well known and used, however, there is no consensus about the connection mechanism occurs between the particles of the densified biomass and the influence of the variables of raw material and densification process has on them. Understanding the connection mechanism between the particles of the densified biomass is critical in determining the parameters of the raw material and the densification process, as well as the tests that should be performed to measure the quality of densified product. This study aimed to analyze the effect of varying the material and the densification process of sawdust in the densified product features and their influence on the binding mechanism between the particles of the material. The material in this work was the sawdust Eucalyptus sp. It was analyzed the effect of the material moisture content and temperature of the densification process in the density and mechanical strength of the densified product, but also the influence of the chemical composition of sawdust on the glass transition of the material. The eucalyptus sawdust was characterized by thermogravimetric analysis (TGA), chemical analysis and Fourier transform infrared spectroscopic (FTIR). The characterization of densified sawdust was performed by bulk density, volumetric expansion, compression mechanical testing, scanning electron microscopy (SEM), optical microscopy (OM), mass spectrometry of secondary ions time of flight (ToF-SIMS) and dynamical mechanical analysis (DMA). The results showed that without the heat densification process, the ideal moisture content eucalyptus sawdust was about 10%, favoring the intermolecular forces between particles of the material. In eucalyptus sawdust densification at different temperatures, lignin acted as a natural binder to form solid bridges between particles of the material at temperatures higher than 140°C. The glass transition temperature of the lignin found to eucalyptus sawdust was of the order of 135°C. In conclusion, the variables of material and densification process influenced the binding mechanism affecting the properties of the densified wood sawdust. The main binding mechanism found in densified wood sawdust were intermolecular interactions and solid bridges.

Na atualidade, a geração de eletricidade e a produção de etanol de segunda geração a partir de materiais lignocelulósicos se apresentam como uma alternativa de desenvolvimento tecnológico no setor sucroenergético. Não obstante, a introdução de novos processos produtivos representa um verdadeiro desafio devido à complexidade e diversidade das rotas tecnológicas alternativas que podem ser avaliadas. Além disso, existem fatores econômicos e ambientais, que devem ser considerados durante o desenvolvimento e consolidação destas novas configurações. Nesse sentido, o presente trabalho tem como objetivo desenvolver uma metodologia para realizar a hierarquização exergética e exergo-ambiental de processos para obtenção de etanol e eletricidade a partir da cana-de-açúcar em distintas configurações de biorrefinarias. Para este fim, dados técnicos de operação foram adotados nas rotas tecnológicas envolvidas, bem como os aspectos ambientais da utilização destes sistemas. Os modelos propostos avaliaram as rotas Convencional (Caso 1), Bioquímica (Caso 2) e Termoquímica (Caso 3), utilizando programas de simulação e ferramentas matemáticas para simular estes processos. Ainda, a integração dos processos e diferentes usos para o bagaço excedente foram estudados, junto com diversos métodos de pré-tratamento visando à otimização e hierarquização destas rotas. O resultado final indicou configurações ótimas que permitiram a hierarquização em termos do índice exergético de renovabilidade dos processos de produção das rotas analisadas. Desse modo a rota convencional otimizada apresentou a máxima eficiência exergética dos processos e, por tanto, o menor custo exergético unitário médio das plataformas avaliadas. Ao passo que a rota bioquímica foi o sistema que promoveu um incremento de 28,58 % e 82,87 % na produção de etanol, quando comparado com o Caso 1 e o Caso 3, respectivamente. Além disso, a rota termoquímica apresentou a configuração com a maior taxa de geração de eletricidade excedente (214,98 kWh/TC). Em relação aos resultados do impacto ambiental das rotas tecnológicas, encontrou-se que a configuração mais sustentável foi a plataforma bioquímica, apresentando as menores taxas de emissões globais de CO2 (131,45 gCO2/MJ produtos). / Currently, electricity generation and second-generation bioethanol production from lignocellulosic materials represent technological alternatives in the sugar-energy sector. Nevertheless, the introduction of new production processes represents a real challenge due to the complexity and diversity of the technological routes that can be evaluated. In addition, there are economic and environmental factors that must be considered during the development and consolidation of these new configurations. Accordingly, this project aims to develop a methodology to perform the exergy and exergo-environmental analysis, evaluation and ranking of processes in order to obtain ethanol and electricity from sugarcane in different biorefinery configurations. Hence, operating technical data of each technological route were adopted as well as the environmental aspects of using these systems. The proposed models assessed the Conventional (Case 1), Biochemical (Case 2) and Thermochemical (Case 3) routes using simulation programs and mathematical tools to simulate the ethanol production and electricity generation. Furthermore, the process integration and different uses for the excess bagasse were studied with various pretreatment methods aiming the optimizing and ranking of routes. The results indicated optimal settings that allowed the ranking in terms of the environmental exergy indicator \"renewability\" of the production processes for analyzed routes. In this way, the optimized conventional route presented the maximum exergy efficiency of the processes, therefore the lowest exergetic cost average of the evaluated platforms. While the biochemical route was the system that promoted an increase of 28.58 % and 82.87% in the ethanol production, when compared to Case 1 and Case 3, respectively. In addition, the thermochemical route presented the configuration with the highest power generation rate exceeding (214.98 kWh/TC). Concerning, the environmental impact results, it was found that the most sustainable configuration was the biochemical platform, which presented the lowest overall CO2 emissions rates (131.45 gCO2/MJ products).