A associação de biorreatores à membranas (MBR) é extremamente atrativa para o tratamento de efluentes de refinaria de petróleo com o objetivo da remoção da matéria-orgânica e de nitrogênio amoniacal. Esta tecnologia de tratamento é relativamente recente e encontra-se em expansão. Os processos de remoção de matéria orgânica e de nitrogênio amoniacal foram estudados em diferentes condições operacionais aplicadas à unidade experimental. Esta unidade MBR operou 24 horas por dia, com dois módulos de membrana fibras ocas submersas de ultrafiltração e fabricadas em PVDF, por um período de aproximadamente 18 meses. Durante este período parâmetros como tamanho médio de flocos, produção de substâncias poliméricas extracelulares (EPS), filtrabilidade do lodo e desempenho hidrodinâmico dos módulos de membrana também foram avaliados. Os resultados obtidos foram divididos em três estudos que contemplam as variações de carga orgânica volumétrica (COV), de carga nitrogenada volumétrica (CNV) e de concentração de oxigênio dissolvido (OD) aplicadas. Durante o primeiro estudo, realizou-se a avaliação da remoção de matéria orgânica em relação à sua eficiência e aos parâmetros cinéticos através da COV, que variou de 0,78 a 3,16 kgDQO/m³.d. Esta variação foi obtida através do aumento progressivo da vazão de efluente bruto da unidade. O aumento crescente da COV e da CNV provocou a diminuição das eficiências de remoção de matéria orgânica e nitrogênio amoniacal. Com base nos resultados deste estudo, verificou-se que a unidade experimental deve ser operada com valores de relação alimento-microrganismo (A/M) inferiores a 0,165 kgDQO/kgSSV.d e com valores de COV entre 0,35 e 0,7 kgDQO/m³.d para que se obtenham eficiência de remoção de matéria orgânica superiores a 90%. Ainda, obteve-se uma constante cinética de remoção de DQO para o reator anóxico de 0,025 L/mgSSV.d. e de 0,0138 L/mgSSV.d para o reator aeróbio. No segundo estudo, com ênfase na remoção de nitrogênio amoniacal, variou-se novamente a vazão de efluente bruto, obtendo-se desta forma CNV crescentes entre 0,087 e 0,169 kgN/m³.d. Foram obtidas eficiências de remoção de nitrogênio amoniacal superiores a 97,5% para todas as CNV utilizadas. Durante este estudo, dentre todos os parâmetros analisados a CNV apresentou a maior influência sobre esta eficiência de remoção. Obteve-se uma velocidade máxima de consumo de nitrogênio amoniacal de 0,109 mgNH3-N/mgSSV.d e uma constante de saturação de 0,333 mg/L. O terceiro estudo, por sua vez, avaliou a influência da concentração de OD na unidade experimental em quatro etapas distintas. Durante a primeira etapa realizou-se, em um período de 2 meses, a diminuição progressiva da concentração de OD no interior do reator aeróbio. Na segunda etapa, zerou-se a concentração de OD no reator aeróbio e realizou-se a injeção de nitrogênio gasoso no tanque de membranas por um período de quatro dias. Na terceira etapa foram realizados dois eventos de 24 horas de duração na ausência de OD e fluxo de nitrogênio gasoso no tanque de membranas. Por fim, durante a quarta etapa os dois eventos apresentaram duração de 2 horas, sendo o primeiro na ausência de OD e com fluxo de nitrogênio e o segundo na ausência de OD e sem fluxo de gás no tanque de membranas. Os resultados obtidos neste último estudo apresentarem algumas divergências em relação à concentração e composição das EPS, à filtrabilidade e ao tamanho médio de flocos. Entretanto, em geral, verificou-se que a remoção de nitrogênio amoniacal diminuiu na ausência de OD e que esta eficiência é mais afetada pela diminuição e/ou ausência de OD do que a remoção de matéria orgânica. As substâncias predominantes na composição das frações solúveis e fracamente ligadas de EPS presente na unidade foram os ácidos húmicos. No entanto, a fração fortemente ligada não apresentou predominância clara. O desempenho hidrodinâmico dos módulos de membranas não foi afetado pela diminuição da concentração de OD e pela utilização de fluxo de nitrogênio gasoso no tanque de membranas. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-07-10T16:26:59Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Cristina Gravina Veronese.pdf: 9043084 bytes, checksum: ef42eeab9bfd1aa382a15155c364d7d3 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-10T16:26:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Cristina Gravina Veronese.pdf: 9043084 bytes, checksum: ef42eeab9bfd1aa382a15155c364d7d3 (MD5) / Petrobrás / The association of bioreactors and membranes (MBR) is extremely attractive for the treatment of oil refinery wastewater aiming the removal of organic materials and ammonia. This treatment technology is relatively recent and is in continuos development. The removal efficiencies of organic materials and ammonia were studied at different operational conditions applied to the experimental unit. This MBR unit operated 24 hours per day, with two ultrafiltration hollow fiber membrane modules made of PVDF, for a period of approximately 18 months. During this period parameters such as mean floc size value, production of extracellular polymeric substances (EPS), sludge filterability, and hydrodynamic performance of the membrane modules were also evaluated. The results obtained were divided in three studies that contemplate the variations on the volumetric organic loading rate (VOLR), on the volumetric nitrogen loading rate (VNLR) and on the dissolved oxygen (DO) concentration applied. During the first study, an evaluation of the removal of the organic materials was held considering the efficiency and the kinetics parameters through the VOLR, that ranged from 0.78 to 3.16 kgCOD/m³.d. This oscillation was possible through the progressive increase of the wastewater flowrate. The increase of the VOLR caused the decrease of the removal efficiencies of organic materials and ammonia. According to the obtained results, it was verified that the experimental unit should be operated with values of food-to-microorganism (F/M) below 0.165 kgCOD/kgVSS.d and with values of VOLR between 0.35 and 0.7 kgCOD/m³.d in order to obtain removals efficiencies of organic materials higher than 90%. Still, a kinetic constant of COD removal of 0.025 L/mgVSS.d for the anoxic reactor, and a kinetic constant of 0.0138 L/mgVSS.d for the aerobic reactor were obtained. On the second study, with emphasis on the removal of ammonia, the wastewater flowrate was varied again, obtaining an increasing VNLR from 0.087 to 0.169 kgN/m³.d. All the removal efficiencies of ammonia obtained were superior to 97.5%. During this study, among all the analyzed parameters, the VNLR presented the greatest influence on this removal efficiency. Still, it was obtained a maximum ammonia consumption rate of 0.109 mgNH3-N/mgVSS.d and a saturation constant of 0.333 mg/L. The third study, on the other hand, evaluated the influence of the DO concentration inside the experimental unit on four different stages. During the first stage, through a period of 2 months, the progressive decrease of the DO concentration was done inside the aerobic reactor. On the second stage the experimental unit operated with the absence of DO and with the injection of nitrogen gas inside the membrane tank for a period of four days. On the third stage two different events with DO absence and the injection of nitrogen gas were performed for 24 hours. And at last, on the fourth stage the first event lasted for 2 hours without oxygen and with nitrogen gas and the second event lasted for 2 hours without oxygen and gas injection on the membrane tank. The results obtained on this last study presented some differences relative to the concentration and composition of EPS, to the sludge filterability and to the mean floc size value. However, in general, it was verified that the removal efficiency of ammonia decreased with the DO absence and that this efficiency was more affected by this absence than the removal of organic materials. The main substances on the composition of the soluble and slightly connected fractions of EPS on the experimental unit were the humic acids. But, the strongly connected fraction did not have a main substance of the composition. The hydrodynamic performance of the membrane modules were not affected by the decrease of DO concentration and for the injection of nitrogen gas inside the membrane tank.

Orientador: Luis Henrique de Souza Guimarães / Banca: José Roberto Ernandes / Banca: Rubens Monti / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Wanderley Pereira Oliveira / Resumo: As β-D-frutofuranosidases, também conhecidas como invertases, são hidrolases que catalisam a hidrólise da sacarose em uma mistura equimolar de β-D-glicose e β-D-frutose que recebe o nome de açúcar invertido. Estas enzimas podem ser encontradas em diversos organismos, como vegetais, animais, bactérias, leveduras e em fungos filamentosos, sendo que os últimos merecem destaque pela alta produção enzimática e estabilidade. O objetivo deste trabalho foi estudar a β-D-frutofuranosidase produzida por Fusarium graminearum em Fermentação Submersa (FSbm) e Fermentação em Substrato Sólido (FSS) purificando-a e caracterizando-a bioquimicamente, além de submeter esta enzima a secagem em Spray dryer e imobilização em suportes de baixo custo. O fungo F. graminearum foi selecionado como bom produtor da enzima, com maiores níveis de produção encontrados quando cultivado em substrato sólido com farelo de trigo umidificado com água de torneira (1:1; m/v) por 9 dias (150 U/g substrato). A β-D-frutofuranosidase extracelular obtida foi purificada 8,41 vezes com recuperação de 14%, obtendo-se em PAGE 7% uma única banda protéica, e em SDS-PAGE 12%, 2 bandas proteicas (94 kDa e 70 kDa) supondo-se um heterodímero, uma vez que a enzima nativa, estimada pela coluna de filtração Sephacryl S200, apresentou 159 kDa. A temperatura ótima de atividade ficou na faixa de 55-60ºC e o pH ótimo 4,5. Foi totalmente estável em temperaturas entre 30oC e 50oC por 1 hora, e com atividade residual acima de 80% entre pH 3,0 e 8,0 por 30 minutos. A β-D-frutofuranosidase extracelular foi ativada pelos íons Mn2+ e K+. A enzima foi capaz de hidrolisar sacarose e rafinose, mas não a inulina, com maior afinidade para a rafinose, com Km de 21,16 mM e Vmax maior quando utilizada a sacarose como substrato... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The β-D-fructofuranosidases, also known as invertase, are hydrolases which catalyze the hydrolysis of sucrose in an equimolar mixture of β-D-glucose and β-D-fructose that is called invert sugar. These enzymes can be found in many organisms, such as plants, animals, bacteria, yeasts and filamentous fungi, and the latter must be highlighted for high enzyme production and stability. The objective of this work was to study the β-D-fructofuranosidase produced by Fusarium graminearum in Submerged Fermentation (SbmF) and Solid Substrate Fermentation (SSF) purifying and characterizing them biochemically, and submit this enzyme to drying using Spray dryer and immobilization on low cost supports. The F. graminearum was selected as a good enzyme producing strain, with higher production levels found when the fungus was grown on wheat bran as solid substrate moistened with tap water (1:1, w/v) for 9 days (150 U/g substrate). The extracellular β-D-fructofuranosidase obtained was purified 8.41-fold with recovery of 14%. A single protein band was obtained in 7% PAGE, and two protein bands (94 kDa and 70 kDa) in 12% SDS-PAGE indicating a heterodimeric structure, since the native enzyme, estimated by gel filtration using Sephacryl S200 column presented 159 kDa. The optimum temperature for activity was 55-60°C and optimum pH 4.5. It was completely stable at temperatures between 30oC and 50oC for 1 hour, and residual activity above 80% between pH 3.0 and 8.0 for 30 minutes was observed. This β-D-fructofuranosidase was activated by Mn2+ and K+. The enzyme was able to hydrolize sucrose and raffinose, but not inulin, with a higher affinity for raffinose, with a Km of 21.16 mM and Vmax was higher when sucrose was used as substrate (1639.34 U/mg protein). The crude extract containing the extracellular enzyme was... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Reinaldo Marchetto / Banca: Eduardo Maffud Cilli / Banca: Alberto José Cavalheiro / Banca: Osvaldo de Freitas / Banca: Clovis Ryuichi Nakaie / Resumo: A maioria das bactérias possui dois tipos de topoisomerases IIA, DNA girase e topoisomerase IV (topo IV), que juntas ajudam a administrar a integridade e a topologia do DNA. A girase primariamente introduz superenovelamento negativo no DNA, e a topo IV, embora intimamente relacionada com a girase, preferencialmente desencadeia o DNA plasmidial e relaxa o superenovelamento positivo, funções essenciais para a replicação do DNA e transcrição. Isso faz da girase e da topo IV alvos importantes para diversas drogas antibacterianas. Estruturalmente, ambas operam como um heterotetrâmero composto por duas proteínas GyrA e duas proteínas GyrB, para a girase, e duas proteínas ParC e duas ParE, na topo IV. Inúmeros agentes antibacterianos atuam inibindo a girase e a topo IV, tais como as quinolonas, cumarinas e algumas toxinas naturais, incluindo o CcdB. A toxina bacteriana CcdB, é uma pequena proteína de 11,7 kDa, contendo 101 resíduos de aminoácidos que, juntamente com o CcdA, faz parte de um sistema de morte celular programada do plasmídeo F, um fator de conjugação muito estudado em Escherichia coli. CcdB atua como uma toxina e o CcdA como a antitoxina. Na ausência de CcdA, CcdB pode matar a bactéria através de um mecanismo, ainda pouco conhecido, que envolve a girase e/ou a topo IV, assim como a região C-terminal da toxina CcdB (Trp-99 a Ile-101). Neste trabalho está descrita a obtenção de uma série de seqüências peptídicas miméticas, racionalmente projetadas, baseadas na estrutura primária do CcdB natural, com o objetivo de melhor entender o mecanismo de inibição da atividade de ambas, DNA girase e topo IV, pelo CcdB, e também propor um novo grupo de moléculas com potencial atividade antibacteriana. / Abstract: Most bacteria posses two type IIA topisomerases, DNA gyrase and topoisomerase IV (topo IV), that together help manage DNA integrity and topology. Gyrase primarily introduces negative supercoils into DNA, and the topo IV, although closely related to gyrase, preferentially decatenates DNA and relaxes positive supercoils, essential functions for bacterial DNA replication and transcription. This makes of the gyrase and topo IV important targets for antibacterial drugs. Structurally both operate as a heterotetramer formed by two GyrA and two GyrB proteins for girase, and two ParC and two ParE proteins for topo IV. A large number of antibacterial agents act in the inhibition of the gyrase and topo IV, such as quinolones, coumarins, and some natural toxins including the protein CcdB. The bacterial toxin CcdB is a 11.7 kDa protein with 101 amino acids that with CcdA form a programmed cell death system of F plasmid, a conjugation factor widely studied in E. coli. CcdB acts like a toxin and CcdA as the antitoxin. In the CcdA absence, CcdB can kill the cell by an unclear mechanism that involves gyrase and/or topo IV, as well as the CcdB C-terminal region (Trp-99 to Ile-101). In this work it is described the obtaining of a several peptides mimics, rationally design, based on the primary structure of natural CcdB toxin, to a better understanding the inhibition mechanism of the activity of the gyrase and topo IV, by CcdB toxin, and also propose a new molecules group with potential antibacterial activity. The peptides mimics were synthesized by Solid Phase methodology (SPPS), purified and analyzed by liquid chromatography (HPLC) and identified by LC/ESI-MS and by amino acid analysis. The inhibition capacity of the peptide mimics was tested by electrophoresis agarose gels and by bacterial growth in liquid medium assays. / Doutor

Resumo: O processo de biolixiviação é a utilização de bactérias, para a solubilização dos metais presentes em sulfetos minerais. As espécies mais estudadas são o Acidithiobacillus thiooxidans e o Acidithiobacillus ferrooxidans, embora outras espécies também participem do processo. Esse processo é aplicado há muito tempo, mas somente nos anos 1950 a participação de microorganismos foi descoberta. A biolixiviação de cobre é um exemplo de aplicação industrial, embora outros metais como ouro, urânio e o níquel, venham sendo obtidos por esse método. A calcopirita (CuFeS2) é o mais abundante mineral de cobre e também o mais refratário ao ataque químico ou bacteriano. Dessa forma, existe um grande interesse no desenvolvimento de alternativas para otimizar a solubilização desse sulfeto. Neste trabalho investigou-se a avaliação do efeito do aminoácido cisteína na biolixiviação de uma amostra de calcopirita utilizando linhagens de A. ferrooxidans e A. thiooxidans. Inicialmente foram realizados testes de respirometria celular com A. ferrooxidans e sulfato ferroso como substrato em diferentes concentrações de cisteína (0, 10-1, 10-3, 10-5, 10-7 mol L-1) para avaliar o efeito inibitório da cisteína na atividade da bactéria. Somente 10-1 mol L-1 provocou uma inibição significativa na oxidação do íon ferroso pela bactéria. A seguir foram realizados ensaios utilizando a calcopirita como substrato, na presença das mesmas concentrações de cisteína. A cisteína em 10-1 mmol L-1 também determinou inibição significativa na oxidação do mineral. As demais concentrações provocaram um aumento na velocidade inicial de oxidação do sulfeto em comparação com o controle na ausência de cisteína. Em ensaios de crescimento da bactéria na presença de meio contendo o íon ferroso, foram obtidos resultados semelhantes aos anteriores, destacando-se... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bioleaching is the solubilization and recovery of metals from sulfides minerals promoted by bacterial metabolism. Although Acidithiobacillus thiooxidans and Acidithiobacillus ferrooxidans are the most studied bacteria, other species contribute to that process. Despite the bioleaching has been utilized for long time, only in the 1950's the active participation of bacteria was demonstrated. Copper bioleaching is the classical industrial application example, although gold, uranium and nickel have been produced by that technique. Chalcopyrite (CuFeS2) is the most abundant copper mineral the most refractory as such. Thus, there is an enormous interest in developing alternatives to optimize this sulfide solubilization. The effect of cysteine on the chalcopyrite dissolution in the presence of A. ferrooxidans and A. thiooxidans was evaluated in this study. Respirometric assays were used initially to test the effects of cysteine in the ferrous or chalcopyrite oxidation by A. ferrooxidans at pH 1.8 in the following amino acid concentrations: 0, 10-1, 10-3, 10-5, 10-7 mol L-1. In both cases, only 10-1 mol L-1 of cysteine was inhibitory to the bacterial oxidation and in the other concentrations a slight increase in the initial oxidation rate was observed, comparing to the control in absence of this amino acid. In growth experiments utilizing ferrous ion as substrate and in the same concentrations of cysteine, 10-3 and 10-5 mol L-1 established an increase in the rate of bacterial growth. These cysteine concentrations were selected to run bioleaching tests through shaking flasks technique. Previously, A. ferrooxidans was acclimated to growth in medium containing only chalcopyrite as substrate, by progressive ferrous iron substitution as energy source. Acclimated A. ferrooxidans cells were utilized in shaking flasks experiments in several conditions such as, inoculation or not... (Complete abstract click electronic access below / Orientador: Oswaldo Garcia Junior / Coorientador: Denise Bevilaqua / Banca: Wilson Cervi da Costa / Banca: Luis Gonzaga Santos Sobral / Mestre

Orientador: Rubens Monti / Banca: Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro / Banca: José Roberto Ernandes / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: Jonas Contiero / Resumo: A utilização de açúcar invertido apresenta uma série de vantagens em relação à acarose diluída e a hidrólise enzimática é superior em rendimento à hidrólise ácida, lém de fornecer um produto de melhor qualidade e não gerar resíduos tóxicos. este sentido, o objetivo deste trabalho foi imobilizar multipontualmente uma nvertase comercial e uma inulinase produzida por uma cepa de Kluyveromyces arxianus em suporte glioxil-agarose, amino-agarose, glutaraldeído-agarose e com uportes epóxidos Sepabeads, Sepabeads-amino e Eupergit C, e determinar as tividades, estabilidades e capacidade de reuso dos derivados. Os derivados foram btidos através de diferentes protocolos e suas propriedades cinéticas Km e Vmax oram determinadas. Os resultados obtidos com os derivados foram comparados com os obtidos com as enzimas solúveis. Quando a invertase foi imobilizada no suportes agarose usando 5mg de enzima/g de suporte, os derivados possibilitaram ao menos duas reutilizações com manutenção da atividade, o que não ocorreu quando alta concentração de enzima foi colocada para reagir com o suporte, tanto usando agarose CL6B como a CL4B. Esta mesma enzima forneceu derivados com alta atividade quando foi realizado "crosslinking" com glutaraldeído, usando agarose CL6B e CL4B, cujas atividades foram as mais elevadas entre todos os derivados (21,643 e 14,984 U/mg prot, respectivamente). Foram obtidos seis derivados de invertase com estabilidade à temperatura de 50°C po r 1440 min e com atividade relativa acima de 80% nas reutilizações; no entanto, não foram obtidos derivados estabilizados com a enzima inulinase. A partir da análise destes resultados foi possível determinar que os derivados amino+glutaraldeído CL6B e amino+glutaraldeído CL4B foram os melhores derivados ativos estabilizados, apresentando eficiência catalítica (Vmax/Km) 0,59 e 0,52,...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The use of inverted sugar presents a series of advantages in relation to diluted sucrose and the enzymatic hydrolysis have a superior yield over acid hydrolysis, beyond supplying a product of better quality and do not generate toxic residues. In this way, the objective of this work was to immobilize by multipoint linkages a commercial invertase and an inulinase produced by a Kluyveromyces marxianus strain on glyoxyl-agarose, amine-agarose, glutaraldehyde-agarose supports and Sepabeads, Sepabeads-amine and Eupergit C epoxy supports, and to determine the activities, stabilities and the capability of reutilization of the derivatives. The derivatives were obtained through different protocols and kinetic parameters Km and Vmax were determined. The results of the derivatives were compared with the ones obtained with soluble enzymes. When invertase was immobilized on agarose using 5mg of enzyme/g of support, it was possible to reutilize the derivatives at least two times with maintenance of the activity, what it was not possible when high enzyme concentration was placed to react with the support, using agarose CL6B or CL4B. This same enzyme supplied derivatives with high activity when glutaraldehyde was used to crosslink the enzyme and agarose CL6B and CL4B supports, with the higher activity of all (21,643 and 14,984 U/mg prot, respectively). Six invertase derivatives were obtained with stability to the temperature of 50°C and for the period of 1440 min, with relative activity above 80% in the reutilizations, but no one inulinase stabilized derivative was obtained. Analyzing these results, it was possible to conclude that the amine+glutaraldehyde CL6B and amine+glutaraldehyde CL4B were the best active stabilized derivatives, presenting catalytic efficiency (Vmax/Km) of 0,59 and 0,52, respectively, corresponding to 59% and 52% of the soluble enzyme efficiency. Keywords: Enzyme immobilization, ...(Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Insituto de Química, 2011. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-11-10T15:18:52Z No. of bitstreams: 1 2011_VinerSousaLima.pdf: 1469310 bytes, checksum: f483f2e7bab94f54441c89a2e140c47f (MD5) / Approved for entry into archive by Leila Fernandes (leilabiblio@yahoo.com.br) on 2012-02-15T14:04:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_VinerSousaLima.pdf: 1469310 bytes, checksum: f483f2e7bab94f54441c89a2e140c47f (MD5) / Made available in DSpace on 2012-02-15T14:04:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_VinerSousaLima.pdf: 1469310 bytes, checksum: f483f2e7bab94f54441c89a2e140c47f (MD5) / Neste trabalho retratamos a síntese e caracterização de complexos de CdII e HgII com bases de Schiff derivadas da condensação de quatroaminoácidos (β-alanina, β fenilalanina, ácido β-aminobutírico e ácido y-aminobutírico) com dois aldeídos (2-hidroxinaftaldeído e 5-bromosalicilaldeído).Das oito bases de Schiff possíveis com esses aminoácidos e aldeídos, apenas aquelas derivadas do ácido aminobutírico não foram isoladas. Para a síntese dos complexos de CdII com as bases de Schiffderivadas de aminoácidos, foi utilizado como precursor metálico o acetato decádmio(II) e duas estratégias foram adotadas: i) reação com as bases isoladas;e ii) reação multicomponente, onde são colocados no mesmo meio reacional oaminoácido, o aldeído e o precursor do metal. Para a síntese dos complexos deHgII foram utilizados como precursores metálicos o acetato de mercúrio(II) ou oacetato de fenil-mercúrio(II), e foram adotadas as mesmas estratégias de síntese adotadas pra os complexos de CdII, sendo que no caso do acetato defenil-mercúrio(II) foi feita também uma reação com um sal de potássio da base de Schiff derivada da condensação da β-alanina com o 5-bromo-salicilaldeído.Os complexos obtidos neste trabalho apresentam-se na proporção 1:1(metal:base de Schiff), com a base dianiônica para aqueles obtidos a partir do acetato de cádmio(II) e acetato de mercúrio(II), e monoaniônica para aqueles obtidos a partir do acetato de fenil-mercúrio(II). A estrutura cristalina/molecular de dois complexos de bases de Schiff com fenil-mercúrio(II) foi determinada por difração de raios X em monocristal, revelando complexos onde o átomo de mercúrio está bi-coordenado, com um átomo de carbono da fenila e um átomo de oxigênio do carboxilato da base; a geometria é linear levemente distorcida em torno do átomo de mercúrio em ambos os casos. Os complexos e as bases de Schiff sintetizados neste foram caracterizados por ponto de fusão,espectrometria de absorção no infravermelho (IV) e espectrometria de ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H, 13C, 113Cd e 199Hg. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / This work describes the synthesis and characterization of CdII and HgIIcomplexes with Schiff bases derived from the condensation of four amino acids(β-alanine, β phenilalanine, β aminobutiric acid and y-aminobutiric acid) with two aldehydes (2-hydroxynaphthaldehyde and 5-bromosalicylaldehyde). From the eight possible Schiff bases with the amino acids and aldehydes cited above, only those derived from -aminobutiric acid were not isolated. For the synthesis of CdII complexes with amino acid derived Schiff bases, it was used as metalprecursor the cadmium(II) acetate, and two strategies were carried out: i) directreaction with the previously isolated bases and ii) multi-component reaction,where the amino acid, the aldehyde and the metal precursor are put together inthe reactional system. For the synthesis of HgII complexes, mercury(II) acetateand phenyl-mercuric(II) acetate were used as metal precursors, and the strategies (i) and (ii) were also adopted. In addition, in the case of phenylmercuric(II) acetate, it was made a reaction with a potassium salt of the Schiffbase derived from the condensation of β-alanine with 5-bromosalicylaldehyde.The complexes obtained in this work show a proportion of 1:1 (metal: Schiffbase), with a dianionic base for those from cadmium(II) acetate and mercury(II)acetate, while monoanionic for those from phenyl-mercuric(II) acetate. The crystal/molecular structure of two phenyl-mercuric(II) complexes was determined by X-ray diffraction, revealing that the mercury atom is bico ordinated, with a carbon atom from the phenyl and a oxygen atom from the Schiff base carboxylate; with a slightly distorted linear geometry around the mercury atom in both cases. The complexes and Schiff bases synthesized in this work were characterized by melting point, Fourier transformation infrared spectrometry (FTIR) and nuclear magnetic resonance spectrometry (NMR) of1H, 13C, 113Cd and 199Hg.

Os linfócitos humanos apresentam na sua superfície a enzima NTPDase1 (ecto-apirase, ecto-difosfoidrolase; CD39; EC 3.6.1.5), responsável pela hidrólise do ATP e ADP extracelular e/ou outros nucleotídeos di ou tri fosfatados. A determinação da atividade da enzima foi padronizada através de método colorimétrico, o qual quantifica o fosfato livre liberado durante a reação. A NTPDase1 foi caracterizada através da demonstração de condições ótimas de incubação, como dependência de cálcio, pH, tempo de incubação e temperatura ótimos, além da obtenção de parâmetros cinéticos. Os resultados obtidos foram confirmados por uma baixa expressão de CD39 nos linfócitos humanos, verificada por análise citométrica, com utilização de anticorpo monoclonal correspondente. Este fato indica um baixo estado de ativação dos linfócitos, uma vez que o CD39 é considerado um marcador de ativação destas células. Posteriormente, foi determinada a atividade da NTPDase1 em linfócitos de pacientes imunodeprimidos pela infecção causada pelo HIV, os quais são acompanhados pelo monitoramento de sua carga viral no plasma e contagem de células T CD4+. A infecção pelo HIV resulta em alterações nas células imunes e na secreção de citocinas importantes na resposta patógenos. Nesta situação pode haver alterações bioquímicas na resposta imune, como por exemplo, alterações na hidrólise de nucleotídeos, ou seja, na atividade das enzimas que degradam nucleotídeos extracelulares. Os linfócitos encontram-se em estado de ativação crônica, o que faz com que até mesmo células não-infectadas pelo vírus, possam sofrer apoptose por ativação de caspases efetoras. Através da determinação da atividade da NTPDase nos linfócitos imunodeprimidos, verificou-se um aumento de sua atividade, acompanhado por uma maior expressão de CD39 na superfície destas células. Estes resultados sugerem que a NTPDase1 é importante para a manutenção da resposta imune, mantendo concentrações adequadas de ATP extracelular, o qual é essencial para certas funções imunes, mas também pode ser prejudicial no momento que induz apoptose nos linfócitos, o que poderia aumentar o estado de imunodepressão. Devido ao fato de que muitos dos pacientes HIV-positivos recebem terapia anti-retroviral, foi necessário verificar in vitro possíveis efeitos destas drogas sobre a atividade da NTPDase1. Neste caso, observou-se que as concentrações terapêuticas destas drogas não afetaram a atividade da enzima. Sendo assim, a atividade aumentada da NTPDase1 nestes pacientes, não é devida à interferência da terapia anti-retroviral.

A adenosina está presente em todos os tipos celulares exercendo um papel homeostático. Em sistema nervoso central e periférico seu papel neuromodulador é observado. A presença de adenosina no meio extracelular permite a ativação de receptores adenosinérgicos específicos, classificados em: A1, A2A, A2B e A3. A ativação dos receptores A1 e A2A, receptores de alta afinidade, está diretamente envolvida com o papel neuromodulador, visto que a sua ativação produz inibição e facilitação da liberação de neurotransmissores, respectivamente. A seleção de qual receptor será ativado, visto que exibem co-expressão em muitas regiões neurais, pode ser feita de acordo com os sítios de liberação ou produção de adenosina extracelular. Desta forma, receptores A1 seriam preferencialmente ativados pela adenosina liberada através dos transportadores bidirecionais de nucleosídeos e os receptores A2A preferencialmente ativados pela adenosina proveniente da degradação do ATP realizada por uma cascata enzimática. A hidrólise de ATP a adenosina é realizada pelas enzimas ectonucleosídeo trifosfato difosfoidrolases e ecto-5’-nucleotidase. Em ratos, a ativação do sistema adenosinérgico exerce seus efeitos neuromoduladores desde fases iniciais de desenvolvimento embrionário, alcançando o padrão adulto mesmo antes do nascimento. A ativação de receptores de adenosina na fase fetal e neonatal foi demonstrada ter como conseqüência o retardo no desenvolvimento global dos animais, bem como, ventriculomegalia e perda de massa cerebral branca. Esta informação levanta a questão da suscetibilidade do cérebro imaturo a certas drogas, tais como a cafeína. A cafeína é uma metilxantina com efeitos estimulantes, a qual exibe como base para seus efeitos o bloqueio inespecífico dos receptores de adenosina. No presente estudo, avaliou-se o efeito da administração de cafeína em diversos parâmetros. A administração aguda de cafeína, mas não a crônica, em ratos adultos foi capaz de alterar significativamente as atividades de hidrólise de ATP no hipocampo e de ADP no estriado. Este resultado poderia estar relacionado com a capacidade plástica do sistema adenosinérgico em restabelecer seu tônus em ratos adultos tratados cronicamente com cafeína. Além disto, verificou-se que a ação direta da cafeína afetou a produção de adenosina. A administração crônica de cafeína na água de beber de ratas mães durante a fase gestacional e lactacional alterou o padrão de hiperlocomoção induzido por MK-801, um antagonista de receptores NMDA glutamatérgicos, nos ratos filhotes aos 21 dias de vida, mesmo quando o acesso a cafeína foi retirado sete dias antes do teste. Além disto, o mesmo tratamento não alterou o limiar de dor de filhotes aos 14 e 50 dias de vida, bem como a analgesia induzida nestes animais aos 50 dias. Entretanto, quando os animais ainda recebiam cafeína no dia do teste, foi observado efeito analgésico somente nos ratos de 14 dias. A análise dos efeitos do tratamento sobre a degradação de acetilcolina e sobre a degradação de nucleotídeos em hipocampo de ratos jovens demonstrou que ambas as atividades foram alteradas. O conjunto de resultados desta tese indica que a intervenção no sistema adenosinérgico durante as fases gestacional e neonatal é capaz de desenvolver adaptações, provavelmente relacionadas ao aumento da expressão de receptores para adenosina, na tentativa de restabelecer o controle modulador adenosinérgico, considerada a importância dos sistemas avaliados para a manutenção do organismo.

Glicoesfingolipídios (GSL) são constituintes da membrana plasmática e possuem bases de cadeia longa (bases esfingóides) como componente estrutural lipídico. Açúcares podem ser adicionados à ceramida sintetizada de novo (rota 1), sintetizada pela reciclagem da esfingosina (rota 2) e em GSL reciclados através do Golgi (rota 3). A serina palmitoiltransferase (SPT) é a enzima marca-passo e catalisa o primeiro passo na biossíntese de novo destes componentes. A linhagem celular GRX, representativa das células estreladas hepáticas, expressa o fenótipo miofibroblástico e pode ser induzida in vitro a adquirir o fenótipo lipocítico. Ambos fenótipos possuem gangliosídios da série-a (GM2, GM1 e GD1a) bem como o seu precursor GM3, que são expressos como doublets em HPTLC (bandas 1 e 2, respectivamente). Para o estudo da biossíntese dos GSL neste modelo biológico, foram determinadas as condições ideais para a atividade da SPT, e foi avaliada sua atividade na fração microssomal nos dois fenótipos. Também foi determinada a contribuição de cada rota de biossíntese para as duplas bandas. As células foram pré-incubadas com 5mM de -cloroalanina (inibidor da SPT) ou com 25M de fumonisina B1 (inibidor da ceramida sintase) e então, [U-14C]galactose foi adicionada no meio de cultura na presença contínua dos inibidores. Culturas controles (sem inibidores) foram realizadas simultaneamente. Os lipídios foram extraídos, os gangliosídios purificados em colunas Sep-Pack C18 e analisados por HPTLC, a qual foi revelada por auto-radiografia e após, submetida à análise densitométrica. Em ambos fenótipos, a síntese de novo, a reciclagem da esfingosina e a reciclagem pelo Golgi contribuem com a biossíntese dos GSL No miofibroblasto, os doublets dos gangliosídios complexos (GD1a e GM1) são, principalmente, sintetizados pelas rotas de reciclagem; enquanto as bandas do GM2 e do GM3 têm uma participação importante da síntese de novo. No lipócito, as rotas de reciclagem são as mais importantes. Contudo, no lipócito, ambas bandas do GM2 e a banda 2 do GM3 apresentam considerável síntese pela rota de novo. Esta rota tem uma contribuição menor no lipócito do que no miofibroblasto, o que está de acordo com os níveis da atividade da SPT detectados nestes fenótipos. Isto sugere que os fenótipos miofibroblasto e lipócito utilizam pools de ceramida distintos para a síntese de seus GSL e que apresentam importantes diferenças entre as rotas biossintéticas, o que pode se refletir no seu comportamento celular.

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-09-05T19:43:20Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Dijanah Cota Machado.pdf: 10723746 bytes, checksum: d639ffb0159f46de67f6ddd8403ff1ab (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-09-14T18:49:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Dijanah Cota Machado.pdf: 10723746 bytes, checksum: d639ffb0159f46de67f6ddd8403ff1ab (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-14T18:49:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Dijanah Cota Machado.pdf: 10723746 bytes, checksum: d639ffb0159f46de67f6ddd8403ff1ab (MD5) Previous issue date: 2014-02-26 / FACEPE / A interação de moléculas unitárias com nanoporos individuais é relevante em diversos processos biológicos, químicos e físicos, uma vez que pode proporcionar o desenvolvimento de dispositivos analíticos, dentre os quais, podemos destacar: sensores, biossensores, espectrômetros de massa e sequenciadores moleculares. Nesse contexto, o nanoporo formado pela α-hemolisina (α-HL) de Staphylococcus aureus é de especial interesse no desenvolvimento de dispositivos sensores devido às suas características estruturais e funcionais. Várias estratégias são utilizadas para melhorar a sua capacidade de detecção pelo uso de adaptadores moleculares ou pela modificação química do nanoporo. O diferencial deste trabalho deve-se a modificação das condições físicos-químicas da solução banhante do elemento de reconhecimento molecular ou seja, o nanoporo unitário. Os íons em meio aquoso podem causar efeitos específicos conhecidos como efeitos de Hofmeister. De acordo com a sua atuação na estrutura da água, os íons podem ser classificados como cosmotrópicos ou caotrópicos. A mudança da estrutura da água por sua vez é capaz de influenciar na solubilidade e estrutura dos co-solutos. Igualmente a composição iônica da solução pode alterar a interação das moléculas solubilizadas. Deste modo neste estudo investigamos os efeitos específicos induzidos pelos cátions e ânions da Série de Hofmeister na interação de moléculas unitárias orgânicas com nanoporos proteicos individuais. A confecção da bicamada lipídica plana e a inserção do nanoporo unitário na membrana, bem como os registros de correntes iônicas através dos poros foram obtidos em condições de fixação de voltagem. Na solução banhante do nanoporo utilizou-se os ânions da família VIIA, formando sais com o K⁺, ou, os cátions da família IA e o íon amônio, formando sais com o Cl⁻, todos na concentração de 4M. A interação da molécula unitária (analito) com o nanoporo causa um bloqueio característico na corrente iônica que passa através dele. A análise desses eventos permite determinar as constantes cinéticas da interação analito-nanoporo. Avaliando a influência do íon amônio e dos íons da família IA e VIIA na interação do analito (polietilenoglicol 1294; PEG 1294) com o nanoporo observamos que esta é muito dependente do tipo do sal. Todos os íons utilizados nesse trabalho induziram efeitos específicos em sistema confinado. Com relação à influência na constante de associação, todos os ânions seguiram a típica série de Hofmeister: F⁻ > Cl⁻ > Br⁻ > I⁻. Já para a constante de dissociação e a solubilidade do PEG, encontramos uma sequência de Hofmeister inversa: F⁻ < Cl⁻ < B⁻ < I⁻. Ao contrário do observado com os ânions, a influência dos cátions sobre as constantes de interação não seguiu a série de Hofmeister. Para a constante de associação, obtivemos a seguinte sequência: Cs⁺ > K⁺ ≥ Rb⁺> Na⁺ > NH⁺ > Li⁺. Para a constante de dissociação obtivemos: K⁺ < Rb⁺ < Cs⁺ < Na⁺ < NH₄⁺ < Li⁺. Uma forte correlação entre as mudanças das constantes cinéticas e a solubilidade do PEG também foi estabelecida. Demonstramos que o efeito salting-out é o responsável por mudanças estabelecidas na interação do analito com o nanoporo. Adicionalmente as constantes de interação PEG/nanoporo são dependentes do potencial transmembrana indicando que o polímero não iônico (PEG) atua como uma molécula com carga elétrica em meio aquoso iônico. Estabelecemos também que a sensibilidade do sensor ao PEG depende fortemente do tipo de íon presente na solução banhante do nanoporo. / The interaction of single molecules with single nanopores is important in several biological, chemical and physical processes because it can provide the development of analytical devices, such as sensors, biosensors, mass spectrometers and molecular sequencers. In this context, the nanopore formed by α-hemolysin (α-HL) of Staphylococcus aureus is very studied for the development of sensor devices due to their structural and functional characteristics. Several strategies are adopted to improve its detection ability, such as the use of molecular adapters and chemical modification of the nanopore. In this work, our approach is different, we modify the ionic composition of the bath solution of the nanopore protein. Ions in aqueous environment can cause specific effects known as Hofmeister effects. According to their influence on the structure of water, the ions can be classified as kosmotropic and chaotropic. The change in the structure of water in turn can influence the structure and solubility of the co- solutes. Then the ionic composition of the solution may change the interaction of solubilized molecules. The goal of this study was to investigate the specific effects induced by cations and anions from Hofmeister series on the interaction of single molecules with nanopores. The preparation of planar lipid bilayer, and single nanopore insertion into membrane, and records of ionic currents were conducted in conditions of voltage clamp. In the bath solution, we use the anions from group VIIA, forming salts with K⁺, and cations from group IA plus ammonium ion, forming salts with Cl⁻ at 4M concentration. The interaction of the analyte with the nanopore causes a blocking characteristic in ionic current through the pore protein. The analysis of these molecular events permit to determine the kinetic constants of the analyte-nanopore interaction. The influence of the anions and cations here investigated in interaction of the analyte (polyethylene glycol 1294, PEG 1294 ) with the nanopore is very dependent on the type of salt. All ions used in this study induced specific effects in confined spaces. With regard to the influence on the on-rate constant, all anions followed the typical Hofmeister series: F⁻ > Cl⁻ > Br⁻ > I⁻. For the off-rate constant and solubility of PEG, we found an inverse Hofmeister sequence: F⁻ < Cl⁻ < Br⁻ < I⁻. However, the influence of the cations on the rate constants didn’t follow the Hofmeister series. For the on-rate constant, we obtained the following sequence: Cs⁺ > K⁺ ≥ Rb⁺ > Na⁺ > NH⁺ > L⁺. For the off-rate constant, we obtained : K⁺ < Rb⁺ < Cs⁺ < Na⁺ < NH₄⁺ < Li⁺. Strong correlation between the changes of the rate constants and the PEG solubility was established. We suggest that the salting-out effect is responsible for the changes on the interaction analyte/ nanopore. Additionally, we found that the rate constants are dependent on voltage transmembrane indicating that the non-ionic polymer (PEG) acts as a molecule with electric charge in an aqueous environment. We also established that the sensitivity of the nanopore it was strongly dependent on the type of ion present in the bath solution. So, the choice of the optimal electrolyte is an important step to stochastic sensors based on a single nanopore.