Die mechanischen Eigenschaften von Zellen charakterisieren und beeinflussen deren Zustand. Die vorliegende Arbeit zielt auf ein besseres Verständnis der biomechanischen Eigenschaften von Zellen ab. Der Fokus lag dabei auf der Biegesteifigkeit von Zellmembranen und der Deformierbarkeit der Zellen. Es werden drei Studien vorgestellt in der diese Materialparameter untersucht wurden. Die erste Studie befasst sich mit der Temperaturabhängigkeit der mechanischen Eigenschaften. Hierbei wurden acht verschieden Zelllienien bei jeweils fünf Temperaturen rheologisch vermessen. Zur Messung wurde der sog. \"optical stretcher\" verwendet der gleichzeitig die Zellen deformieren und aufheizen kann. Die Versuche zeigen, dass eine Zeit-Temperatur superposition dabei nicht für alle Zelltypen funktioniert. In der zweiten Studie wurden die Membransteifigkeit von Gewebeproben von Brust- und Gebärmutterhalskrebspatienten untersucht. Als Kontrollsystem wurde gutartiges Gewebe aus dem Umfeld des Tumors verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass die Zellmembranen von Tumorzellen weicher waren als von gesundem Vergleichsgewebe. Die Änderung der Membrankomposition wurde dabei als mögliche Ursache massenspektroskopisch Untersucht und verschieden Ursachen der weichen Membrane diskutiert. Für die dritte Studie wurde der chemische Wirkstoff Soraphen A eingesetzt um die Membransteifigkeit von zwei Zelllienien zu erhöhen. Dies zeigte eine Verringerung von Zellbeweglichkeit und Invasivität.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Konservierung elektrophysiologischer Charakteristika von Proteintranslokasen aus verschiedenen Organismen untersucht. Die Sec61/Sec61p Komplexe aus rauen Mikrosomen von Canis familiaris und Saccharomyces cerevisiae bilden ionenpermeable Poren mit einer hohen Leitfähigkeit in planaren Lipidmembranen. In Säugerzellen werden diese durch einen Calcium-Calmodulin (Ca2+-CaM)-vermittelten negativen Feedback-Mechanismus reguliert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Spezifität der zugrundeliegenden Interaktion von Ca2+-CaM mit der α-Untereinheit des Sec61 Komplexes belegt werden. Es wurde gezeigt, dass der Calmodulin Antagonist Ophiobolin A in der Lage ist, die Inhibition der Ionenpermeation durch Sec61 aufzuheben. Des Weiteren wurde anhand elektrophysiologischer Messungen nachgewiesen, dass dieser Ca2+-CaM-vermittelte Regulationsmechanismus in der Hefe S. cerevisiae nicht vorhanden ist. Dies wird auf eine kritische Variation in der Primärstruktur des Hefe-Proteins zurückgeführt, welche die Bindung von Calmodulin an den N-Terminus von Sec61p verhindert. Der bakterielle SecYEG Komplex aus E. coli konnte erfolgreich in Proteoliposomen rekonstituiert werden. Die Funktionalität des Translokons wurde in in vitro proOmpA Importexperimenten nachgewiesen. Mittels dieser Proteoliposomen sollten SecYEG Poren in den planaren Bilayer integriert werden. Sowohl für den inaktiven als auch für den durch die Anwesenheit von Substraten oder Bindepartnern aktivierten Komplex konnten keine ionenpermeablen Poren in der Membran nachgewiesen werden. Dies lässt darauf schließen, dass im Gegensatz zu den homologen Komplexen in Eukaryoten, der bakterielle Sec Komplex intrinsisch die Permeabilitätsbarriere für Ionen aufrechterhält. Die vorliegenden Ergebnisse legen nahe, dass weder die Ausbildung ionenpermeabler Poren, noch deren Regulation zwischen den Sec Komplexen von Bakterien, Hefen und Säugern vollständig konserviert ist. In einem zweiten Teilprojekt wurden auf der Suche nach der zentralen Proteinimportpore in der äußeren Mitochondrienmembran von Trypanosoma brucei zwei mögliche Kandidaten, TbSam50 und ATOM, anhand elektrophysiologischer Untersuchungen verglichen. Beide waren in der Lage in planaren Bilayern ionenpermeable Poren auszubilden. Die elektrophysiologischen Grundcharakteristika dieser Poren, wie der hohe Leitwert und die Selektivität für Kationen sowie die beobachtete Interaktion mit mitochondrialen Präsequenzen, stimmen gut mit einer potentiellen Funktion als Proteinimportpore überein. Eine detaillierte Untersuchung der Einzelkanaleigenschaften zeigte, dass TbSam50 beträcht-liche Ähnlichkeiten zu homologen Proteinen in Hefen und menschlichen Zellen aufweist. Somit bestätigen die hier präsentierten Ergebnisse die Identifikation von TbSam50 als Kern der trypanosomalen Assemblierungsmaschinerie für β-barrel Proteine in der äußeren Mitochondrienmembran. Besonderheiten in der Beeinflussung der Kanaleigenschaften durch mitochondriale Präpeptide, insbesondere die erhöhte Verweildauer des Kanals im geschlossenen Zustand, weisen darauf hin, dass TbSam50 keine duale Funktion als β-barrel Insertase und Proteintranslokase besitzt. Hingegen lieferte die elektrophysiologische Charakterisierung von ATOM Hinweise, welche die Identifikation dieses Proteins als porenbildende Untereinheit des mitochondrialen Proteinimportapparates in T. brucei bestätigen. Darüber hinaus zeigten Vergleiche der elektrophysiologischen Charakteristika, insbesondere des Schaltverhaltens und der Anzahl porenbildender Untereinheiten pro aktiver Einheit im artifiziellen Bilayer, dass ATOM stärkere Ähnlichkeiten zu Proteintranslokasen bakterieller Abstammung aufweist, als zu Tom40, der generellen Importpore der Eukaryoten. Dies unterstützt das auf Sequenzvergleichen basierende Model, dass ATOM ein evolutives Relikt repräsentiert, anhand dessen die Entwicklung der mitochondrialen Proteinimportmaschinerie aus einer bakteriellen, Omp85-artigen Protein-exportpore abgeleitet werden kann.

Die zwei Nanomotoren der rotierenden ATP-Synthase sind über einen zentralen Rotor und einen peripheren Stiel miteinander gekoppelt. Während der katalytisch aktive F1-Teil in drei 120°-Schritten rotiert, benötigt der ionentranslozierende FO-Teil in Escherichia coli zehn Schritte für eine Rotation um 360°. Angesichts dieses Symmetriemissverhältnisses wurde eine elastische Kopplung der beiden Domänen als Voraussetzung für die katalytische Funktionalität des Enzyms angesehen. Der elastische Bereich des Rotors wurde an den Kontaktflächen der globulären Domänen der gamma- und epsilon-Untereinheit zum c10-Ring lokalisiert und mit einer Torsionsfederkonstanten von 68 pNnm bestimmt. In dieser Arbeit wurde die Torsionsfederkonstante des ab2c10-Komplexes anhand der Beobachtung von bis zu dreizehn Einzelmolekülen mit einer Torsionsfederkonstanten von 1300 pNnm bestimmt. Neben ihrer hervorragenden Eigenschaft zur Formung einer realitätsnahen und natürlichen Umgebung für Membranproteine sind die Eigenschaften von Phospholipidmembranen intrinsisch hinsichtlich ihrer chemischen und mechanischen Stabilität begrenzt. Künstliche Membranen aus ABA-Triblockcopolymer haben sich als vielversprechender, stabiler Lipidersatz erwiesen. Durch Variation der Stöchiometrie der Blöcke können die physikochemischen Eigenschaften des Triblocks verändert werden. Die ATP-Synthase aus E. coli konnte unter Erhalt der Funktionalität in Polymervesikel (Polymerosomen) eingebaut werden. Allerdings war die Aktivität nicht eindeutig der Polymerumgebung zuzuordnen, da die Enzympräparation in Gegenwart von natürlichem Lidid durchgeführt wurde. Der Einbau des Enzyms, das auf drei unterschiedliche Arten lipidfrei präpariert wurde, in Polymerosomen konnte auch unter Verwendung von drei unterschiedlichen Rekonstitutionsmethoden weder durch funktionelle Tests noch immunologisch nachgewiesen werden.

Functional immobilization and lateral organization of proteins into micro- and nanopatterns is an important prerequisite for miniaturizing analytical and biotechnological devices. In this thesis I present novel and versatile approaches for high contrast surface micropatterning of proteins, artificial membranes and live cells based on maleimide photochemistry. The patterning strategy is carried-out on glass substrates exploiting a poly(ethylene glycol) PEG polymer layer as a compatible scaffold. The flexible PEG cushion prevents unspecific proteins attachment and cell adhesion to surfaces. The versatility of this method is demonstrated by means of different orthogonal chemistries using covalent- and affinity- based interactions for protein immobilization. Furthermore, using maleimide based alkyl-thiol chemistry, I utilized the patterning approach for capturing liposomes and proteoliposomes onto surfaces. Formation of fluid patterned polymer-supported membranes demonstrating lateral diffusion of lipids and proteins was confirmed by biophysical assays. A similar approach was used for micropatterning of transmembrane proteins in surface adhered live cells.

Anders als menschengemachte Maschinen verfügen Zellen über keinen festgeschriebenen Bauplan und die Positionen einzelner Elemente sind häufig nicht genau festgelegt, da die Moleküle diffusiven Zufallsbewegungen unterworfen sind. Darüber hinaus sind einzelne Bauteile auch nicht auf eine einzelne Funktion festgelegt, sondern können parallel in verschiedene Prozesse einbezogen sein. Basierend auf Selbstorganisation und Selbstassemblierung muß die Organisation von Anordnung und Funktion einer lebenden Zelle also bereits in ihren einzelnen Komponenten inhärent enthalten sein. Die intrazelluläre Organisation wird zum großen Teil durch ein internes Biopolymergerüst reguliert, das Zytoskelett. Biopolymer-Netzwerke und –Fasern durchdringen die gesamte Zelle und sind verantworlich für mechanische Integrität und die funktionale Architektur. Unzählige essentielle biologische Prozesse hängen direkt von einem funktionierenden Zytoskelett ab. Die vorliegende Arbeit zielt auf ein besser Verständnis und den Nachbau zweier verschiedener funktionaler Module lebender Zellen anhand stark reduzierter Modellsysteme. Als zentrales Element wurde Aktin gewählt, da dieses Biopolymer eine herausragende Rolle in nahezu allen eukaryotischen Zellen spielt. Mit dem ersten Modellsystem wird der bewegliche Aktin-Polymerfilm an der Vorderkante migrierender Zellen betrachtet. Die wichtigsten Elemente dieser hochdynamischen Netzwerke sind bereits bekannt und wurden in dieser Arbeit benutzt um ein experimentelles Modellsystem zu etablieren. Vor allem aber lieferten detailierte Computersimulationen und ein mathematisches Modell neue Erkenntnisse über grundlegende Organisationsprinzipien dieser Aktinnetzwerke. Damit war es nicht nur möglich, experimentelle Daten erfolgreich zu reproduzieren, sondern das Entstehen von Substrukturen und deren Charakteristika auf proteinunabhängige, generelle Mechanismen zurückzuführen. Das zweite studierte System betrachtet die Selbstassemblierung von Aktinnetzwerken durch entropische Kräfte. Aktinfilamente aggregieren hierbei durch Kondensation multivalenter Ionen oder durch Volumenausschluss hochkonzentrierter inerter Polymere. Ein neu entwickelter Experimentalaufbau bietet die Möglichkeit in gut definierten zellähnlichen Volumina, Konvektionseinflüsse zu umgehen und Aggregationseffekte gezielt einzuschalten. Hierbei wurden neuartige, regelmäßige Netzwerkstrukturen entdeckt, die bislang nur im Zusammenhang mit molekularen Motoren bekannt waren. Es konnte ferner gezeigt werden, dass die Physik der Flüssigkristalle entscheidend zu weiteren Variationen dieser Netzwerke beiträgt. Dabei wird ersichtlich, dass entstehende Netzwerke in ihrer Architektur direkt die zuvor herrschenden Anisotropien der Filamentlösung widerspiegeln.

Cilien und eukariotische Flagellen sind lange, dünne Fortsaetze von Zellen. Sie enthalten eine Struktur namens Axonem. Die wesentlichen Komponenten des Axonems sind die Filamente und Motorproteine namens Mikrotubuli und Dynein. Die Motoren forcieren die Filamente, sich in oszillierender Weise gegeneinander zu verschieben, was zu einem Schlagmuster entlang des Axonemes fuehrt. Wie diese Motoren koordiniert werden und wie dieses Phaenomen quantitativ beschrieben werden kann, ist nicht verstanden. Wir studierten die Wellenformen an Spermienschwaenzen, welche ein solches Axonem enthalten, unter verschiedenen Bedingungen mit einer Hochgeschwindigkeitskamera. Wir entwickelten eine automatisierte Bildanalyse-Software, die es erlaubt, lange Zeitreihen solcher Wellenformen von Filmen zu extrahieren. In einer anschließenden Fourieranalyse erzielten wir eine gemittelte Wellenform mit erhoehter Präzision. Ein Vergleich von unseren Daten mit den Vorhersagen einer Theorie (Camalet, Julicher et al. 1999) führte zu einer Diskrepanz. Entsprechend schlugen wir eine Erweiterung der Theorie vor, indem wir annahmen, daß an der Basis des Axonems ein viskos-elastisches Element existiert. Dies führte zu einer zufrieden stellenden Übereinstimmung zwischen Theorie und Experiment. Abschließend diskutieren wir offene Fragen und zukünftige Experimente. Als ein Nebenprodukt entdeckten wir ein neues Phaenomen, bei welchem Spermien Anordnungen von dynamischen Strudeln (Vortices) bilden. Wir beschrieben dieses Phaenomen im Detail und führten einen neuen Ordnungsparameter ein, mit dem die Ordnung zwischen vielen Objekten quantifiziert werden kann. Mittels dieses Ordnungsparameters konnten wir zeigen, daß dieses Muster sich erst ab einer kritischen Dichte herausbildet. Wir schlugen ein Model vor, um den Ursprung des Musters zu erklären. Die Simulation des Models zeigte volle Uebereinstimmung mit den wesentlichen Eigenschaften dieses Musters. Weiterhin schaetzten wir die typische Wechselwirkungskraft zwischen aktiven Axonemen mit 0.1 pN ab. Abschließend ziehen wir Schlußfolgerungen über die kollektive Wirkung von Axonemen im Allgemeinen mit Hinblick auf Spermienkooperation und metachronale Cilienwellen. - Die Druckexemplare enthalten jeweils eine CD-ROM als Anlagenteil: QuickTimeMovies (ca. 65 MB) Nutzung: PLAY32 - Übersicht über Inhalte siehe Dissertation S. 108 - 109 / Cilia and eukaryotic flagella are long, thin extensions of cells that contain a structure known as axoneme. The key components of the axoneme are microtubule filaments and the motor proteins dynein. These dynein motors force the microtubules to slide in an oscillatory fashion leading to a wave pattern along the axoneme. How these motors are coordinated and how this phenomenon can be described quantitatively is not understood. I therefore studied the waveforms of sperm tails that contain such an axoneme. I observed these waveforms under different conditions with a high-speed camera and developed an automated image analysis tool allowing the extraction of long time series of this waveform. In a subsequent Fourier analysis I increased the precision by obtaining an averaged waveform. I then compared the data to the predictions of a theoretical framework (Camalet, Julicher et al. 1999) and found that they do not agree. I suggested extending this theoretical framework by considering a visco-elastic element at the base of the axoneme, which leads to a satisfactory agreement. This project leaves open questions hence further work is discussed. As a side finding, I discovered a new phenomenon on how spermatozoa form dynamic vortex arrays. I described this pattern in detail and introduced a novel order parameter to quantify the order among many particles. I showed that the array only forms above a critical sperm density. I suggested a model to explain the origin of the pattern and showed by simulation that the model can account for the main features of the pattern. Finally I estimated the typical interaction force between beating axonemes to be 0.1 pN and drew conclusions about their collective action in general that might be relevant for sperm cooperation or metachronal waves of cilia.

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Kieselalgen – auch Diatomeen genannt – verfügen über die einzigartige Fähigkeit, nanostrukturierte, hierarchisch aufgebaute Zellwände aus Siliziumdioxid – auch als Biosilica bekannt – mit beispielloser Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu bilden. Ein tieferes Verständnis für diesen Prozess, der als “Biomineralisation“ bekannt ist, ist nicht nur auf dem Gebiet der Grundlagenforschung zu Kieselalgen sehr bedeutsam, sondern auch für die Nutzung dieser Nanostrukturierung in den Materialwissenschaften oder der Nanobiotechnologie. Nach dem derzeitigem Stand der Wissenschaft wird diese Strukturierung durch die Selbstorganisation von Proteinmustern, an denen sich das Siliziumdioxid bildet, erreicht. Um die Funktion und das Zusammenspiel einzelner Proteine, die an diesem Biomineralisationsprozess beteiligt sind, entschlüsseln zu können, ist es essentiell ihre strukturelle Organisation aufzuklären und diese mit den morphologischen Zellwandmerkmalen zu korrelieren. Die Größenordnung dieser Merkmale ist im Bereich von Nanometern angesiedelt. Mit Hilfe der Elektronenmikroskopie können diese Biosilicastrukturen aufgelöst werden, jedoch ist keine proteinspezifische Information verfügbar. Ziel dieser Arbeit war es daher, eine Technik zu etablieren, die in der Lage ist, einzelne Biosilica-assozierte Proteine mit Nanometer-Präzision zu lokalisieren. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie (single-molecule localization microscopy, kurz: SMLM) beispielhaft in der Kieselalge Thalassiosira pseudonana etabliert. Die Position verschiedener Biosilica-assoziierte Proteine innerhalb des Biosilicas und nach dessen chemischer Auflösung wurde mit einer hohen räumlichen Auflösung bestimmt. Um quantitative Ergebnisse zu erhalten, wurde ein Analyse-Workflow entwickelt, der grafische Benutzeroberflächen und Skripte für die Visualisierung, das Clustering und die Kolokalisation von SMLM Daten beinhaltet. Um optimale Markierungen für SMLM an Biosilica-eingebetteten Proteinen zu finden, wurde ein umfassendes Screening von photo-schaltbaren fluoreszierenden Proteinen durchgeführt. Diese wurden als Fusionsproteine mit Silaffin3, einem Protein, welches eng mit der Biosilica-Zellwand assoziiert ist, exprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass nur drei von sechs Kandidaten funktional sind, wenn sie in Biosilica eingebettet sind. Silaffin3 konnte indirekt mittels SMLM mit einer Lokalisationsgenauigkeit von 25 nm detektiert werden. Dies erlaubte es, seine strukturelle Organisation aufzulösen und Silaffin3 als eine Hauptkomponente in der Basalkammer der Fultoportulae zu identifizieren. / Diatoms feature the unique ability to form nanopatterned hierarchical silica cell walls with unprecedented accuracy and reproducibility. Gathering a deeper understanding of this process that is known as “biomineralization” is vitally important not only in the field of diatom research. In fact, the nanopatterning can also be exploited in the fields of material sciences or nanobiotechnology. According to the current understanding, the self-assembly of protein patterns along which biosilica is formed is key to this nanopatterning. Thus, in order to unravel the function of individual proteins that are involved in this biomineralization process, their structural organization has to be deciphered and correlated to morphological cell wall features that are in the order of tens of nanometer. Electron microscopy is able to resolve these features but does not provide protein-specific information. Therefore, a technique has to be established that is able to localize individual biosilica-associated proteins with nanometer precision. To achieve this objective, single-molecule localization microscopy (SMLM) for the diatom Thalassiosira pseudonana has been pioneered and exploited to localize different biosilica associated proteins inside silica and after silica removal. To obtain quantitative data, an analysis workflow was developed including graphical user interfaces and scripts for SMLM visualization, clustering, and co-localization. In order to find optimal labels for SMLM to target biosilica-embedded proteins, a comprehensive screening of photo-controllable fluorescent proteins has been carried out. Only three of six candidates were functional when embedded inside biosilica and fused to Silaffin3 – a protein that is tightly associated with the biosilica cell wall. Silaffin3 could be localized using SMLM with a localization precision of 25 nm. This allowed to resolve its structural organization and therefore identified Silaffin3 as a major component in the basal chamber of the fultoportulae. Additionally, co-localization studies on cingulins – a protein family hypothesized to be involved in silica formation – have been performed to decipher their pattern-function relationship. Towards this end, novel imaging strategies, co-localization calculations and pattern quantifications have been established. With the help of these results, the spatial arrangement of cingulins W2 and Y2 could be compared with unprecedented resolution. In summary, this work has laid ground for quantitative SMLM studies of proteins in diatoms in general and contributed insights into the spatial organization of proteins involved in biomineralization in the diatom T. pseudonana.