Les lésions de cartilage ne cicatrisent pas spontanément et la réparation de ce tissu est un challenge. Les techniques chirurgicales restant insatisfaisantes, la thérapie cellulaire et l'ingénierie tissulaire sont maintenant envisagées. La transplantation de chondrocytes autologues (TCA) existe déjà mais cette procédure nécessite l'amplification des chondrocytes qui s'accompagne d'une perte du phénotype différencié (dont l'indicateur est le collagène de type II), au profit d'un phénotype fibroblastique (dont l'indicateur est le collagène de type I, retrouvé dans les tissus fibreux). La TCA conduit donc à une greffe de chondrocytes dédifférenciés produisant un fibrocartilage, dont les propriétés mécaniques sont différentes du cartilage hyalin natif. L'objectif de mes travaux était de développer un nouveau kit d'ingénierie tissulaire du cartilage par association de chondrocytes humains, de biomatériaux et d'une sélection de facteurs solubles. Nous avons utilisé le cocktail FGF-2/insuline (FI) pour l'amplification cellulaire et le cocktail BMP-2/insuline/T3 (BIT) pour redifférencier les chondrocytes dans des éponges de collagène. Nos résultats ont montré que cette combinaison permet la synthèse d'une matrice cartilagineuse dans les supports collagène. Cependant, cette synthèse s'est trouvée favorisée en périphérie des éponges cultivées en conditions statiques. Nous avons ensuite utilisé un bioréacteur pour perfuser les éponges et nos résultats ont révélé alors un dépôt plus homogène de cartilage dans ces supports. De manière très intéressante, nous avons aussi observé l'arrêt de l'expression du collagène de type I. Ainsi, notre approche multifactorielle combinant des chondrocytes humains, des biomatériaux collagène, une combinaison FI-BIT et une culture en perfusion permet la reconstruction d'un cartilage non fibrotique

Tissue engineering and ex vivo gene therapy can be used synergically as tool to regenerate bone, which overcome the problems of currently available bone replacements. Recently, a new source of mesenchymal stromal cells (MSCs) has been found in the umbilical cord; human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) provide an alternative to bone marrow derived MSCs and due to their easy harvest, fast expansion, and non-immunogeneic and immunomodulatory phenotype we hypothesized that HUCPVCs are a putative candidate cell source for osteogenic ex vivo gene therapy. This work proposes the generation of cocktails of genetically modified HUCPVCs and their cryopreservation as an “off the shelf” therapeutic. This approach involves the engineering of osteogenic cell populations, by genetically modifying HUCPVCs using recombinant adenoviruses to deliver four fundamental genes for bone formation: bone morphogenetic protein 2 (BMP-2), runt-related transcription factor 2 (Runx2), Osterix (OSX/SP7) transcription factor and vascular endothelial growth factor (VEGF). Our results show that HUCPVCs can be efficiently modified by adenoviruses and can be cryopreserved without affecting the production efficiency and bioactivity of proteins of interest produced by the cells. Moreover, overexpression of BMP2, Runx2 and SP7 enhances ALP activity levels in HUCPVCs and upregulates ALP, OPN, COL1A1 and OCN gene expression; data that provides the first evidence of the effects of combinational expression of BMP2, Runx2 and SP7. Furthermore, we report for the first time the genetic modification of human BMSCs to express SP7 and Runx2, which enhances their ALP activity and matrix mineralization capacity.

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Abstract Dentin formation in physiological and pathological conditions has been widely studied, but the events and regulation are still not completely understood. Odontoblasts, terminally differentiated post-mitotic cells located in a single cell layer around pulp tissue, synthesize and mineralize dentin organic matrix. Growth factors, such as TGF-β1 and BMP-2, have been implicated in the regulation of the responses of odontoblasts and pulp tissue to external irritation. Matrix metalloproteinases (MMPs), a family of 28 endopeptidases collectively capable of degrading virtually all extracellular matrix components, and their specific tissue inhibitors (TIMPs) participate in the organo- and morphogenesis, physiological tissue turnover and pathological tissue destruction in many tissues, but very little is known about their presence, function, and regulation in the dentin-pulp complex cells and tissues. The aim of the work presented in this thesis was to analyze the expression and regulation of collagens, MMPs and TIMPs by TGF-β1 and BMP-2 in mature human odontoblasts and pulp tissue. Odontoblasts synthesize and secrete type I and type III collagens, with no clear effect of TGF-β1 on their expression levels. MMP-1, -2, -8, -9, -10, -11, -14, -15, -16, -19 and TIMP-1, -2, -3 and -4 were expressed by both odontoblasts and pulp tissue. MMP-3 and MMP-12 were not expressed in native odontoblasts or pulp tissue, and MMP-7, -24, and -25 were expressed only in odontoblasts. MMP-2, -10, -14, -20 and -23 were expressed more abundantly in odontoblasts, whereas pulp tissue expressed more MMP-13 and MMP-17. Growth factors differentially regulated the expression of different MMPs and TIMPs within and among the cells and tissues studied. In odontoblasts, MMP-1, -8 and -14 were down-regulated, but MMP-7, MMP-9, TIMP-1 and TIMP-3 up-regulated, by either TGF-β1 or BMP-2, alone or in combination. In pulp tissue, growth factors up-regulated the expression of MMP-1, -2, -10, -13, -17 and TIMP-3, but down-regulated TIMP-4. The widespread of expression of MMPs and TIMPs by mature human odontoblasts and pulp tissue suggests that they may participate in dentin matrix organization prior to mineralization, and that growth factors may further control dentin matrix modeling, not by regulating the synthesis of type I or III collagens as previously believed, but rather by differentially regulating each MMPs and TIMPs.

Microparticles produced from kafirin, the sorghum grain prolamin protein, by molecular selfassembly using coacervation with acetic acid solvent are vacuolated. They have shown considerable potential for encapsulation of antioxidants and for preparation of high quality free-standing bioplastic films. However, the functional quality of these kafirin microstructures needs to be improved to exploit their potential application, particularly as biomaterials. Wet heat, transglutaminase and glutaraldehyde treatments were used to modify the physical structure and chemical properties of the kafirin microstructures. Heat treatment (50–96°C) increased microparticle average size by up to four-fold to ≈20 μm, probably due to disulphide cross-linking of kafirin proteins. The vacuoles within these microparticles enlarged up to >10-fold, probably due to greater expansion of air within the microparticles with higher temperature, as the vacuoles are probably footprints of air bubbles. As with heat treatment, glutaraldehyde (10–30%) treatment resulted in oval microparticles, up to about four-fold larger than the control, probably due to covalent glutaraldehyde-polypeptide linkage. Transglutaminase (0.1–0.6%) treatment had only slight effect on the size and shape of microparticles, probably because kafirin has very low lysine content, inhibiting transglutaminase-catalysed cross-linking through ε-(-glutamyl)-lysine bonding. Surface morphology using atomic force microscopy indicated that the microparticles apparently comprised coalesced nanostructures. With heat and transglutaminase treatments, the microparticles seemed to be composed of round nanostructures that coalesced into random irregular shapes, indicative of non-linear protein aggregation. In contrast, with glutaraldehyde treatment, the nanostructures were spindle-shaped and had a unidirectional orientation, probably due to linear alignment of the nanostructures controlled by glutaraldehyde-polypeptide linkage. Thin (<50 μm) films prepared from kafirin microparticles and conventional cast kafirin films were compared in terms of their water stability and other related properties. Films cast from microparticles were more water-stable compared to conventional kafirin films, probably because the large vacuoles within the kafirin microparticles may have enhanced protein solubility in the casting solution, thereby improving the film matrix cohesion. The films prepared from microparticles treated with glutaraldehyde were more water-stable compared to the control, despite the loss of plasticizer, probably due to formation of the covalent glutaraldehyde-polypeptide linkages. The potential of modified kafirin microparticles to bind bone morphogenetic protein-2 (BMP- 2) was investigated. Compared to a collagen standard, the BMP-2 binding capacity of control, heat-treated, transglutaminase-treated and glutaraldehyde-treated kafirin microparticles were 7%, 18%, 34% and 22% higher, respectively, probably mainly due to the vacuoles within the microparticles creating greater binding surface area. The safety, biodegradability and effectiveness of kafirin microparticle film and kafirin microparticle film-BMP-2 system in inducing bone growth were determined by a subcutaneous bioassay using a rat model. Kafirin microparticle film and kafirin microparticle film-BMP-2 system was non-irritant to the animals, probably because kafirin is non-allergenic. The kafirin microparticle film implants showed signs of some degradation but a large proportion of these implants was still intact by Day 28 post implantation, probably because of the low susceptibility of kafirin to mammalian proteolytic enzymes. Kafirin microparticle film-BMP-2 system did not induce bone growth, probably mainly due to low BMP-2 dosage and short study duration. Modification of kafirin microparticles by wet heat or glutaraldehyde treatment both result in increased size of the microparticles with similar gross structure. However, it is apparent that with both treatments the proteins within the pre-formed kafirin microparticles undergo some form of further assisted-assembly through different mechanisms. It seems that heat-induced disulphide cross-linking reinforces a layer around the nanostructures, probably rich in γ- kafirin polypeptides, that stabilizes the structure of the nanostructures. In contrast, glutaraldehyde-treatment appears to destabilize this structure-stabilizing layer through formation of γ-kafirin polypeptide-glutaraldehyde covalent bonding. This probably offsets the balance of attractive and repulsive forces between the different kafirin subclasses within the nanostructures, thereby resulting in collapsed nanostructures and linear realignment. A deeper understanding of the mechanism of kafirin self-assembly will be important for further development of kafirin microstructures for different applications. / Thesis (PhD)--University of Pretoria, 2012. / Food Science / unrestricted

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Wachstumsfaktoren sind wichtige Steuerelemente des Knochenzellmetabolismus. Im Verlauf der Frakturheilung kommt es zur Ausschüttung von zahlreichen Wachstumsfaktoren, Zytokinen und Botenstoffen im und um den Bereich des Frakturspalts, die systemisch oder lokal, endokrin, parakrin oder autokrin wirksam werden können. Für verschiedene Wachstumsfaktoren konnten in zahlreichen Studien osteoinduktive und die Frakturheilung positiv beeinflussende Wirkungen nachgewiesen werden. In vitro und in vivo Studien belegen, dass einige dieser Faktoren wie Insulin-like growth factor-I (IGF-I), Transforming growth factor-beta1 (TGF-beta1) und Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) einen stimulierenden Effekt auf osteo- und chondrogene Zellen aufweisen und somit die Knochenheilung stimulieren. Der genaue Wirkmechanismus dieses positiven Effektes der Wachstumsfaktoren und ihre Interaktion im Verlauf der Frakturheilung ist nicht bekannt. Die lokale Applikation der Faktoren für einen therapeutischen Einsatz bei der Frakturheilung stellte bisher jedoch ein Problem dar. Mit der entwickelten biodegradierbaren Poly(D,L-Laktid)-Beschichtung von Implantaten können eingearbeitete Wachstumsfaktoren kontrolliert und lokal direkt an der Fraktur freigesetzt werden. Das beschichtete Implantat dient dabei der Stabilisation der Fraktur und gleichzeitig als Wirkstoffträger. Die Beschichtung weist eine hohe mechanische Stabilität auf. Die eingearbeiteten Wachstumsfaktoren behalten ihre biologische Aktivität in der Beschichtung und werden kontrolliert lokal freigesetzt. Um den Effekt lokal applizierter Wachstumsfaktoren auf die Frakturheilung zu untersuchen, wurde ein standardisiertes geschlossenes Frakturmodell entwickelt, das der klinischen Situation möglichst nahe ist und reproduzierbar durchgeführt werden kann. Untersucht wurde der Effekt der Wachstumsfaktoren IGF-I, TGF-beta1 und BMP-2 und des Trägermaterials PDLLA sowie lokale und systemische unerwünschte Wirkungen. Die Ergebnisse zeigten einen signifikant grösseren stimulierenden Effekt von IGF-I auf die Frakturheilung im Vergleich zur TGF-beta1 Applikation. Die kombinierte Gabe beider Faktoren ergab einen signifikant grösseren Effekt auf die torsionale Stabilität und die Kallusreifung im Vergleich zur Einzelapplikation. Beide Faktoren scheinen einen synergistischen Effekt auf die Frakturheilung zu haben. Die lokale Applikation von BMP-2 beschleunigte ebenso, wie die lokale Freisetzung von IGF-I und TGF-beta1 die Frakturheilung signifikant. Deutliche Unterschiede zwischen IGF-I / TGF-beta1 und BMP-2 konnten nicht festgestellt werden.Allerdings zeigte sich bei der Verwendung von BMP-2 auch ausserhalb der Frakturzone eine grössere Mineralisation der Kortikalis, die bei IGF-I / TGF-beta1 nicht zu beobachten ist. Auch im Grosstiermodell bestätigte sich die Wirksamkeit dieser bioaktiven Oberflächen-beschichtung auf die Osteotomieheilung. Die PDLLA-Beschichtung alleine, ohne eingearbeitete Wachstumsfaktoren, zeigte bereits einen positiven Effekt auf die Frakturheilung. Die Untersuchungen belegen, dass die lokale Freisetzung von Wachstumsfaktoren aus einer biodegradierbaren PDLLA-Beschichtung von Implantaten die Frakturheilung signifikant beschleunigt, wobei keine unerwünschten lokalen oder systemischen Wirkungen beobachtet werden konnten. Bei dem Vergleich lokaler (durch Wachstumsfaktoren) mit systemischer Stimulationsmöglichkeit (durch Wachstumshormon) der Frakturheilung lässt sich zusammenfassend feststellen, dass die kombinierte Anwendung beider Stimulationsmöglichkeiten zu keiner weiteren Steigerung der Heilungsvorgänge führte. Weitere Untersuchungen wurden hinsichtlich der genauen Rolle und Interaktion der Wachstumsfaktoren durchgeführt. Vor allem die Frühphase scheint hierbei eine entscheidende Rolle bei der Frakturheilung einzunehmen. Es zeigte sich hierbei eine deutliche Stimulation der Osteoblastendifferenzierung mit einer Erhöhung der Kollagen-1 Produktion in vitro sowie eine Steigerung der Proliferationsrate und Angiogenese mit einem schnelleren Ablauf der Phasen der Frakturheilung in vivo durch lokal appliziertes IGF-I und TGF-beta1. Weitere Anwendungen der entwickelten Beschichtungstechnologie stellen die lokale Applikation von Wachstumsfaktoren von beschichteten PDLLA-Cages bei der intervertebralen Spondylodese sowie die lokale Applikation von Antibiotika aus einer PDLLA-Beschichtung von Implantaten zur Prophylaxe der Implantat-assoziierten Osteomyelitis dar.Basierend auf diesen Ergebnissen steht der Einsatz PDLLA-Gentamicin beschichteter intramedullärer Tibianägel kurz vor der klinischen Anwendung.Eine Zulassung durch die entsprechenden Behörden ist erfolgt.Die klinische Anwendung Wachstumsfaktoren-beschichteter Implantate ist bereits in der Vorbereitung. / Growth factors are important regulators of bone metabolism. During fracture healing many growth factors or cytokines were locally released at the facture site. In several studies, different growth factors demonstrated osteoinductive and fracture stimulating properties. In vitro and in vivo studies showed a stimulating effect of Insulin-like growth factor-I (IGF-I), Transforming growth factor-beta1 (TGF-beta1) and Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) on osteo- and chondrogenetic cells. The exact effectiveness and the interaction of these growth factors during fracture healing is not known so far. Further, the local application of these factors for therapeutically use in fracture treatment is still a problem. The developed biodegradable poly(D,L-lactide)-coating of implants allows the local and controlled release of incorporated growth factors directly at the fracture site. The coated implant serves on the one hand for fracture stabilization and on the other hand as a drug delivery system. The coating has a high mechanical stability. The incorporated growths factors remain biologically active in the coating and were released in a sustained and controlled manner. To investigate the effect of locally released growth factors IGF-I, TGF-beta1 and BMP-2 and the carrier PDLLA on fracture healing, standardised closed fracture models were developed with a close relationship to clinical situation. Further, possible local and systemic side effects were analysed. The results demonstrated a significantly higher stimulating effect of IGF-I on fracture healing compared to TGF-beta1. The combined application of both growth factors showed a synergistic effect on the mechanical stability and callus remodeling compared to single treatment. The local release of BMP-2 also enhanced fracture healing significantly - comparable to combination of IGF-I and TGF-beta1. However, a higher rate of mineralisation was measurable outside the fracture region using BMP-2 in a rat fracture model. Using a large animal model on pigs with a 1 mm osteotomy gap, the effectiveness of locally released growths factors could be confirmed. Further, the PDLLA-coating without any incorporated growth factors demonstrated a significantly effect on healing processes in both models. These investigations showed, that the local release of growth factors from PDLLA coated implants significantly stimulate fracture healing without any local or systemic side effects. Comparing systemic with local stimulation techniques, we found an improvement of fracture healing by systemic administration of growth hormone and local application of IGF-I and TGF-beta1. However, the combined use of both simulation techniques did not lead to a further increase of healing processes. Investigations on the effectiveness and the interaction of growth factors during fracture healing demonstrated an dramatic effect in the early phases of healing processes. The growth factors stimulate the differentiation of osteoblasts with a higher production of collagen I in vitro and increase osteogenesis and vascularisation of the fracture callus in vivo. Further applications of the coating technology are the use of PDLLA and growth factor coated cages for the stimulation of intervertebral fusion and the use of PDLLA and Gentamicin coated implants in order to prevent implant associated infections. The clinical use of antibiotic and growth factor coated implants are in preparation.

Zur Therapie von Knochendefekten, die nach Traumata, nach Infektion oder Knochennekrosen ohne das Einbringen von Knochenersatz nicht zu heilen sind, wird versucht, Knochenersatz oder Knochenersatzgewebe mit Hilfe des Tissue Engineerings zu züchten. Da eine vollständige Vaskularisation für das Einheilen großer Ersatzgewebe unabdingbar ist, wird durch verschiedene Strategien versucht eine Blutgefäßversorgung solcher Knochenersatzgewebe zu erzielen. Das Ziel dieser Arbeit ist die Generierung axial vaskularisierten Knochenersatzgewebes mit einer β-Trikalziumphosphat-Hydroxylapatitkeramik, mesenchymalen Stammzellen und BMP-2 (bone morphogenetic protein 2) im Großtiermodell des Schafes. Um das Potential zur Knochenbildung bei Verwendung einer β-Trikalziumphosphat-Hydroxylapatitkeramik mit und ohne Zugabe des Wachstumsfaktors bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) von ovinen mesenchymalen Stammzellen sowohl als direkt reimplantierte oder vorher expandierte Zellquelle zu untersuchen, wurden im ersten Teil dieser Studie die mesenchymalen Stammzellen des Schafes isoliert und durch Durchflusszytometrie auf Proteinebene und PCR-Untersuchung auf Genebene charakterisiert. Die für die Induktion der Knochenbildung nötige Konzentration von BMP-2 in Kombination mit der Knochenersatzmatrix und Fibrinkleber im Schaf wurde durch subkutane Implantation evaluiert. Nach zwölf Wochen Implantationsdauer wurden die Konstrukte mit 2,5 μg/ml, 12,5 μg/ml und 60 μg/ml BMP-2 im Fibrinkleber durch histologische Auswertung untersucht. Es konnte festgestellt werden, dass für die Ausbildung von lamellärem Knochengewebe 60μg/ml BMP-2 nötig waren. Als nächster Schritt wurden zur Untersuchung des Verhaltens der mesenchymalen Stammzellen für unterschiedliche Implantationsdauern sowohl direkt reimplantierte mesenchymale Stammzellen als auch expandierte Stammzellen im subkutanen Modell des Schafes untersucht. Das Verhalten der verschieden prozessierten Stammzellen war bezüglich ihres Proliferations- und Apoptoseverhaltens, das immunhistologisch untersucht wurde, ähnlich. Das Potential zur ektopen Knochenbildung der direkt reimplantierten mesenchymalen Stammzellen alleine oder in Kombination mit 60 μg/ml BMP-2 und der expandierten mesenchymalen Stammzellen jeweils mit β-Trikalziumphosphat-Hydroxylapatitkeramik und Fibrinkleber wurde nach zwölfwöchiger subkutaner Implantation untersucht. Durch PCR-Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass in allen drei Gruppen Knochengene im Vergleich zur Kontrollgruppe mit β-Trikalziumphosphat-Hydroxylapatitkeramik und Fibrinkleber hochreguliert waren. Die quantitative histologische Auswertung ergab, dass die innerhalb der Konstrukte gebildete Knochenfläche im Vergleich zu den anderen Gruppen in den Konstrukten mit expandierten mesenchymalen Stammzellen signifikant größer war. Zur Generierung axial vaskularisierten Knochengewebes wurde das AV-Loop-Modell der Ratte auf das Schaf übertragen und das Potential von direkt reimplantierten mesenchymalen Stammzellen mit β-Trikalziumphosphat-Hydroxylapatitkeramik allein und mit der Zugabe von 60 μg/ml BMP-2 untersucht. Neben der Analyse der Vaskularisierung dieser Konstrukte durch immunhistologische und bildgebende Methoden wurde die Knochenbildung anhand histologischer Präparate quantifiziert. Die AV-Loop-Konstrukte beider Gruppen waren nach zwölfwöchiger Implantationsdauer vollständig vaskularisiert. Die für die Gruppe mit BMP-2 als Wachstumsfaktor durchgeführten intravitalen MRT-Untersuchungen zeigten, dass der Zuwachs an Gefäßen vor allem zwischen der vierten und achten Woche stattfand. Die quantitative Auswertung der neugebildeten Knochenfläche wurde semiautomatisch an histologischen Präparaten durchgeführt. In der Gruppe mit β-Trikalziumphosphat-Hydroxylapatitkeramik, direkt reimplantierten mesenchymalen Stammzellen und 60 μg/ml BMP-2 war die Knochenfläche signifikant größer als in der Gruppe ohne Wachstumsfaktor. Mit dieser Studie konnte erstmals im Großtiermodell gezeigt werden, dass mesenchymale Stammzellen nach direkter Reimplantation im subkutanen Modell und im AV-Loop-Modell zur Induktion der Knochenbildung fähig sind. Durch die Generierung axial vaskularisierten Knochenersatzgewebes im Großtiermodell des Schafes könnte es gelingen, die Größenlimitierung der durch Tissue Engineering gezüchteten Ersatzgeweben zu überwinden.

Les nanotechnologies sont en train de révolutionner le domaine biomédical et plus particulièrement l’ingénierie tissulaire. Elles permettent aujourd’hui, non seulement de réparer mais aussi de régénérer les tissus. Cette nanomédecine régénérative est particulièrement adaptée pour répondre aux besoins importants liés aux maladies dégénératives, au vieillissement et aux traumatismes.Mon travail de thèse s’inscrit dans ce contexte et concerne l’élaboration de biomatériaux nanofibreux et microporeux actifs pour la régénération osseuse. Notre objectif essentiel est de réaliser un implant biodégradable nanostructuré permettant d’accélérer la réparation du tissu osseux. Notre stratégie innovante repose non seulement sur la mise en oeuvre de membranes par électrospinning mais aussi sur leur fonctionnalisation par des facteurs de croissance. Cette fonctionnalisation originale a consisté à enrober ces principes actifs dans des nanoréservoirs en utilisant la technique multicouche de polyélectrolytes. Des membranes de polycaprolactone (PCL) nanofibreuses et microporeuses ont été obtenues par électrospinning puis les fibres ont été enrobées de réservoirs contenant le facteur ostéoinducteur, la protéine morphogénique osseuse 2 (BMP-2). L’induction osseuse engendrée par ces réservoirs actifs a été mise en évidence in vitro après culture d’ostéoblastes humains primaires. Des expérimentations in vivo chez la souris ont permis de confirmer l’accélération de la régénération osseuse grâce à ces nanoréservoirs.Cette même stratégie a été validée in vivo, chez la souris, en utilisant des membranes de collagène d’origine animal commerciales utilisées en clinique. L’activité de ces membranes fonctionnalisées par des nanoréservoirs de BMP-2 est en cours d’analyse dans le cadre de tests précliniques pour une application maxillofaciale et parodontale. / Nanobiotechnology enables the emergence of entirely new classes of bioactive devices intended for targeted intracellular delivery for more efficiency and less toxicities. Tissue engineering is an interdisciplinary field that has attempted to implement a variety of processing methods for synthetic and natural polymers to fabricate tissue and organ regeneration scaffolds.We report here the first demonstration of bone regeneration by using a strategy based on a synthetic nanostructured membrane. This electrospun membrane is manufactured by using a FDA approved polymer, PCL, (polycaprolactone), and functionalized with nanoreservoirs of a growth factor (BMP-2). Our expected outcomes are the development of clinical applications in the field of tissue engineering and nanomedecine and particularly in bone regeneration.We propose the development of smart nanostructured active implants for regenerative medicine. Our strategycombines a synthetic biodegradable electrospun nanofibrous membrane based on PCL and a bioactive growth factor (BMP-2) entrapped into polymer nanoreservoirs built atop the nanofibers according to the layer-by-layer technology. In this study, by using primary osteoblasts, we have shown the capacity of these sophisticated implants to promote and accelerate not only in vitro bone induction; but also, in vivo, bone formation (mouse model).We have also validated our strategy, in vivo (mouse model), by using an already used in the clinic collagen membrane (animal origin) to accelerate bone regeneration. This unique strategy is used to entrap, protect and stabilize the therapeutic agent into polymer coating acting as nanoreservoirs enrobing fibers of membranes.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:32:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AndreaFS_tese.pdf: 610478 bytes, checksum: 22934e3fba7a401686d3b0057e0e7f35 (MD5) Previous issue date: 2007-07-11 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / The expression of bone morphogenetic proteins (BMPs) is altered in a variety of human canceres. The BMP-2/4 and BMPR-IA were recently shown to be overexpressed in high-risk premalignant and malignant lesions of oral epithelium. The present study analysed the expression of BMP-2/4 and BMPR-IA in Oral Squamous Cell Carcinoma (OSCC) such as their implications in disease prognostic using munohistochemistry. Ten cases of Oral Fibroepithelial Hiperplasia were selected as a control group. The experimental group included 16 cases of OSCC without metastases and 7 cases of OSCC metastatic. The presence or absence of nodal metastases was used as parameter to evaluated the disease prognostic. The results demonstrated weak immunoreactivity for BMP-2/4 and BMPR-IA in every case of the control group. In the cases of OSCC with metastases an overexpression of BMP-2/4 (71,4%) was observed while the BMPR-IA showed weak expression (85,7%). In the cases of OSCC without metastases BMP-2/4 (62,5%) and BMPR-IA showed strong immunostaining standing out an overexpression of the receptor in all the specimens. Observed statistical significance for correlation between the oral cancer prognostic and the staining intensity of the BMP-2/4 (p=0,002). There wasn t statistical significance for association between the staining intensity of the BMPR-IA and the disease prognostic (p<0,001). In conclusion, this findings suggest that the overexpression of BMP-2/4 associated with the loss of expression of the BMPR-IA in OSCC metastatic has prognostic relevance, as the loss of sensitivity to BMPs can be an indicative of metastases development in OSCC / A express?o das prote?nas morfogen?ticas ?sseas (BMPs) est? alterada em v?rios c?nceres humanos. A BMP-2/4 e o BMPR-IA foram recentemente encontrados superexpressos em les?es malignas e pr?-malignas de alto risco em epit?lio oral. Este estudo analisou a express?o da BMP-2/4 e seu receptor BMPR-IA em 23 esp?cimes de Carcinoma Epiderm?ide Oral (CEO), utilizando a imuno-histoqu?mica. O grupo controle constou de 10 casos de Hiperplasia Fibro-epitelial da mucosa oral. O grupo experimental foi constitu?do por 16 casos de CEO n?o metast?tico e 7 casos de CEO metast?tico. Utilizou-se o par?metro presen?a ou aus?ncia de met?stase nodal para avaliar o progn?stico da doen?a. Os resultados demonstraram imunorreatividade fraca para a BMP-2/4 e o BMPR-IA em todos os esp?cimes do grupo controle. No grupo experimental com met?stase, a BMP-2/4 exibiu forte expressividade (71,4%), enquanto que o BMPR-IA mostrou fraca express?o (85,7%). No grupo experimental sem met?stase, evidenciou-se forte express?o para a BMP-2/4 (62,5%) e para o BMPR-IA (100%). Encontrou-se signific?ncia estat?stica para a associa??o entre o progn?stico do CEO e a intensidade de marca??o da BMP-2/4 (p=0,002). Para o BMPR-IA n?o houve signific?ncia estat?stica ? sua associa??o com o progn?stico da doen?a (p<0,001), em fun??o do tamanho da amostra. Portanto, os resultados sugerem que a fraca expressividade do BMPR-IA associada ? forte express?o da BMP-2/4, no grupo experimental com met?stase, tem relev?ncia progn?stica, j? que a perda de sensibilidade ?s BMPs, atrav?s da perda de express?o de seus receptores pode ser indicativo de desenvolvimento de met?stase em CEO