Made available in DSpace on 2016-08-10T10:55:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernanda de Oliveira Feitosa de Castro.pdf: 485024 bytes, checksum: 876ee7e1b14c3a6b20a7d9aef9cbe13a (MD5) Previous issue date: 2011-02-25 / Snake s venoms are complexes mixtures of proteins and peptides, aminoacids, nucleotides, lipids and carbohydrates, that showes importants biologicals activities like cytotoxicity, neurotoxicity, systemic myolysis, cardiotoxicity, kidney damage, hematologic disorders, like others. These molecules has shown pharmacological potential components with potent action against bacterias, virus and fungis. This present work aimed assed no cytotoxic effect of the crude venom of the snake Bothrops pauloensis in the culture of peripheral blood mononuclear cells (PBMC). After standardization of obtaining PBMC and evaluation of ideal concentration of fitohemagglutinin (PHA) and interleukin-2 (IL-2) for the cell culture was performed the evaluation of no citotoxic effect on CMN by different doses of crude venom of Bothrops pauloensis. The CMN was separated by density gradient, posterior being cultured. The evaluation of the no cytotoxic activity of the venom was performer by the visualization of the plate after 24, 48 and 72 hours. The concentration 0,05 mg/ml did not appear citotoxic activity, suggesting the possibility of using in testing with CMN infected by viruses, bacteria and fungi. / Os venenos de serpentes são misturas complexas compostas por proteínas e peptídeos, aminoácidos, nucleotídeos, lipídios e carboidratos que apresentam importantes atividades biológicas como citotoxicidade, neurotoxicidade, miólise sistêmica, cardiotoxicidade, danos renais, desordens hematológicas entre outras. Essas moléculas têm-se mostrado como potenciais componentes farmacológicos com potente ação contra a atividade de bactérias, vírus e fungos. O presente trabalho visou avaliar a atividade não citotóxica do veneno bruto da cobra Bothrops pauloensis em células mononucleares (CMN) do sangue periférico humano. Após a padronização da obtenção de CMN do sangue periférico e da concentração ideal de fitohemaglutinina(PHA) e interleucina-2 (IL- 2) para cultivo celular, foi realizada a avaliação do efeito não citotóxico de diferentes concentrações do veneno bruto da Bothrops pauloensis no cultivo celular. As células mononucleares do sangue periférico foram separadas por meio gradiente de densidade e cultivadas em meio de cultura. A avaliação da atividade citotóxica do veneno foi realizada pela visualização da placa após 24, 48 e 72 horas. A concentração 0,05 μg/ml não apresentou atividade citotóxica, sugerindo a possibilidade de utilização em ensaio com CMN infectadas por vírus, bactérias e fungos.

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Resumo: As fosfolipases A2-like (PLA2s-like) estão entre os principais componentes de peçonhas de serpentes envolvidas no processo de envenenamento, particularmente em serpentes do gênero Bothrops. Essas toxinas promovem efeitos miotóxicos que não são neutralizados pela soroterapia convencional e podem levar até a perda do membro afetado. Os estudos estruturais, em especial a técnica de cristalografia, são uma ferramenta poderosa na compreensão da relação estrutura-função de moléculas. O presente trabalho teve por objetivo estudar estruturalmente por diferentes técnicas biofísicas (dicroísmo circular, espalhamento de luz dinâmico, Espectroscopia de fluorescência, termoforese de microescala, cristalização, coleta de dados de difração de raios-X, elucidação e análise estrutural) uma Lys-49-PLA2 da peçonha de Bothrops pauloensis, denominada BnSP-7, em suas formas nativa e complexadas com o ácido cinâmico e seus derivados, ácido cafeico e ácido p-cumárico. Adicionalmente, a mesma proteína foi estudada em sua forma recombinante. A ORF referente à BnSP-7 foi inserida no vetor a partir dos sítios de restrição EcoRI (3’ DNA) e NotI (5’ DNA). Esse inserto foi inserido em um vetor pPicZA, transformado em Pichia pastoris e induzida a expressão. Após purificação da proteína expressa, foram realizados ensaios de cristalização. Nas estruturas da BnSP-7 obtida a partir do veneno de B. pauloensis, foram encontrados ligantes na região MDoS nos três complexos elucidados, bem como a análise dos túnei... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Submitted by LINO FERNANDO GOMES DE LIMA (linofernando@ibb.unesp.br) on 2017-10-12T13:07:03Z No. of bitstreams: 1 TESE_DOUTORADO_LINO_FINAL_CORREÇÕES_BANCA.pdf: 7596280 bytes, checksum: daa6099c657cb8875c1dc696f2b54217 (MD5) / Approved for entry into archive by Monique Sasaki (sayumi_sasaki@hotmail.com) on 2017-10-18T16:34:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lima_lfg_dr_bot.pdf: 7596280 bytes, checksum: daa6099c657cb8875c1dc696f2b54217 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-18T16:34:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lima_lfg_dr_bot.pdf: 7596280 bytes, checksum: daa6099c657cb8875c1dc696f2b54217 (MD5) Previous issue date: 2017-08-22 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / As fosfolipases A2-like (PLA2s-like) estão entre os principais componentes de peçonhas de serpentes envolvidas no processo de envenenamento, particularmente em serpentes do gênero Bothrops. Essas toxinas promovem efeitos miotóxicos que não são neutralizados pela soroterapia convencional e podem levar até a perda do membro afetado. Os estudos estruturais, em especial a técnica de cristalografia, são uma ferramenta poderosa na compreensão da relação estrutura-função de moléculas. O presente trabalho teve por objetivo estudar estruturalmente por diferentes técnicas biofísicas (dicroísmo circular, espalhamento de luz dinâmico, Espectroscopia de fluorescência, termoforese de microescala, cristalização, coleta de dados de difração de raios-X, elucidação e análise estrutural) uma Lys-49-PLA2 da peçonha de Bothrops pauloensis, denominada BnSP-7, em suas formas nativa e complexadas com o ácido cinâmico e seus derivados, ácido cafeico e ácido p-cumárico. Adicionalmente, a mesma proteína foi estudada em sua forma recombinante. A ORF referente à BnSP-7 foi inserida no vetor a partir dos sítios de restrição EcoRI (3’ DNA) e NotI (5’ DNA). Esse inserto foi inserido em um vetor pPicZA, transformado em Pichia pastoris e induzida a expressão. Após purificação da proteína expressa, foram realizados ensaios de cristalização. Nas estruturas da BnSP-7 obtida a partir do veneno de B. pauloensis, foram encontrados ligantes na região MDoS nos três complexos elucidados, bem como a análise dos túneis revelou diferenças nas cargas positivas da BnSP-7 em comparação com outras miotoxinas. Os experimentos de termoferese revelaram que os três ligantes se ligaram à BnSP-7 com afinidades variando de 20-300 µM, sendo que a maior afinidade foi observada para o ácido cafeico, seguido pelo ácido p-cumárico e pelo ácido cinâmico. Estes dados estão de acordo com o número de interações eletrostáticas observadas nas estruturas cristalográficas. Esses resultados reforçam a importância da região MDoS no mecanismo de ação miotóxica dessas proteínas, além de fornecer dados estruturais para o desenvolvimento de inibidores mais efetivos contra os efeitos locais do acidente ofídico, não eficientemente tratado pela soroterapia convencional. / Phospholipases A2-like (PLA2-like) toxins are among the main components of snake venoms involved in the envenomation process, particularly in snakes from Bothrops genus. These toxins promote myotoxic effects that aren't neutralized by conventional serum therapy and may lead to loss of the affected limb. Structural studies, especially the crystallography technique, are powerful tools for understanding of the structure-function relationship of molecules. The aim of this work was structurally study by different biophysical techniques (circular dichroism, dynamic light scattering, fluorescence spectroscopy, microscale thermophoresis, crystallization, X-ray diffraction data, elucidation and structural analysis) a Lys-49-PLA2 of Bothrops pauloensis venom, named BnSP-7, in native form and complexed to cinnamic acid and its derivatives caffeic acid and p-coumaric acid. BnSP-7 ORF was inserted into the vector EcoRI (3 'DNA) and NotI (5' DNA) restriction sites. This insert was inserted into pPicZA vector, transformed into Pichia pastoris and induced the expression. After purification of the expressed protein, crystallization assays were performed. BnSP-7 structures complexed to the ligands were performed using B. pauloensis venom which these molecules were found interacting to MDoS region for the three complexes. Furthermore, tunnel analyses revealed differences in the positive charges of BnSP-7 compared to other myotoxins which may be related to the specificity of this toxin. Thermophesis experiments revealed that all three ligands bound to BnSP-7 with affinities ranging from 20-300 μM, in which the highest affinity was observed for caffeic acid, followed by the p-coumaric acid and by cinnamic acid. These data are in agreement with the observed number of electrostatic interactions observed in crystallographic structures. These results consolidate the importance of the MDoS region as a mechanism of myotoxic action of these proteins, in addition to providing structural data for the more effective inhibitors development against the local effects of the snakebite, not efficiently neutralized by conventional serum therapy. / CNPq: 140501/2014-2

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / CHAPTER II: Toxoplasmosis affects a third of world population with high incidence in tropical areas. Since this disease has great relevance in health public, the search for new therapeutic approaches has been considered. Here, we report the antiparasitic effects of BnSP-­7 toxin, a Lys49 phospholipase A2 homologue from Bothrops pauloensis snake venom, on Toxoplasma gondii. BnSP-­7 presented activity against HeLa host cells in higher doses (200 μg/mL to 50 μg/mL) by MTT assay, whereas in lower doses (25 μg/mL to 1.56 μg/mL) does not interfere with HeLa viability. Also, the toxin did not presented effects on T. gondii tachyzoite viability as carried out by trypan blue exclusion, but decreased both adhesion and parasite proliferation, when tachyzoites were treated before infection. We also performed cytokine measurements from supernatants collected from HeLa cells infected with T. gondii tachyzoites previously treated with RPMI or BnSP-­7. MIF and IL-­6 productions by HeLa cells were increased by BnSP-­7 treatment. These data suggest that the BnSP-­7 toxin is an important tool for the discovery of new parasite targets that can be exploited to develop new drugs for toxoplasmosis treatment. / CAPÍTULO II: A toxoplasmose afeta um terço da população mundial com alta incidência em áreas tropicais. Uma vez que esta doença tem grande relevância na saúde pública, a busca por novas abordagens terapêuticas são constantemente exigidas. Neste trabalho nós relatamos os efeitos antiparasitários da toxina BnSP-­7, uma fosfolipase A2 Lys49 homóloga da peçonha de Bothrops pauloensis, em Toxoplasma gondii. BnSP-­7 apresentou citotoxicidade contra células HeLa em doses mais elevadas (200 μg/mL a 50 ug/ ml), enquanto que em doses mais baixas (25 ug/ml a 1,56 ug/ml), a toxina não interferiu na viabilidade da HeLa. A toxina não alterou a viabilidade de formas taquizotas de T. gondii, realizado pelo ensaio de exclusão de azul de tripan, mas diminuiu tanto a adesão quanto à proliferação desses parasitas, quando foram tratados antes da infecção. Também foi realizado a dosagem de citocinas a partir de sobrenadantes recolhidos a partir de células HeLa infectadas com formas taquizoítas de T. gondii previamente tratados com meio RPMI ou BnSP-­7. A produção de MIF e IL-­6 foram aumentadas pelas células HeLa após o tratamento com BnSP-­7. Estes dados sugerem que a toxina BnSP-­7 é uma ferramenta importante para a descoberta de novos alvos de parasitas que podem ser explorados para desenvolver novos fármacos para o tratamento da toxoplasmose. / Mestre em Genética e Bioquímica

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CHAPTER II: The snake venom is composed by a diversity of biomolecules with many actions on physiological processes. The serine peptidases are a group of proteases present in the constitution of the venom, capable of interfering on several points of hemostasis. Some serine peptidases has thrombin-like activity, what makes them targets on the development of therapeutics agentes on the treatment of many hemostatic disorders. In this study, a recombinant thrombin-like serine peptidase called rBpSP-II was obtained from the cDNA of the venom gland of the snake Bothrops pauloensis and biochemically characterized. The cDNA correspondent to rBpSP-II was cloned on the pPICZαA vector and inserted on the methylotrophic yeast Pichia pastoris KM71H for the heterologous expression. This enzyme showed single band when analised on SDS-PAGE with approximated molecular mass of 44,5 kDa under reducing conditions. The enzyme rBpSP-II showed clotting activity on bovine plasma and proteolytic activity on fibrinogen, cleaving exclusively the Aα chain. The evaluation of rBpSP-II activity on chromogenic substrates showed that the enzyme has thrombin-like activity due to its capacity to hydrolyze the thrombin substrate. / CAPÍTULO II: A peçonha de serpente é composta por uma diversidade de biomoléculas com inúmeras ações sobre os processos fisiológicos. As serinoproteases são um grupo de proteases presentes na constituição da peçonha, capazes de interferir em diversos pontos da hemostasia. Algumas serinoproteases possuem atividade semelhante à trombina, o que as tornam alvos de interesse no desenvolvimento de agentes terapêuticos no tratamento de desordens hemostáticas. Neste estudo, uma serinoprotease thrombin-like recombinante denominada rBpSP-II foi obtida a partir do cDNA da glândula da peçonha da serpente Bothrops pauloensis e caracterizada bioquimicamente. O cDNA correspondente à rBpSP-II foi clonado no vetor pPICZαA e inserido na levedura metilotrófica Pichia pastoris KM71H para a realização da expressão heteróloga. Esta enzima apresentou banda única quando analisada em SDS-PAGE com massa molecular aproximada de 44.5 kDa sob condições redutoras. A rBpSP-II apresentou atividade coagulante sobre plasma bovino e atividade proteolítica sobre o fibrinogênio, clivando preferencialmente a cadeia Aα. A avaliação da atividade da rBpSP-II sobre substratos cromogênicos demonstrou que a enzima possui atividade thrombin-like devido a sua capacidade de hidrolisar o substrato da trombina. / Mestre em Genética e Bioquímica

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Proteases are enzymes widely found in all five life being kingdoms. These proteolytic enzymes have been studied and can be used as therapeutic tools due to their actions on physiopathologic events. Metalloproteinase are hydrolytic zinc-binding dependent enzymes which interfere in physiological processes. Snake venom metalloproteinase are widely studied animal toxins. They are divided into classes (PI, PII and PIII) and PI metalloproteinase are composed of a pro-domain and a catalytic domain in its structure. In the present work, we demonstrated the biochemical and functional characteristics of a PI- metalloproteinase (BpMP-II) isolated from B. pauloensis venom. BpMP-II was purified in three chromatography steps on cation exchange resin CM-Sepharose Fast flow, filtration Sephacryl S-300 and anion exchange Capto-Q. The isolated enzyme was homogeneous on SDS-PAGE under reduction and non-reduction conditions, with a molecular weight of 23kDa determined by MALDI-TOF mass spectrometry. The isoeletric focalization demonstrated a slight acid pI (6,1) of BpMP-II. The partial sequence of protein was determined by MS/MS (MALDI-TOF/TOF) and showed high structural similarity with others SVMPs as well as a significant score match. BpMP-II showed high proteolytic activity upon azocasein and bovine fibrinogen and was inhibited by EDTA, 1,10 phenantroline and β-mercaptoethanol. Moreover, this enzyme showed stability at neutral and alkaline pH and it was inactivated at temperatures higher than 60oC. Concentrations higher than 20μg of BpMP-II was able to decrease tEnd cells viability. A slight increase in creatine kinase (CK) levels was noticed when BpMP-II was administrated an intramuscular route on mice. Therefore, the present work permitted the identification and characterization of a molecule with great therapeutic potential. / Proteases são enzimas abundantemente encontradas em todos os cinco grandes reinos de seres vivos. Essas enzimas proteolíticas provenientes da natureza têm sido alvos de estudos com a finalidade de buscar ferramentas de uso terapêutico por atuarem em diversos processos fisiopatológicos. Metaloproteases são enzimas proteolíticas da classe das hidrolases que dependem da ligação de um metal em seu sítio ativo (geralmente o zinco) para exercer suas atividades. Essas enzimas participam de diversos eventos fisiológicos e patológicos. As metaloproteases de peçonha de serpentes (SVMPs) estão entre as toxinas animais mais estudadas. Elas são divididas em classes (PI, PII e PIII) de acordo com a composição estrutural e a presença de domínios. As metaloproteases da classe PI contêm um pró-domínio e o domínio catalítico em sua estrutura. No presente trabalho, nós descrevemos as características bioquímicas e funcionais de uma metaloprotease da classe PI denominada Bothrops pauloensis Metalloproteinase-II (BpMP-II), isolada da peçonha da serpente Bothrops pauloensis. BpMP-II foi purificada utilizando-se três passos cromatográficos em resinas de troca catiônica CM-Sepharose Fast Flow, coluna de gel filtração Sephacryl S-300 e resina de troca aniônica HisTrap Capto-Q. A enzima isolada apresentou-se homogênea em eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12,5% sob condições redutoras e não-redutoras, com uma massa molecular de 23kDa determinada por espectrometria de massas MALDI-TOF. O ensaio de focalização isoelétrica resultou em um pI levemente ácido de 6,1 para a BpMP-II. A sequência parcial da proteína determinada por MS/MS (MALDI TOF/TOF) apresentou alta similaridade estrutural com outras SVMPs com score bastante significativo. BpMP-II mostrou alta atividade proteolítica sobre azocaseína sob diferentes condições experimentais e sobre o fibrinogênio bovino com variação de dose, pH. BpMP-II foi inibida por EDTA, 1,10 fenantrolina (agentes quelantes) e β-mercaptoetanol (agente redutor ligação S-S). Além disso, esta protease apresentou estabilidade em pH neutro ou alcalino e foi inativada em temperaturas elevadas (60ºC). BpMP-II mostrou ser citotóxica para células tEnd em concentrações acima de 20μg/μL. Um leve aumento nos níveis de creatina quinase (CK) foi observado quando injetada intramuscularmente em camundongos. Assim, o presente trabalho permitiu identificar e caracterizar uma molécula com grande potencial de aplicação terapêutica. / Mestre em Genética e Bioquímica