Le transporteur d'ADP/ATP est une protéine de la membrane interne mitochondriale qui joue un rôle physiologique majeur en catalysant l'échange d'un ADP cytoplasmique contre un ATP néo-synthétisé dans la matrice mitochondriale. Cette protéine peut être inhibée de manière très spécifique par deux poisons naturels, le carboxyatractyloside (CATR) et l'acide bongkrekique (BA) qui stabilisent la protéine dans deux états conformationnels distincts adoptés au cours du mécanisme de transport. Afin de mieux appréhender cette dynamique fonctionnelle, une étude du transporteur d'ADP/ATP bovin en complexe avec le CATR ou le BA dans le détergent Triton X-100 a été réalisée par échange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse. Ces travaux se sont déroulés en 4 parties. La première a consisté à adapter cette technique à l'étude des protéines membranaires intégrales. En effet, la présence de détergents, nécessaires au maintien en solution de l'état natif de ces protéines, n'a pas permis jusqu'ici de les étudier par cette approche. Pour pallier cette difficulté, un protocole automatisé de chromatographie liquide permettant l'élimination du Triton X-100 a été mis au point. Les cinétiques de deutération des différents complexes ont alors pu être analysées dans le deuxième volet de cette étude. Les données obtenues ont permis de proposer des modèles conformationnels du transport de nucléotides à travers la membrane interne mitochondriale, dans lesquels le transporteur présenterait une cavité ouverte tour à tour vers l'espace intermembranaire et vers la matrice. Afin d'apporter d'autres éléments de réponse sur ce mécanisme de transport et de s'affranchir de différents problèmes liés à l'utilisation des détergents, des essais de deutération du transporteur d'ADP/ATP bovin dans les mitochondries ont été entrepris et représentent le troisième volet de ces travaux. Cette approche, qui nécessite encore plusieurs améliorations, a permis d'obtenir les premières données de deutération d'une protéine membranaire dans son environnement natif. Le transporteur d'ADP/ATP est aussi impliqué dans des pathologies humaines plus ou moins graves. Dans une dernière partie, l'étude de ces mutations a été abordée en réalisant chez la levure Saccharomyces cerevisiae une étude phénotypique et biochimique de plusieurs mutants du transporteur de l'amibe Dictyostelium discoideum correspondant aux mutations humaines. Cette étude a mis en évidence un problème dans le mécanisme intrinsèque de transport, induit par la mutation V291M, qui pourrait être à l'origine de la pathologie associée.

La prédiction in silico de la structure tridimensionnelle d'une protéine à partir de sa séquence en acides aminés constitue un défi scientifique d'intérêt majeur. Il est à présent admis que les structures protéiques peuvent être décrites à partir d'un répertoire limité de structures locales récurrentes. Cette observation a conduit au développement de techniques de prédiction de la structure 3D par assemblage de fragments. Ces techniques sont aujourd'hui parmi les plus performantes. Dans ce contexte, la prédiction des structures locales constitue une première étape vers la prédiction de la structure 3D globale d'une protéine. Mon travail de thèse porte principalement sur l'étude des structures protéiques locales à travers deux thèmes : (i) la prédiction des structures locales à partir de la séquence et (ii) l'analyse de la prédictibilité des structures locales en fonction de la flexibilité des structures protéiques. Ces études reposent sur une bibliothèque de 120 fragments chevauchants de 11 résidus de long précédemment développée au sein du laboratoire. Une méthode de prédiction des structures locales à partir de la séquence avait également été mise en place et permettait d'obtenir un taux de prédiction correct de 51 %. La prise en compte de données évolutionnaires couplée à l'utilisation de Machines à Vecteurs de Support a permis d'améliorer la prédiction des structures locales jusqu'à 63 % de prédiction correctes. De plus, un indice de confiance permettant d'évaluer directement la qualité de la prédiction et ainsi d'identifier les régions plus ardues à prédire a été mis au point. Par ailleurs, la structure des protéines n'est pas rigide. Ainsi, j'ai étendu notre analyse à l'étude la prédictibilité structurale des séquences d'acides aminés en fonction de leur flexibilité structurale au sein des protéines. Une analyse des propriétés dynamiques des structures locales a été menée en s'appuyant sur (i) les B-facteurs issus des expériences de cristallographie et (ii) les fluctuations du squelette polypeptidique observées lors de simulations de dynamique moléculaire. Ces analyses de la relation flexibilité-structure locale ont conduit au développement d'une stratégie de prédiction originale de la flexibilité à partir de la séquence. Nos différentes approches constituent une première étape vers la prédiction de la structure tridimensionnelle globale d'une protéine.

Un des buts de la recherche pharmaceutique est l'inhibition de protéines avec l'aide de petites molécules (ligands). L'une des phases clefs de ce procédé est la détermination du mode d'interaction entre un ligand et son récepteur. Cette tâche peut être entravée par l'absence de structure du complexe protéine-ligand. C'est pour répondre à ce besoin que nous présentons dans ce travail de thèse, une méthode capable de déterminer la structure de complexes protéine-ligands. Dans la méthode INPHARMA (Inter-ligands Nuclear Overhauser Effect for Pharmacophore Mapping), les inter-ligands NOEs (INPHARMA NOEs) sont utilisés pour déterminer l'orientation relative de deux ligands qui interagissent de manière compétitive avec un même récepteur. Cette nouvelle approche ouvre la voie à des applications pharmaceutiques, également au stade initial du développement, quand l'information structurale via la cristallographie par Rayons X est difficile d'accès.

Le fer est un élément important de plusieurs métabolismes et fonctions physiologiques. Il possède la propriété de gagner ou de perdre facilement un électron, passant ainsi de la forme ferreuse (FeII) à la forme ferrique (FeIII), et inversement. C'est cette propriété qui lui confère un rôle primordial dans les phénomènes d'oxydations et de réductions biologiques. Bien qu'il soit très abondant dans la croûte terrestre, le fer est très peu soluble en milieu aérobie et à pH physiologique et est de ce fait est très peu biodisponible. La concentration de FeIII libre dans l'environnement est d'environ 10-18 M, bien trop basse pour les bactéries pathogènes qui exigent une concentration de l'ordre de 10-5 à 10–7 M pour établir et maintenir une infection. Pour contourner le problème de la faible disponibilité de fer, les bactéries ont développé différents mécanismes d'acquisition de ce métal. Le mécanisme le plus répandu implique la synthèse et la sécrétion des sidérophores, ayant une très forte affinité pour leFeIII. Après leur sécrétion, les sidérophores chélatent le Fe3+ dans le milieu extracellulaire et le transportent au travers de la membrane externe via les récepteurs TonB-dépendants (RTBDs). Les RTBDs sont également impliqués dans le transport d'autres molécules comme l'hème. Durant cette thèse nous nous sommes intéressés à l'étude structurale des RTBDs de différentes bactéries à Gram-négatif et aussi au devenir, au niveau du périplasme, de la ferri-pyoverdine, après son transport à travers la membrane externe via le RTBD FpvA chez P. aeruginosa. Pour les études structurales, nous nous sommes intéressés à 4 RTBDs (ShuA, SuxA, FauA et FetA). Nous avons défini et optimisé un protocole de surexpression, de purification et de cristallisation pour les RTBDs. Le protocole mis en place est rapide, efficace et reproductible. Il nous a permis de purifier, de cristalliser rapidement et de collecter des données de diffraction pour 4 RTBDs. La structure de ShuA a ensuite été résolue à 2,6 Å, celle de FauA à 2,3 Å de résolution par le Dr D. Cobessi. Celle de FetA est actuellement en cours d'affinement à 3,2 Å. Pour les études fonctionnelles, nous nous sommes intéressés à l'implication des gènes du cluster fpvCDEFGHJK dans l'acquisition du fer par la voie Pvd chez P. aeruginosa. Ce cluster est conservé chez toutes les espèces de Pseudomonas produisant la Pvd, il est organisé en 2 opérons, fpvCDEF et fpvGHJK, séparés par 32 paires de bases. Les résultats obtenus pendant cette thèse, suggèrent l'implication des protéines FpvCDEF dans la dissociation périplasmique de la ferri-pyoverdine par réduction du FeIII en FeII. En effet, la mutation de ces gènes abolie complètement le transport du fer par la Pvd. Le phénotype sauvage a été restauré par l'addition du DTT, suggérant l'implication de ses protéines dans la dissociation périplasmique de la ferri-pyoverdine par réduction du FeIII en FeII. Nous avons également montré que la protéine FpvG est une protéine périplasmique dont l'expression est régulée par les niveaux de fer. Les études de spectrométrie de masse et de dosage des métaux ont montré que cette protéine était également capable de lier directement le fer. Enfin, l'étude des interactions protéine-protéine a montré une interaction entre les protéines FpvG et FpvA, confirmant l'implication de la protéine FpvG dans le transport du fer par la Pvd. FpvG serait probablement impliquée dans la prise en charge du fer dans le périplasme après sa dissociation de la Pvd et assurant ensuite son transport vers le cytoplasme via le transporteur ABC FpvHJ. L'ensemble de ces résultats a permis également de montrer que le transport du fer via la Pvd implique des mécanismes très différents de ceux qui sont décrits précédemment pour les sidérophores utilisés par E. coli.

L'ADN, support de l'information génétique, est constamment soumis à des stress l'endommageant. Ceci peut conduire à des modifications structurales de la molécule d'ADN et à des conséquences biologiques néfastes de type mutagénèse ou cancérogénèse. Les lésions de l'ADN peuvent être réparées par des complexes enzymatiques qui restaurent la séquence originale. Dans le présent travail nous nous sommes intéressés aux aspects structuraux des lésions de l'ADN et à leur réparation par excision de base (BER) ou par réversion (RR). Notre travail a consisté à développer un nouvel outil de type biopuce pour détecter ces activités de réparation par mesure de fluorescence. Pour cela des oligonucléotides lésés auto-complémentaires ont été immobilisés sur des lames de verre. Après avoir mis au point les conditions d'immobilisation, par la chimie click, nous avons validé ce nouveau biocapteur pour la détection d'activités de réparation d'enzymes purifiées (glycosylases et AP-endonucléases) ou au sein d'extraits cellulaires. Utilisant un principe similaire, nous avons adapté cette biopuce pour mesurer les activités de réparation par réversion ainsi que pour le screening d'inhibiteurs. Dans une seconde partie de ce travail, nous avons appliqué la technique de résonance paramagnétique électronique pulsée (RPE pulsée) pour étudier la déformation structurale induite par plusieurs dommages de l'ADN. Pour cela nous avons développé une méthode de multi-marquage de l'ADN par des radicaux nitroxydes. Cette technique a alors été appliquée pour la première fois à la détection d'une activité enzymatique de réparation de l'ADN.

Les neurotoxines botuliques (BoNTs), toxines les plus efficaces connues, sont responsables du botulisme. Elles inhibent la libération d'acétylcholine aux jonctions neuromusculaires causant des paralysies flasques. Lors de l'intoxication, la BoNT se lie à ses récepteurs à la surface des neurones, puis est internalisée par endocytose. L'interaction de son domaine de translocation avec la membrane à l'intérieur de compartiments cellulaires acides permet le passage du domaine catalytique dans le cytosol. Le domaine de translocation de BoNT/A (Tm) a été exprimé à partir d'un gène de synthèse. L'insertion de Tm dans la membrane et son activité sont dépendantes du pH et apparaissent dès pH 5,5. Aucun changement de structure n'est détecté par spectroscopie. Cependant, la formation d'une structure quaternaire n'est pas exclue. L'activité de Tm est aussi sensible à la courbure de la membrane, ce qui pourrait permettre une régulation supplémentaire de sa fonction.<br /><br />L'apomyoglobine appartient à la famille des protéines à repliement de type globine, comme certaines toxines bactériennes. Son interaction avec la membrane présente de fortes homologies avec celle du domaine de translocation de la toxine diphtérique. Ce processus à deux étapes (liaison puis insertion) est dépendant du pH et requiert le passage par un état partiellement replié. Pour chaque étape, les régions impliquées ont été localisées par des expériences d'échanges Hydrogène/Deuterium analysées par spectrométrie de masse. La liaison à la bicouche se fait par une hélice amphiphile, puis une hélice hydrophobe intervient pour l'insertion. Cette dernière n'est accessible qu'après formation de l'état partiellement replié.

L'acétylcholinestérase est une enzyme très rapide, essentielle à la neurotransmission cholinergique. Elle est la cible de toutes les molécules actuellement utilisées dans le traitement de la maladie d'Alzheimer, et les progrès à venir dans la modulation de son activité réclament une connaissance plus fine de sa structure et de sa dynamique. Dans cette thèse, nous décrivons trois approches expérimentales ayant permis d'obtenir des informations structurales sur la dynamique de l'acétylcholinestérase. Nous rapportons, dans un premier temps, la structure de cette enzyme en complexe avec un putatif médicament anti-Alzheimer de seconde génération. Nous décrivons, par ailleurs, une approche de mise à l'équilibre réactionnel de complexes enzyme/substrat cristallins, grâce à laquelle le trafic des substrats au sein de l'acétylcholinestérase a pu être suivi structuralement. Nous présentons, enfin, le développement d'une stratégie nouvelle en cristallographie cinétique des protéines, basée sur l'utilisation d'un précurseur photosensible du produit de réaction enzymatique, sa photolyse in-crystallo par le biais d'un laser, et l'application subséquente de profils de température adéquats afin de permettre la survenue des mouvements moléculaires nécessaires à l'expulsion des produits de photolyse. Prises conjointement, les différents résultats de cette thèse permettent une description détaillée du trafic des substrats et produits au sein de l'acétylcholinestérase, et fournissent un aperçu structural de son paysage conformationnel.

Les microsatellites, séquences répétées en tandem de période une à six paires de bases, sont des entités génomiques présentes dans tous les organismes qu'ils soient animaux, végétaux ou microbiens. Ils présentent un cycle de vie caractérisé par trois phases principales : une apparition et une maturation, une dynamique à l'état mature, puis une dégénérescence. Nous nous intéressons dans cette thèse à la première phase, l'apparition des microsatellites. <br />Pour traiter ces questions, nous nous sommes basés sur l'analyse de la séquence du génome humain. L'une des lacunes de ce type d'analyse est qu'il faut d'abord extraire les microsatellites du génome, et qu'il existe plusieurs algorithmes de nature et fonctionnement différents. La première partie de cette thèse se concentre donc sur la comparaison de quelques-uns des principaux algorithmes de recherche de répétitions en tandem, et dresse un portait des différentes qualités et limitations de chacun des algorithmes.<br />Deux possibilités majeures sont détaillées, l'apparition par l'intermédiaire d'éléments transposables (ETs), et l'apparition spontanée à partir d'une séquence quelconque. Dans le premier cas, l'étude est focalisée sur le rôle des queues polyA des séquences Alu chez les primates. La question de l'apparition à partir d'une séquence quelconque cherche à établir l'impact de trois mécanismes mutationnels différents sur la création et le développement primordial des microsatellites : la mutation ponctuelle, le glissement de polymérase et la micro-duplication adjacente de quelques nucléotides. Un modèle général d'apparition des microsatellites est aussi proposé, suggérant une dynamique d'apparition plus complexe que ce qui était précédemment supposé.

L'utilisation thérapeutique de glycoprotéines recombinantes produites dans le système baculovirus-cellules d'insectes reste limitée par le potentiel de glycosylation de ces cellules, qui produisent essentiellement des structures O- et N-glycanniques courtes. Notre travail s'inscrit donc dans un effort global d'"humanisation" de la glycosylation des protéines produites dans les cellules de Lépidoptères.<br />Nous nous sommes d'abord attachés à comprendre la voie de maturation des N-glycannes dans des cellules Sf9. L'utilisation d'inhibiteurs de la maturation ou du trafic intracellulaire nous a permis d'identifier des intermédiaires clés et de confirmer l'hypothèse que la maturation des N-glycannes dans les cellules d'insectes et de mammifères suivent un chemin métabolique parallèle jusqu'à la formation de l'espèce GlcNAcMan3[Fuc]GlcNAc2. Chez les insectes, cette structure est ensuite substrat d'une β-N-acétylglucosaminidase qui produit l'espèce finale Man3[Fuc]GlcNAc2.<br />Cette voie de maturation peut néanmoins être déviée vers la synthèse de N-glycannes de type complexe par l'addition de glycosyltransférases absentes : ainsi, l'expression d'une β1,4-galactosyltransférase permet la synthèse de l'espèce GalGlcNAcMan3[Fuc]GlcNAc2.<br />Notre intérêt s'est ensuite porté sur l'ingénierie de la sialylation dans les cellules d'insectes, compliquée par l'absence du donneur d'acides sialiques, le CMP-Neu5Ac. Notre stratégie a été d'exprimer la trans-sialidase de Trypanosoma cruzi sur la membrane plasmique des cellules, afin qu'elle puisse sialyler les glycoprotéines sécrétées en utilisant des donneurs du milieu. La construction exprimée grâce à un vecteur baculovirus code une enzyme active, dont une partie est retrouvée sur la membrane plasmique et sur l'enveloppe des particules virales, tandis qu'une partie, croissante avec l'infection, est soluble. Néanmoins, le système permet une sialylation quantitative d'accepteurs exogènes.<br />Notre étude contribue à montrer que l'ingénierie de la glycosylation dans le système baculovirus-cellules d'insectes est envisageable. Pour résoudre le problème de la sialylation, la trans-sialidase est une alternative possible aux sialyltransférases.

Biomolecules on cell surfaces play critical roles in diverse biological and physiological processes. However, conventional bulk scale techniques are unable to clarify the density and distribution of specific biomolecules in situ on single, living cell surfaces at the micro or nanoscale. In this work, a single cell analysis technique based on Atomic Force Microscopy (AFM) is developed to spatially identify biomolecules and characterize nanomechanical properties on single cell surfaces. The unique advantage of these AFM-based techniques lies in the ability to operate in situ (in a non-destructive fashion) and in real time, under physiological conditions or controlled micro-environments. First, AFM-based force spectroscopy was developed to study the fundamental biophysics of the heparin/thrombin interaction at the molecular level. Based on force spectroscopy, a force recognition mapping strategy was developed and optimized to spatially detect single protein targets on non-biological surfaces. This platform was then translated to the study of complex living cell surfaces. Specific carbohydrate compositions and changes in their distribution, as well as elasticity change were obtained by monitoring Bacillus cells sporulation process. The AFM-based force mapping technique was applied to different cellular systems to develop a cell surface biomolecule library. Nanoscale imaging combined with carbohydrate mapping was used to evaluate inactivation methods and growth temperatures effects on Yersinia pestis surface. A strategy to image cells in real time was coupled with hydrophobicity mapping technique to monitor the effect of antimicrobials (antimicrobial polymer and copper) on Escherichia coli and study their killing mechanisms. The single spore hydrophobicity mapping was used to localize the exosporium structure and potentially reconstruct culture media. The descriptions of cell surface DNA on single human epithelial cells potentially form a novel tool for forensic identification. Overall, these nanoscale tools to detect and assess changes in cell behavior and function over time, either as a result of natural state changes or when perturbed, will further our understanding of fundamental biological processes and lead to novel, robust methods for the analysis of individual cells. Real time analysis of cells can be used for the development of lab-on-chip type assays for drug design and testing or to test the efficacy of antimicrobials.