Jean M.F. Martins, CR1 CNRS, LTHE (UMR 5564), CNRS, INPG, IRD, Univ. J. Fourier, Grenoble I Résumé : L'ensemble de mes travaux est basé sur une approche pluri et interdisciplinaire développée dans le but d'améliorer nos connaissances et la compréhension du comportement biogéochimique (sorption, biotransformation et transfert) et l'impact des micropolluants dans l'environnement, afin de mieux prédire l'exposition et les impacts sur notre santé ou celle de nos écosystèmes. Au moment ou des polluants émergeants sont détectés dans les eaux et les sols dès qu'on se donne les moyens pour les détecter, et alors que la directive européenne REACH se met en place, les approches de recherche monodisciplinaires montrent de plus en plus clairement leurs limites et font ainsi ressortir le caractère indispensable de la pluridisciplinarité dans l'approche de la problématique de la biogéochimie des polluants. C'est dans ce contexte que j'ai essayé, à chaque fois que cela était nécessaire et possible, de développer une approche interdisciplinaire en rupture avec les approches classiques, en abordant notamment les phénomènes couplés ou cinétiques, dans le but d'évaluer simultanément et de modéliser le comportement biogéochimique (sorption, biotransformation et transferts) et l'impact des micropolluants dans les sols à plusieurs échelles et dans différents contextes biogéochimiques. Les approches ainsi développées ont permis de caractériser les mécanismes de sorption des polluants dans le sol et dans ses différents compartiments, minéral, organique et biotique et d'établir l'effet de ces processus sur le transfert réactifs de ces polluants en combinant des approches expérimentales et théoriques en conditions dynamiques et en faisant appel à des dispositifs technologiques spécifiquement développés. La première partie de ce mémoire concerne l'étude des processus de sorption des micropolluants organiques et métalliques dans les sols, et des divers facteurs qui les contrôlent, notamment la spéciation chimique. Cette spéciation contrôle directement l'ambiance chimique dans les sols, qui correspond à un équilibre de la chimie et de la distribution des micropolluants entre les différents compartiments du sol. Ainsi les interactions des micropolluants avec les constituants abiotiques (minéraux et matière organique) et biotiques (microorganismes) des sols et leur modélisation ont été étudiées par des approches combinées de dynamique des systèmes (colonnes), chimie de solution (batch) et spectroscopiques ou microscopiques (spectroscopie EXAFS, MEB- et MET-EDX). Le premier exemple abordé a concerné la réactivité de composés organiques (dinitrophénols) en mono- et multi-contaminations. Pour cette dernière condition, il a été montré de manière originale l'existence de processus complexes et prépondérants de compétition pour les sites de sorption dans les sols et de synergie pour la toxicité, processus largement négligés dans les études classiques mono-polluants, qui ne sont que rarement représentatives de la réalité du terrain. Ainsi, ces phénomènes induisent des modifications importantes du comportement global de ces composés en termes de mobilité (cinétiques de transfert de masse), d'impact et de dégradabilité, rendant également leur prédiction très délicate car nécessitant la prise en compte des phénomènes de synergie et de compétition précités. La réactivité des micropolluants avec une des fractions les plus réactives des sols, la biomasse vivante, a également été étudiée au travers de trois modèles bactériens contrastés (Cupriavidus metallidurans CH34, Escherichia coli, Pseudomonas putida) par une approche combinée de spectroscopie X et de chimie de solution. Ainsi nous avons contribué à la validation d'un modèle universel de réactivité de surface bactérienne aux micropolluants, notamment métalliques, basé sur la prise en compte de groupements réactifs déjà connus, phosphoesters, carboxyles, ou nouvellement identifiés, sulfhydriles, par une approche d'absorption X et de modélisation thermodynamique. Ce modèle reste toutefois peu satisfaisant pour les structures biologiques complexes telles que les biofilms, qui présentent une réactivité largement sous-estimée en raison de la mise en jeu de substances polymériques extracellulaires (EPS) complexes, particulièrement abondantes dans ces structures. Ce volet constitue une de mes principales perspectives de recherche. Dans la seconde partie de ce mémoire, des approches en conditions statiques et dynamiques et mono et multi-pollutions ont permis d'évaluer la biodégradabilité et la biotransformation de contaminants traces en sols naturels. Leur impact sur le compartiment microbien a été évalué par des méthodes d'écotoxicologie classique (bio-indicateurs, marqueurs microbiologiques globaux) et par des méthodes plus innovantes (biocapteurs, biodiversité) permettant la mise en évidence du contrôle de la toxicité des contaminants par leur biodisponibilité, elle-même largement contrôlée par leur spéciation chimique, leur réactivité et leur diffusion au contact des cellules bactériennes (accessibilité). Ces études ont contribué à montrer le rôle important (prépondérant sous certaines conditions) des microorganismes dans la rétention et dans le transport des micropolluants dans les sols, phénomènes qui ont longtemps été négligés et restent encore aujourd'hui difficiles à évaluer in situ. Cela a constitué la dernière partie de ce travail qui présente une approche de dynamique des systèmes en colonnes de sols, permettant d'identifier et modéliser les conditions biogéochimiques impliquées dans le transfert réactif des polluants dans la zone non saturée des sols. Nous avons ainsi caractérisé les principaux facteurs biotiques et abiotiques contrôlant la mobilité des polluants et des bactéries dans les sols et développé une modélisation intégrant ces facteurs dominants. En plus d'être rapidement mobilisées dans les sols, certaines cellules bactériennes peuvent, sous certaines conditions, accélérer fortement le transport de polluants, comme nous avons pu le montrer avec le pentachlorophénol ou avec le Zn, le Cd ou le Cu et le prédire par une modélisation couplée hydrodynamique et géochimique. L'approche pluridisciplinaire et multi-échelle (moléculaire à macroscopique) développée dans ces travaux, fournit des connaissances nouvelles (i) pour la compréhension des cycles biogéochimiques des micropolluants dans les sols, et (ii) pour l'évaluation des risques liés à ces pollutions (notamment les multi-pollutions) et le développement de techniques de bioremédiation de sols et d'eaux contaminés. Mots clefs : Micropolluants, biotransformations, spéciation, écotoxicité, biodisponibilité, accessibilité, réactivité de surface, transfert réactif, bioremédiation, couplages, modélisation.

La transglutaminase microbienne (Microbial transglutaminase : MTG) est fortement exploitée dans l’industrie textile et alimentaire afin de modifier l’apparence et la texture de divers produits. Elle catalyse la formation de liaisons iso-peptidiques entre des protéines par l’entremise d’une réaction de transfert d’acyle entre le groupement γ-carboxamide d’une glutamine provenant d’un substrat donneur d’acyle, et le groupement ε-amino d’une lysine provenant d’un substrat accepteur d’acyle. La MTG est tolérante à un large éventail de conditions réactionnelles, ce qui rend propice le développement de cette enzyme en tant que biocatalyseur. Ayant pour but le développement de la MTG en tant qu’alternative plus soutenable à la synthèse d’amides, nous avons étudié la réactivité d’une gamme de substrats donneurs et accepteurs non-naturels. Des composés chimiquement diversifiés, de faible masse moléculaire, ont été testés en tant que substrats accepteurs alternatifs. Il fut démontré que la MTG accepte une large gamme de composés à cet effet. Nous avons démontré, pour la première fois, que des acides aminés non-ramifiés et courts, tels la glycine, peuvent servir de substrat accepteur. Les α-acides aminés estérifiés Thr, Ser, Cys et Trp, mais pas Ile, sont également réactifs. En étendant la recherche à des composés non-naturels, il fut observé qu’un cycle aromatique est bénéfique pour la réactivité, bien que les substituants réduisent l’activité. Fait notable, des amines de faible masse moléculaire, portant les groupements de forte densité électronique azidure ou alcyne, sont très réactives. La MTG catalyse donc efficacement la modification de peptides qui pourront ensuite être modifiés ou marqués par la chimie ‘click’. Ainsi, la MTG accepte une variété de substrats accepteurs naturels et non-naturels, élargissant la portée de modification des peptides contenant la glutamine. Afin de sonder le potentiel biocatalytique de la MTG par rapport aux substrats donneurs, des analogues plus petits du peptide modèle Z-Gln-Gly furent testés; aucun n’a réagi. Nous avons toutefois démontré, pour la première fois, la faible réactivité d’esters en tant que substrats donneurs de la MTG. L’éventuelle amélioration de cette réactivité permettrait de faire de la MTG un biocatalyseur plus général pour la synthèse d’amides. Mots clés: Lien amide, biocatalyse, biotransformation, transglutaminase, arrimage moléculaire, criblage de substrats, ingénierie de substrats. / Microbial transglutaminase (MTG) is used extensively in the food and textile industry to alter the appearance and texture of products. MTG catalyses the formation of isopeptide linkages between proteins by an acyl transfer reaction between the γ-carboxamide group of a glutamine ‘acyl-donor’ substrate, and the ε-amino group of a lysine ‘acyl-acceptor’ substrate. MTG is tolerant to a broad range of reaction conditions and is therefore suitable for further development as a biocatalyst. Toward developing MTG as a “green” alternative for amide synthesis, we have investigated a range of non-native donor and acceptor substrates to probe the scope of MTG reactivity. Small, chemically varied compounds were tested as alternative acyl-acceptor substrates. We observed a broad acceptor specificity. We show, for the first time, that very short-chain alkyl-based amino acids such as glycine can serve as acceptor substrates. The esterified α-amino acids Thr, Ser, Cys and Trp – but not Ile – also show reactivity. Extending the search to non-natural compounds, an aromatic ring was observed to be beneficial for reactivity, although ring substituents reduced reactivity. Overall, bonding of the amine to a less hindered carbon increases reactivity. Importantly, very small amines carrying either the electron-rich azide or the alkyne groups required for click chemistry were highly reactive as acceptor substrates, providing a ready route to minimally modified, ‘clickable’ peptides. These results demonstrate that MTG is tolerant to a variety of chemically varied natural and non-natural acceptor substrates, which broadens the scope for modification of glutamine-containing peptides. To further probe the biocatalytic potential of MTG in terms of the donor substrate, smaller analogues of the model substrate Z-Gln-Gly were tested. We did not find product formation with substrates smaller than the model substrate. We observed, for the first time, trace esterase activity with MTG. Future improvement of this activity would render MTG a more attractive, general biocatalyst for amide bond formation.

La transglutaminase microbienne (Microbial transglutaminase : MTG) est fortement exploitée dans l’industrie textile et alimentaire afin de modifier l’apparence et la texture de divers produits. Elle catalyse la formation de liaisons iso-peptidiques entre des protéines par l’entremise d’une réaction de transfert d’acyle entre le groupement γ-carboxamide d’une glutamine provenant d’un substrat donneur d’acyle, et le groupement ε-amino d’une lysine provenant d’un substrat accepteur d’acyle. La MTG est tolérante à un large éventail de conditions réactionnelles, ce qui rend propice le développement de cette enzyme en tant que biocatalyseur. Ayant pour but le développement de la MTG en tant qu’alternative plus soutenable à la synthèse d’amides, nous avons étudié la réactivité d’une gamme de substrats donneurs et accepteurs non-naturels. Des composés chimiquement diversifiés, de faible masse moléculaire, ont été testés en tant que substrats accepteurs alternatifs. Il fut démontré que la MTG accepte une large gamme de composés à cet effet. Nous avons démontré, pour la première fois, que des acides aminés non-ramifiés et courts, tels la glycine, peuvent servir de substrat accepteur. Les α-acides aminés estérifiés Thr, Ser, Cys et Trp, mais pas Ile, sont également réactifs. En étendant la recherche à des composés non-naturels, il fut observé qu’un cycle aromatique est bénéfique pour la réactivité, bien que les substituants réduisent l’activité. Fait notable, des amines de faible masse moléculaire, portant les groupements de forte densité électronique azidure ou alcyne, sont très réactives. La MTG catalyse donc efficacement la modification de peptides qui pourront ensuite être modifiés ou marqués par la chimie ‘click’. Ainsi, la MTG accepte une variété de substrats accepteurs naturels et non-naturels, élargissant la portée de modification des peptides contenant la glutamine. Afin de sonder le potentiel biocatalytique de la MTG par rapport aux substrats donneurs, des analogues plus petits du peptide modèle Z-Gln-Gly furent testés; aucun n’a réagi. Nous avons toutefois démontré, pour la première fois, la faible réactivité d’esters en tant que substrats donneurs de la MTG. L’éventuelle amélioration de cette réactivité permettrait de faire de la MTG un biocatalyseur plus général pour la synthèse d’amides. Mots clés: Lien amide, biocatalyse, biotransformation, transglutaminase, arrimage moléculaire, criblage de substrats, ingénierie de substrats. / Microbial transglutaminase (MTG) is used extensively in the food and textile industry to alter the appearance and texture of products. MTG catalyses the formation of isopeptide linkages between proteins by an acyl transfer reaction between the γ-carboxamide group of a glutamine ‘acyl-donor’ substrate, and the ε-amino group of a lysine ‘acyl-acceptor’ substrate. MTG is tolerant to a broad range of reaction conditions and is therefore suitable for further development as a biocatalyst. Toward developing MTG as a “green” alternative for amide synthesis, we have investigated a range of non-native donor and acceptor substrates to probe the scope of MTG reactivity. Small, chemically varied compounds were tested as alternative acyl-acceptor substrates. We observed a broad acceptor specificity. We show, for the first time, that very short-chain alkyl-based amino acids such as glycine can serve as acceptor substrates. The esterified α-amino acids Thr, Ser, Cys and Trp – but not Ile – also show reactivity. Extending the search to non-natural compounds, an aromatic ring was observed to be beneficial for reactivity, although ring substituents reduced reactivity. Overall, bonding of the amine to a less hindered carbon increases reactivity. Importantly, very small amines carrying either the electron-rich azide or the alkyne groups required for click chemistry were highly reactive as acceptor substrates, providing a ready route to minimally modified, ‘clickable’ peptides. These results demonstrate that MTG is tolerant to a variety of chemically varied natural and non-natural acceptor substrates, which broadens the scope for modification of glutamine-containing peptides. To further probe the biocatalytic potential of MTG in terms of the donor substrate, smaller analogues of the model substrate Z-Gln-Gly were tested. We did not find product formation with substrates smaller than the model substrate. We observed, for the first time, trace esterase activity with MTG. Future improvement of this activity would render MTG a more attractive, general biocatalyst for amide bond formation.