Acidentes com animais venenosos constituem um problema de saúde pública negligenciado em todo o mundo. Estimativas indicam que, considerando-se apenas acidentes com serpentes venenosas, ocorram mundialmente cerca de 2,5 milhões de casos, causando 85.000 óbitos anuais. O desenvolvimento do quadro patológico dos envenenamentos é o resultado conjunto de potentes atividades biológicas exercidas, principalmente, por proteínas e peptídeos que compõem os venenos animais. A proteômica aplicada à caracterização de componentes de venenos animais, denominada venômica, é uma metodologia essencial na identificação não apenas dos componentes tóxicos, mas também valiosa na investigação molecular dos mecanismos patológicos dos envenenamentos. Através de metodologias proteômicas, descrevemos a caracterização protéica dos venenos animais das serpentes Bothrops jararaca e Bothrops lanceolatus e da lagarta Lonomia obliqua. Ainda, avaliamos através da proteômica de tecido experimentalmente envenenado as ações tóxicas de um componente isolado do veneno de Bothrops jararaca. Através de análise comparativa e semi-quantitativa da composição protéica dos venenos de B. jararaca e B. lanceolatus, descrevemos uma diferença qualitativa na distribuição dos componentes tóxicos. Enfatizando o grupo protéico majoritário, metaloproteases (SVMP), descrevemos diferentes abundâncias relativas entre os subtipos destas enzimas. Esta diferença explicaria as repercussões clínicas opostas durante o envenenamento humano, sendo um veneno hemorrágico e o outro prótrombótico. Componentes tóxicos capazes de gerar um quadro hemorrágico também foram avaliados através da análise proteômica das secreções tóxicas de L. obliqua. O estudo comparativo entre hemolinfa e extrato de espículas demonstrou que, diferentemente dos venenos botrópicos, as secreções tóxicas são compostas majoritariamente de inibidores de proteases, predominantemente serpinas. Além disso, descrevemos pela primeira vez a presença de novos componentes potencialmente tóxicos, como metaloproteases. Por fim, a proteômica de tecidos foi aplicada à investigação dos efeitos locais da injeção da metaloprotease do veneno de B. jararaca, jararagina. O efeito direto da ação da metaloprotease foi observado através da identificação de proteínas presentes em maior ou menor abundância, denotando infiltração ou degradação, respectivamente. Hemorragia, edema e estresse oxidativo foram evidenciados por pronunciado aumento em proteínas envolvidas nesses processos, mas, acima de tudo, identificamos degradação de proteínas relacionadas à manutenção da integridade da matriz extracelular e estabilização de coágulos, sugerindo novos mecanismos relacionados à atividade tóxica a serem investigados. De uma maneira geral, o presente trabalho descreve componentes tóxicos de venenos animais causadores de síndromes hemorrágicas e gera novas hipóteses em relação a mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento da patofisiologia dos envenenamentos. / Accidents with venomous animals are a neglected health issue worldwide. Global estimates points to the occurrence of 2,500,000 envenomation cases, causing 85,000 deaths per year. The pathological envenomation condition is a result of strong biological activities caused mainly by the action of venom's proteins and peptides components. Proteomics applied to the characterization of animal venom active principles, so called venomics, is an essential tool to the identification of toxic molecules as well as to help understanding the molecular mechanisms underlying pathological envenomation conditions. Through a proteomic methodology, here we describe the characterization of venoms from the snakes Bothrops jararaca and Bothrops lanceolatus and the caterpillar Lonomia obliqua. Moreover, from a tissue proteomic perspective we were able to evaluate the toxic effects of a B. jararaca venom component upon experimentally envenomed skin. Using a comparative semi-quantitative proteomic analysis, we described a qualitative difference in toxic components distribution between B. jararaca and B. lanceolatus venoms. Focusing on snake venom metaloproteases (SVMPs) distribution, we observed different relative abundance of these enzymes subgroups. Those differences could explain the opposite clinical envenomation characteristics, since one venom is hemorrhagic and the other induces a prothrombotic profile. Pro-hemorrhagic venom toxins were also characterized through the proteome of L. obliqua venomous secretions. Hemolymph and bristle extract were analyzed showing that, different from bothropic venoms, the toxic secretions composition are mainly protease inhibitors, especially serpins. Moreover, we were able to demonstrate for the first time the presence of new putative toxins, such as metalloproteases. Finally, we applied tissue proteomics to the investigation of local snakebite pathology by jararhagin, a metalloprotease from B. jararaca venom. The metalloprotease direct effect was observed through the increase or decrease in protein identification, indicating infiltration or degradation respectively. Hemorrhage, edema and oxidative stress were characterized by enhance in correlated proteins but, most of all, we identified degradation in proteins important to extracellular matrix integrity and clot stabilization, indicating novel mechanism of toxicity to be further evaluated. In a general perspective, the present work describes toxic components from venomous animals that cause hemorrhagic syndromes and generates new testable hypothesis of the mechanisms of action involved in the development of envenomation pathophysiology.

Acidentes com animais venenosos constituem um problema de saúde pública negligenciado em todo o mundo. Estimativas indicam que, considerando-se apenas acidentes com serpentes venenosas, ocorram mundialmente cerca de 2,5 milhões de casos, causando 85.000 óbitos anuais. O desenvolvimento do quadro patológico dos envenenamentos é o resultado conjunto de potentes atividades biológicas exercidas, principalmente, por proteínas e peptídeos que compõem os venenos animais. A proteômica aplicada à caracterização de componentes de venenos animais, denominada venômica, é uma metodologia essencial na identificação não apenas dos componentes tóxicos, mas também valiosa na investigação molecular dos mecanismos patológicos dos envenenamentos. Através de metodologias proteômicas, descrevemos a caracterização protéica dos venenos animais das serpentes Bothrops jararaca e Bothrops lanceolatus e da lagarta Lonomia obliqua. Ainda, avaliamos através da proteômica de tecido experimentalmente envenenado as ações tóxicas de um componente isolado do veneno de Bothrops jararaca. Através de análise comparativa e semi-quantitativa da composição protéica dos venenos de B. jararaca e B. lanceolatus, descrevemos uma diferença qualitativa na distribuição dos componentes tóxicos. Enfatizando o grupo protéico majoritário, metaloproteases (SVMP), descrevemos diferentes abundâncias relativas entre os subtipos destas enzimas. Esta diferença explicaria as repercussões clínicas opostas durante o envenenamento humano, sendo um veneno hemorrágico e o outro prótrombótico. Componentes tóxicos capazes de gerar um quadro hemorrágico também foram avaliados através da análise proteômica das secreções tóxicas de L. obliqua. O estudo comparativo entre hemolinfa e extrato de espículas demonstrou que, diferentemente dos venenos botrópicos, as secreções tóxicas são compostas majoritariamente de inibidores de proteases, predominantemente serpinas. Além disso, descrevemos pela primeira vez a presença de novos componentes potencialmente tóxicos, como metaloproteases. Por fim, a proteômica de tecidos foi aplicada à investigação dos efeitos locais da injeção da metaloprotease do veneno de B. jararaca, jararagina. O efeito direto da ação da metaloprotease foi observado através da identificação de proteínas presentes em maior ou menor abundância, denotando infiltração ou degradação, respectivamente. Hemorragia, edema e estresse oxidativo foram evidenciados por pronunciado aumento em proteínas envolvidas nesses processos, mas, acima de tudo, identificamos degradação de proteínas relacionadas à manutenção da integridade da matriz extracelular e estabilização de coágulos, sugerindo novos mecanismos relacionados à atividade tóxica a serem investigados. De uma maneira geral, o presente trabalho descreve componentes tóxicos de venenos animais causadores de síndromes hemorrágicas e gera novas hipóteses em relação a mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento da patofisiologia dos envenenamentos. / Accidents with venomous animals are a neglected health issue worldwide. Global estimates points to the occurrence of 2,500,000 envenomation cases, causing 85,000 deaths per year. The pathological envenomation condition is a result of strong biological activities caused mainly by the action of venom's proteins and peptides components. Proteomics applied to the characterization of animal venom active principles, so called venomics, is an essential tool to the identification of toxic molecules as well as to help understanding the molecular mechanisms underlying pathological envenomation conditions. Through a proteomic methodology, here we describe the characterization of venoms from the snakes Bothrops jararaca and Bothrops lanceolatus and the caterpillar Lonomia obliqua. Moreover, from a tissue proteomic perspective we were able to evaluate the toxic effects of a B. jararaca venom component upon experimentally envenomed skin. Using a comparative semi-quantitative proteomic analysis, we described a qualitative difference in toxic components distribution between B. jararaca and B. lanceolatus venoms. Focusing on snake venom metaloproteases (SVMPs) distribution, we observed different relative abundance of these enzymes subgroups. Those differences could explain the opposite clinical envenomation characteristics, since one venom is hemorrhagic and the other induces a prothrombotic profile. Pro-hemorrhagic venom toxins were also characterized through the proteome of L. obliqua venomous secretions. Hemolymph and bristle extract were analyzed showing that, different from bothropic venoms, the toxic secretions composition are mainly protease inhibitors, especially serpins. Moreover, we were able to demonstrate for the first time the presence of new putative toxins, such as metalloproteases. Finally, we applied tissue proteomics to the investigation of local snakebite pathology by jararhagin, a metalloprotease from B. jararaca venom. The metalloprotease direct effect was observed through the increase or decrease in protein identification, indicating infiltration or degradation respectively. Hemorrhage, edema and oxidative stress were characterized by enhance in correlated proteins but, most of all, we identified degradation in proteins important to extracellular matrix integrity and clot stabilization, indicating novel mechanism of toxicity to be further evaluated. In a general perspective, the present work describes toxic components from venomous animals that cause hemorrhagic syndromes and generates new testable hypothesis of the mechanisms of action involved in the development of envenomation pathophysiology.

Acidentes com animais venenosos constituem um problema de saúde pública negligenciado em todo o mundo. Estimativas indicam que, considerando-se apenas acidentes com serpentes venenosas, ocorram mundialmente cerca de 2,5 milhões de casos, causando 85.000 óbitos anuais. O desenvolvimento do quadro patológico dos envenenamentos é o resultado conjunto de potentes atividades biológicas exercidas, principalmente, por proteínas e peptídeos que compõem os venenos animais. A proteômica aplicada à caracterização de componentes de venenos animais, denominada venômica, é uma metodologia essencial na identificação não apenas dos componentes tóxicos, mas também valiosa na investigação molecular dos mecanismos patológicos dos envenenamentos. Através de metodologias proteômicas, descrevemos a caracterização protéica dos venenos animais das serpentes Bothrops jararaca e Bothrops lanceolatus e da lagarta Lonomia obliqua. Ainda, avaliamos através da proteômica de tecido experimentalmente envenenado as ações tóxicas de um componente isolado do veneno de Bothrops jararaca. Através de análise comparativa e semi-quantitativa da composição protéica dos venenos de B. jararaca e B. lanceolatus, descrevemos uma diferença qualitativa na distribuição dos componentes tóxicos. Enfatizando o grupo protéico majoritário, metaloproteases (SVMP), descrevemos diferentes abundâncias relativas entre os subtipos destas enzimas. Esta diferença explicaria as repercussões clínicas opostas durante o envenenamento humano, sendo um veneno hemorrágico e o outro prótrombótico. Componentes tóxicos capazes de gerar um quadro hemorrágico também foram avaliados através da análise proteômica das secreções tóxicas de L. obliqua. O estudo comparativo entre hemolinfa e extrato de espículas demonstrou que, diferentemente dos venenos botrópicos, as secreções tóxicas são compostas majoritariamente de inibidores de proteases, predominantemente serpinas. Além disso, descrevemos pela primeira vez a presença de novos componentes potencialmente tóxicos, como metaloproteases. Por fim, a proteômica de tecidos foi aplicada à investigação dos efeitos locais da injeção da metaloprotease do veneno de B. jararaca, jararagina. O efeito direto da ação da metaloprotease foi observado através da identificação de proteínas presentes em maior ou menor abundância, denotando infiltração ou degradação, respectivamente. Hemorragia, edema e estresse oxidativo foram evidenciados por pronunciado aumento em proteínas envolvidas nesses processos, mas, acima de tudo, identificamos degradação de proteínas relacionadas à manutenção da integridade da matriz extracelular e estabilização de coágulos, sugerindo novos mecanismos relacionados à atividade tóxica a serem investigados. De uma maneira geral, o presente trabalho descreve componentes tóxicos de venenos animais causadores de síndromes hemorrágicas e gera novas hipóteses em relação a mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento da patofisiologia dos envenenamentos. / Accidents with venomous animals are a neglected health issue worldwide. Global estimates points to the occurrence of 2,500,000 envenomation cases, causing 85,000 deaths per year. The pathological envenomation condition is a result of strong biological activities caused mainly by the action of venom's proteins and peptides components. Proteomics applied to the characterization of animal venom active principles, so called venomics, is an essential tool to the identification of toxic molecules as well as to help understanding the molecular mechanisms underlying pathological envenomation conditions. Through a proteomic methodology, here we describe the characterization of venoms from the snakes Bothrops jararaca and Bothrops lanceolatus and the caterpillar Lonomia obliqua. Moreover, from a tissue proteomic perspective we were able to evaluate the toxic effects of a B. jararaca venom component upon experimentally envenomed skin. Using a comparative semi-quantitative proteomic analysis, we described a qualitative difference in toxic components distribution between B. jararaca and B. lanceolatus venoms. Focusing on snake venom metaloproteases (SVMPs) distribution, we observed different relative abundance of these enzymes subgroups. Those differences could explain the opposite clinical envenomation characteristics, since one venom is hemorrhagic and the other induces a prothrombotic profile. Pro-hemorrhagic venom toxins were also characterized through the proteome of L. obliqua venomous secretions. Hemolymph and bristle extract were analyzed showing that, different from bothropic venoms, the toxic secretions composition are mainly protease inhibitors, especially serpins. Moreover, we were able to demonstrate for the first time the presence of new putative toxins, such as metalloproteases. Finally, we applied tissue proteomics to the investigation of local snakebite pathology by jararhagin, a metalloprotease from B. jararaca venom. The metalloprotease direct effect was observed through the increase or decrease in protein identification, indicating infiltration or degradation respectively. Hemorrhage, edema and oxidative stress were characterized by enhance in correlated proteins but, most of all, we identified degradation in proteins important to extracellular matrix integrity and clot stabilization, indicating novel mechanism of toxicity to be further evaluated. In a general perspective, the present work describes toxic components from venomous animals that cause hemorrhagic syndromes and generates new testable hypothesis of the mechanisms of action involved in the development of envenomation pathophysiology.

Submitted by Biblioteca da Faculdade de Farmácia (bff@ndc.uff.br) on 2017-03-28T17:57:30Z No. of bitstreams: 1 Martins, Tiago Leite [Dissertação, 2014].pdf: 3135883 bytes, checksum: 5772657ec1d18e995c9ce1854aa81fca (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-28T17:57:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martins, Tiago Leite [Dissertação, 2014].pdf: 3135883 bytes, checksum: 5772657ec1d18e995c9ce1854aa81fca (MD5) / Os venenos de serpente são complexa mistura de toxinas, que são principalmente enzimas e peptídeos com diversas atividades biológicas. Os venenos botrópicos podem induzir hemorragia, edema, necrose e diversas doenças da pele, tais como a formação de bolhas e dermonecrose. Embora existam progressos consideráveis no estudo da patogênese da hemorragia e mionecrose em Viperidae peçonhentas, existem poucas referências das anormalidades de pele derivadas destes venenos, independentemente da sua relevância clínica. O nosso objetivo é avaliar os efeitos dos venenos de Bothrops leucurus e Bothrops jararaca na indução de lesões da pele, bem como no processo de regeneração. Foram utilizados camundongos swiss albinos adultos com 25 ± 3 g (n = 4/grupo, do sexo masculino), que durante todo o experimento receberam comida e água "ad libitum" e foram mantidos em ciclo de luz natural. A manipulação e os procedimentos com os animais seguiram os princípios do Comitê de Ética no Uso de Animais em Pesquisa (CEUA-UFF n º 219). As lesões cutâneas foram induzidas no abdome por injeção intradérmica de 3 mg / kg de veneno de B. leucurus ou B. jararaca. O grupo controle recebeu injeção de solução salina fisiológica. Os animais foram sacrificados 1, 3, 7, 14, 21, 45 e 60 dias após a injeção de veneno, sob anestesia geral, a fim de remover a pele para processamento histológico. O passo seguinte foi corar com hematoxilina e eosina as amostras de pele e análise por microscopia óptica. Depois de 24 h a epiderme das amostras injetadas com os venenos estava desorganizada e apresentava maior espessura, em comparação com o controle. Após 21 e 45 dias foi possível identificar diferenças na análise imuno-histoquímica de citoqueratina 14 com padrão de marcação suprabasal das camadas epidérmicas, observado apenas em áreas de hiperproliferação nas amostras de pele injetadas com veneno. As amostras de pele de 60 dias do grupo de B. leucurus apresentaram células com núcleos picnóticos e as amostras de pele injetadas com as peçonhas de ambas espécies tinham fibra muscular em fase de recuperação, com núcleos centralizados, indicando processo de regeneração. Ainda nesta fase crônica foi possível identificar angiogênese com base na marcação de endotélio na derme através da imuno-histoquímica com o anticorpo CD34. Os resultados indicam que as lesões cutâneas induzidas por B. leucurus diferem de B. jararaca, sendo que as primeiras produziram intenso infiltrado inflamatório com padrão proliferativo diferenciado de reparação de feridas. Além disso, as peçonhas estudadas apresentaram-se como ferramentas úteis para o estudo de modelos de regeneração cutânea, porém a confirmação da tumorigênese depende de uma análise mais complexa, com destaque para fatores determinantes como o tempo e a intensidade de exposição ao veneno / Snake venoms are complex mixture of toxins, which are mostly enzymes and peptides with diverse biological activities. The bothropic venoms can induce hemorrhage, edema, necrosis and various skin conditions such as blister formation and dermonecrosis. Although there are significant advances in the study of the pathogenesis of hemorrhage and myonecrosis in venomous Viperidae, there are few references to the skin abnormalities derived from these venoms, regardless of its clinical relevance. Our goal is to evaluate the effects of B. leucurus and B. jararaca venoms in the induction of skin lesions as well as in the process of regeneration. The animals used were adult albino Swiss mice with 25 ± 3 g (n = 4/group, male), which throughout the experiment received food and water "ad libitum" and were maintained in natural light cycle. Manipulation and procedures with animals followed the principles of Evaluation Committee on the Use of Animals in Research (CEUA-UFF nº 219). The skin lesions were induced in the abdomen by intradermal injection of 3 mg/kg B. leucurus or B. jararaca venom. The control group received injection of physiological saline solution. The animals were sacrificed 1, 3, 7, 14, 21, 45 and 60 days after venom injection under general anesthesia in order to remove the skin for histological processing. The next step was the hematoxylin and eosin staining of the skin samples and analysis by optical microscopy. After 24 h the epidermis of the samples injected with venoms was disorganized and had greater thickness, compared with the control. After 21 and 45 days it was possible to identify differences in immunohistochemical analysis of cytokeratin 14 with suprabasal epidermal layers staining, observed only in areas of hyperproliferation in samples of skin injected with venom. Skin samples of B. leucurus 60 days group cells had pyknotic nuclei and skin samples injected with venoms of both species had muscle fiber in recovery phase, with centered nuclei , indicating regeneration process. Still in chronic phase, we found angiogenesis based on marking endothelium in the dermis by immunohistochemistry with CD34 antibody. The results indicate that the cutaneous lesions induced by B. leucurus differs from B. jararaca, with the first resulting in intense inflammatory infiltrate with different proliferative pattern of wound repair. In addition, the venoms studied were presented as useful tools to study models of skin regeneration , although confirmation of tumorigenesis depends on a more complex analysis with emphasis on determining factors such as the time and intensity of exposure to the venoms

A saúde bucal, na maioria dos municípios brasileiros, constitui ainda um grande desafio aos princípios do Sistema Único de Saúde, principalmente no que se refere à universalização, à eqüidade do atendimento e alto custo envolvido na terapia restauradora. A procura pela descoberta de novos compostos metabólicos com atividade antibacteriana para a prevenção de doenças bucais e talvez com menores impactos a saúde e financeiros, seria muito importante para obtenção de um meio efetivo de controle da formação de um biofilme patogênico e da cárie dental. O objetivo deste trabalho é estudar a viabilidade biotecnológica do uso de venenos nativos de diferentes serpentes quanto à capacidade de inibir o crescimento de Streptococcus mutans, principal agente envolvido na cárie dental. Nossos resultados mostraram que os venenos das serpentes Bothrops moojeni e Bothrops jararacussu inibiram o crescimento de Streptococcus mutans e o componente responsável pela inibição parece ser a peróxido de hidrogênio. Apesar de ainda não totalmente conclusivos, os ensaios já realizados, permitem afirmar que venenos de serpentes são ferramentas importantes na inibição do crescimento de patógenos, especificamente daqueles envolvidos nas doenças cariogênicas. / The oral health at the most of Brazilian municipalities is still a big challenge to the principles of the Brazilian Health Unique System (SUS), particularly with regard to the globalization, the equity of care and high cost involved in restorative therapy. The demand for discovery of new natural products with antibacterial activity in order to prevent dental diseases and perhaps with fewer health and financial impacts, would be very important to achieve an effective means to control the formation of a pathogenic biofilm and dental caries. The objective of this work is to study the feasibility of the use of different snakes crude venom in inhibiting the growth of Streptococcus mutans, the principal agent involved in dental caries. Our results showed that Bothrops moojeni and Bothrops jararacussu venoms were able to inhibit the growth of Streptococcus mutans and the component responsible for that inhibition appears to be the hydrogen peroxide. Though still not fully conclusive, the tests already carried out, show that snake venoms are important tools to inhibit the growth of pathogens, specifically those involved in caries diseases. MOSCA, R.C., 2008 7 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO................................................................................................

A saúde bucal, na maioria dos municípios brasileiros, constitui ainda um grande desafio aos princípios do Sistema Único de Saúde, principalmente no que se refere à universalização, à eqüidade do atendimento e alto custo envolvido na terapia restauradora. A procura pela descoberta de novos compostos metabólicos com atividade antibacteriana para a prevenção de doenças bucais e talvez com menores impactos a saúde e financeiros, seria muito importante para obtenção de um meio efetivo de controle da formação de um biofilme patogênico e da cárie dental. O objetivo deste trabalho é estudar a viabilidade biotecnológica do uso de venenos nativos de diferentes serpentes quanto à capacidade de inibir o crescimento de Streptococcus mutans, principal agente envolvido na cárie dental. Nossos resultados mostraram que os venenos das serpentes Bothrops moojeni e Bothrops jararacussu inibiram o crescimento de Streptococcus mutans e o componente responsável pela inibição parece ser a peróxido de hidrogênio. Apesar de ainda não totalmente conclusivos, os ensaios já realizados, permitem afirmar que venenos de serpentes são ferramentas importantes na inibição do crescimento de patógenos, especificamente daqueles envolvidos nas doenças cariogênicas. / The oral health at the most of Brazilian municipalities is still a big challenge to the principles of the Brazilian Health Unique System (SUS), particularly with regard to the globalization, the equity of care and high cost involved in restorative therapy. The demand for discovery of new natural products with antibacterial activity in order to prevent dental diseases and perhaps with fewer health and financial impacts, would be very important to achieve an effective means to control the formation of a pathogenic biofilm and dental caries. The objective of this work is to study the feasibility of the use of different snakes crude venom in inhibiting the growth of Streptococcus mutans, the principal agent involved in dental caries. Our results showed that Bothrops moojeni and Bothrops jararacussu venoms were able to inhibit the growth of Streptococcus mutans and the component responsible for that inhibition appears to be the hydrogen peroxide. Though still not fully conclusive, the tests already carried out, show that snake venoms are important tools to inhibit the growth of pathogens, specifically those involved in caries diseases. MOSCA, R.C., 2008 7 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO................................................................................................

SOUSA, Fabíola Carine Monteiro de. Avaliação dos efeitos renais induzidos pelo veneno e PLA, LYS 49 e ASP 49 da serpente Bothropoides erythromelas (Amaral, 1923) : análise dos mediadores envolvidos. 2010. 214 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2010. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-07-26T16:36:48Z No. of bitstreams: 1 2010_tese_fcmsousa.pdf: 4619146 bytes, checksum: d8b1a37dd28f0be3b597cd8b5416322c (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-08-06T11:53:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_tese_fcmsousa.pdf: 4619146 bytes, checksum: d8b1a37dd28f0be3b597cd8b5416322c (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-06T11:53:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_tese_fcmsousa.pdf: 4619146 bytes, checksum: d8b1a37dd28f0be3b597cd8b5416322c (MD5) Previous issue date: 2010 / Bothropoides erythromelas is responsible for a great deal of snakebites in Northeastern from Brazil. The venom of this snake induces acute renal failure. Isolated kidneys from Wistar rats, weighting 250 to 300g, were perfused with Krebs-Henseleit solution containing 6g% of bovine serum albumin for 120 min. The whole venom of Bothropoides erythromelas been previously studied (SOUSA, 2004) and used in this study for comparison with the treated groups with the PLA2 fractions Lys 49 and Asp 49 of the venom. The whole venom (10mg/mL) and the fractions PLA2 Lys 49 and Asp 49 of B. erythromelas (5mg/mL) were added into the system 30 min after the beginning of each experiment. The parameters studied included perfusion pressure (PP), renal vascular resistance (RVR), glomerular filtration rate (GFR), urinary flow (UF), percent sodium, potassium and chloride tubular transport (%TNa+, %TK+ and %TCl-), percent sodium, potassium and chloride proximal transport (%pTNa+, %pTK+ and %pTCl-), sodium, potassium and chloride excretion (ENa+, EK+ e ECl-) and osmotic clearance (Cosm) (p< 0.05*). The control group perfused with albumin was functionally stable for over 120 min. The infusion of venom caused a significant increase in UF, ENa+, ECl- and Cosm and a decreased in PP, RVR, %TNa+, %TK+, %TCl-, %pTNa+, %pTK+ and %pTCl-. The GFR and the EK+ decreased at 60 min and increased at 90 and 120 min when compared with control group. The infusion of Lys 49 caused a significant increase in PP, UF, ENa+, EK+ and Cosm and decreased the GFR and the %TNa+ when compared with control group. Lys49 did not modify the others functional kidney parameters. The infusion of Asp 49 only modify the functional kidney parameters %pTK+ (decreased) and EK+ (increase) when compared with control group. Lys 49 showed a similar effect at whole venom in parameters UF, %TNa+, ENa+, EK+ and Cosm and Asp 49 in parameters %pTK+ and EK+. The histological analysis showed a mild amount of a proteinaceous substance in the renal tubules and glomeruli of kidneys perfused with the venom, Lys 49 and Asp 49, as well as focal areas of apoptosis/necrosis in perfused kidneys with Lys 49 e Asp 49. MDCK cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% vv fetal bovine serum and then assessed in the presence of the whole venom, Lys 49 and Asp 49 of B. erythromelas in the concentrations (100; 50; 25; 12.5; 6.25 and 3.125mg/mL). The analysis of cytotoxic effects on MDCK cells was performed by MTT method. The venom promoted cytotoxic effect in the concentrations of 50 and 100mg/mL (IC50 =93.31mg/mL). Lys 49 promoted cytotoxic effect in the concentrations of 6.25; 12.5; 25; 50 and 100 mg/mL (IC50 = 38.29mg/mL). Asp 49 promoted cytotoxic effect in the concentrations of 50 and 100 mg/mL (IC50 = 158mg/mL). Also the levels of lactic dehydrogenase (LDH) were measured and no significant increase was observed with whole venom and Asp 49. Lys 49 promoted a significant increase in the levels of LDH only in the concentration of 100mg/mL. After culture of MDCK cells with the whole venom, at concentrations of 46.65 and 23.32µg/mL, was performed the real time polymerase chain reaction for evaluation of pro (Caspase-3, Caspase-8 and Bax) and antiapoptotic (Bcl-XL and Mcl-1) genes expression. The evaluation of pro and antiapoptotic genes expression with Lys 49 e Asp 49 did not realized. In the expression of pro-apoptotic genes the whole venom caused increase of caspase-3 at concentration of 23.32µg/mL and of caspase-8 at concentrations of 46.65 and 23.32µg/mL, when compared with negative (PBS) and positive (DOXO) controls and decreased the expression of Bax in both concentrations. In the expression of anti-apoptotic genes the whole venom caused significant induction of Mcl-1 only at a concentration of 46.65µg/mL and did not modify the expression of Bcl-XL, when compared with the negative control. The venom and the fractions PLA2 Lys 49 e Asp 49 of Bothropoides erythromelas is able to promote significant effects on renal function parameters and on MDCK cells, with indications of cell death by apoptosis through the extrinsic pathway. / Bothropoides erythromelas é responsável por muitos acidentes no Nordeste do Brasil. O veneno desta serpente induz insuficiência renal aguda. Rins isolados de ratos Wistar, pesando 250 a 300g, foram perfundidos durante 120 min com solução Krebs-Henseleit contendo 6g% de albumina bovina. O veneno total de Bothropoides erythromelas foi estudado anteriormente (SOUSA, 2004) e utilizado neste estudo para posterior comparação com os grupos tratados com as frações PLA2 Lys 49 e Asp 49 do veneno. O veneno total (10mg/mL) e as frações PLA2 Lys 49 e Asp 49 (5mg/mL) de B. erythromelas foram adicionados ao sistema 30 min após o início de cada experimento. Os parâmetros estudados incluíram pressão de perfusão (PP), resistência vascular renal (RVR), ritmo de filtração glomerular (RFG), fluxo urinário (FU), percentual de transporte tubular de sódio, potássio e cloreto (%TNa+, %TK+ e %TCl-), percentual de transporte proximal de sódio, potássio e cloreto (%pTNa+, %pTK+ e %pTCl-), excreção de sódio, potássio e cloreto (ENa+, EK+ e ECl-) e clearance osmótico (Cosm) (p< 0,05*). O grupo controle perfundido com albumina foi funcionalmente estável por todos os 120 min. A infusão do veneno causou um aumento significante no FU, ENa+, ECl- e Cosm e uma diminuição na PP, RVR, %TNa+, %TK+, %TCl-, %pTNa+, %pTK+ e %pTCl-. O RFG e a EK+ diminuíram aos 60 min e aumentaram aos 90 e 120 min quando comparado com o grupo controle. A infusão de Lys 49 causou um aumento significante na PP, FU, ENa+, EK+ e Cosm e diminuiu o RFG e o %TNa+ quando comparada com o grupo controle. Lys 49 não modificou os outros parâmetros funcionais renais. A infusão de Asp 49 modificou apenas os parâmetros funcionais renais %pTK+ (diminuição) e EK+ (aumento) quando comparada ao grupo controle. Lys 49 apresentou um efeito similar ao veneno total nos parâmetros FU, %TNa+, ENa+, EK+ e Cosm e Asp 49 nos parâmetros %pTK+ e EK+. A análise histológica mostrou uma quantidade moderada de material proteináceo nos glomérulos e túbulos de rins perfundidos com o veneno, Lys 49 e Asp 49, bem como regiões focais de apoptose/necrose em rins perfundidos com Lys 49 e Asp 49. Células MDCK foram cultivadas em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 10% vv de soro bovino fetal e então avaliadas na presença do veneno total, Lys 49 e Asp 49 de B. erythromelas nas concentrações (100; 50; 25; 12,5; 6,25 e 3,125mg/mL). A análise dos efeitos citotóxicos em células MDCK foi executada pelo método MTT. O veneno promoveu efeito citotóxico nas concentrações de 50 e 100mg/mL (IC50 =93,31mg/mL). Lys 49 promoveu efeito citotóxico nas concentrações de 6,25; 12,5; 25; 50 e 100mg/mL (IC50 = 38,29mg/mL). Asp 49 promoveu efeito citotóxico nas concentrações de 50 e 100mg/mL (IC50 = 158mg/mL). Também foram mensurados os níveis de lactato desidrogenase (LDH) e nenhum aumento significante foi observado com veneno total e Asp 49. Lys 49 promoveu um aumento significante nos níveis de lactato desidrogenase apenas na concentração de 100mg/mL. Após o cultivo de células MDCK com o veneno total, nas concentrações de 46,65 e 23,32mg/mL, foi realizada a reação de polimerase em cadeia em tempo real para a avaliação da expressão de genes pró (Caspase-3, Caspase-8 e Bax) e antiapoptóticos (Bcl-XL e Mcl-1). Não foi realizada avaliação da expressão de genes pró e antiapoptóticos com Lys 49 e Asp 49. Na expressão de genes pró-apoptóticos o veneno total promoveu um aumento da expressão de caspase-3 na concentração de 23,32µg/mL e de caspase-8 nas concentrações de 46,65 e 23,32µg/mL, quando comparado com os controles positivo (DOXO) e negativo (PBS) e diminuiu a expressão de Bax em ambas as concentrações. Na expressão de genes antiapoptóticos o veneno total promoveu indução significativa de Mcl-1 somente na concentração de 46,65mg/mL e não modificou a expressão de Bcl-XL, quando comparado com o controle negativo. O veneno e as frações PLA2 Lys 49 e Asp 49 da serpente Bothropoides erythromelas é capaz de promover significativos efeitos sobre os parâmetros de função renal e sobre células MDCK, com indicativo de morte celular por apoptose através da via extrínseca.

JORGE, Roberta Jeane Bezerra. Venômica e antivenômica de Bothrops erythromelas : estudo da variação intraespecífica. 2015. 131 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-03-06T13:00:26Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_rjbjorge.pdf: 8490082 bytes, checksum: d6ca5417614b4fb1e727b7db3ef1d01d (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-03-06T13:02:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_rjbjorge.pdf: 8490082 bytes, checksum: d6ca5417614b4fb1e727b7db3ef1d01d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-06T13:02:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_rjbjorge.pdf: 8490082 bytes, checksum: d6ca5417614b4fb1e727b7db3ef1d01d (MD5) Previous issue date: 2015 / ABSTRACT Bothrops erythromelas snake is a species of medical importance responsible for snakebites, predominantly in the Northeast of B razil. This study aimed to conduct a comparative proteomic study of venoms pool of this species from five geographical regions of the Northeast: Ceará, Pernambuco, Juazeiro, Paraíba and Itaparica Island. In addition, we investigated the ability of Bothrops antivenom (SAB) of the Vital Brazil Institute and polyspecific serum (BCL) of Costa Rica to neutralize the venoms from these populations (antivenomics) and the ability to neutralize the in vivo haemorrhagic activity of venom. Two - dimensional electrophores is (2DE) showed similar patterns of protein distributed in the range of 14 - 95 kDa molecular mass and isoelectric points ranging from 4 to 8.5. Thirty to forty fractions were collected by Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography (RP - HPLC). Each chromatographic fraction collected manually were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis - SDS (SDS - PAGE) and protein bands were excised and subjected to venomic analysis resulting in the identification of approximately 65 proteins and 8 species of peptides belonging to 12 protein families (Bradykinin - Potentiating Peptides (BPPs), Snake Venom Vascular Endothelial Growth Factor (svVEGF), Phospholipase A 2 , Serine Preotease, Metalloproteases class I and class III (PI and PIII - Symp), Disintegrins and Disintegrin - like and Rich in Cysteine domains, C - type Lectins, Nucleotidases (5' - nucleotidase; 5'NT and Phosphodiesterase; PDE), Secretory Proteins rich in Cysteine (CRISP) and snake venoms Phospholipase B. Through this work it was shown that the proteomes of venoms of B. erythromelas of different regions of Northeast are similar and seem to be quite kept according to their geographical distribution, although they contain peculiar differences such as the presence of CRISP detected only in the venoms of Pern ambuco and 5 'NT in the population of Juazeiro; and PDEs only in proteomes of populations of Ceará and Pernambuco and PLB in Ceará, Juazeiro and Itaparica Island. The antivenomics results showed that SAB pentavalent serum immunoreactivity is similar across the five populations and more efficient compared to the polyvalent BCL. However, it can be seen that especially low molecular weight fractions are not efficiently recognized by both antivenoms. Although differences were shown in their neutralization effic acy, both were effective in neutralizing antivenom hemorrhagic activity. Despite the B.erythromelas snake inhabit acomprehensivegeographical area , the five populations showed similar composition, displaying a highly conserved profile of representative venom protein classes. Therefore, this study assigned all proteins in the venom of B. erythromelas that have been characterized in the literature (BPP, PLA2 Asp49, PIII - Symp and svVEGF) and provided additional information to the presence of Serine Proteases and C - type Lectins and other minor or specific components (PDE, 5'NT, PLB, CRISP). / UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA PÓS - GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA ROBERTA JEANE BEZERRA JORGE VENÔMICA E ANTIVENÔMICA DE Bothro p s eryth r omelas : ESTUDO DA VARIAÇÃO INTRAESPECÍ FICA . ORIEN TADORA: HELENA SERRA AZUL MONTEIRO CO - ORIENTADOR : JUAN JOSÉ CALVETE CHORNET Fortaleza 2015 ROBERTA JEANE BEZERRA JORGE VENÔMICA E ANTIVENÔMICA DE Bothro ps eryth r omelas : ESTUDO DA VARIAÇÃO INTRAESPECIFICA . Tese de Doutorado apresentada ao Cur so de Pós - G raduação em Farmacologia da Universidade Federal do Ce ará para obtenção do titulo de Doutor em Farm a cologia ORIENTADORA: HELENA SERRA AZUL MONTEIRO CO - ORIENTADOR : JUAN JOSÉ CALVETE CHORNET Fortaleza 2015 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará Biblioteca de Ciências da Saúde J71v Jorge, Roberta Jeane Bezerra. Venô mica e Antivenômica de Bothrops erythromelas : estudo da variação intraespecífi ca. / Roberta Jeane B ezerra Jorge. – 2015. 130 f.: il. color., enc.; 30 cm. Tese (doutorado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina, Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Programa de Pós - Graduação em Farmacologia, Doutorado em Farmacologia, Fortaleza, 201 5. Área de Concentração: Farmacologia. Orientação: Profa. Dra. Helena Serra Azul Monteiro. Co - Orientação: Prof. Dr. Juan José Calvete Chornet. 1. Bothrops. 2. Proteômica. 3. Venenos de Serpente. I. Título. CDD 615.942 A os meus pais Nádja e Roberto e ao meu irmão Júnior. AGRADECIMENTOS A Deus, minha força maior e inexaurível . A os meus pais pelo que sou hoje. A todos meus familiares e amigos pelo companheirismo e presteza, seria impossível e a té passível de cometer algum esquecimento citar o nome de todos eles, mas cada um sabe o quanto sou grata e que podem sempre contar comigo . Aos que contribuíram diretamente para a realização deste trabalho: M inha orientadora P rofa Dra Helena Serra Azul M onteiro e ao meu co - orientador Prof . Dr. Juan José Calvete e a sua equipe do Laboratório de Ve nômica y Proteinómica Estructural do Instituto de Biomedicina de Valencia e aos grandes amigos que fiz no período de estágio de doutorado na Espanha . A todos os colaboradores deste trabalho no Brasil, Espanha e Costa Rica . A todos do Laboratório de Farmacologia Venenos e Toxina s (LAFAVET) , aos companheiros científicos, em especial aos amigos que fiz e a Pós - graduação em Farmacologia da Universidade Federal do Cea rá, os quais me proporcionaram crescimento profissional e pessoal. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior ( CAPES ) pela concessão da bolsa de Doutorado Sanduiche e m Valencia - Espanha . Ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pelo apoio financeiro . “ Entrega teu caminho ao S enhor, confia nele , e ele o fará ” Salmo 37:5 RESUMO A serpente Bothrops erythromelas é uma espécie de importância médica responsável por acidentes ofídicos, com predominância no N ordeste do Brasil. O presente trabalho teve como objetivo realizar um estudo proteômico comparativo do pool de venenos desta espécie procedentes de cinco regiões geográficas do Nordeste: Ceará, Pernambuco, Juazeiro, Paraíba e Ilha de Itaparica. Além disso, foi investigada a capacidade do soro antibotrópico (SAB) do Instituto Vital Brazil e soro poliespecífico (BCL) da Costa Rica em neutralizar os venenos provenientes dessas populações através da antivenômica e a capacidade de neutralização frente à atividad e hemorrágica in vivo . A eletroforese bidimensional (2DE) mostrou padrões similares de proteínas distribuídas no intervalo de 14 - 95 kDa de massa molecular e pontos isoelétricos variando de 4 - 8,5. Trinta a quarenta frações foram recolhidas por meio de Cro matografia Líquida de Alta Eficiência em Fase Reversa (RP - HPLC). Cada fração cromatográfica coletada manualmente foi analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida – SDS ( SDS - PAGE) e as bandas de proteínas foram excisadas e submetidas à análise venômi ca que resultaram na identificação de aproximadamente 65 proteínas e 8 espécies de peptídeos pertencentes a 12 famílias de proteínas de venenos de serpentes: (Peptídeos Potenciadores de Bradicinina (BPPs), Fator de Crescimento Endotelial Vascular de Veneno de Serpente (svVEGF), Fosfolipase A 2 , Serinoproteases, Metaloproteases da classe I e da classe III (PI e PIII – SVMP), Desintegrinas e Domínios tipo Desintegrina e rico em Cisteínas, Lectinas do tipo C, Nucleotidases (5' - nucleotidase; 5’NT e Fosfodiester ase; PDE), Proteínas Secretórias Ricas em Cisteína (CRISP) e Fosfolipase B). Através desse trabalho foi demonstrado que os proteomas dos venenos das B. erythromelas das diferentes regiões do Nordeste são similares e parecem ser bastante conservados de acor do com sua distribuição geográfica, embora contenham diferenças peculiares tais como, a presença de CRISP detectadas apenas nos venenos de Pernambuco e da 5’ NT na população de Juazeiro; assim como PDEs apenas nos proteomas das populações do Ceará e Pernam buco e da PLB no Ceará, Juazeiro e Ilha de Itaparica. Os resultados da antivenômica mostraram que a imunorreatividade do soro pentavalente SAB é similar frente às cinco populações e mais eficiente em relação ao polivalente BCL. No entanto, pode - se observar especialmente que as frações de baixo peso molecular não são reconhecidas pelos dois antivenenos de forma eficiente. Embora tenham mostrado diferenças na sua eficácia de neutralização, ambos os antivenenos foram eficazes na neutralização da atividade hemo rrágica in vivo . Apesar da serpente de B. erythromelas habitar uma abrangente área geográfica, as cinco populações estudadas apresentaram composição semelhante, exibindo um perfil altamente conservado das classes das proteínas representativas do veneno. Po rtanto, este estudo identificou as proteínas do veneno de B. erythromelas já caracterizadas na literatura (BPP, PLA 2 Asp49, PIII - SVMP e svVEGF) e forneceu informações adicionais para a presença de Serinoproteases e Lectinas do tipo C e de outros component es minoritários ou específicos (PDE, 5’NT, PLB, CRISP).

DANTAS, Rodrigo Tavares. Avaliação dos efeitos renais da fração L-aminoácido oxidase isolada do veneno da serpente Bothrops marajoensis. 2010. 104 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2010. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-05-15T12:10:30Z No. of bitstreams: 1 2010_dis_rtdantas.pdf: 3573132 bytes, checksum: 27b964204fc5e26e329b4d9950fd7885 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-05-15T16:29:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_dis_rtdantas.pdf: 3573132 bytes, checksum: 27b964204fc5e26e329b4d9950fd7885 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-15T16:29:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_dis_rtdantas.pdf: 3573132 bytes, checksum: 27b964204fc5e26e329b4d9950fd7885 (MD5) Previous issue date: 2010 / There are about 3.000 species of snakes worldwide, but only 10 to 14% are venomous. Among South American countries, Brazil is the one with the largest number of accidents, with approximately 20.000 snakebites each year. According to the Department of Health of Brazil, the genus Bothrops are the main involved in snakebites in the country. Acute renal failure (ARF) is a serious complication of snake poisoning. The fraction L-amino acid oxidase (LAAO) constitutes a main part of the total composition of snake venoms. In some cases this amount can reach 30% of total venom proteins. The renal effects of fraction L-amino acid oxidase isolated from the venom of Bothrops marajoensis (LAAOBM) was investigated in this study. Isolated perfused rat kidney and the cultured renal tubular cells line MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) were used here. For the isolated perfused rat kidney method, we used Wistar rats weighing between 250 and 300. Their right kidneys were surgically excised and perfused with Krebs-Hanseleit containing 6% w/v bovine albumin previously dialyzed. The effects of LAAOBM (10 mg/mL, n=4) were analyzed on the Perfusion Pressure (PP), Renal Vascular Resistance (RVR), Urinary Flow (UF), Glomerular Filtration Rate (GFR) Percentage of Sodium Proximal Tubular Transport (%pTNa+), Percentage of Sodium (%TNa+), Potassium (%TK+) and Chloride (%TCl-) Tubular Transport. MDCK cells were cultured in RPMI 1640 medium supplemented with 10% v/v fetal bovine serum and incubated with LAAOBM at concentrations of 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 and 1.652 mg/mL. After 24 hours of incubation, assays were performed on cell proliferation and viability using the MTT method. The LAAOBM promoted a reduction of perfusion pressure at 90 minutes of the experiment and this reduction was even slightly higher at 120 minutes. It was also observed decrease in renal vascular resistance at 120 minutes. There was a sharp and sudden drop in urine flow at 90 minutes, despite the tendency of recovery observed at 120 minutes, still proved to be quite small when compared to the control group. The infusion of LAAOBM also promoted a reduction in glomerular filtration rate at 90 minutes compared to the control group and this parameter still remained at the same level of reduction at 120 minutes. The LAAOBM gradually reduced the percentage of sodium tubular transport at 90 and 120 minutes and the percentage of chloride tubular transport in the periods of 60, 90 and 120 minutes. Histological analysis of kidneys perfused with LAAOBM showed the presence of significant morphological changes such as accumulation of proteins in tubular and glomerular spaces. In the MDCK cell culture LAAOBM promoted a reduction in cell viability from concentrations of 3.25 mg / mL until 50μg/mL, with IC50 value of 2.43 mg/mL. Inverted light microscopy showed morphological changes of these cells, such as vacuolation, alteration of the state of confluence and detachment of the substrate culture. These results demonstrated that LAAOBM changed all the parameters evaluated in renal and vascular perfusion of isolated kidney and had cytotoxic activity on MDCK cells after 24 hours of incubation. / No mundo, existem cerca de 3.000 espécies de serpentes das quais 10 a 14% são peçonhentas. Dentre os países sul-americanos, o Brasil é o que apresenta maior número de aciden¬tes/ano com cerca de 20.000 acidentes ofídicos por ano. De acordo com o Ministério da Saúde, as serpentes do gênero Bothrops são as principais envolvidas nos acidentes ofídicos no país e a insuficiência renal aguda (IRA) é uma complicação grave dos envenenamentos produzidos por estas serpentes. Tendo em vista que a fração L-aminoácido oxidase (LAAO) constitui grande parte da composição total do veneno de serpentes, em algumas serpentes chegando a constituir mais de 30% do total de proteínas do veneno, neste trabalho, foram investigados os efeitos renais da fração L-aminoácido oxidase isolada do veneno da serpente Bothrops marajoensis (LAAOBM) em sistema de perfusão de rim isolado e em cultura de células tubulares renais da linhagem MDCK (Madin-Darby Canine Kidney). Para perfusão de rim isolado foram utilizados ratos Wistar pesando entre 250 e 300g, cujos rins foram excisados cirurgicamente e perfundidos com solução de Krebs-Hanseleit contendo 6%p/v de albumina bovina previamente dialisada. Foram investigados os efeitos da LAAOBM (10 µg/mL; n=4) sobre a Pressão de Perfusão (PP), Resistência Vascular Renal (RVR), Fluxo Urinário (FU), Ritmo de Filtração Glomerular (RFG), Percentual de Transporte Tubular Proximal de Sódio (%pTNa+),Percentual de Transporte Tubular de Sódio (%TNa+), de Potássio (%TK+) e de Cloreto (%TCl-). As células MDCK foram cultivadas em meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 10% v/v de Soro Bovino Fetal e então incubadas com a LAAOBM nas concentrações de 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 e 1,652 µg/mL. Após 24 horas de incubação, foram realizados os ensaios de viabilidade e proliferação celular utilizando-se o método do MTT. A LAAOBM promoveu uma redução da pressão de perfusão aos 90 minutos de experimento e esta redução foi ainda discretamente maior aos 120 minutos. Observou-se também queda da resistência vascular renal aos 120 minutos. Houve uma queda abrupta e acentuada do fluxo urinário aos 90 minutos que, apesar da tendência à recuperação observada aos 120 minutos, ainda mostrou-se bastante reduzido quando comparado ao grupo controle. A infusão da LAAOBM também promoveu uma redução do ritmo de filtração glomerular aos 90 minutos quando comparada ao grupo controle e este parâmetro manteve-se ainda no mesmo patamar de redução aos 120 minutos. A LAAOBM reduziu gradativamente o percentual de transporte tubular de sódio aos 90 e 120 minutos e o percentual de transporte tubular de cloreto nos tempos de 60, 90 e 120 minutos. A análise histológica dos rins perfundidos com LAAOBM mostrou a presença de alterações morfológicas significativas, como acúmulo de proteínas nos espaços tubulares e glomerulares. Na cultura de células MDCK a LAAOBM promoveu uma redução da viabilidade celular a partir da concentração de 3,25µg/mL até a concentração de 50µg/mL, com valor da CI50 de 2,43µg/mL. Foram observadas também, através de microscópio óptico invertido, alterações morfológicas destas células, tais vacuolização citoplasmática, alteração do estado de confluência e desprendimento das mesmas do substrato de cultura. Estes resultados demonstram que a LAAOBM alterou todos os parâmetros vasculares e renais avaliados na perfusão de rim isolado e possui ação citotóxica sobre as células MDCK após 24 horas de incubação.

EVANGELISTA, Inez Liberato. Caracterização das atividades cardiorenal e neural de Bothrops marajoensis e suas frações. 2009. 116 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2009. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-06-11T16:07:57Z No. of bitstreams: 1 2009_tese_ilevangelista.pdf: 1002705 bytes, checksum: 1ca0fdd63eeb9c816ec03fcadbfe7553 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-06-12T14:04:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_tese_ilevangelista.pdf: 1002705 bytes, checksum: 1ca0fdd63eeb9c816ec03fcadbfe7553 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-12T14:04:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_tese_ilevangelista.pdf: 1002705 bytes, checksum: 1ca0fdd63eeb9c816ec03fcadbfe7553 (MD5) Previous issue date: 2009 / In this article we evaluated the activity of Bothrops marajoensis (Bmj) and its fractions in the cardio-renal system. The results of the total venom in blood pressure experiments showed a decrease in the mean arterial pressure and heart rate without significant changes in respiratory rate. The same experiments performed in rats atropinized showed the permanence of falling blood pressure and heart rate. After administration of Bmj used in infusion of isolated rats heart of there was a decrease in myocardial force of contraction accompanied by an increase in perfusion pressure, without changes in coronary flow. The electrocardiographic analysis after injection of Bmj in rats causes a progressive atrioventricular block until a complete blockage and difficulty in atrial conduction. The assessment in the mesenteric vascular bed Bmj did not produce significant changes. The system renal perfusion in rats caused significant decrease in perfusion pressure, renal vascular resistance, urinary flow, filtration rate, transport of sodium and chloride. The phospholipase (PLA2) type 1 showed only an alteration in the transport of electrolytes. The Bmj fractions neurotoxicity in rat phrenic nerve diaphragm increasing showed a blockage dose-dependent in the strength of contraction. In mice vas deferens we observed an induced of a dose-dependent inhibition of contraction stimulated by electric field. This fact was not reversed by yohimbine or by naloxone. In another study the addition of the total venom of Bmj inhibited the neurogenic contraction, compared with no significant decrease in contraction by Cch, NA or ATP (in normal Krebs solution or with enriched with guanethidine and phentolamine). The fractions, PLA2 (type 1 and type 2) showed a dose-dependent inhibition of contraction. / Avaliou-se a atividade de Bothrops marajoensis (Bmj) e suas frações no sistema cardiorrenal. A resposta pressora do veneno bruto demonstrou uma diminuição da pressão arterial média e da freqüência cardíaca, sem alterações significativas na freqüência respiratória. Em ratos atropinizados demonstrou a permanência dos efeitos. Na perfusão de coração isolado de ratos observou-se uma diminuição na força de contração miocárdica acompanhada de um aumento da pressão de perfusão, sem alterações no fluxo coronariano. A análise eletrocardiográfica em ratos após injeção de Bmj provocou um bloqueio átrio ventricular gradual até um bloqueio completo indicando arritmia e dificuldade de condução atrial. Em leito vascular mesentério pré-contraído com fenilefrina não houve alterações significativas. No sistema de perfusão renal em ratos apresentou decréscimo significativo na pressão de perfusão, resistência vascular, fluxo urinário, ritmo de filtração e transportes de sódio e de cloreto. Fosfolipase miotóxica (tipo 1) demonstrou alterações somente no transporte de íons. A atividade de Bmj em doses crescentes em nervo Frênico Diafragma de rato mostrou um bloqueio na força de contração dose dependente, com efeito significante nas maiores doses. Em canal deferente de camundongos induziu a uma inibição dose dependente da contração estimulada por campo elétrico. Este feito não foi revertido pela Ioimbina nem por naloxone. Em outro estudo a adição do veneno bruto de Bmj inibiu a contração neurogênica,quando comparado com nenhuma queda significante pela contração com Cch, NA ou ATP (em Krebs normal ou enriquecido com guanetidina e fentolamina. A ausência de efeito do veneno bruto de Bothrops marajoensis sobre a contração induzida pelos principais agonistas purinérgicos demonstra provável atividade a nível pré-sináptico. Frações de fosfolipases miotóxicas (tipo 1 e tipo 2) demonstraram uma inibição da contração dose dependente.