ARAGÃO, Janisi Sales. Aspectos ecotoxicológicos relacionados à carcinicultura marinha. 2012. 138 f. : Tese (doutorado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Engenharia de Pesca, Fortaleza-CE, 2012 / Submitted by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-07-26T15:05:27Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_jsaragão.pdf: 1589132 bytes, checksum: a1ac0fd409cb94137f61baa73b6571b7 (MD5) / Approved for entry into archive by Nádja Goes (nmoraissoares@gmail.com) on 2016-07-26T15:05:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_jsaragão.pdf: 1589132 bytes, checksum: a1ac0fd409cb94137f61baa73b6571b7 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-26T15:05:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_jsaragão.pdf: 1589132 bytes, checksum: a1ac0fd409cb94137f61baa73b6571b7 (MD5) Previous issue date: 2012 / Farming of shrimp is an important economic activity; however, its exponential growth has attracted attention to the potential impacts brought over the environment. Wastewater generated by this activity can contribute to the eutrophication of waters receiving these effluents, as those may bear a variety of contaminants, such as sodium metabisulfite, a sulphitant agent that removes the oxygen from water and food. Additionally, this effluent carries the phytoplankton community that proliferates in these systems, which may include toxic cyanobacteria. Therefore, the aim of the present study was to perform an ecotoxicological assessment using biological test models and biological responses to evaluate potential impacts caused by use of sodium metabisulfite and by the proliferation of cyanobacteria in shrimp farming. Phytoplankton samples were collected in three shrimp farms from the state of Ceará for quantitative and qualitative analysis and for the isolation of cyanobacteria. The microorganisms, which were identified by morphological and molecular techniques, were grown in laboratory to o btain organic extracts on which were conducted toxicity tests with mice and mysids. Sodium metabisulfite was evaluated through acutetoxicity tests using organisms at different trophic levels (microalgae, cladocerans, shrimps and fish) and by the rate of oxygen consumption and enzymatic activities (CAT,AChE and GST) in shrimps. On fish, tests evaluating the embriolarval development and enzymatic activities (AChE and GST) were performed. Qualitative and quantitative analysis of phytoplankton community showed a large number of species from nearly all classes of phytoplankton, including cyanobacteria. From this latter group, Synechococcus sp. was isolated and cultivated, and the extract generated from the living cells showed toxicity in mice, as evidenced by damage to the liver and kidneys of animals. For acute toxicity tests sodium metabisulphite showed an EC 50 of 24.29 mg/L for the microalgae and LC 50 of 34.90 mg/L and 69.65 mg/L for cladocer ans and shrimp, respectively. Regarding the consumption of oxygen and enzymatic activities, these did not show significant differences when compared to their respective controls, except for the AChE in shrimp and GST in fish. On embriolarval developing of fish, sodium metabisulfite caused different types of effects, from destruction of eggs to deformities in larvae. Thus, these results show that sodium metabisulphite and the cyanobacteria Synechococcus sp. are toxic to other organisms, evidenced by both, acute and chronic toxicity / Apesar do cultivo de camarão ser uma importante atividade econômica, o seu crescimento tem atraído a atenção para os possíveis impactos ao meio ambiente. As águas residuais geradas pelos cultivos podem contribuir para a eutrofização das águas receptoras desses efluentes, já que possuem uma ampla variedade de substâncias consideradas contaminantes potenciais, como o metabissulfito de sódio, um agente sulfitante que retira o oxigênio da água e de alimentos. Além disso, os efluentes carreiam a comunidade fitoplanctônica que prolifera nos sistemas de cultivo, incluindo cianobactérias produtoras de toxinas. Com isso o objetivo desse estudo foi uma avaliação ecotoxicológica utilizando diferentes organismos testes e respostas biológicas dos possíveis impactos causados pelo uso do metabissulfito de sódio ou pela proliferação de cianobactérias coletadas nos próprios cultivos. Amostras do fitoplâncton foram coletadas em três fazendas do estado do Ceará para análise qualitativa, quantitativa e para o isolamento das cianobactérias. Estes organismos foram identificados através de técnicas morfológicas e de biologia molecular, cultivados no laboratório para obtenção dos extratos e realizados ensaios com camundongos e misidáceos. O metabissulfito de sódio teve sua toxicidade avaliada por meio de ensaios agudos em diferentes níveis tróficos (microalgas, cladóceros, camarões e peixes), mas também pela taxa do consumo de oxigênio e das atividades enzimáticas (CAT; AChE e GST) em camarões. Para os peixes, foram realizados ainda ensaios com o desenvolvimento embriolarval e das atividades enzimáticas (AChE e GST). A análise qualitativa e quantitativa da comunidade fitoplanctônica mostrou um grande número de espécies de quase todas as classes do fitoplâncton, inclusive cianobactérias. Deste último grupo foi isolada e cultivada Synechococcus sp., para a qual o extrato e as células vivas mostraram toxicidade em camundongos evidenciada por danos observados no fígado e rins dos animais. Já na avaliação da toxicidade do metabissulfito de sódio, este apresentou toxicidade aguda para os organismos testes, apresentando uma EC50 de 24,29 mg/L para as microalgas, CL50 de 34,90 mg/L e 69,65 mg/L para cladóceros e camarões, respectivamente. Em relação ao consumo de oxigênio e atividades enzimáticas, estes não apresentaram diferenças significativas quando comparados aos controles, com exceção para a AChE nos camarões e GST nos peixes. No desenvolvimento embriolarval dos peixes, o metabissulfito de sódio causou diferentes tipos de efeitos desde a destruição dos ovos à deformidades nas larvas. Sendo assim, esses resultados mostram que o metabissulfito de sódio e a cianobactéria Synechococcus sp. são tóxicos para diferentes organismos, evidenciados tanto pela toxicidade aguda quanto pela crônica.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Proteases are enzymes widely found in all five life being kingdoms. These proteolytic enzymes have been studied and can be used as therapeutic tools due to their actions on physiopathologic events. Metalloproteinase are hydrolytic zinc-binding dependent enzymes which interfere in physiological processes. Snake venom metalloproteinase are widely studied animal toxins. They are divided into classes (PI, PII and PIII) and PI metalloproteinase are composed of a pro-domain and a catalytic domain in its structure. In the present work, we demonstrated the biochemical and functional characteristics of a PI- metalloproteinase (BpMP-II) isolated from B. pauloensis venom. BpMP-II was purified in three chromatography steps on cation exchange resin CM-Sepharose Fast flow, filtration Sephacryl S-300 and anion exchange Capto-Q. The isolated enzyme was homogeneous on SDS-PAGE under reduction and non-reduction conditions, with a molecular weight of 23kDa determined by MALDI-TOF mass spectrometry. The isoeletric focalization demonstrated a slight acid pI (6,1) of BpMP-II. The partial sequence of protein was determined by MS/MS (MALDI-TOF/TOF) and showed high structural similarity with others SVMPs as well as a significant score match. BpMP-II showed high proteolytic activity upon azocasein and bovine fibrinogen and was inhibited by EDTA, 1,10 phenantroline and β-mercaptoethanol. Moreover, this enzyme showed stability at neutral and alkaline pH and it was inactivated at temperatures higher than 60oC. Concentrations higher than 20μg of BpMP-II was able to decrease tEnd cells viability. A slight increase in creatine kinase (CK) levels was noticed when BpMP-II was administrated an intramuscular route on mice. Therefore, the present work permitted the identification and characterization of a molecule with great therapeutic potential. / Proteases são enzimas abundantemente encontradas em todos os cinco grandes reinos de seres vivos. Essas enzimas proteolíticas provenientes da natureza têm sido alvos de estudos com a finalidade de buscar ferramentas de uso terapêutico por atuarem em diversos processos fisiopatológicos. Metaloproteases são enzimas proteolíticas da classe das hidrolases que dependem da ligação de um metal em seu sítio ativo (geralmente o zinco) para exercer suas atividades. Essas enzimas participam de diversos eventos fisiológicos e patológicos. As metaloproteases de peçonha de serpentes (SVMPs) estão entre as toxinas animais mais estudadas. Elas são divididas em classes (PI, PII e PIII) de acordo com a composição estrutural e a presença de domínios. As metaloproteases da classe PI contêm um pró-domínio e o domínio catalítico em sua estrutura. No presente trabalho, nós descrevemos as características bioquímicas e funcionais de uma metaloprotease da classe PI denominada Bothrops pauloensis Metalloproteinase-II (BpMP-II), isolada da peçonha da serpente Bothrops pauloensis. BpMP-II foi purificada utilizando-se três passos cromatográficos em resinas de troca catiônica CM-Sepharose Fast Flow, coluna de gel filtração Sephacryl S-300 e resina de troca aniônica HisTrap Capto-Q. A enzima isolada apresentou-se homogênea em eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE 12,5% sob condições redutoras e não-redutoras, com uma massa molecular de 23kDa determinada por espectrometria de massas MALDI-TOF. O ensaio de focalização isoelétrica resultou em um pI levemente ácido de 6,1 para a BpMP-II. A sequência parcial da proteína determinada por MS/MS (MALDI TOF/TOF) apresentou alta similaridade estrutural com outras SVMPs com score bastante significativo. BpMP-II mostrou alta atividade proteolítica sobre azocaseína sob diferentes condições experimentais e sobre o fibrinogênio bovino com variação de dose, pH. BpMP-II foi inibida por EDTA, 1,10 fenantrolina (agentes quelantes) e β-mercaptoetanol (agente redutor ligação S-S). Além disso, esta protease apresentou estabilidade em pH neutro ou alcalino e foi inativada em temperaturas elevadas (60ºC). BpMP-II mostrou ser citotóxica para células tEnd em concentrações acima de 20μg/μL. Um leve aumento nos níveis de creatina quinase (CK) foi observado quando injetada intramuscularmente em camundongos. Assim, o presente trabalho permitiu identificar e caracterizar uma molécula com grande potencial de aplicação terapêutica. / Mestre em Genética e Bioquímica