INTRODUÇÃO: As reconstruções ósseas craniofaciais utilizam enxertos ósseos rotineiramente. Entretanto, pode haver problemas na disponibilidade ou na cicatrização óssea. A engenharia tecidual visa a solucionar problemas como este, através da produção de órgãos e tecidos pela combinação entre matrizes, células e fatores de crescimento. OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi avaliar cranioplastias experimentais, através da combinação entre proteína morfogenética óssea tipo 2 (BMP-2) e diferentes matrizes e carreadores. MÉTODO: Realizamos um estudo experimental prospectivo, comparativo e aberto, dividido em sete grupos: 1 – BT: BMP-2 e fosfato de cálcio (TCP); 2 – BM: BMP-2 e matriz dérmica acelular Matriderm ® (MDM); 3 – BA: BMP-2 e alginato de cálcio (ALG); 4 – TCP; 5 – MDM; 6 – ALG; 7 – Enxerto autógeno ou autoenxerto (AEN). Uma falha de 3 x 5 mm foi criada no osso parietal esquerdo de camundongos machos adultos, com mais de 3 meses. No mesmo tempo cirúrgico, uma das sete reconstruções foi realizada. Após cinco semanas, os animais for submetidos a eutanásia e um bloco ósseo, envolvendo a cranioplastia e uma margem de osso nativo circunjacente, foi retirado e preparado para análise histológica. Utilizamos o teste de Kruskal-Wallis para a análise estatística, com nível de significância de P<0,05. Os critérios histológicos utilizados foram: fusão de corticais; neoformação óssea; neovascularização e formação de medula óssea. RESULTADOS: Foram estudados 38 animais. Em todos os animais, houve permanência do material utilizado para reconstrução. Não houve retração cicatricial nem deiscência em nenhum dos casos. Uma incidência elevada de infecção ocorreu no grupo MDM (57%, P=0,037). Houve diferença estatística na maioria dos critérios avaliados. No critério fusão de corticais, os grupos AEN, TCP e BT obtiveram as melhores pontuações em relação aos demais (P=0,00846). No critério neoformação óssea, os grupos BT, AEN e TCP obtiveram as melhores pontuações (P=0,00835). Já no quesito neovascularização, os grupos melhor pontuados foram BM, BA, TCP e MDM em relação aos demais (P=0,001695). Por fim, no critério formação de medula óssea, o AEN liderou a pontuação, seguido dos grupos BT e TCP (P=0,008317). CONCLUSÕES: O uso de BMP-2 melhorou a regeneração óssea de cranioplastias experimentais, principalmente com a associação de TCP, que foi comparável ao AEN, o padrão-ouro, em alguns critérios histológicos. Ademais, a associação BM aumentou significativamente a neovascularização na área receptora e diminuiu a incidência de infecção em relação à MDM isolada. / INTRODUCTION: Bone craniofacial reconstructions employ bone grafts routinely. Nevertheless, there may be troubles either in availability or healing. Tissue engineering aims to solve such problems, building either organs or tissues through combination among matrices, cells and growth factors. OBJECTIVE: The aim of this study was to evaluate experimental cranial vault reconstructions, by combining bone morphogenetic protein type 2 (BMP-2) and different matrices or cell carriers. METHOD: We performed an experimental, open, prospective and comparative study, divided in seven groups: 1 – BT: BMP-2 and calcium phosphate (TCP); 2 – BM: BMP-2 and acellular dermal matrix Matriderm® (MDM); 3 – BA: BMP-2 and calcium alginate (ALG); 4 – TCP; 5 – MDM; 6 – ALG; 7 – Bone autograft (BAG). A bone failure, measuring approximately 3 x 5 mm was created in left parietal bone of adult male mice, aging more than 3 months old. At the same procedure, one of the seven reconstructions was performed. After five weeks, animals were sacrificed and a bone block, including cranial vault reconstruction area and nearby native bone was removed and processed to histological analysis. Statistics was made with Kruskal-Wallis test, and significance was considered when P<0.05. Histological criteria were: cortical fusion; new bone formation; neovascularization; and bone marrow formation. RESULTS: Thirty-eight animals were evaluated. In all of them, materials used to reconstruction remained at the receptor site. There has been neither dehiscence nor wound retraction in any case. A higher incidence of infection has occurred in MDM group (57%, P=0.037). There has been significant difference in most of the studied histological criteria. In cortical fusion, groups BAG, TCP, and BT have got the best scores, comparing to the others (P=0.00846). In new bone formation, groups BT, BAG, and TCP have presented the best scores (P=0.00835). When neovascularization was considered, best groups were BM, BA, TCP, and MDM (P=0.001695). At last, BAG group has been the best in bone marrow formation, followed by groups BT and TCP (P=0.008317). CONCLUSIONS: BMP-2 has increased bone regeneration in experimental skull reconstruction, especially when combined to TCP. Such association was even comparable to BAG, the gold-standard treatment, in some histological criteria. Besides, BM group has increased significantly neovascularization in receptor area and decreased the incidence of infection, when compared to MDM alone.

Angiogenesis is required for endochondral ossification during development and fracture healing; however the exact mechanisms and temporal relationship between the two processes remains unclear. In this study, we utilize an in vivo model of endochondral ossification in mice by implanting demineralized bone matrix (DBM) proximal to the femur to induce ectopic bone formation. TNP-470, a drug known to be anti-angiogenic, was used to inhibit vascularization during the time course of de novo bone formation in order to define the role of angiogenesis during the chondrogenic phase of endochondral bone formation. Day 2, day 8, and day 16 post-surgery were selected time points to represent pre-chondrogenic, chondrogenic, and bone mineralization stages, respectively. Plain x-ray and micro-CT analysis showed that inhibition of angiogenesis led to decreased mineralized tissue formation. Inhibited angiogenesis was confirmed with qRT-PCR. Most striking, however, is that while stem cells are recruited and committed to the chondrogenic lineage, subsequent chondrogenesis failed to progress based on the failure of Sox5 and Sox6 expression, which directs chondrocyte commitment. This expands the role for angiogenesis to a much earlier stage than currently thought and places the necessity of angiogenesis very early in the endochondral ossification process.

Considerando-se que o tabagismo afeta a maioria dos sistemas do corpo humano, que os estudos concentram-se mais sobre os efeitos deletérios do tabaco em doenças cujos órgãos vitais são afetados e que seu impacto na formação e na consolidação óssea ainda não está estabelecido, a proposta neste estudo foi avaliar os efeitos da exposição à fumaça de cigarro no mecanismo de consolidação e remodelamento da matriz óssea e relacioná-los ao processo inflamatório desencadeado por fratura em modelo desenvolvido em camundongos. Para isso, camundongos C57BL6 machos foram distribuídos em quatro grupos: C (n=29) expostos ao ar ambiente; F (n=23) expostos ao ar ambiente e submetidos à osteotomia da tíbia direita; CS (n=29) expostos à fumaça de cigarro; FCS (n=23) expostos à fumaça de cigarro e submetidos à osteotomia da tíbia direita. Nossos dados indicaram diminuição do volume trabecular, da mineralização, MS/BS% (p < 0,05), e da formação óssea, MAR (p=0,0004), bem como aumento de osteoclastos, Oc.S/BS% (p=0,0361), e de reabsorção óssea, ES/BS% (p=0,0114), no grupo CS, quando comparado ao grupo C. Identificamos uma elevação significativa de IL-6 nos grupos CS e FCS (p < 0,001) na comparação com os grupos C e F (p < 0,05). Observamos diminuição de VEGF nos grupos CS e FCS, quando comparados com os grupos C e F (p=0,01). O índice de IGF demonstrou-se diminuído nos grupos CS e FCS, quando comparados com os grupos C e S (p < 0,05). A matriz fibrilar apresentou um intenso remodelamento, caracterizado pelo aumento da expressão de Colágeno V na avaliação por imuno-histoquímica nos grupos CS, F e FCS, comparados com C (p < 0,05), e da expressão dos genes COL5A1 (p < 0,0001) e COL5A2 nos grupos F e FCS (p < 0,0001). Identificamos também diminuição significativa de Colágeno I nos grupos CS, F e FCS, comparados com C (p < 0,001), e da expressão dos genes COL1A1 no grupo CS (p=0,008) e COL1A2 nos grupos CS, F e FCS (p=0,005). Nosso estudo mostra que a exposição à fumaça de cigarro altera a composição das fibras de colágeno pertencentes à matriz fibrilar óssea, retarda a mineralização e modifica a interação entre os diferentes tipos de colágeno, importantes no desempenho funcional do osso / Introduction: The impact of cigarette smoke on bone metabolism is not yet fully understood. This study aimed to verify the effects of cigarette smoke exposure in bone healing in an experimental tibial fracture model, evaluating the mineralization process, bone cellular differentiation/function and collagen types deposition. Materials and Methods: C57BL/6 male mice were assigned into four groups: C(n=29): exposure to room air; F(n=23): exposure to room air and right tibia osteotomy; CS(n=29): exposure to cigarette smoke; FCS(n=23): exposure to cigarette smoke and right tibia osteotomy. Results: Histomorphometry of Bone Mineral Matrix revealed that cigarette smoke exposure significantly reduced thickness of bone trabeculae, associated with a decrease in mineralizing surface and in rate of mineral apposition, which was reflected in lower bone formation rate and consequently in a longer time for mineralization. Both resorption surface and osteoclastic surface were higher in the CS group, evidencing the increase of the resorptive action of cigarette smoke. Histomorphometry of Bone Fibrillar Matrix: Type I collagen demonstrated a decrease in CS and FCS compared to C (p < 0.01); Type V collagen demonstrated an increase in CS, FC and FSC compared to C (p < 0.0001). The cytokines expression evaluation demonstrated that only CS exposure has already induced a VEGF and IGF decrease with a concomitant increase in IL-6 and these changes were intensified under fracture conditions. COL1A1 gene expression was reduced in the CS and FCS groups, similar result was observed in COL1A2 evaluation. COL5A1 gene expression, showed an increase in CS and Fracture groups while the COL5A2 gene expression increase was detected only in Fracture groups. Conclusion: Cigarette smoke exposure alters bone matrix composition and worsens bone mineralization, leading to bone fragility by increasing collagen V synthesis and deposition and impairing collagen I fibril forming and assembling

O objetivo do atual trabalho, foi correlacionar os eventos celulares e teciduais com a expressão das proteínas VEGF, BMP-7, RANKL e OPG durante a osteogênese ectópica e ortotópica, induzida pela matriz óssea (MO) e dentinária (MD) alogênica. Matrizes alogênicas desmineralizada em HCl a 0,6N, obtidas de fêmur e incisivo de ratos, fori implantada entre as fáscias musculares da coxa e em defeito trans-ósseo de 8mm de diâmetro nos ossos parietais. As análises radiográfica e histomorfométrica da neoformação óssea e, a imunohistoquímica e o western blotting para as proteínas VEGF, BMP, RANKL e OPG, mostraram que: a) o volume da região do enxerto nos sítios ortotópicos reduziu 19% em 42 dias; b) em ambos tipos de enxerto e locais de implantação, ocorreu formação de tecido cartilaginoso e ósseo; c) nos sítios intramusculares, a reabsorção da matriz alogênica e a remodelação do tecido cartilaginoso, ósseo e medular foi mais acelerado, em relação a implantação ortotópico; d) o aumento na densidade de volume dos vasos sanguíneos e no número de osteoblastos/osteócitos e osteoclastos ocorreu simultaneamente e estava associado à maior reabsorção da matriz alogênica e à formação do tecido medular (hematopoiético); e) as proteínas VEGF, BMP-7, RANKL, OPG foram expressas em condrócitos, osteoblastos ativos, osteócitos recém aprisionados na matriz e em células estromais próximas aos osteoblastos ou às áreas da matriz alogênica reabsorvida; e f) a expressão das proteínas VEGF, BMP-7, RANKL e OPG foi maior no grupo MO. O pico de expressão dessas proteínas ocorreu nos períodos de 14 aos 21 dias no grupo da MO e 21 e 28 dias no grupo da MD. Concluímos que, a capacidade osteoindutora da matriz alogênica desmineralizada está relacionado a origem da matriz e ao sítio de implantação e que, as proteínas VEGF, BMP-7, RANKL e OPG estão associadas a maior reabsorção da matriz implantada, promovendo uma rápida e contínua liberação dos morfógenos contidos em seu interior que, induzem temporal e espacialmente a formação óssea/medular. / The aim of the present work was to correlate the cellular and tissue events with the expression of VEGF, BMP-7, RANKL and OPG during ectopic and orthotopic osteogenesis, induced by bone and dentin allogeneic matrix. Allogenic matrices obtained from femur and incisor of rats and demineralized in 0.6 N HCl were implanted into a intramuscular pocket and a 8mm-diameter bone defect in the skull. The radiographic and histomorphometric analysis of new bone formation, and immunohistochemistry and western blotting for VEGF, BMP, RANKL and OPG proteins, showed that: a) the total volume of the graft region in orthotopic site decreased 19% at 42 days b) in both graft types and implantation sites occurred formation of cartilaginous and bone tissues, c) in intramuscular sites, the resorption of allogenic matrix and remodeling of the new formed cartilage and bone were faster, in relation to orthotopic implantation sites; d) the increase in the volume density of blood vessels and in the number of osteoblasts/osteocytes and osteoclasts occurred simultaneously and was associated with greater reabsorption of the allogenic matrix and hematopoietic bone marrow formation; e) VEGF, BMP-7, RANKL, OPG proteins were expressed in chondrocytes, active osteoblasts, newly osteocytes confined and stromal cells located near the osteoblasts or in the surface of the reabsorbed matrix; and f) the VEGF, BMP-7, RANKL and OPG expression was higher in MO grafts than in the MD. The peak of expression of these proteins each occurred at 14 and 21 days in MO and 21 and 28 days in MD. We concluded that, the osteoinductive capacity of allogeneic demineralized matrix is related to matrix origin and implantation site and that the VEGF, BMP-7, RANKL and OPG proteins are associated with greater reabsorption of the implanted matrix, promoting rapid and continuous matrix-release morphogens that induces spatially and temporally the bone and bone marrow formation.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-27Bitstream added on 2014-06-13T21:02:12Z : No. of bitstreams: 1 salim_maa_dr_araca.pdf: 2801897 bytes, checksum: 99b625311eab55330261435209d48950 (MD5) / Este estudo teve como objetivo avaliar o reparo ósseo em defeitos periimplatares experimentais utilizando enxerto autógeno e implante de matriz óssea bovina desmineralizada em tíbias de coelhos. Foram instalados 30 implantes de titânio diâmetro de 3,75 mm plataforma regular (4,1 mm) e altura de 10 mm, no qual cada animal recebeu dois implantes na face lateral da porção mediana da tíbia. Ao redor dos implantes foi confeccionado defeito ósseo de 6,0 mm de diâmetro através da trefina e enxertado no local osso autógeno ou matriz óssea heterógena desmineralizada. As lâminas obtidas foram submetidas à análise histológica e histométrica com contagem das áreas de osso neoformado, matriz óssea bovina, medula e enxerto de osso autógeno. Como resultado observou-se diferença significativa entre a formação de novo osso no período de 15 dias quando comparado o grupo de implante de matriz óssea bovina desmineralizada e enxerto autógeno, demonstrando maior formação óssea neste último; e diferença significativa entre a permanência do tecido implantado em relação ao enxerto autógeno, demonstrado pela permanência da matriz no período de 60 dias. Avaliando os dados obtidos nesta pesquisa concluímos que o processo de reparo periimplantar ocorreu com maior neoformação óssea no grupo tratado por enxerto de osso autógeno e a matriz óssea bovina desmineralizada se comportou como um condutor ósseo de lenta absorção sem demonstrar reação inflamatória aguda ou crônica. / This study aimed to evaluate the bone healing in experimental periimplatar defects using autogenous graft and implantation of bovine demineralized bone matrix in the tibia of rabbits. Were installed 30 titanium implants of 3.75 mm diameter regular platform (4.1 mm) and height of 10 mm, in which each animal received two implants in the median portion of the tibial. Around the implants was made bone defect of 6.0 mm in diameter through the trephine and grafted in place autogenous bone or demineralized bone matrix heterogenous. The slides obtained were subjected to histological and histometric count with areas of newly formed bone, bovine bone matrix, bone marrow and bone graft. Results revealed a significant difference between the formation of new bone within 15 days when compared to the group of implant bovine demineralized bone matrix and autogenous graft, showing a higher bone formation in the latter, and a significant difference between the permanence of the implanted tissue in compared to autograft, demonstrated by the permanence of the matrix within 60 days. Evaluating the data obtained in this study concluded that the repair process was better in periimplant bone formation than in the group treated with autogenous bone graft and demineralized bovine bone matrix acted as a conductor low absorption without showing acute inflammatory reaction or chronic.

O objetivo do atual trabalho, foi correlacionar os eventos celulares e teciduais com a expressão das proteínas VEGF, BMP-7, RANKL e OPG durante a osteogênese ectópica e ortotópica, induzida pela matriz óssea (MO) e dentinária (MD) alogênica. Matrizes alogênicas desmineralizada em HCl a 0,6N, obtidas de fêmur e incisivo de ratos, fori implantada entre as fáscias musculares da coxa e em defeito trans-ósseo de 8mm de diâmetro nos ossos parietais. As análises radiográfica e histomorfométrica da neoformação óssea e, a imunohistoquímica e o western blotting para as proteínas VEGF, BMP, RANKL e OPG, mostraram que: a) o volume da região do enxerto nos sítios ortotópicos reduziu 19% em 42 dias; b) em ambos tipos de enxerto e locais de implantação, ocorreu formação de tecido cartilaginoso e ósseo; c) nos sítios intramusculares, a reabsorção da matriz alogênica e a remodelação do tecido cartilaginoso, ósseo e medular foi mais acelerado, em relação a implantação ortotópico; d) o aumento na densidade de volume dos vasos sanguíneos e no número de osteoblastos/osteócitos e osteoclastos ocorreu simultaneamente e estava associado à maior reabsorção da matriz alogênica e à formação do tecido medular (hematopoiético); e) as proteínas VEGF, BMP-7, RANKL, OPG foram expressas em condrócitos, osteoblastos ativos, osteócitos recém aprisionados na matriz e em células estromais próximas aos osteoblastos ou às áreas da matriz alogênica reabsorvida; e f) a expressão das proteínas VEGF, BMP-7, RANKL e OPG foi maior no grupo MO. O pico de expressão dessas proteínas ocorreu nos períodos de 14 aos 21 dias no grupo da MO e 21 e 28 dias no grupo da MD. Concluímos que, a capacidade osteoindutora da matriz alogênica desmineralizada está relacionado a origem da matriz e ao sítio de implantação e que, as proteínas VEGF, BMP-7, RANKL e OPG estão associadas a maior reabsorção da matriz implantada, promovendo uma rápida e contínua liberação dos morfógenos contidos em seu interior que, induzem temporal e espacialmente a formação óssea/medular. / The aim of the present work was to correlate the cellular and tissue events with the expression of VEGF, BMP-7, RANKL and OPG during ectopic and orthotopic osteogenesis, induced by bone and dentin allogeneic matrix. Allogenic matrices obtained from femur and incisor of rats and demineralized in 0.6 N HCl were implanted into a intramuscular pocket and a 8mm-diameter bone defect in the skull. The radiographic and histomorphometric analysis of new bone formation, and immunohistochemistry and western blotting for VEGF, BMP, RANKL and OPG proteins, showed that: a) the total volume of the graft region in orthotopic site decreased 19% at 42 days b) in both graft types and implantation sites occurred formation of cartilaginous and bone tissues, c) in intramuscular sites, the resorption of allogenic matrix and remodeling of the new formed cartilage and bone were faster, in relation to orthotopic implantation sites; d) the increase in the volume density of blood vessels and in the number of osteoblasts/osteocytes and osteoclasts occurred simultaneously and was associated with greater reabsorption of the allogenic matrix and hematopoietic bone marrow formation; e) VEGF, BMP-7, RANKL, OPG proteins were expressed in chondrocytes, active osteoblasts, newly osteocytes confined and stromal cells located near the osteoblasts or in the surface of the reabsorbed matrix; and f) the VEGF, BMP-7, RANKL and OPG expression was higher in MO grafts than in the MD. The peak of expression of these proteins each occurred at 14 and 21 days in MO and 21 and 28 days in MD. We concluded that, the osteoinductive capacity of allogeneic demineralized matrix is related to matrix origin and implantation site and that the VEGF, BMP-7, RANKL and OPG proteins are associated with greater reabsorption of the implanted matrix, promoting rapid and continuous matrix-release morphogens that induces spatially and temporally the bone and bone marrow formation.

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A reparação de defeitos ósseos é uma preocupação constante em diversas áreas da odontologia. Vários materiais são usados com a finalidade de ajudar e acelerar esta reparação, tais como enxertos autógenos, xenógenos, membranas e alguns medicamentos, assim como a associação de alguns destes métodos. A sinvastatina, medicamento utilizado para redução de colesterol, em alguns estudos, tem demonstrado ação na estimulação de formação óssea. O objetivo do presente estudo foi avaliar a influência da associação da sinvastatina à matriz desmineralizada de osso bovino na reparação de defeitos ósseos em calvária de ratos. Foram confeccionados defeitos ósseos na calvária de 48 ratos, sendo um defeito 5mm de diâmetro em cada parietal do animal. Os ratos foram divididos em três grupos de acordo com o material utilizado: grupo controle, que não recebeu nenhum tipo de substância, grupo sinvastatina-matriz óssea desmineralizada, que recebeu uma associação de sinvastatina e matriz desmineralizada de osso bovino e grupo matriz óssea desmineralizada que recebeu somente matriz desmineralizada de osso bovino como material de enxertia. Os sacrifícios foram realizados após trinta e sessenta dias. Após o sacrifício as calvárias foram radiografadas em aparelho de raios-X digital para análise de densidade radiográfica em tons de cinza e foram submetidas à preparação histológica de rotina, para posterior análise histológica descritiva e histométrica da área de matriz óssea neoformada, utilizando-se programa computacional para análise de imagens. Os dados submetidos à analise estatística ANOVA a 5% demonstraram que os animais que receberam a associação de sinvastatina-MODB apresentaram, na análise histométrica a menor área de neoformação e na análise radiográfica a menor densidade óssea. Concluiu-se, de acordo com a metodologia utilizada, que a associação sinvastatina-MODB influenciou negativamente o reparo ósseo. / Bone defect healing is a constant concern to several areas of Dentistry. A great variety of materials is currently used to help in the healing process as well as to speed it up. Materials such as autografts, xenografts, membranes, some drugs, and the association of some of them are being used. Simvastatin, a substance used to reduce cholesterol levels, has shown, in some studies, a capacity to stimulate bone formation. The purpose of the present experimental study is to evaluate the influence of the association of sinmvastatin with bovine demineralized bone matrix on the healing of bone defects in rats calvariae. Bone defects were produced in the calvariae of 48 rats, thus each animal had a defect in each parietal bone measuring 5mm of diameter. The rats were grouped according to the graft material used: the control group which didnt receive any substance; the simvastatin-demineralized bone matrix group which received an association of simvastatin and bovine demineralized bone matrix; and the demineralized bone matrix group which received bovine demineralized bone matrix. The animals were sacrificed after thirty or sixty days. After the sacrifices, digital radiographies were taken of the calvariae in order to analyse the radiographic density in shades of gray. They were also submitted to routine histological preparation for future descriptive histological and histomorfometric analyses of the new formed bone matrix through the use of a software to analyse the images. The data submitted to statistical analysis ANOVA (5%) showed that the animals which received the association simvastatin-demineralized bone matrix presented the smallest density and area of new bone formation of the three groups. According to the methodology used, we concluded that the association simvastatin demineralized bone matrix influenced negatively the bone healing.

The osteocytes are the most abundant and longest living bone cells, embedded in the bone matrix. They are interconnected with each other through dendrites, located in slender canals called canaliculi. The osteocyte lacunae, cavities in which the cells are located, together with the canaliculi form a communication network throughout the bone matrix, permitting transport of nutrients, waste and signals. These cells were firstly considered passive, but lately it has become increasingly clear their role as mechanosensory cells and orchestrators of bone remodeling. Despite recent advances in imaging techniques, none of the available methods can provide an adequate 3D assessment of the lacuno-canalicular network (LCN). The aims of this thesis were to achieve 3D imaging of the LCN with synchrotron radiation X-ray computed tomography (SR-CT) and to develop tools for 3D detection and segmentation of this cell network, leading towards automatic quantification of this structure. We demonstrate the feasibility of parallel beam SR-CT to image in 3D the LCN (voxel~300 nm). This technique can provide data on both the morphology of the cell network and the composition of the bone matrix. Compared to the other 3D imaging methods, this enables imaging of tissue covering a number of cell lacunae three orders of magnitude greater, in a simpler and faster way. This makes possible the study of sets of specimens in order to reach biomedical conclusions. Furthermore, we propose the use of divergent holotomography, to image the ultrastructure of bone tissue (voxel~60 nm). The image reconstruction provides phase maps, obtained after the application of a suitable phase retrieval algorithm. This technique permits assessment of the cell network with higher accuracy and it enables the 3D organization of collagen fibres organization in the bone matrix, to be visualized for the first time. In order to obtain quantitative parameters on the geometry of the cell network, this has to be segmented. Due to the limitations in spatial resolution, canaliculi appear as 3D tube-like structures measuring only 1-3 voxels in diameter. This, combined with the noise, the low contrast and the large size of each image (8 GB), makes the segmentation a difficult task. We propose an image enhancement method, based on a 3D line filter combined with bilateral filtering. This enables improvement in canaliculi detection, reduction of the background noise and cell lacunae preservation. For the image segmentation we developed a method based on variational region growing. We propose two expressions for energy functionals to minimize in order to detect the desired structure, based on the 3D line filter map and the original image. Preliminary quantitative results on human femoral samples are obtained based on connected components analysis and a few observations related to the bone cell network and its relation with the bone matrix are presented.

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