Este trabalho apresenta a síntese e a caracterização de quatro complexos trinucleares de acetato de rutênio, de fórmula geral [Ru3O(CH3COO)6(L)2(CO)] nos quais L são ligantes N-heterocíclicos 4-aminopiridina, isonicotinamida, 4-(dimetil)aminopiridina e 2,6-dimetilpirazina com características -aceptoras ou -doadoras. Os derivados de rutênio foram sintetizados de acordo com adaptações de rotas sintéticas já reportadas na literatura, e caracterizados por meio de técnicas de cunho espectroscópico, eletroquímico e outras, a saber: análise elementar, 1H RMN, absorção UV-vis, infra-vermelho, voltametria cíclica e difração de raios-X. Foi investigada a liberação fotoinduzida de monóxido de carbono proveniente dos complexos trinucleares em acetonitrila, por meio de acompanhamento espectrofotométrico. O rendimento quântico envolvido na liberação do CO foi calculado por meio de actinometria química. Foi estudada a interação entre os complexos com as biomoléculas HSA e o DNA de timo de bezerro por meio das técnicas espectroscópicas de fluorescência, UV-vis e dicroísmo circular. Além disso, foram realizados ensaios preliminares in vitro para avaliar a citotoxicidade dos complexos frente a uma linhagem de células de melanoma murinho (B16F10) e foi avaliada a atividade tripanocida dos complexos sobre a forma amastigota do parasita Tripanossoma cruzi. / This work describes the synthesis and characterization of four ruthenium trinuclear complex of general formula [Ru3O(CH3COO)6(CO)(L)2] where L = 2,6-dimethylaminopyridine; isonicotinamide; 4-aminopyridine and 4-dimethylpyrazine (N-heterocyclic ligands with -acceptor or -donor characteristics). The ruthenium derivatives were synthesized according to adaptations of synthetic routes already reported in literature and characterized by spectroscopic and electrochemical techniques such as nuclear magnetic ressonance (NMR), UV-vis, infrared, cyclic voltammetry, X-ray diffraction and elemental analysis. The photoinduced release of carbon monoxide in acetonitrile was investigated by means of spectrophotometric monitoring. The quantum yield involved in the CO release was calculated by chemical actinometry. It was studied the interaction between the complexes with the biomolecules HSA and calf thymus DNA by spectroscopic techniques of fluorescence, UV-vis and circular dichroism. In addition, preliminary tests were performed in vitro in order to evaluate the cytotoxicity of the complexes against a murine melanoma cell line (B16F10) and trypanocidal activity of the complexes over the amastigote form of the parasite Trypanosoma cruzi.

La protéine RhBG humaine est un membre de la famille des protéines Rh (Rhésus), premiers canaux à gaz caractérisés chez les mammifères et par conséquent, de la superfamille Amt/Mep/Rh des transporteurs d'ammonium. Elle facilite le transport de la forme neutre de l'ammonium (NH3) et est ancrée à la membrane plasmique basolatérale de cellules épithéliales rénales, via l'ankyrine G, protéine adaptatrice du squelette membranaire dépendant de la spectrine. Nous avons montré que la mutation du motif d'ancrage à l'ankyrine G, localisé dans l'extrémité C-terminale intracytoplasmique de RhBG, retarde l'adressage, diminue la stabilité à la surface et abolit la fonction de transport de NH3 de la protéine RhBG dans les cellules épithéliales HEK293. Nous avons également montré que la tyrosine Y429, qui appartient au signal d'adressage basolatéral YED de RhBG, est phosphorylée in vitro par les kinases Src et Syk purifiées. D'autre part, le traitement de cellules HEK293 par le pervanadate, un inhibiteur de phosphatases sur phosphotyrosine (donc un activateur indirect des tyrosine kinases) diminue fortement l'activité de transport de la protéine native mais pas celle d'un mutant Y429A (bloquant sa phosphorylation). Ce résultat montre d'une part que Y429 est le seul résidu tyrosine de RhBG impliqué dans la régulation du transport de NH3, via une phosphorylation, d'autre part que la protéine RhBG est phosphorylée ex vivo sur cette tyrosine. Des mutations Y429D et Y429E, mimant une phosphorylation constitutive, abolissent le transport de NH3 et favorisent la solubilisation du RhBG membranaire. À l'inverse, des mutants Y429A et Y429F non phosphorylés et non phosphorylables se comportent comme la protéine RhBG sauvage. En revanche, des études en microscopie confocale montrent que seules les mutations Y429A et Y429F entraînent une dépolarisation de l'expression de RhBG dans des cellules MDCK polarisées, les mutants Y429D et Y429E étant normalement localisés dans le domaine basolatéral des cellules. L'ensemble de ces résultats démontre que l'adressage, l'ancrage au squelette sous-membranaire et la fonction de transport d'ammonium de RhBG sont régulés à la fois par la phosphorylation et la liaison au squelette membranaire de son domaine C-terminal cytoplasmique et nous a conduit à proposer un modèle dans lequel la phosphorylation de la tyrosine Y429 faisant partie du motif YED, serait nécessaire à l'adressage de RhBG vers la membrane basolatérale de cellules épithéliales polarisées, alors que la déphosphorylation de cette tyrosine permettrait l'ancrage de la protéine au squelette membranaire, via l'ankyrine G, et l'activation du canal à NH3 par un changement conformationnel potentiel de l'extrémité C-terminale.

La schistosomiase est la deuxième endémie parasitaire mondiale après le paludisme; 200 millions d'individus sont infectés à travers le monde et la morbidité reste élevée (environ 200 000 morts par an) malgré l'utilisation du praziquantel, seule drogue disponible. Cinq espèces de schistosomes infectent l'Homme dont celle que nous étudions, Schistosoma mansoni. Ce parasite possède un cycle de vie complexe, comportant 4 stades de développement morphologiquement distincts et 2 hôtes successifs, un hôte intermédiaire, le mollusque Biomphalaria glabrata et un hôte définitif, l'Homme. Afin de déterminer les mécanismes mis en jeu dans le contrôle du développement du schistosome et de caractériser des cibles potentielles de nouveaux agents chimiothérapeutiques, nous nous intéressons à certains acteurs impliqués dans la régulation génique, et plus particulièrement, les histones déacétylases, ou HDACs. Les HDACs sont des enzymes bien conservées dans le règne du vivant. Elles contrôlent l'expression de 5 à 10% des gènes, majoritairement en réprimant la transcription via la déacétylation des histones. Elles sont réparties en 3 classes, les classes I et II sont composées d'enzymes dont le site catalytique comporte un ion de zinc ; tandis que la classe III est composée des sirtuines, dépendantes du NAD+. Chez le parasite, une partie de nos études porte sur les 3 enzymes de classe I que nous avons identifiées et caractérisées au niveau moléculaire, SmHDAC1, 3 et 8. Ensuite nous avons réalisé une étude fonctionnelle de SmHDAC1 et mis en évidence sa capacité de répression de la transcription en système hétérologue. Puis nous nous sommes intéressés à l'inhibition de l'activité HDAC chez le parasite, grâce à l'utilisation de différents inhibiteurs des classes 1 et 2 des HDACs. Nous avons montré que des parasites cultivés en présence de trichostatine A (TSA) mouraient de manière dose dépendante. Nous avons approfondi notre étude au niveau moléculaire et avons étudié la variation d'acétylation des histones des parasites en présence de TSA et d'acide valproique. Nous avons montré une augmentation de l'acétylation de manière dose-dépendante de l'histone H4. Le traitement par la TSA entraîne la mort de nombreux types cellulaires par apoptose et provoque une surexpression de certains gènes impliqués dans ce processus. Nous avons démontré que ce traitement induit l'apoptose chez des larves maintenues en culture, ainsi qu'une activation des Caspases 3/7. Ensuite, la caractérisation des ADNc des Caspases 3 et 7 nous a permis de montrer par RT-PCR en temps réelle que les transcrits correspondants sont surexprimés après traitement par la TSA, tandis que celle-ci n'a aucun effet sur la transcription de SmHDAC1 et 3. Par la suite, nous avons corrélé cette augmentation avec le taux d'acétylation de H4 sur le promoteur de caspase7. Cette étude sera poursuivie à l'avenir par l'investigation de la relation structure/fonction des HDACs afin de développer des inhibiteurs spécifiques. En parallèle, nous étudions une HDAC de classe III, SmSirt1, que nous avons identifiée et caractérisée. La présence d'une grande insertion dans son domaine catalytique présage des fonctions modifiées par rapport à ses orthologues chez d'autres espèces. Nous souhaitons nous focaliser sur les conséquences de cette insertion spécifique chez S. mansoni. En effet, elle semble être la cible de potentielles modifications post-traductionnelles (site de phosphorylation par PKB/Akt), que nous voulons mettre en évidence. De plus, l'une des fonctions de Sirt1 est l'interaction avec le facteur de transcription FoxO et la régulation de la voie de signalisation insuline dépendante (impliquant PKB/Akt). Par ce biais FoxO et Sirt1 contrôlent le métabolisme, des mécanismes de survie cellulaire et la longévité. Une modification de la fonction de SmSirt1 pourrait être à la base de la durée de vie anormalement longue de S. mansoni. Nous avons donc également réalisé la caractérisation moléculaire de SmFoxO, afin de mettre en évidence son interaction avec Sirt1 ainsi que l'implication de cette interaction dans le contrôle de la transcription de gènes cibles. Par la suite nous étudierons le rôle de Sirt1 et FoxO dans la régulation de la signalisation insuline dépendante sur des parasites en culture

Chez les Eucaryotes, la transcription du génome nucléaire est assurée par trois formes d'ARN polymérase ADN dépendantes (Pol I, II et III) qui transcrivent chacune une classe spécifique de gènes. Ainsi, la Pol I transcrit uniquement le gène codant le précurseur des grands ARN ribosomiques. La transcription Pol I est extrêmement active et représente plus de 60% de l'activité transcriptionnelle totale de la cellule en phase exponentielle de croissance. La transcription nucléaire dans sa globalité est réprimée dans de nombreuses conditions, notamment lors d'une carence en nutriments (qui peut être mimée par un traitement à la rapamycine). Nous avons étudié chez la levure S. cerevisiae les effets de traitements longs à la rapamycine sur la transcription Pol I. Grâce à une souche mutante de levure (souche CARA) dans laquelle la Pol I est constitutivement active, nous avons montré que le niveau de transcription Pol I contrôle le niveau de biogenèse des ribosomes. En présence de rapamycine et pour des temps courts de traitement, la répression de la transcription Pol I est atténuée dans la souche CARA par rapport à la souche sauvage (WT). Cependant, au bout de 4h de traitement, le niveau de transcription devient non détectable dans les deux souches et, de façon remarquable, la structure du nucléole est conservée dans la souche CARA alors que le nucléole est totalement déstructuré dans la souche WT. Des expériences d'immunoprécipitation de la chromatine et des analyses par Miller spread ont permis de montrer que même après 4h de traitement à la rapamycine, la Pol I reste associée à l'ADNr dans les cellules CARA, alors que dans les cellules WT, une très forte diminution de l'occupation de l'ADNr par la Pol I est observée dès quelques minutes de traitement. Ces données constituent la première demonstration d'un découplage entre l'activité de transcription Pol I et le maintien de l'intégrité de la structure du nucléole. Dans une deuxième partie nous avons initié l'étude mécanistique de la transcription Pol I in vitro afin de déterminer les conséquences sur les différentes étapes du cycle transcriptionnel de l'association covalente du facteur Rrn3 avec l'enzyme. La seule différence entre les cellules WT et CARA étant a priori que le complexe Pol I-Rrn3 n'est pas dissociable dans la souche CARA. Nos résultats suggèrent un modèle selon lequel le complexe Pol I-Rrn3 se dissocie très rapidement lors de l'étape d'initiation. Cette dissociation est une étape nécessaire pour que l'ADNr 35S soit transcrit efficacement.

Au cours de ma thèse, je me suis intéressée au facteur de transcription TFIIS, un facteur d'élongation de l'ARN polymérase II impliqué dans la stimulation de l'activité de clivage intrinsèque de cette enzyme. L'étude de la localisation globale du facteur TFIIS sur le génome de Saccharomyces cerevisiae par ChIP-on-chip a révélé que TFIIS, en plus d'être présent sur les gènes de classe II (ie. transcrits par l'ARN polymérase II), est également présent sur l'ensemble des transcrits de classe III (ie. transcrits par l'ARN polymérase III), suggérant ainsi un rôle jusqu'alors inconnu de cette protéine dans la transcription par l'ARN polymérase III. Des expériences de génomique, de génétique et de biochimie nous ont permis de montrer que TFIIS est un facteur de transcription de l'ARN polymérase III impliqué dans le choix du site d'initiation de la transcription. Par la suite, j'ai souhaité poursuivre cette étude chez Mus musculus, afin de déterminer, entre autres, si le rôle de TFIIS dans la transcription par l'ARN polymérase III est conservé chez les eucaryotes pluricellulaires. Des expériences préliminaires révèlent que Tcea1, l'une des isoformes de TFIIS chez M. musculus, serait présent sur quelques gènes de classe II et III. Lors de ma thèse, j'ai également pris part à deux autres projets en cours dans le laboratoire. L'un a porté sur le rôle du Médiateur, un complexe multiprotéique coactivateur de la transcription par l'ARN polymérase II, dans la mise en place du complexe de préinitiation via le recrutement du facteur TFIIH. Le second projet a permis de montrer que l'ARN polymérase II agit comme un senseur de la disponibilité en nucléosides triphosphates dans la cellule.

Neisseria meningitidis est le principal agent responsable de méningites bactériennes. Les interactions hôte-pathogène dépendent du repliement correct de nombreuses protéines de surface, qui nécessite souvent la formation de ponts disulfures. Chez les bactéries à Gram-négatif, la synthèse de ces ponts est catalysée par l'oxydoréductase de thiol-disulfure DsbA. N. meningitidis possède trois gènes qui codent pour trois DsbA actives : DsbA1, DsbA2 et DsbA3. DsbA1 et DsbA2 sont des lipoprotéines impliquées dans la virulence alors que DsbA3 est une enzyme soluble périplasmique non reliée à la virulence. Les travaux de cette thèse se rapportent aux caractérisations biochimiques de ces trois enzymes et structurales de DsbA1 et DsbA3. DsbA1 et DsbA3 adoptent le repliement classique de DsbA d'Escherichia coli. La caractéristique la plus étonnante partagée par ces trois enzymes est leur exceptionnel pouvoir oxydant. Avec un potentiel redox de -80 mV, les DsbA de Neisseria sont les enzymes de la famille des thiorédoxines les plus oxydantes connues à ce jour. En accord avec cela, les études de stabilité thermales indiquent que leur forme réduite est extrêmement stable. Pour chacune de ces enzymes, les études montrent que le résidu Thréonine, retrouvé dans la région du site actif, joue un rôle clé dans la détermination de cet extraordinaire pouvoir oxydant. L'ensemble de ces résultats montrent comment des résidus situés en dehors du motif actif CXXC peuvent influencer le potentiel redox de membres de la famille des thiorédoxines. Ils montrent également que le phénotype associé à DsbA3 chez N. meningitidis ne peut être expliqué par une différence d'activité redox ou de structure.

La compréhension du phénomène de stress oxydant est devenue un des enjeux majeurs de la biochimie, en particulier depuis le début des années 70. Ce déséquilibre de la balance d'oxydoréduction au sein des cellules est impliqué dans un si grand nombre de pathologies graves (dont la plupart des cancers, pour ne citer qu'eux) qu'il est devenu crucial de cerner ses origines et ses mécanismes, pour envisager une prévention et des traitements plus efficaces. Nous nous sommes intéressés aux interactions existant entre les thiols (qui sont les acteurs principaux de la lutte antioxydante) et trois agents oxydants importants : le peroxyde d'hydrogène et les radicaux hydroxyle et superoxyde. Malgré le nombre important d'études dédiées à ce sujet, les mécanismes de ces réactions n'étaient pas clairement identifiés, c'est pourquoi nous avons pensé qu'une étude théorique pourrait apporter des éclaircissements utiles. En effet, la connaissance des mécanismes de réaction permettrait d'une part de faciliter l'interprétation des données expérimentales, et d'autre part d'envisager plus efficacement d'éventuels traitements basés sur l'inhibition ou la catalyse de ces réactions. Nous avons utilisé des méthodes ab initio de chimie quantique permettant d'atteindre une précision "chimique", par exemple la méthode par interaction de configuration quadratique (QCI). Ces techniques impliquent des temps de calcul relativement longs, ce qui nous a incités à modéliser les thiols par de petites molécules comme le méthanethiol et le résidu cystéine. Les mécanismes des trois réactions étudiées ont été identifiés, et nos travaux ont démontré l'importance que peuvent avoir les effets environnementaux (comme la présence de liaisons hydrogène ou la constante diélectrique du milieu) sur les cinétiques de réaction.

Source d'énergie renouvelable et non polluante, le biohydrogène connaît un intérêt croissant. En culture continue sur glucose, la productivité d'hydrogène la plus élevée est réalisée par la bactérie anaérobie Clostridium acetobutylicum avec 2,4 litres d'hydrogène produit l-1 h-1. Cette production d'hydrogène est catalysée par la [FeFe]-hydrogénase HydA. Pour comprendre et améliorer les capacités de ce micro-organisme pour la production d'hydrogène, nous avons voulu caractériser les relations structure-fonctions de HydA avec ses partenaires d'oxydo-réduction. Par homologie avec l'hydrogénase à fer I de Clostridium pasteurianum, les centres [4Fe-4S] FS4C et [2Fe-2S] FS2, situés en surface de la protéine, pourraient être impliqués dans le transfert inter-moléculaire d'électrons entre HydA et ses partenaires d'oxydoréduction. Notre objectif a alors été de déterminer l'implication de FS4C et FS2 dans ce transfert. Pour cela, des mutations par substitutions d'acides aminés et par délétions de domaines ont été effectuées au niveau de FS4C et FS2. Pour palier des problèmes d'instabilité des hydrogénases à fer native et modifiées, le protocole de purification a été amélioré. L'hydrogénase native a nettement été stabilisée, mais l'instabilité persistante des hydrogénases modifiées est restée une limitation importante pour leur caractérisation catalytique. La perte d'activité des hydrogénases modifiées a pu être corrélée à une perte importante de fonctionnalité de leur site actif et à un nombre d'atomes de fer incorporés inférieur à la valeur théorique. Les partenaires physiologiques d'oxydo-réduction de HydA chez C. acetobutylicum, la ferrédoxine CAC0303 et la flavodoxine, ont été purifiés. Le profil catalytique complet et les paramètres cinétiques des activités de consommation et de production d'hydrogène de HydA native avec différents partenaires d'oxydo-réduction ont été déterminés. L'amélioration du protocole de purification a permis d'augmenter significativement les activités de consommation et production d'hydrogène. Nous avons confirmé la préférence in vitro de HydA à catalyser la consommation de l'hydrogène par rapport à la production. Une valeur très élevée de kcat a été obtenue avec le substrat artificiel, méthyl viologène, en consommation d'hydrogène. Cela semble indiquer que le méthyl viologène pourrait interagir plus ou moins directement avec le site actif de l'enzyme, en évitant le transfert intramoléculaire d'électrons. Des efficacités catalytiques élevées de consommation et de production de l'hydrogène ont été obtenues avec le méthyl viologène (sauf sous sa forme réduite), la ferrédoxine et la flavodoxine. Ce résultat reflète le haut potentiel de HydA pour les réactions liées à l'hydrogène, potentiel conservé aussi bien pour ses partenaires redox physiologiques qu'artificiel. Ainsi, en condition de croissance en carence en fer, la substitution de la ferrédoxine par la flavodoxine ne serait pas une limitation pour l'activité hydrogénase in vivo.

L'ATPase-Ca2+ du réticulum sarcoplasmique de muscle squelettique rapide (SERCA1a) est une protéine membranaire qui permet le transport actif de deux ions calcium depuis le cytosol jusque dans la lumière du réticulum. Depuis 2000, l'obtention de nombreuses structures à résolution atomique de cette enzyme a été un atout majeur pour comprendre son cycle catalytique (Toyoshima, Nakasako et al. 2000). Toutefois, avant 2007, les formes de cette enzyme cristallisées en absence de calcium avaient été obtenues en présence d'un inhibiteur fixé au domaine membranaire. Nous avons d'abord montré, notamment par des techniques de spectroscopie de fluorescence et de protéolyse ménagée, que l'interaction de la protéine avec ces inhibiteurs, qui rend l'ATPase incapable d'adopter certaines des conformations présentes au cours de son cycle catalytique, avait certainement induit des biais significatifs dans la structure de certaines des formes cristallisées avant 2007 (Montigny, Picard et al. 2007). Nos résultats ont stimulé la recherche de structures nouvelles, en absence ou en présence d'inhibiteurs, dont l'analyse a pleinement confirmé nos conclusions. L'utilisation de ces inhibiteurs pendant la cristallisation de la protéine solubilisée était jusque là jugée utile pour protéger celle-ci de son éventuelle inactivation irréversible en présence de détergent (Lund, Orlowski et al. 1989). Utilisant le glycérol pour ralentir cette inactivation, nous avons mis en évidence des conséquences inattendues de l'interaction de l'ATPase avec deux des détergents communément utilisés pour sa cristallisation, son isolement ou sa simple étude (Montigny, Arnou et al. 2008). En présence de glycérol, nous avons également pu étudier certains traits de fonctionnement de trois mutants de l'ATPase, purifiés après expression hétérologue dans la levure S. cerevisiae : un mutant d'un des sites de fixation du calcium (i.e. capable de fixer un seul des deux calciums) (Montigny, Arnou et al. 2008) et deux autres mutants bloquant l'enzyme dans des états particuliers du cycle catalytique (Marchand, Winther et al. 2008). Parallèlement à ces études, nous avons élucidé le mystère des propriétés de fluorescence anormales d'une forme particulière de l'enzyme SERCA1a marquée au FITC dans son site nucléotidique. Nous avons mis en évidence une phosphorylation imprévue du FITC lié, conduisant à une très faible fluorescence, particulièrement stable dans le temps. Les conditions de cette phosphorylation impliquent une réorganisation de l'orientation relative des domaines cytosoliques de l'ATPase lors de l'étape de relargage des ions calcium vers la lumière du réticulum (McIntosh, Montigny et al. 2008). Dans toutes nos études, il nous a fallu évidemment tenir compte de la possible chélation des cations divalents interagissant avec l'enzyme (calcium, magnésium, ...) par les anions présents. Par pH métrie et à l'aide de sondes colorées, nous avons vérifié que le magnésium n'était PAS chélaté par le tampon Mops classiquement utilisé, contrairement à ce qui était rapporté dans certaines tables de constantes d'association (Montigny and Champeil 2007). A cette occasion, mettant notre savoir-faire au service de collègues du laboratoire, nous avons également précisé les différents complexes formés par association entre le cadmium (Cd2+) et le glutathion réduit (GSH-) (Leverrier, Montigny et al. 2007), afin de mieux comprendre lesquels de ces complexes étaient le plus susceptibles de se former au cours de la détoxication cellulaire du Cd2+. Abréviations : ATPase, AdénosineTriPhosphatase ; SERCA1a, Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase, isoforme 1a ; FITC, fluorescéine isothiocyanate ; Mops, acide 4-morpholinopropanesulfonique.

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste responsable de nombreuses maladies nosocomiales ainsi que d'infections graves chez les patients atteints de mucoviscidose ou chez immunodéprimés. La résistance aux antibiotiques observée chez de nombreuses souches fait de cette bactérie un pathogène difficile à éradiquer. Sa capacité à former un biofilm renforce en particulier cette résistance. Au cours de son processus infectieux, la bactérie utilise des lectines qui lui permettent de reconnaitre et de fixer spécifiquement les oligosaccharides présents en particulier sur les cellules hôte. Parmi elles, sont retrouvées la lectine soluble PA-IL (lectine à galactose) ainsi qu'une lectine fimbriale nouvellement identifiée, CupB6. Ces protéines seraient impliquées dans l'adhésion aux tissus de l'hôte et dans l'élaboration du biofilm. Nos travaux portent sur l'étude biochimique et structurale de ces deux lectines. Par des techniques de microcalorimétrie, de résonance plasmonique de surface et de cristallographie aux rayons X, le site de liaison du sucre de PA-IL a été parfaitement caractérisé, et de nombreux inhibiteurs dérivés du galactose ont pu être testés. D'autre part, nous avons exprimé Cup6 sous forme recombinante et nous avons étudié sa spécificité. Nos études ont montré que le sucre reconnu pourrait être le Lewis b et des études structurales sont en cours. Ces travaux s'inscrivent dans l'optique d'élaborer des glycomimétiques qui pourraient apporter une alternative aux antibiotiques.