Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) se développe suite à une atteinte pulmonaire lésionnelle, induisant un œdème et une inflammation excessive, généralement suivis d’une réparation atypique menant à la fibrose. Malgré de signifiants progrès dans les traitements, la mortalité reste élevée : ~ 40 %. Mon hypothèse de travail est que l’atténuation de l’œdème ou de la réponse inflammatoire pourrait freiner le développement ou la sévérité de la phase exsudative. Nous avons évalué cette hypothèse à l’aide d’un modèle de phase exsudative du SDRA, i.e. instillation intra-trachéale de bléomycine, chez les souris.  La modulation des fluides alvéolaires est étudiée avec des souris transgénique (Tg) pour le canal ENaC, qui sont sensibles à la formation d’un œdème. Cependant, ces souris Tg ne sont pas plus sensibles au développement de la phase exsudative en condition lésionnelle (bléomycine). Nous avons déterminé par une étude électrophysiologique des cellules épithéliales alvéolaires de type II (AT II) que ce n’est pas lié à une inhibition par la bléomycine de la fonction du canal ENaC.  Le traitement de la réponse inflammatoire associée au SDRA par des glucocorticoïdes est une thérapie potentielle mais controversée. Les glucocorticoïdes dans notre modèle murin ne réduisent pas la sévérité des lésions. Nous avons pu déterminé lors d’expériences in vitro que ce serait dû à une réduction de la capacité de réparation des AT II. En résumé :  La modulation du canal ENaC ne modifie pas le développement de la phase exsudative, suggérant que la régulation de l’œdème n’est pas suffisante pour modifier l’évolution du SDRA.  La modulation de l’inflammation par les glucocorticoïdes est ineffective, possiblement à cause d’une altération de la réparation. Mon étude suggère que le traitement de la phase exsudative du SDRA est complexe. En effet, la régulation de l’œdème ou de l’inflammation de façon isolée ne peut pas modifier l’évolution du SDRA. L'hétérogénéité des sources du SDRA et la redondance des mécanismes cellulaires impliqués dans l’évolution des lésions pulmonaires suggèrent que le traitement nécessitera une approche visant plusieurs cibles mécanistiques afin d’en accélérer la résolution. / Although much has been learned about the mechanisms leading to acute respiratory distress syndrome (ARDS), mortality remains high: ~ 40%. This syndrome is associated with lung injury where alveolar edema and excessive inflammatory response can progress to abnormal epithelial repair and fibrosis. The hypothesis of the work presented in this thesis is that attenuation of edema or of the inflammatory response in the initial stage of the acute lung injury would decrease the severity of injury. I evaluated this hypothesis in an ARDS acute phase, modeled by an intratracheal instillation of bleomycin in mice, using two distinct experimental strategies.  The importance of edema clearance was studied in a transgenic (Tg) ENaC mouse, a mouse known to be sensitive to the formation of edema. However, our results show that these Tg mice were not more susceptible to the development of the ARDS acute phase induced by bleomycin. Furthermore, we have been able to show that bleomycin itself did not interfere with the ENaC channel function of alveolar epithelial cells type II (AT II).  The treatment of the inflammatory response associated with ARDS by glucocorticoid therapy is subject to controversy. In our mouse model, glucocorticoids decrease the level of cytokine in the alveolar milieu but did not decrease the severity of lung injury. Using in vitro experiments, we show that this lack of response could be secondary to the impact of the treatment on the epithelial repair capacity of AT II. In summary:  The ENaC channel expression did not have an impact on the development of the exudative phase, suggesting that the regulation of edema is not sufficient to alter the course of ARDS.  The modulation of inflammation by glucocorticoids was ineffective, possibly because of impaired repair of the epithelium. These results suggest that the control of edema or inflammation separately does not modify the evolution of lung injury. The heterogeneity of the ARDS origins and the redundancy of cellular mechanisms involved in lung injury will require therapy aimed at multiple pathophysiological targets to permit the resolution of lung injury.

Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) se développe suite à une atteinte pulmonaire lésionnelle, induisant un œdème et une inflammation excessive, généralement suivis d’une réparation atypique menant à la fibrose. Malgré de signifiants progrès dans les traitements, la mortalité reste élevée : ~ 40 %. Mon hypothèse de travail est que l’atténuation de l’œdème ou de la réponse inflammatoire pourrait freiner le développement ou la sévérité de la phase exsudative. Nous avons évalué cette hypothèse à l’aide d’un modèle de phase exsudative du SDRA, i.e. instillation intra-trachéale de bléomycine, chez les souris.  La modulation des fluides alvéolaires est étudiée avec des souris transgénique (Tg) pour le canal ENaC, qui sont sensibles à la formation d’un œdème. Cependant, ces souris Tg ne sont pas plus sensibles au développement de la phase exsudative en condition lésionnelle (bléomycine). Nous avons déterminé par une étude électrophysiologique des cellules épithéliales alvéolaires de type II (AT II) que ce n’est pas lié à une inhibition par la bléomycine de la fonction du canal ENaC.  Le traitement de la réponse inflammatoire associée au SDRA par des glucocorticoïdes est une thérapie potentielle mais controversée. Les glucocorticoïdes dans notre modèle murin ne réduisent pas la sévérité des lésions. Nous avons pu déterminé lors d’expériences in vitro que ce serait dû à une réduction de la capacité de réparation des AT II. En résumé :  La modulation du canal ENaC ne modifie pas le développement de la phase exsudative, suggérant que la régulation de l’œdème n’est pas suffisante pour modifier l’évolution du SDRA.  La modulation de l’inflammation par les glucocorticoïdes est ineffective, possiblement à cause d’une altération de la réparation. Mon étude suggère que le traitement de la phase exsudative du SDRA est complexe. En effet, la régulation de l’œdème ou de l’inflammation de façon isolée ne peut pas modifier l’évolution du SDRA. L'hétérogénéité des sources du SDRA et la redondance des mécanismes cellulaires impliqués dans l’évolution des lésions pulmonaires suggèrent que le traitement nécessitera une approche visant plusieurs cibles mécanistiques afin d’en accélérer la résolution. / Although much has been learned about the mechanisms leading to acute respiratory distress syndrome (ARDS), mortality remains high: ~ 40%. This syndrome is associated with lung injury where alveolar edema and excessive inflammatory response can progress to abnormal epithelial repair and fibrosis. The hypothesis of the work presented in this thesis is that attenuation of edema or of the inflammatory response in the initial stage of the acute lung injury would decrease the severity of injury. I evaluated this hypothesis in an ARDS acute phase, modeled by an intratracheal instillation of bleomycin in mice, using two distinct experimental strategies.  The importance of edema clearance was studied in a transgenic (Tg) ENaC mouse, a mouse known to be sensitive to the formation of edema. However, our results show that these Tg mice were not more susceptible to the development of the ARDS acute phase induced by bleomycin. Furthermore, we have been able to show that bleomycin itself did not interfere with the ENaC channel function of alveolar epithelial cells type II (AT II).  The treatment of the inflammatory response associated with ARDS by glucocorticoid therapy is subject to controversy. In our mouse model, glucocorticoids decrease the level of cytokine in the alveolar milieu but did not decrease the severity of lung injury. Using in vitro experiments, we show that this lack of response could be secondary to the impact of the treatment on the epithelial repair capacity of AT II. In summary:  The ENaC channel expression did not have an impact on the development of the exudative phase, suggesting that the regulation of edema is not sufficient to alter the course of ARDS.  The modulation of inflammation by glucocorticoids was ineffective, possibly because of impaired repair of the epithelium. These results suggest that the control of edema or inflammation separately does not modify the evolution of lung injury. The heterogeneity of the ARDS origins and the redundancy of cellular mechanisms involved in lung injury will require therapy aimed at multiple pathophysiological targets to permit the resolution of lung injury.

Nhx1 est un antiport vacuolaire de Na+/H+ chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Nhx1 joue un rôle important dans le maintien de l’homéostasie ionique du cytoplasme de la cellule. En effet, la mutation du gène NHX1 chez la levure nhx1Δ entraîne une perte de l’homéostasie cellulaire quand les cellules sont cultivées dans un milieu de faible osmolarité. Ce travail rapporte pour la première fois, et contrairement à la cellule parentale, que la mutation du gène NHX1 a pour effet une sensibilité du mutant nhx1Δ à une variété des drogues et des agents cationiques et anioniques lorsque les cellules sont cultivées dans un milieu riche. En outre, dans ces conditions de culture, aucune sensibilité n’a été observée chez le mutant nhx1Δ quand les cellules sont traitées avec différentes concentrations de sel. Nous avons aussi démontré que la sensibilité du mutant nhx1Δ aux différents agents ainsi que la sécrétion de l’enzyme carboxypeptidase Y observé chez ce mutant n’ont pas été restauré lorsque les cellules sont cultivées dans des milieux avec différents pH ou avec différentes concentrations de sel. Enfin, une analyse génétique a révélé que le mutant nhx1Δ montre un phénotype distinct d’autres mutants qui ont un défaut dans le trafic entre le compartiment pré-vacuolaire et l’appareil de Golgi quand ces cellules sont traitées avec différents agents. Cette analyse prouve que la sensibilité de nhx1Δ aux différents agents n’est pas liée au trafic entre le compartiment pré-vacuolaire et l’appareil de Golgi. / Nhx1 is an intracellular Na+/H+ exchanger localized to the late endosome in Saccharomyces cerevisiae. It is believed that Nhx1 plays a major role in pH-mediated vesicle trafficking, as nhx1Δ mutant is defective in maintaining the intracellular pH in the vacuoles and cytoplasm when grown in low osmolarity media. In this work, we reported novel drug sensitivities of the nhx1Δ mutant to a range of cationic and anionic agents when cells are grown in rich media. Unlike the low osmolarity media, the nhx1Δ mutant showed no sensitivity to salt. Furthermore, we showed that the drug phenotypes of the nhx1Δ mutant, as well as the secretion of the vacuolar protein carboxypeptidase Y, were not rescued by either altering the pH or salt concentration. Although, amino acid substitution of the phylogenetically conserved residue Glu355 for Ala (E355A) in Nhx1 resulted in sensitivity to genotoxic drug bleomycin, it was not observed for the non-conserved residue Glu371Ala (E371A). Moreover, genetic analysis revealed that the nhx1Δ mutant displayed distinct drug phenotypes in comparison to mutants that are defective in retrograde trafficking from the prevacuole to the late Golgi, excluding the possibility that the drug sensitivity of the nhx1Δ mutant is related to retrograde trafficking.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est une forme sévère de défaillance respiratoire qui se caractérise par la présence de dommages alvéolaires, d’un oedème pulmonaire et d’une réponse inflammatoire exacerbée. C’est une condition pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement pharmacologique efficace. Lors des dernières années, des antagonistes des récepteurs de l’IL-1 (Kineret) et de l’IL-6 (tocilizumab) ont fait preuve d’une efficacité modérée pour le traitement du SDRA causé par la COVID-19. Cependant, leur potentiel thérapeutique en SDRA clinique non causé par la COVID reste à démontrer et les résultats obtenus dans les modèles animaux sont mitigés. Nous avons émis l’hypothèse que le tocilizumab et le Kineret pourraient améliorer la résolution des différents paramètres du SDRA non causé par la COVID-19. Nous avons aussi posé l’hypothèse que des peptides, antagonistes des récepteurs de l’IL-1 (rytvela) ou de l’IL- 6 (HSJ633) et permettant de préserver certaines voies aux propriétés cytoprotectrices en aval de ces récepteurs, pourraient potentiellement être plus efficaces que le Kineret et le tocilizumab pour le traitement des paramètres du SDRA. L’objectif de ma maîtrise était donc de tester ces deux hypothèses dans un modèle murin d’atteinte pulmonaire aiguë (ALI) induite par la bléomycine, qui mime pendant sa phase aiguë les principaux paramètres du SDRA. Mes travaux montrent qu’aucun des quatre antagonistes n’a permis d’améliorer significativement les paramètres observés à jour 7 post-bléomycine (état général, dommages alvéolaires, oedème et inflammation pulmonaire). Ainsi, mes données suggèrent que dans notre modèle d’ALI induit par la bléomycine, la réponse inflammatoire induite via le IL-1R ou le IL-6R ne semble pas constituer un des mécanismes principaux engendrant les différentes atteintes, puisqu’elles ne sont pas prévenues par les antagonistes de ces récepteurs. En plus de contribuer à mieux comprendre ce modèle animal, mes résultats permettent de mettre en lumière que la réparation des dommages ainsi que la résorption secondaire de l’oedème sont cruciales pour la résolution du SDRA et que de viser seulement la voie inflammatoire est insuffisant. / Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is a form of severe lung failure characterized by the presence of a pulmonary edema, an inflammatory response, and alveolar damage. There is currently no effective pharmacological treatment for ARDS. In recent years, IL-1 and IL-6 receptor antagonists Kinerert and tocilizumab, respectively, have shown some efficacy as a treatment of ARDS caused by COVID-19. However, their therapeutic potential in non-COVID ARDS remains to be proven and the results obtained in animal models are conflicting. We thus tested the hypothesis that tocilizumab and Kineret could improve the resolution of key parameters of non-COVID ARDS. We also hypothesized that two peptides, rytvela and HSJ633, IL-1 and IL-6 receptor antagonists, respectively, which preserve some of the cytoprotective downstream pathways, could potentially be more effective than Kineret and tocilizumab in treating the various parameters of ARDS. The goal of my master thesis was therefore to test these two hypotheses in a mouse model of acute lung injury (ALI) induced by bleomycin instillation, which, during its acute phase, mimics the main parameters of ARDS. My work has shown that none of the antagonists were able to significantly improve the parameters observed on day 7 post-bleomycin (general condition of the mice, alveolar damages, pulmonary edema and inflammation). Thus, my data suggest that in our bleomycin-induced ALI model, the inflammatory response triggered via IL-1R or IL-6R does not appear to be the principal mechanism generating the main damaging outcome, since they are not prevented by the antagonists of these receptors. In addition to contributing to a better understanding of this animal model of ALI, my research has highlighted the fact that targeting inflammation alone is insufficient and that repairing alveolar damages, and secondary resorbing lung edema, are cornerstones for the resolution of ARDS.