A mancha preta dos citros causada pelo fungo Guignardia citricarpa Kiely [Phyllosticta citricarpa (McAlp.) Van der Aa], possui duas formas de infecção, conídios e ascósporos. Informações a respeito da importância dos conídios na epidemiologia da doença são escassas ou controversas. Visando uma maior compreensão sobre o patossistema citros-G. citricarpa (P. citricarpa), os objetivos desta dissertação foram: elaborar e validar uma escala diagramática para avaliação da severidade da mancha preta em folhas de citros; verificar o efeito da temperatura e da duração do período de molhamento na formação de apressórios formados a partir de conídios; observar por meio de microscopia eletrônica de varredura a germinação de conídios e a formação de apressórios sobre folhas destacadas de limão 'Siciliano' submetidas a diferentes temperaturas e períodos de molhamento. A escala diagramática com níveis de severidade de 1; 3; 6; 12; e 24% de área foliar lesionada foi validada por dois grupos de avaliadores, com e sem experiência na quantificação de doenças. Comparada com a avaliação sem escala, o uso da escala proporcionou melhor precisão e acurácia tanto para avaliadores experientes como inexperientes, quando considerada a estimativa média dos mesmos. Na maioria dos casos, os desvios entre estimativas e severidade atual da doença foram mais evidentes para os níveis de severidade entre 5 e 15%. A reprodutibilidade das avaliações resultou em valores de R 2 mais uniformes para a maioria dos avaliadores experientes. Diferenças consideráveis de precisão foram observadas entre avaliadores inexperientes. O efeito da temperatura (10 o C - 40 o C) e da duração do molhamento (4 - 48 h) na formação de apressórios formados a partir de conídios de G. citricarpa (P. citricarpa) foi avaliado sob condições "in vitro" e sobre a superfície de folhas de limão 'Siciliano'. A formação de apressórios ocorreu em todas as temperaturas a partir de 12 horas de molhamento, sendo os extremos de temperatura (10 o C e 40 o C) menos favoráveis à formação de apressórios. A temperatura mínima para formação de apressórios, estimada pela função beta generalizada foi de 3 o C e a máxima de 48,4 o C, ambas para 48 horas de molhamento. A formação de apressórios foi consideravelmente favorecida pela duração do período de molhamento, com o máximo de apressórios formados a 24 horas de molhamento, para a maioria das temperaturas. O período de molhamento constituído de 48 horas foi essencial para que os esporos submetidos a temperaturas de 10 o C e 40 o C, formassem apressórios. A superfície de resposta obtida pela multiplicação das funções beta generalizada e monomolecular apresentou um ajuste satisfatório para os dados observados na estimativa da porcentagem relativa de apressórios formados (R 2 =0,75). As amostras observadas em microscopia eletrônica de varredura possibilitaram a aquisição de imagens de conídios e apressórios sobre a superfície de folhas de limão 'Siciliano' em todas as combinações de temperatura e molhamento avaliadas. / Citrus black spot caused by Guignardia citricarpa Kiely [Phyllosticta citricarpa (McAlp.) van der Aa] presents two infection forms, conidia and ascospores. Information regarding the importance of the conidia in the epidemiology of the disease is scarce and controversial. Seeking a better understanding on the pathosystem citrus-G. citricarpa (P. citricarpa), the objectives of this dissertation were: elaborate and validate a diagrammatic scale for assessments of the citrus black spot; verify the effect of the temperature and of the wetness duration in the appressorium formation; observe through scanning electron microscopy the germination and formation of appressorium on outstanding lemon 'Siciliano' leaves submitted to different temperatures and wetness duration. The diagrammatic scale with severity levels of 1; 3; 6; 12; and 24% of diseased leaf area was validated by two groups of raters, with experience and without experience in the quantification of diseases. The scale provided better precision and accuracy for both experienced and inexperienced raters, considering the estimates average of them. In the majority of cases, the bias between estimated and actual disease severity were more evident for disease severity levels between 5 and 15%. The reproducibility of assessments resulted in R 2 with more uniforms values for the majority of the experienced raters, considerable differences of precision were observed among inexperienced raters. The effect of the temperature (10 o C - 40 o C) and of the wetness duration (4 - 48 h) in the germination of conidia and appressoria formation of G. citricarpa (P. citricarpa), was assessed "in vitro" and on the surface of lemon 'Siciliano' leaves. The appressoria formation occurred in all the temperatures starting from 12 hours of wetness. The extreme temperatures (10 o C and 40 o C) were less favorable to the apressorium formation. The minimum temperature for appressorium formation, estimated by generalized beta function was of 3 o C and the maximum of 48,4 o C, both for 48 hours of wetness. The appressorium formation was favored considerably by the wetness duration period, with the maximum of apressoria formed at 24 hours of wetness, for majority of the temperatures. The wetness duration period constituted of 48 hours was essential so that the spores submitted to temperatures of 10 o C and 40 o C, formed appressorium. The response surface obtained by the multiplication of the generalized beta and monomolecular functions provided a close fit to observed data in the estimate of the relative percentage of formed appressorium (R 2 =0,75). The samples observed in scanning electron microscopy made possible the acquisition of images of conidia and appressoria on the surface of lemon 'Siciliano' leaves in all the temperature combinations and wetness evaluated.

O Brasil é considerado o maior produtor de citros e o maior exportador de suco de laranja. Doenças de pós-colheita representam uma grande perda na citricultura, sendo que para muitos frutos a serem exportados, existe uma exigência para que os mesmos estejam isentos de resíduos químicos. Em relação a alguns patógenos de importância em pós-colheita podemos destacar, Guignardia citricarpa (Mancha-pretados- citros), Penicillium digitatum (Bolor-verde) e Colletotrichum gloeosporioides (Antracnose). Dada a importância econômica que representa esse complexo de doenças dos frutos cítricos, tanto em termos de comprometimento da qualidade dos frutos, limitações às exportações e dificuldade de controle, a busca de alternativas adicionais que possam viabilizar a capacidade produtiva dos produtores e garantir a obtenção de frutos com excelentes padrões de qualidade torna-se imprescindível. Nesse contexto, pode-se inserir o emprego de medidas de controle alternativas que não englobam o controle químico clássico. Sob esse ponto de vista inclui-se o controle através do uso de agentes bióticos e abióticos e a indução de resistência em plantas. Portanto neste trabalho, foi estudada a viabilidade do controle de doenças pós-colheita em citros, envolvendo a ação direta sobre os patógenos através do uso dos extratos etanólicos de albedo (mesocarpo) de laranja doce (Citrus sinensis var. Valência) e flavedo (exocarpo ou epicarpo) de limão-Tahiti (Citrus aurantifolia Swing var. Tahiti). O extrato do albedo apresentou efeito antifúngico sobre G. citricarpa e o flavedo do limão "Tahiti" sobre C. gloeosporioides, além de se demonstrar a existência de compostos voláteis com efeito tóxico. A segunda parte envolveu o controle e a indução de resistência em frutos, através do uso dos agentes bióticos Lentinula edodes e Agaricus blazei e do agente abiótico ácido jasmônico. Foi possível observar que o extrato aquoso do albedo (C. sinensis), flavedo (C. aurantifolia), L. edodes e A. blazei diminuíram o aparecimento de novas lesões causadas por G. citricarpa, porém não apresentaram efeitos sobre P. digitatum e C. gloeosporioides em frutos de C. sinensis var. Valência quando tratados em pós-colheita. Dessa maneira, no presente trabalho demonstrou-se a viabilidade de um possível controle alternativo de doenças pós-colheita em citros, buscando-se novos agentes que atuem como indutores de resistência ou de controle direto sobre os fitopatógenos. / Brazil is considered the biggest citrus producer and the biggest orange juice exporter. Post-harvest diseases represent a great loss in the citriculture, and for many fruits to be exported they should be free of chemical residues. In relation to some pathogens of importance in post-harvest it can be mentioned Guignardia citricarpa (black-spot-ofcitrus), Penicillium digitatum (green-mold) and Colletotrichum gloeosporioides (anthracnose). Because of the economical importance that represents this disease complex in citric fruits, in terms of compromising fruit quality, limitations to the exports and control difficulties, the search for alternative control measures that can make possible improve the producing capacity of the producers and the obtaining of fruits with excellent quality are indispensable. Thus, in this context it can be included measures of alternative control that do not include the chemical control. Under this point of view, control include the use of biotic and abiotic agents and the resistance induction in plants. Therefore, it was studied the viability of the control of post-harvest diseases in citrus, involving the direct action on the patogens by using ethanolic extracts of albedo (mesocarp) of sweet orange (Citrus sinensis var. Valência) and flavedo (exocarp or epicarp) of lemon-Tahiti (Citrus aurantifolia Swing var. Tahiti). The results showed that the extract of the albedo exhibited antifungal activity on G. citricarpa and the flavedo of the "Tahiti" lemon on C. gloeosporioides, and it was also demonstrated the existence of volatile compounds toxic to the fungus. The second part involved the control and resistance induction in the fruits, by using the biotic agents Lentinula edodes and Agaricus blazei and the abiotic agent jasmonic acid. It was possible to observe that the aqueous extracts from the albedo (C. sinensis), flavedo (C. aurantifolia), L. edodes and A. blazei reduced the formation of new lesions caused by G. citricarpa, however they did not exhibit effects on P. digitatum and C. gloeosporioides in fruits of C. sinensis var. Valência when treated in post-harvest. Thus, in the present work it was demonstrated the viability of possible alternative control measures of diseases in post-harvest of citrus, indicating the need of looking for new agents to act as resistance inducers or agents to directly control on the phytopathogens.

A pinta preta dos citros tem como agente causal o fungo G. citricarpa. A doença causa depreciação estética dos frutos e praticamente inviabiliza a exportação de laranja in natura principalmente para a União Européia, por ser considerada uma doença quarentenária. Frutos colhidos contendo infecções quiescentes, embora sem sintomas, podem desenvolvê-los durante o processo de exportação. A utilização de fungicidas é o principal método de controle utilizado em pré e pós-colheita. No entanto, o custo do controle químico é significativamente alto e já foi relatado o surgimento de isolados resistentes. A levedura S. cerevisiae é capaz de inibir o desenvolvimento in vitro de G. citricarpa e o antagonismo se deve a produção de compostos orgânicos voláteis de ação fungistática. Em virtude da procura por novos métodos de controle menos danosos à saúde humana e meio ambiente, dos prejuízos causados pela doença e do potencial dos compostos voláteis no controle da doença na pós-colheita, o trabalho visou identificar os compostos voláteis produzidos pela levedura e elucidar os mecanismos envolvidos na inibição do fitopatógeno. Esse conhecimento é fundamental para o desenvolvimento de técnicas inovativas de controle. A produção de compostos voláteis antimicrobianos por S. cerevisiae foi dependente do substrato utilizado para o seu cultivo, sendo a glicose, sacarose e maltose fontes de carbono favoráveis. Foi verificado através da análise em SPME-GC-MS que a levedura produziu em meio BDA, principalmente compostos pertencentes ao grupo dos álcoois, constituindo 95% da composição total, além de ésteres em menor proporção. A mistura artificial de voláteis mimetizou os efeitos dos voláteis produzidos pela levedura, sendo os valores de MIC50 e MIC100 de 0,48 µL mL-1 e 2,84 µL mL-1, respectivamente. A exposição do fitopatógeno aos compostos voláteis reduziu a síntese de proteínas e inibiu a atividade de enzimas associadas à morfogênese (quitinase, b-1,3-glucanase, lacase e tirosinase). Os compostos voláteis desencadearam o processo de estresse oxidativo no fungo, fato observado através da elevação da atividade de enzimas (superóxido dismutase e catalase) associadas a mecanismos de detoxificação de espécies ativas de oxigênio. A análise das proteínas diferencialmente expressas de G. citricarpa, através de eletroforese bidimensional, indicou que os compostos voláteis alteraram a expressão de 40 proteínas, sendo 29 inibidas e 11 superexpressas. A mistura artificial de voláteis também foi ativa contra fungos de diversos grupos taxonômicos, no entanto, não apresentou atividade sobre as bactérias testadas. Os compostos 3-metil-1-butanol e 2- metil-1-butanol foram os mais ativos quando utilizados isoladamente contra Colletotrichum gloesporioides, Penicillium digitatum, Sclerotinia sclerotiorum e Fusarium oxysporum. Sementes de feijão fumigadas com a mistura artificial de voláteis exibiram redução na incidência de S. sclerotiorum. A mistura também exibiu efeito nematicida sobre Meloidogyne javanica. Portanto, os resultados demonstram que os voláteis identificados em S. cerevisiae afetam a síntese de proteínas e a atividade de enzimas associadas ao crescimento vegetativo de G. citricarpa. Finalmente, fumigação utilizando compostos voláteis apresenta potencial no controle de G. citricarpa em pós-colheita, bem como de outros organismos de importância agronômica. O trabalho também contribuiu com novos elementos sobre o papel dos voláteis na interação entre microrganismos na natureza. / The citrus black spot has as causal agent the fungus G. citricarpa. The disease causes aesthetic depreciation of fruits and practically makes them unviable for exportation mainly to European Union where the disease is considered a quarantine pest. Harvested fruits can have quiescent infections although without symptoms and can develop them during the exportation process. The use of fungicides is the main chemical control method used in pre and post-harvest, however the cost is significantly high and it was already described the development of fungicide resistant strains. The yeast S. cerevisiae is able to inhibit the in vitro G. citricarpa growth, and the antagonism is due to production of volatile organic compounds (VOCs) of fungistatic effect. Because of the search for new control methods less harmful for human health and environment, the losses caused by the disease and the potential of the VOCs in the control of the pathogen in the post-harvest, the aim of this work was to identify the VOCs produced by the yeast and to elucidate the mechanisms involved in the inhibition of the fungus. This knowledge is essential for the development of innovative control techniques. The results showed that the production of antimicrobial VOCs by S. cerevisiae was dependent on the substrate used, being glucose, sucrose and maltose favorable carbon sources. It was verified through analysis in SPME-GC-MS that the yeast, grown on PDA medium, produced mainly compounds belonging to the group of alcohols (95% of the total composition), besides esters in smaller proportion. An artificial volatile mixture reproduced the effects of the VOCs produced by the yeast, being the values of MIC50 and MIC100 of 0.48 µL mL-1 and 2.84 µL mL-1, respectively. The phytopathogen exposition to the VOCs reduced protein synthesis and inhibited the activity of morphogenesis associated enzymes like chitinase, b-1,3-glucanase, laccase and tyrosinase. The VOCs initiated the oxidative stress process, which was observed through the increase in the activity of superoxide dismutase and catalase, enzymes associated to the detoxification of active oxygen species. The analysis of the differentially expressed proteins of G. citricarpa, through two-dimensional gel electrophoresis, indicated that the VOCs modified the expression of 40 proteins, being 29 down regulated and 11 up regulated. The artificial mixture of VOCs was also active against fungi of several taxonomic groups, however, there were no activity against bacteria. The compounds 3-methyl-1-butanol and 2-methyl-1-butanol were the most active when tested alone against Colletotrichum gloesporioides, Penicillium digitatum, Sclerotinia sclerotiorum and Fusarium oxysporum. Bean seeds fumigated with the artificial mixture of VOCs showed reduction in S. sclerotiorum incidence. In addition, the VOCs exhibited nematicidal effect against Meloidogyne javanica. The results demonstrate that the VOCs produced by S. cerevisiae affect protein synthesis and the activity of enzymes associated to the vegetative growth in G. citricarpa. Thus, the fumigation using VOCs presents potential in the control of citrus black spot disease in post-harvest as well as of other organisms of agronomic importance. The present workalso contributed with new information regarding the role of the VOCs in the interactions among microorganisms in nature.

A mancha preta dos citros causada pelo fungo Guignardia citricarpa Kiely [Phyllosticta citricarpa (McAlp.) Van der Aa], possui duas formas de infecção, conídios e ascósporos. Informações a respeito da importância dos conídios na epidemiologia da doença são escassas ou controversas. Visando uma maior compreensão sobre o patossistema citros-G. citricarpa (P. citricarpa), os objetivos desta dissertação foram: elaborar e validar uma escala diagramática para avaliação da severidade da mancha preta em folhas de citros; verificar o efeito da temperatura e da duração do período de molhamento na formação de apressórios formados a partir de conídios; observar por meio de microscopia eletrônica de varredura a germinação de conídios e a formação de apressórios sobre folhas destacadas de limão 'Siciliano' submetidas a diferentes temperaturas e períodos de molhamento. A escala diagramática com níveis de severidade de 1; 3; 6; 12; e 24% de área foliar lesionada foi validada por dois grupos de avaliadores, com e sem experiência na quantificação de doenças. Comparada com a avaliação sem escala, o uso da escala proporcionou melhor precisão e acurácia tanto para avaliadores experientes como inexperientes, quando considerada a estimativa média dos mesmos. Na maioria dos casos, os desvios entre estimativas e severidade atual da doença foram mais evidentes para os níveis de severidade entre 5 e 15%. A reprodutibilidade das avaliações resultou em valores de R 2 mais uniformes para a maioria dos avaliadores experientes. Diferenças consideráveis de precisão foram observadas entre avaliadores inexperientes. O efeito da temperatura (10 o C – 40 o C) e da duração do molhamento (4 – 48 h) na formação de apressórios formados a partir de conídios de G. citricarpa (P. citricarpa) foi avaliado sob condições "in vitro" e sobre a superfície de folhas de limão 'Siciliano'. A formação de apressórios ocorreu em todas as temperaturas a partir de 12 horas de molhamento, sendo os extremos de temperatura (10 o C e 40 o C) menos favoráveis à formação de apressórios. A temperatura mínima para formação de apressórios, estimada pela função beta generalizada foi de 3 o C e a máxima de 48,4 o C, ambas para 48 horas de molhamento. A formação de apressórios foi consideravelmente favorecida pela duração do período de molhamento, com o máximo de apressórios formados a 24 horas de molhamento, para a maioria das temperaturas. O período de molhamento constituído de 48 horas foi essencial para que os esporos submetidos a temperaturas de 10 o C e 40 o C, formassem apressórios. A superfície de resposta obtida pela multiplicação das funções beta generalizada e monomolecular apresentou um ajuste satisfatório para os dados observados na estimativa da porcentagem relativa de apressórios formados (R 2 =0,75). As amostras observadas em microscopia eletrônica de varredura possibilitaram a aquisição de imagens de conídios e apressórios sobre a superfície de folhas de limão 'Siciliano' em todas as combinações de temperatura e molhamento avaliadas. / Citrus black spot caused by Guignardia citricarpa Kiely [Phyllosticta citricarpa (McAlp.) van der Aa] presents two infection forms, conidia and ascospores. Information regarding the importance of the conidia in the epidemiology of the disease is scarce and controversial. Seeking a better understanding on the pathosystem citrus-G. citricarpa (P. citricarpa), the objectives of this dissertation were: elaborate and validate a diagrammatic scale for assessments of the citrus black spot; verify the effect of the temperature and of the wetness duration in the appressorium formation; observe through scanning electron microscopy the germination and formation of appressorium on outstanding lemon 'Siciliano' leaves submitted to different temperatures and wetness duration. The diagrammatic scale with severity levels of 1; 3; 6; 12; and 24% of diseased leaf area was validated by two groups of raters, with experience and without experience in the quantification of diseases. The scale provided better precision and accuracy for both experienced and inexperienced raters, considering the estimates average of them. In the majority of cases, the bias between estimated and actual disease severity were more evident for disease severity levels between 5 and 15%. The reproducibility of assessments resulted in R 2 with more uniforms values for the majority of the experienced raters, considerable differences of precision were observed among inexperienced raters. The effect of the temperature (10 o C - 40 o C) and of the wetness duration (4 – 48 h) in the germination of conidia and appressoria formation of G. citricarpa (P. citricarpa), was assessed "in vitro" and on the surface of lemon 'Siciliano' leaves. The appressoria formation occurred in all the temperatures starting from 12 hours of wetness. The extreme temperatures (10 o C and 40 o C) were less favorable to the apressorium formation. The minimum temperature for appressorium formation, estimated by generalized beta function was of 3 o C and the maximum of 48,4 o C, both for 48 hours of wetness. The appressorium formation was favored considerably by the wetness duration period, with the maximum of apressoria formed at 24 hours of wetness, for majority of the temperatures. The wetness duration period constituted of 48 hours was essential so that the spores submitted to temperatures of 10 o C and 40 o C, formed appressorium. The response surface obtained by the multiplication of the generalized beta and monomolecular functions provided a close fit to observed data in the estimate of the relative percentage of formed appressorium (R 2 =0,75). The samples observed in scanning electron microscopy made possible the acquisition of images of conidia and appressoria on the surface of lemon 'Siciliano' leaves in all the temperature combinations and wetness evaluated.

O Brasil é considerado o maior produtor de citros e o maior exportador de suco de laranja. Doenças de pós-colheita representam uma grande perda na citricultura, sendo que para muitos frutos a serem exportados, existe uma exigência para que os mesmos estejam isentos de resíduos químicos. Em relação a alguns patógenos de importância em pós-colheita podemos destacar, Guignardia citricarpa (Mancha-pretados- citros), Penicillium digitatum (Bolor-verde) e Colletotrichum gloeosporioides (Antracnose). Dada a importância econômica que representa esse complexo de doenças dos frutos cítricos, tanto em termos de comprometimento da qualidade dos frutos, limitações às exportações e dificuldade de controle, a busca de alternativas adicionais que possam viabilizar a capacidade produtiva dos produtores e garantir a obtenção de frutos com excelentes padrões de qualidade torna-se imprescindível. Nesse contexto, pode-se inserir o emprego de medidas de controle alternativas que não englobam o controle químico clássico. Sob esse ponto de vista inclui-se o controle através do uso de agentes bióticos e abióticos e a indução de resistência em plantas. Portanto neste trabalho, foi estudada a viabilidade do controle de doenças pós-colheita em citros, envolvendo a ação direta sobre os patógenos através do uso dos extratos etanólicos de albedo (mesocarpo) de laranja doce (Citrus sinensis var. Valência) e flavedo (exocarpo ou epicarpo) de limão-Tahiti (Citrus aurantifolia Swing var. Tahiti). O extrato do albedo apresentou efeito antifúngico sobre G. citricarpa e o flavedo do limão “Tahiti” sobre C. gloeosporioides, além de se demonstrar a existência de compostos voláteis com efeito tóxico. A segunda parte envolveu o controle e a indução de resistência em frutos, através do uso dos agentes bióticos Lentinula edodes e Agaricus blazei e do agente abiótico ácido jasmônico. Foi possível observar que o extrato aquoso do albedo (C. sinensis), flavedo (C. aurantifolia), L. edodes e A. blazei diminuíram o aparecimento de novas lesões causadas por G. citricarpa, porém não apresentaram efeitos sobre P. digitatum e C. gloeosporioides em frutos de C. sinensis var. Valência quando tratados em pós-colheita. Dessa maneira, no presente trabalho demonstrou-se a viabilidade de um possível controle alternativo de doenças pós-colheita em citros, buscando-se novos agentes que atuem como indutores de resistência ou de controle direto sobre os fitopatógenos. / Brazil is considered the biggest citrus producer and the biggest orange juice exporter. Post-harvest diseases represent a great loss in the citriculture, and for many fruits to be exported they should be free of chemical residues. In relation to some pathogens of importance in post-harvest it can be mentioned Guignardia citricarpa (black-spot-ofcitrus), Penicillium digitatum (green-mold) and Colletotrichum gloeosporioides (anthracnose). Because of the economical importance that represents this disease complex in citric fruits, in terms of compromising fruit quality, limitations to the exports and control difficulties, the search for alternative control measures that can make possible improve the producing capacity of the producers and the obtaining of fruits with excellent quality are indispensable. Thus, in this context it can be included measures of alternative control that do not include the chemical control. Under this point of view, control include the use of biotic and abiotic agents and the resistance induction in plants. Therefore, it was studied the viability of the control of post-harvest diseases in citrus, involving the direct action on the patogens by using ethanolic extracts of albedo (mesocarp) of sweet orange (Citrus sinensis var. Valência) and flavedo (exocarp or epicarp) of lemon-Tahiti (Citrus aurantifolia Swing var. Tahiti). The results showed that the extract of the albedo exhibited antifungal activity on G. citricarpa and the flavedo of the "Tahiti" lemon on C. gloeosporioides, and it was also demonstrated the existence of volatile compounds toxic to the fungus. The second part involved the control and resistance induction in the fruits, by using the biotic agents Lentinula edodes and Agaricus blazei and the abiotic agent jasmonic acid. It was possible to observe that the aqueous extracts from the albedo (C. sinensis), flavedo (C. aurantifolia), L. edodes and A. blazei reduced the formation of new lesions caused by G. citricarpa, however they did not exhibit effects on P. digitatum and C. gloeosporioides in fruits of C. sinensis var. Valência when treated in post-harvest. Thus, in the present work it was demonstrated the viability of possible alternative control measures of diseases in post-harvest of citrus, indicating the need of looking for new agents to act as resistance inducers or agents to directly control on the phytopathogens.

A pinta preta dos citros tem como agente causal o fungo G. citricarpa. A doença causa depreciação estética dos frutos e praticamente inviabiliza a exportação de laranja in natura principalmente para a União Européia, por ser considerada uma doença quarentenária. Frutos colhidos contendo infecções quiescentes, embora sem sintomas, podem desenvolvê-los durante o processo de exportação. A utilização de fungicidas é o principal método de controle utilizado em pré e pós-colheita. No entanto, o custo do controle químico é significativamente alto e já foi relatado o surgimento de isolados resistentes. A levedura S. cerevisiae é capaz de inibir o desenvolvimento in vitro de G. citricarpa e o antagonismo se deve a produção de compostos orgânicos voláteis de ação fungistática. Em virtude da procura por novos métodos de controle menos danosos à saúde humana e meio ambiente, dos prejuízos causados pela doença e do potencial dos compostos voláteis no controle da doença na pós-colheita, o trabalho visou identificar os compostos voláteis produzidos pela levedura e elucidar os mecanismos envolvidos na inibição do fitopatógeno. Esse conhecimento é fundamental para o desenvolvimento de técnicas inovativas de controle. A produção de compostos voláteis antimicrobianos por S. cerevisiae foi dependente do substrato utilizado para o seu cultivo, sendo a glicose, sacarose e maltose fontes de carbono favoráveis. Foi verificado através da análise em SPME-GC-MS que a levedura produziu em meio BDA, principalmente compostos pertencentes ao grupo dos álcoois, constituindo 95% da composição total, além de ésteres em menor proporção. A mistura artificial de voláteis mimetizou os efeitos dos voláteis produzidos pela levedura, sendo os valores de MIC50 e MIC100 de 0,48 µL mL-1 e 2,84 µL mL-1, respectivamente. A exposição do fitopatógeno aos compostos voláteis reduziu a síntese de proteínas e inibiu a atividade de enzimas associadas à morfogênese (quitinase, b-1,3-glucanase, lacase e tirosinase). Os compostos voláteis desencadearam o processo de estresse oxidativo no fungo, fato observado através da elevação da atividade de enzimas (superóxido dismutase e catalase) associadas a mecanismos de detoxificação de espécies ativas de oxigênio. A análise das proteínas diferencialmente expressas de G. citricarpa, através de eletroforese bidimensional, indicou que os compostos voláteis alteraram a expressão de 40 proteínas, sendo 29 inibidas e 11 superexpressas. A mistura artificial de voláteis também foi ativa contra fungos de diversos grupos taxonômicos, no entanto, não apresentou atividade sobre as bactérias testadas. Os compostos 3-metil-1-butanol e 2- metil-1-butanol foram os mais ativos quando utilizados isoladamente contra Colletotrichum gloesporioides, Penicillium digitatum, Sclerotinia sclerotiorum e Fusarium oxysporum. Sementes de feijão fumigadas com a mistura artificial de voláteis exibiram redução na incidência de S. sclerotiorum. A mistura também exibiu efeito nematicida sobre Meloidogyne javanica. Portanto, os resultados demonstram que os voláteis identificados em S. cerevisiae afetam a síntese de proteínas e a atividade de enzimas associadas ao crescimento vegetativo de G. citricarpa. Finalmente, fumigação utilizando compostos voláteis apresenta potencial no controle de G. citricarpa em pós-colheita, bem como de outros organismos de importância agronômica. O trabalho também contribuiu com novos elementos sobre o papel dos voláteis na interação entre microrganismos na natureza. / The citrus black spot has as causal agent the fungus G. citricarpa. The disease causes aesthetic depreciation of fruits and practically makes them unviable for exportation mainly to European Union where the disease is considered a quarantine pest. Harvested fruits can have quiescent infections although without symptoms and can develop them during the exportation process. The use of fungicides is the main chemical control method used in pre and post-harvest, however the cost is significantly high and it was already described the development of fungicide resistant strains. The yeast S. cerevisiae is able to inhibit the in vitro G. citricarpa growth, and the antagonism is due to production of volatile organic compounds (VOCs) of fungistatic effect. Because of the search for new control methods less harmful for human health and environment, the losses caused by the disease and the potential of the VOCs in the control of the pathogen in the post-harvest, the aim of this work was to identify the VOCs produced by the yeast and to elucidate the mechanisms involved in the inhibition of the fungus. This knowledge is essential for the development of innovative control techniques. The results showed that the production of antimicrobial VOCs by S. cerevisiae was dependent on the substrate used, being glucose, sucrose and maltose favorable carbon sources. It was verified through analysis in SPME-GC-MS that the yeast, grown on PDA medium, produced mainly compounds belonging to the group of alcohols (95% of the total composition), besides esters in smaller proportion. An artificial volatile mixture reproduced the effects of the VOCs produced by the yeast, being the values of MIC50 and MIC100 of 0.48 µL mL-1 and 2.84 µL mL-1, respectively. The phytopathogen exposition to the VOCs reduced protein synthesis and inhibited the activity of morphogenesis associated enzymes like chitinase, b-1,3-glucanase, laccase and tyrosinase. The VOCs initiated the oxidative stress process, which was observed through the increase in the activity of superoxide dismutase and catalase, enzymes associated to the detoxification of active oxygen species. The analysis of the differentially expressed proteins of G. citricarpa, through two-dimensional gel electrophoresis, indicated that the VOCs modified the expression of 40 proteins, being 29 down regulated and 11 up regulated. The artificial mixture of VOCs was also active against fungi of several taxonomic groups, however, there were no activity against bacteria. The compounds 3-methyl-1-butanol and 2-methyl-1-butanol were the most active when tested alone against Colletotrichum gloesporioides, Penicillium digitatum, Sclerotinia sclerotiorum and Fusarium oxysporum. Bean seeds fumigated with the artificial mixture of VOCs showed reduction in S. sclerotiorum incidence. In addition, the VOCs exhibited nematicidal effect against Meloidogyne javanica. The results demonstrate that the VOCs produced by S. cerevisiae affect protein synthesis and the activity of enzymes associated to the vegetative growth in G. citricarpa. Thus, the fumigation using VOCs presents potential in the control of citrus black spot disease in post-harvest as well as of other organisms of agronomic importance. The present workalso contributed with new information regarding the role of the VOCs in the interactions among microorganisms in nature.

Les animaux infectés ont une odeur, une apparence, un comportement et/ou un son différent de leurs congénères non infectés. Ces différences peuvent servir d'indices pour reconnaître et éviter les individus infectés. Des études récentes montrent que les hôtes potentiels peuvent utiliser les indices visuels et/ou chimiques pour éviter les individus infectés et minimiser les risques d'infection. Par ailleurs, la prévalence d’un parasite dans l’environnement peut influencer l’apprentissage ainsi que la force de sélection pour la reconnaissance et l’évitement de ce parasite. Bien qu'il existe des preuves que les poissons utilisent des comportements d’évitement pour réduire le risque d'infection, les mécanismes sous-jacents restent peu connus. Nous avons examiné la capacité de deux populations (naïves et expérimentées aux parasites) de crapets-soleil (Lepomis gibbosus) à distinguer les congénères infectés par des vers parasites et les congénères non infectés (c.-à-d. expériences de choix binaires) en utilisant séparément les indices visuels et chimiques. En présence d’indices visuels, les crapets ont montré une forte préférence pour leurs congénères, quel que soit le niveau d'infection, plutôt que d'être seuls. À l’inverse, les crapets évitaient leurs congénères et restaient seuls en présence d’indices chimiques. Nous suggérons que les indices visuels et chimiques ne sont pas redondants et que les crapets utilisent les deux pour prendre des décisions sociales adéquates. Les poissons des deux populations n'ont montré aucune préférence en présence d’indices visuels de congénères infectés et non infectés. Cependant, en présence d’indices chimiques, il existait une grande variation en termes de préférence : certains préférant les congénères non infectés et d'autres préférant les congénères infectés. En moyenne, notre population naïve a évité les congénères infectés alors que notre population expérimentée n'a montré aucune préférence, ce qui suggère une habituation aux signaux d'infection dans la population expérimentée. Nous proposons que les crapets utilisent des indices chimiques plutôt que visuels pour discriminer leurs congénères infectés et non infectés. Notre étude souligne l'importance de prendre en compte différents indices sensoriels ainsi que la charge parasitaire lors de l'étude des comportements d'évitement et de formation de bancs. Ceci est particulièrement important sachant que l'environnement chimique et visuel ainsi que l'abondance des parasites sont modifiés par les changements globaux tel que les pluies acides, le brunissement et l’eutrophisation des écosystèmes d’eau douce. / Infected animals smell, look, behave and/or sound different from uninfected conspecifics. These differences can serve as cues used to recognize and avoid infected individuals. Recent studies show that visual and/or chemical cues of infected individuals can be used by potential hosts to modify their movement behaviours and minimize risks of infection. Furthermore, the prevalence of a parasite in the environment can influence learning and the strength of selection for parasite recognition and avoidance. Although there is some evidence that fishes use prophylactic behaviours to reduce infection risk, the underlying mechanisms remain unknown. We investigated the ability of two populations (naive and experienced to parasites) of wild caught pumpkinseed sunfish (Lepomis gibbosus) in distinguishing between conspecifics infected with parasitic worms versus uninfected individuals (i.e. binary choice experiments) using visual and chemical cues separately. Pumpkinseeds showed a strong preference for conspecifics, regardless of their infection level, over being alone when given visual cues but avoided conspecifics and remained alone when given chemical cues. We suggest that visual and chemical cues are not redundant, and that pumpkinseeds use both to make relevant social decisions. Fish of both populations did not show any preferences when given visual cues of infected and uninfected conspecifics. However, in the presence of chemical cues, there was a great variation in terms of preference: some preferring uninfected conspecifics while others preferring the infected ones. On average, our naive population avoided infected conspecifics whereas our experienced one did not show any preferences, suggesting habituation to infection cues in the experienced population. We propose that pumpkinseeds use chemical rather than visual cues to discriminate between infected and uninfected conspecifics and make a shoaling decision. Our study highlights the importance of considering different sensory cues as well as parasite load when studying avoidance and shoaling behaviours. This is particularly important in a time of modifying chemical and visual environment as well as parasites abundance through global change such as acid rain, browning and eutrophication of freshwater ecosystems.