Apesar da obtenção de animais nascidos vivos a partir de oócitos imaturos bovinos congelados ou vitrificados, um dos grandes desafios continua sendo o desenvolvimento de um método que proporcione melhores resultados de viabilidade pós-criopreservação. Assim como a ação dos crioprotetores empregados, a eficiência no processo de maturação in vitro (MIV) influi diretamente na taxa de desenvolvimento embrionário. Durante a maturação oocitária in vitro observa-se expansão e mucificação das células da granulosa que formam o complexo cumulus oophorus-oócito (CCO), em função da intensa síntese de componentes da matriz extracelular. Essas modificações no aspecto do cumulus são utilizadas como indicativo da ocorrência de maturação oocitária e contribuem para que ocorra a fecundação. A expressão gênica de proteínas associadas à matriz extracelular das células do cumulus pode estar sob influência de fatores de origem oocitária e de composição do meio de MIV. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão gênica das proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e HSP70-1 (proteína de choque térmico) em células do cumulus oophorus de oócitos imaturos bovinos submetidos a exposição e/ou vitrificação em duas soluções crioprotetoras e, posteriormente, maturados in vitro. Foram comparadas duas soluções de vitrificação (SV): SV1 = 20% de etileno glicol (EG) + 20% de 1,2 propanediol (PRO), e SV2 = 20% de EG + 20% DMSO + 0,5M de sacarose. Os CCOs foram obtidos a partir de ovários coletados de fêmeas bovinas logo após o abate, selecionados morfologicamente e distribuídos em 6 grupos experimentais: G1 (AOC), CCOs não maturados; G2 (AMC), CCOs submetidos à MIV; G3 (B1EC), CCOs expostos à SV1 e submetidos à MIV; G4 (B2EC), CCOs expostos à SV2 e submetidos à MIV; G5 (A1VC), CCOs vitrificados com a SV1 e submetidos à MIV; G6 (A2VC), CCOs vitrificados com a SV2 e submetidos à MIV. A MIV foi realizada em TCM 199 suplementado com soro de égua em estro, à 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. Após a MIV, 5 CCOs de cada grupo (G2 a G6), foram coletados, submetidos ao desnudamento mecânico e as células do cumulus foram concentradas por centrifugação e acondicionadas em tubos cônicos de 0,5 ml em nitrogênio líquido. O restante dos CCOs destes grupos foi submetido a fecundação e cultivo in vitro sob condições semelhantes a MIV. Para a extração do RNA total das amostras de células do cumulus foi utilizado o reagente TRIzol®. O RNA total foi re-suspenso e as amostras foram submetidas à captação específica do mRNA utilizando-se um “kit” comercial de separação magnética. Os mRNAs foram transcritos reversamente em cDNA utilizando-se a técnica de RT-PCR, para avaliar os padrões de expressão dos quatro transcritos de bovinos (link protein, HAS2, conexina 43 e HSP70-1). O grupo de oócitos imaturos exposto a SV1 apresentou uma taxa de blastocistos (30,1%) semelhante ao grupo controle (38,1%) e significativamente superior ao grupo exposto a SV2, (16,9%; p=0,0013). Houve diferença significativa (p<0,0001) entre o grupo controle e os grupos vitrificados nas soluções SV1 e SV2, tanto na taxa de clivagem (respectivamente, 79,2%; 22,1% e 43,3%) quanto no desenvolvimento até o estádio de blastocisto (respectivamente, 35,6%; 0% e 4,1%). A análise dos resultados de abundância relativa obtida a partir das células do cumulus oophorus de 5 CCOs bovinos em cada um dos seis grupos experimentais, após três repetições, não mostrou diferença significativa entre os diferentes grupos testados para os transcritos de link protein (p=0,738), HAS2 (p=0,772), conexina 43 (p=0,130) e HSP70-1 (p=0,333). / The major challenge in the cryopreservation of bovine immature oocytes is still developing a method that provides adequate results of survival and viability after vitrification. As the action of cryoprotectants employed, the efficiency of in vitro maturation (IVM) process directly influences the embryonic development. The mucification and expansion of the granulosa cells from the cumulus oophorus-oocyte complex (COC), caused by copious synthesis and deposition of extracellular matrix components, is observed during oocyte maturation in vitro. Such changes in the cumulus appearance are used as indicative of the oocyte maturation occurrence and contribute to fertilization. The gene expression of proteins associated with the extracellular matrix of the cumulus cells could be on the oocyte and/or IVM medium composition influences. The aim of this study was to evaluate, through the RT-PCR technique, the gene expression of hyaluronic acid synthase protein 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), connexin 43 (GJA1) and heat shock protein 70 (HSP70-1) in the cumulus oophorus cells of bovine immature oocytes exposed and/or vitrified in cryoprotectant solutions and then matured in vitro. We compared two vitrification solutions (VS): VS1 = 20% ethylene glycol (EG) + 20% 1,2 propanediol (PRO), and VS2 = 20% EG + 20% DMSO + 0.5 M sucrose. The COCs were obtained from cow ovaries, collected right after slaughter. After the morphological selection, the COCs were allocated into six experimental groups: G1- imature COCs; G2- COCs subjected to IVM; G3- COCs exposed to VS1 and subjected to IVM; G4- imature COCs exposed to VS2 and submitted to IVM; G5- COCs vitrified with VS1 and subjected to IVM; and G6- COCs vitrified with VS2 and submitted to IVM. The IVM was performed in TCM 199 supplemented with oestrus mare serum, at 39°C, under 5% of CO2 and maximum relative humidity, for 22 to 24 hours. After IVM, five COCs in each group (G2 to G6) were collected, the oocytes were stripped of cumulus cells by vortexing and the cells were concentrated by centrifugation and placed in conical tubes of 0.5 ml in liquid nitrogen. In each group COCs were subjected to in vitro fertilization and culture under similar conditions from used in MIV. The RNA extraction from samples containing the cumulus cells was performed by using TRIzol® reagent protocol. Total RNA was re-suspended and the samples were subjected to the specific capture of mRNA using a commercial kit for magnetic separation. The mRNAs were reverse transcribed into cDNA using the RT-PCR technique to evaluate patterns of expression of the four bovine transcripts (link protein, HAS2, connexin 43 and HSP70-1). The immature oocytes group exposed to VS1 showed a blastocyst rate (30.1%) similar to the control group (38.1%) and significantly higher than the group exposed to VS2, (16.9%, p = 0.0013). Significant difference (p <0.0001) was observed between the control group and groups vitrified in the VS1 and VS2, both in the rate of cleavage (respectively, 79.2%, 22.1% and 43.3%) and the development to the blastocyst stage (respectively, 35.6%, 0% and 4.1%). The results of relative abundance obtained from the cumulus cells of the five bovine COCs in each experimental group, after three repetitions, showed no significant difference between the groups tested for the transcripts of link protein (p = 0.738 ), HAS2 (p = 0.772), connexin 43 (p = 0.130) and HSP70-1 (p = 0.333).

O herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1) está amplamente disseminado no rebanho bovino brasileiro. Visando aprofundar o conhecimento sobre a patogenicidade para o trato respiratório de amostras dos subtipos deste vírus mais freqüentemente encontrados no Brasil (BHV-1.1 e BHV-1.a), isolados autóctones oriundos de casos de doença respiratória foram inoculados em bovinos suscetíveis. As amostras de ambos os subtipos foram capazes de induzir doença respiratória após inoculação pela via intranasal, em intensidade que variou de moderada a grave, independentemente do subtipo de vírus inoculado. Foi ainda caracterizada a resposta imune humoral induzida por tais amostras quanto ao perfil de classes e subclasses de imunoglobulinas, sendo esta igualmente indistinguível com relação aos vírus inoculados. O perfil de classes de imunoglobulinas apresentadas pelos animais permitiu a determinação do status da infecção nos animais inoculados através da análise da resposta sorológica. Na segunda etapa deste trabalho foram testadas as propriedades vacinais de um vírus recombinante, do qual foi deletada a glicoproteína E (gE; 265gE-), gerado a partir de uma amostra brasileira de BHV-1.2a. Experimentos de inoculação do recombinante 265gE- em animais suscetíveis e o desafio destes animais com a amostra parental virulenta demonstraram a segurança e eficácia desta amostra na prevenção de sinais clínicos da infecção pelo BHV-1. Posteriormente, o recombinante 265gE- foi inoculado em vacas em diferentes estágios da gestação. Não foram observadas quaisquer anormalidades nestas gestações e as 22 vacas vacinadas deram à luz a animais saudáveis. Conclui-se que o recombinante é imunogênico e capaz de conferir significativa proteção frente ao desafio com a amostra parental virulenta do vírus. O recombinante também não causou enfermidade nas vacas inoculadas nem tampouco aos fetos quando inoculado em diferentes estágios da gestação.

Os papilomavírus constituem uma extensa família de vírus associados a lesões epiteliotrópicas, assim como acometem o tecido mucoso onde podem causar tumores benignos que podem evoluir para a malignização. A papilomatose bovina é uma doença economicamente relevante, já que há a desvalorização dos animais a serem comercializados devido à aparência e depreciação do couro. Em humanos, a identificação dos tipos de papilomavírus (HPV) envolvidos bem como o relato de co-infecções são bem estabelecidos. Já foram descritos na literatura mais de 200 tipos de HPVs, o que ainda é pouco explorado na área da Medicina Veterinária, em que somente 21 tipos de papilomavírus bovino (BPV) foram caracterizados até o momento. A presente dissertação visou investigar a diversidade de BPV presentes em um papiloma de um bovino oriundo do Estado de Rondônia. A partir do DNA extraído da lesão, foi realizada a rooling circle amplification (RCA) seguida do sequenciamento de última geração (Ilumina MiSeq). O emprego dessas metodologias culminou na identificação do BPV13, que atualmente é bem caracterizado, e de três prováveis novos tipos de BPVs que haviam sido descritos em um único estudo recente. Estes resultados confirmam a presença de co-infecção em lesões de papilomatose bovina e demonstram que estas técnicas possibilitaram a detecção de espécies que não são identificadas pelos métodos convencionais. Este conhecimento sobre a diversidade de BPV servirá de base para o melhor entendimento da biologia do vírus e para a geração de vacinas profiláticas ou terapêuticas eficazes. / Papillomaviruses are an extensive family of viruses associated with epitheliotropic lesions, as well as affecting mucosal tissue where they can cause benign tumors that may progress to malignancy. Bovine papillomatosis is an economically relevant disease, since there is a devaluation of the animals to be marketed due to the appearance and depreciation of the leather. In humans, the identification of the types of papillomavirus (HPV) involved as well as the reporting of co-infections is well established. More than 200 types of HPV have been described in the literature, which is still little explored in the area of Veterinary Medicine, in which only 21 types of bovine papillomavirus (BPV) have been characterized. This study aimed to investigate the diversity of BPV present in a papilloma of a bovine animal from the State of Rondônia. From the DNA extracted from the lesion, the rooling circle amplification (RCA) was performed followed by the last generation sequencing (Ilumina MiSeq). The use of these methodologies culminated in the identification of BPV13, which is currently well characterized, and of three putative new BPVs types that had been described in a single recent study. These results confirm the presence of co-infection in bovine papillomatosis lesions and demonstrate that these techniques enabled the detection of species that are not identified by conventional methods. This knowledge on BPV diversity will serve as a basis for a better understanding of the biology of the virus and for the generation of effective prophylactic or therapeutic vaccines.

A mortalidade fetal é uma causa importante de perdas reprodutivas em animais domésticos e tem impacto significativo na rentabilidade de um sistema de produção animal. No Brasil, poucas informações são disponíveis sobre as principais causa de aborto em bovinos. O presente estudo resultou em cinco artigos. O primeiro artigo descreve as principais causas de aborto bovino diagnosticadas no Setor de Patologia Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul no período 2003-2011. Neste período um total de 490 fetos bovinos foi analisado. Causas específicas de aborto foram encontradas em 46,7 % dos casos. Infecções por protozoários, em especial Neospora caninum acometeram 33 % dos casos (162/490). Bactérias em 6,3 % (31/490), seguidas por fungos 0,8% (4/490) foram causas adicionais de abortos. Em dois fetos (0,4 %), coinfecções por dois agentes foram identificadas. Causas não infecciosas foram observadas em 3 % dos abortos e malformações congênitas a 2,6%. No segundo artigo estima-se a ocorrência de abortos por Brucella abortus em bovinos na região sul, caracterizando os achados macroscópicos, histopatológicos, bacteriológicos, imuno-histoquímicos e de PCR desta enfermidade. No terceiro artigo relata-se a infecção por Geotrichum candidum em feto bovino abortado associado a lesões de pele e pulmonares. A ocorrência de malformações congênitas múltiplas em um feto bovino abortado é relatada no quarto artigo e casos de condrodisplasia tipo Dexter em fetos bovinos abortados são descritos no quinto. / The fetal mortality is an important cause of reproductive failure in domestic animals and has a significant impact on the profitability of a livestock production system. In Brazil, little information is available on the main cause of abortion in cattle. This study resulted in five articles. The first article describes the main causes of abortion in cattle diagnosed in the period January 2003 to december 2011. A total of 490 fetuses, from several Brazilian states, were evaluated. Specific causes of abortion were found in 46,7 % of cases. Protozoan abortions especially Neospora caninum were detected in 33 % (162/490) of the cases. Bacterial abortions corresponded to 6,3 % (31/490), followed by fungal 0,8 % (4/490). In two aborted fetuses (0,4 %), a co-infection with two agents could be identified. Noninfectious diseases could be associated with 3 % of the abortions and congenital malformations with 2,6%. In the second article estimated the incidence of abortion by Brucella abortus in cattle in the southern region, characterizing the macroscopic findings, histological, bacteriological, immunohistochemical and molecular aspects of this disease. The third article relates a Geotrichum candidum infection in aborted bovine fetus associated with skin and lung lesions. The occurrence of multiple congenital malformations in an aborted bovine fetus is reported in the fourth article and cases of Dexter chondrodysplasia type of aborted fetuses are described in the fifth.

A mortalidade fetal é uma causa importante de perdas reprodutivas em animais domésticos e tem impacto significativo na rentabilidade de um sistema de produção animal. No Brasil, poucas informações são disponíveis sobre as principais causa de aborto em bovinos. O presente estudo resultou em cinco artigos. O primeiro artigo descreve as principais causas de aborto bovino diagnosticadas no Setor de Patologia Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul no período 2003-2011. Neste período um total de 490 fetos bovinos foi analisado. Causas específicas de aborto foram encontradas em 46,7 % dos casos. Infecções por protozoários, em especial Neospora caninum acometeram 33 % dos casos (162/490). Bactérias em 6,3 % (31/490), seguidas por fungos 0,8% (4/490) foram causas adicionais de abortos. Em dois fetos (0,4 %), coinfecções por dois agentes foram identificadas. Causas não infecciosas foram observadas em 3 % dos abortos e malformações congênitas a 2,6%. No segundo artigo estima-se a ocorrência de abortos por Brucella abortus em bovinos na região sul, caracterizando os achados macroscópicos, histopatológicos, bacteriológicos, imuno-histoquímicos e de PCR desta enfermidade. No terceiro artigo relata-se a infecção por Geotrichum candidum em feto bovino abortado associado a lesões de pele e pulmonares. A ocorrência de malformações congênitas múltiplas em um feto bovino abortado é relatada no quarto artigo e casos de condrodisplasia tipo Dexter em fetos bovinos abortados são descritos no quinto. / The fetal mortality is an important cause of reproductive failure in domestic animals and has a significant impact on the profitability of a livestock production system. In Brazil, little information is available on the main cause of abortion in cattle. This study resulted in five articles. The first article describes the main causes of abortion in cattle diagnosed in the period January 2003 to december 2011. A total of 490 fetuses, from several Brazilian states, were evaluated. Specific causes of abortion were found in 46,7 % of cases. Protozoan abortions especially Neospora caninum were detected in 33 % (162/490) of the cases. Bacterial abortions corresponded to 6,3 % (31/490), followed by fungal 0,8 % (4/490). In two aborted fetuses (0,4 %), a co-infection with two agents could be identified. Noninfectious diseases could be associated with 3 % of the abortions and congenital malformations with 2,6%. In the second article estimated the incidence of abortion by Brucella abortus in cattle in the southern region, characterizing the macroscopic findings, histological, bacteriological, immunohistochemical and molecular aspects of this disease. The third article relates a Geotrichum candidum infection in aborted bovine fetus associated with skin and lung lesions. The occurrence of multiple congenital malformations in an aborted bovine fetus is reported in the fourth article and cases of Dexter chondrodysplasia type of aborted fetuses are described in the fifth.

O experimento 1 verificou o efeito de um protocolo de indução e sincronização de estros em novilhas sobre a cronologia das parições e a repetição de crias como primíparas. 194 novilhas Hereford e Braford foram divididas em 2 grupos: Tratamento, submetido a um protocolo misto de observação e sincronização de estros e inseminação artificial a tempo fixo (IATF); e Controle, submetido ao manejo convencional de inseminação artificial (IA). Ambos grupos foram submetidos a repasse por touros. O Experimento 2 avaliou o efeito de um pré-tratamento com norgestomet (NOR), prévio a um protocolo de sincronização para IATF em novilhas, sobre as taxas de prenhez, assim como os efeitos de características relacionadas com a reprodução. 74 novilhas Angus e cruzas, 18 e 24 meses de idade, com peso médio de 276 kg, condição corporal (CC) mínima de 3 (1-5) e avaliadas por ultra-som para o status ovariano, onde utilizaram-se somente novilhas 2 e 3 (1-3). Pesagens a cada 30 dias, desde os 60 dias anteriores aos serviços. Coletado sangue para dosagem de progesterona. Os animais foram divididos em 2 grupos: Tratamento, que recebeu um implante com 6 mg de NOR, na orelha direita, permanecendo por 14 dias; e Controle, que não recebeu implante. Dez dias após a retirada dos implantes, todas as novilhas foram a um protocolo para IATF, com uma injeção de GnRH, 7 dias depois uma aplicação de prostaglandina (PGF) e 48 horas mais tarde, as IATF e outra aplicação de GnRH. Quatorze dias após iniciou-se repasse com 2 touros, por mais 45 dias. O Experimento 3 avaliou o efeito da suplementação com progestágeno (acetato de medroxi-progesterona; MAP) ou progesterona, anteriormente a um protocolo para IATF, e verificou o efeito de características associadas à reprodução de novilhas, e de distintos manejos alimentares sobre as taxas de prenhez. Utilizaram-se 102 novilhas Angus, cruzas Angus e Braford, 22-24 meses, peso médio 241 kg e CC mínima de 2,5. Pesagens a cada 30 dias, a partir dos 60 dias anteriores aos serviços e ultra-som para o status ovariano (1-3). Quarenta e cinco dias antes da estação foram divididas em 2 grupos, Sem Suplementação, com 27 novilhas exclusivamente sobre pastagem natural, e Com Suplementação, com 75 novilhas consumindo 1% do peso em concentrado. Coletas de sangue para dosagem de progesterona. Grupos novamente divididos em 3, para receber dispositivo com progesterona, ou uma esponja intravaginal com MAP, ambos por 10 dias. O grupo Controle não recebeu nenhum tratamento. Na retirada dos implantes, todas as novilhas receberam PGF, e 4 dias depois, foram a um protocolo para IATF, com 2 mg de benzoato de estradiol na colocação de uma esponja com MAP. Sete dias depois, a esponja foi retirada, sendo aplicada PGF, seguindo-se nova aplicação de BE 24 horas depois, e IATF 52-56 horas após a PGF. Observação de estros 2 vezes por dia, desde a PGF até a IATF. Passados 14 dias, iniciou repasse por 4 touros, durante 45 dias. O Experimento 4 avaliou o efeito da suplementação de novilhas de corte com gammaorizanol, sobre o desempenho reprodutivo, assim como o efeito de outras características sobre a reprodução. Utilizaram-se 84 novilhas Angus, Hereford, Braford e Angus x Hereford, com 24 meses, peso médio de 283 kg e CC ≥ 3. Pesagens a cada 30 dias, desde 60 dias antes até o início dos serviços, coletas de sangue para dosagem de progesterona. Duas avaliações da espessura de gordura subcutânea, sobre a região P8 por ultra-som, com intervalo de 30 dias. Animais foram divididos em 2 grupos: Tratamento, que recebeu desde 45 dias antes até o início da estação reprodutiva, 150 ml/dia de gamma-orizanol junto à 1 kg de concentrado; e Controle, com 150 ml/dia de melaço, junto à 1 kg do mesmo concentrado. Observações de estros 2 vezes/dia e IA. Dez dias após aplicou-se PGF a todas ainda não observadas em estro, prosseguindo-se a observação e IA por mais 25 dias. Após, repasse por 2 touros por 45 dias. Diagnósticos de gestação por ultra-som, 30 dias após as IATF ou IA, e novamente, 30 dias depois de retirados os touros. No experimento 1, a porcentagem de prenhez na primeira estação reprodutiva foi semelhante para os 2 grupos. Entretanto, a repetição de crias nas primíparas do grupo Tratamento foi significativamente maior. No Experimento 2, não foram observadas diferenças entre as taxas de prenhez à IATF e final, e conforme a idade e o status ovariano. No Experimento 3, taxas de estro superiores para o grupo Progesterona em relação ao Progestágeno e Controle. Entretanto, taxas de prenhez semelhantes entre os grupos. Foi encontrada diferença entre o peso 24 dias antes dos serviços, para as novilhas que emprenharam em relação às que permaneceram vazias e para os pesos das novilhas ao final da temporada. As novilhas com status ovariano 2 e 3 foram mais pesadas em relação ao 1, mas as taxas de prenhez não diferiram com o status ovariano. O concentrado proporcionou superior GMD para o grupo Com Suplementação, mas sem diferenças para as taxas de prenhez. No Experimento 4, taxas de prenhez semelhantes para Tratamento e Controle. Novilhas prenhas foram as que acumularam maior quantidade de gordura na região P8. Concluindo, o manejo com sincronização de estros e IATF na primeira estação reprodutiva em novilhas, apesar de apresentar índices idênticos de prenhez ao final da temporada, proporcionou diferença significativa nos índices de prenhez na segunda estação. O pré-tratamento com norgestomet não proporcionou superiores taxas de prenhez em novilhas. Da mesma forma, o priming com progesterona ou MAP, não proporcionou taxas de prenhez superiores, assim como a utilização de suplementação alimentar. O peso corporal antes ou dos serviços, foi superior para as novilhas que emprenharam. Novilhas com status ovariano 2 e 3, foram mais pesadas. O fornecimento de gamma-orizanol não proporcionou superiores taxas de prenhez ou peso corporal, entretanto, novilhas que resultaram prenhas, acumularam maior quantidade de gordura antes da estação reprodutiva. / Experiment 1 verified the effect of an estrus synchronization protocol in heifers on parturition chronology and primiparous reproductive performance. 194 Hereford and Braford heifers were divided into 2 groups: Treatment group, submitted to an estrus observation and synchronization to fixed-time artificial insemination (FTAI) protocol; and Control group, submitted to a conventional artificial insemination (AI) management. All groups were submitted to a bull’s clean-up period. Experiment 2 evaluated the norgestomet (NOR) priming effect, before a fixed-time artificial insemination protocol (FTAI) in heifers, on pregnancy rates, as well as the effects of reproductive related characteristics. 74 Angus and cross-bred heifers, 18 and 24 months old, with 276 kg of body weight, body condition score (BCS) minimum of 3 (1- 5), and ovarian status evaluated by US. Only the 2 or 3 class heifers were used (1-3). Heifers were weighted at 30 days intervals, starting 60 days before the reproductive period. Blood was collected for progesterone assay. Heifers were divided in 2 groups: Treatment group, that received an ear implant with 6 mg of NOR, in the right ear, removing it 14 days after; and Control group, did not receive the implant. Ten days after the implants removal, all heifers were submitted to FTAI protocol, which including a GnRH i.m. injection, 7 days after the prostaglandin (PGF) aplication, and 48 hours later, FTAI and a second GnRH injection. Fourteen days later, started a clean-up period with 2 bulls, for 45 days more. Experiment 3 evaluated the progestin (medroxiprogesterone acetate; MAP) or progesterone suplementation effect, before a FTAI protocol, and evaluated the effects of reproductive associated characteristics in heifers, and feeding managements over pregnancy rates. 102 Angus, cross-bred Angus and Braford heifers, 22-24 months old were used, with an average body weight of 241 kg, and a minimum BCS of 2,5. Heifers were weighted at 30 days intervals, starting 60 days before the breeding period and an ecography was performed to evaluate ovarian status. Fourty five days before the season, heifers were divided into 2 groups. Without Suplementation group, with 27 heifers, only over natural pastures, and With Suplementation group, with 75 heifers receiving suplementation (72% TDN and 15% GP) about 1% body weight. Blood was collected for progesterone assay. Groups were again divided into 3, to receive a progesterone device or an intravaginal MAP sponge, for 10 days. The Control group, not received the treatment. At the implants removal, all heifers received PGF, and 4 days later were submitted to a FTAI protocol, with 2 mg estradiol benzoate with an intravaginal MAP sponge aplication. Seven days later, the sponge was removed, and PGF was injected, with a new EB injection, 24 hours later, and FTAI 52-56 hours after PGF. Estrus was observed from PGF injection to FTAI. A clean-up period started 14 days after with 4 bulls, for more 45 days. Experiment 4 evaluated the gamma-orizanol suplementation effects and other reproductive associated characteristics on fertility of beef heifers. 84 Angus, Angus x Hereford, Hereford and Braford heifers, 24 months old were used, with an average body weight of 283 kg and BCS ≥ 3. Heifers were weighted at 30 days intervals, to register ADG, and blood samples were collected for progesterone assay. Two subcutaneous fat thickness ecographic evaluations were performed at P8 region, with a 30 days interval. Animals were divided into 2 groups: Treatment group, that received 150 ml/day of gammaorizanol with 1 kg of concentrate since 45 days before the reproductive season start ; and Control group, with 150 ml/day of molasses with 1 kg of concentrate during the same period. Estrus control was done twice for day with AI of estrous heifers. Ten days later PGF was applied to all heifers that did not show estrus. The AI management continued for 25 days. In sequence, a clean-up period with 2 bulls was performed for 45 days. Gestational diagnostics by ecography at 30 days after FTAI, and again at 30 days after bulls removal. In experiment 1, pregnancy rates were similar between groups after first reproductive season. However, the repetition of Treatment group was significantly higher. In Experiment 2, were not observed differences between groups in FTAI and final pregnancy rates, without differences for age or ovarian status In Experiment 3, Progesterone group presented the higher estrus rates than Progestin and Control groups. However, were not observed differences in pregnancy rates among the groups. At the same experiment, difference on weights before mating was found between the heifers that became pregnant compared to heifers that stayed non pregnant. Heifers with ovarian status 2 and 3 had higher average weight than heifers with status 1. The suplementation enhanced ADG in the With Suplementation group, but it did not produce differences on pregnancy rates. In Experiment 4, pregnancy rates were similar between groups. Heifers which became pregnant acumulated more fat amount in P8 region, during the treatment period. In conclusion, the first breeding season management with synchronization to FTAI in heifers, since being presented identical final pregnancy rates, produced signifficative differences on pregnancy rates in the second breeding season. The priming with norgestomet did not enhance pregnancy rates in beef heifers, as well the progesterone or progestin primings and the different feeding managements. Heifers with ovarian status 2 and 3, had higher body weights. Gamma-orizanol supplementation did not enhanced pregnancy rates, ADG neither body weight. Heifers that became pregnant, acumulated more fat amount on P8 region before the reproductive season.

Em experimento conduzido com o objetivo de avaliar os efeitos da concentração da dose de sêmen e o horário da inseminação artificial a tempo pré-fixado, foram utilizadas 516 fêmeas bovinas. Os animais, das raças Aberdeen Angus (Bos taurus) e Braford (Bos taurus 5/8 x Bos indicus 3/8) eram constituídos de 270 novilhas e 246 vacas multíparas. Os animais foram submetidos a um protocolo de sincronização de estros e ovulação através de implante vaginal contendo 250 mg de Acetato de Medroxiprogesterona (MAP) associado a duas aplicações de Benzoato de Estradiol (BE), sendo a primeira de 2 mg IM por ocasião da inserção do implante e a segunda de 1 mg IM vinte e quatro horas após a retirada do mesmo. Quando da remoção do implante foram administrados 500 mcg de Cloprostenol Sódico. As inseminações foram efetuadas às 48, 54 ou 60 horas após a retirada do implante, utilizando para cada momento duas concentrações distintas de espermatozóides viáveis, 10 e 20 milhões por dose. Verificou-se que as fêmeas (em especial as novilhas) inseminadas às 48 horas com 20 milhões de sptz/dose apresentaram índice de prenhez significativamente maior do que as inseminadas no mesmo momento com 10 milhões sptz/dose. As vacas inseminadas com 10 milhões de sptz às 60h apresentaram melhor taxa de prenhez (p<0,05) quando comparadas às inseminadas com 10 milhões de sptz às 48h. O percentual de prenhez encontrado nas vacas foi significativamente maior que o das novilhas, assim como o verificado nas fêmeas Aberdeen Angus, comparadas às Braford. A taxa de prenhez de novilhas inseminadas a tempo fixo pode ser incrementada utilizando-se maior número de espermatozóides viáveis por dose inseminante. / The objective of this study was to analyse the effects of semen concentration and moment of fixed timed insemination on pregnancy rates in 516 beef cattle females of the Aberdeen Angus (Bos taurus) and Braford (Bos taurus 5/8 x Bos indicus 3/8) breeds. The females were constituted of 270 heifers and 246 multiparous cows. The animals were all submitted to a synchronization program consisting of vaginal implants of 250mg of medroxiprogesterone acetate (MPA) associated to application of 2mg IM of estradiol benzoate (EB).After 7 days the implants were removed and 500 mg of cloprostenol were injected at the time. After 24hs of implant removal 1mg IM of EB was injected. The inseminations were done 48, 54 and 60 hours after the removal of the implants and semen with 10 and 20 million viable spermatozoa per dosis was used. The females (specially the heifers) of the group inseminated 48 hours after implant removal and using semen with 20 million viable sptz showed a significant higher percentage of pregnancy than the inseminated 48 hours using 10 million viable sptz. The cows inseminated at 60 hours with 10 million sptz showed higher pregnancy rates (p<0,05) than cows inseminated at 48 hours with 10 million sptz. The total pregnancy rate achieved on the cows was significantly higher than on the heifers. The females of the A. Angus group had higher pregnancy rates than the females of the Braford breed. The pregnancy rate of heifers fixed-timed inseminated can be increased using a higher semen concentration.

Disenteria de inverno é uma doença causada pelo coronavírus bovino que afeta animais adultos. Descrevem-se dois surtos de disenteria de inverno em rebanhos leiteiros nos municípios de Viamão e Vespasiano Corrêa, Rio Grande do Sul. A doença foi reproduzida experimentalmente em dois bovinos adultos. O quadro clínico se caracterizou por diarréia, inicialmente líquida esverdeada com estrias de sangue e muco, que em alguns animais, evoluiu para coloração marrom escura à sanguinolenta e que persistiu, em média, cinco dias. Na propriedade de Vespasiano Corrêa os animais apresentaram sinais respiratórios como tosse e corrimento nasal. Diminuição na produção de leite e no consumo de alimentos, além de graus variados de depressão foram também observados. Foi detectada a presença do coronavírus bovino nas fezes e secreção nasal dos animais pela técnica da nested RT-PCR. Foi realizada necropsia de um animal naturalmente infectado que morreu devido à doença. Na necropsia, observou-se mucosas pálidas, conteúdo sanguinolento com presença de grande quantidade de coágulos, principalmente no cólon espiral e petéquias na mucosa do cólon. No cólon espiral, foram observados os principais achados histológicos que incluíram criptas dilatadas sem epitélio de revestimento, ou revestidas por epitélio pavimentoso e/ou cuboidal, às vezes, com núcleos grandes e nucléolos proeminentes. Algumas criptas eram preenchidas por debris necróticos e polimorfonucleares. Amostra de fezes de um animal naturalmente infectado foi usada, através de uma suspensão administrada via oral e nasal, para tentar induzir infecção experimental em 3 bovinos de 20 meses. Foi observada diarréia em dois desses animais, no 5º dia após a inoculação. Esses animais foram eutanasiados ao 2º e 3º dias de diarréia. As lesões histológicas dos casos experimentais foram semelhantes àquelas do caso natural. Na imuno-histoquímica anti-coronavírus bovino (8F2) em cortes de tecido incluído em parafina do cólon espiral, houve marcação positiva no citoplasma de enterócitos das criptas, nos debris necróticos dessas criptas e em macrófagos na lâmina própria, tanto no caso natural como nos experimentais. Nos casos experimentais, também foi observada marcação imuno-histoquímica positiva em duodeno, jejuno, íleo, ceco, cólon descendente e epitélio de revestimento dos cornetos nasais. / Winter dysentery is caused by bovine coronavírus that affects adult animals. This report describes two outbreaks of the disease in dairy herds located in the counties of Viamão and Vespasiano Corrêa, Rio Grande do Sul. The disease was induced experimentally in two adult cattle. The most significant clinical sign was profuse and watery diarrhea, which ranged from greenish to brownish coloration with occasional blood streaks and mucus to a bloody diarrhea. In one herd, animals showed respiratory signs such as cough and nasal discharge. Most cases persisted for 5 days and also included depression, decreased milk production, and diminished food intake. The presence of bovine coronavirus was detected in feces and nasal secretions of animals by nested RTPCR. Necropsy was performed in one animal naturally affected and died due to the disease and revealed pale mucosa, sanguineous contents, and blood clots particularly within the spiral colon and pinpoint hemorrhages on the colonic mucosa. Histopathological lesions were predominant in the spiral colon and consisted of a high number of dilated crypts without epithelium or with replaced pavement epithelium with occasional immature cuboidal cells, which sometimes showed enlarged nucleus and prominent nucleolus. Some crypts were filled with epithelial desquamation and polymorphonuclear cells. Fecal samples from one naturally infected animal were used as a suspension and inoculated orally and nasal in three 20-month-old heifers. Diarrhea was observed in 2 of them and started on the 5th day post infection. These animals were euthanized at the second and third days of diarrhea. The histological lesions of experimental cases were similar to the natural case. Anti-bovine coronavirus (8F2) immunostaining was applied on paraffin embedded sections of the spiral colon and showed positive reactions in the cytoplasm of the infected crypt epithelium, sloughed necrotic cells, and within macrophages in the lamina propria of both, natural and experimental cases. Positive reactions were also seen in duodenum, jejunum, ileum, cecum, descending colon and the epithelium lining the nasal turbinate from experimental cases.

Apesar da obtenção de animais nascidos vivos a partir de oócitos imaturos bovinos congelados ou vitrificados, um dos grandes desafios continua sendo o desenvolvimento de um método que proporcione melhores resultados de viabilidade pós-criopreservação. Assim como a ação dos crioprotetores empregados, a eficiência no processo de maturação in vitro (MIV) influi diretamente na taxa de desenvolvimento embrionário. Durante a maturação oocitária in vitro observa-se expansão e mucificação das células da granulosa que formam o complexo cumulus oophorus-oócito (CCO), em função da intensa síntese de componentes da matriz extracelular. Essas modificações no aspecto do cumulus são utilizadas como indicativo da ocorrência de maturação oocitária e contribuem para que ocorra a fecundação. A expressão gênica de proteínas associadas à matriz extracelular das células do cumulus pode estar sob influência de fatores de origem oocitária e de composição do meio de MIV. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão gênica das proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e HSP70-1 (proteína de choque térmico) em células do cumulus oophorus de oócitos imaturos bovinos submetidos a exposição e/ou vitrificação em duas soluções crioprotetoras e, posteriormente, maturados in vitro. Foram comparadas duas soluções de vitrificação (SV): SV1 = 20% de etileno glicol (EG) + 20% de 1,2 propanediol (PRO), e SV2 = 20% de EG + 20% DMSO + 0,5M de sacarose. Os CCOs foram obtidos a partir de ovários coletados de fêmeas bovinas logo após o abate, selecionados morfologicamente e distribuídos em 6 grupos experimentais: G1 (AOC), CCOs não maturados; G2 (AMC), CCOs submetidos à MIV; G3 (B1EC), CCOs expostos à SV1 e submetidos à MIV; G4 (B2EC), CCOs expostos à SV2 e submetidos à MIV; G5 (A1VC), CCOs vitrificados com a SV1 e submetidos à MIV; G6 (A2VC), CCOs vitrificados com a SV2 e submetidos à MIV. A MIV foi realizada em TCM 199 suplementado com soro de égua em estro, à 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. Após a MIV, 5 CCOs de cada grupo (G2 a G6), foram coletados, submetidos ao desnudamento mecânico e as células do cumulus foram concentradas por centrifugação e acondicionadas em tubos cônicos de 0,5 ml em nitrogênio líquido. O restante dos CCOs destes grupos foi submetido a fecundação e cultivo in vitro sob condições semelhantes a MIV. Para a extração do RNA total das amostras de células do cumulus foi utilizado o reagente TRIzol®. O RNA total foi re-suspenso e as amostras foram submetidas à captação específica do mRNA utilizando-se um “kit” comercial de separação magnética. Os mRNAs foram transcritos reversamente em cDNA utilizando-se a técnica de RT-PCR, para avaliar os padrões de expressão dos quatro transcritos de bovinos (link protein, HAS2, conexina 43 e HSP70-1). O grupo de oócitos imaturos exposto a SV1 apresentou uma taxa de blastocistos (30,1%) semelhante ao grupo controle (38,1%) e significativamente superior ao grupo exposto a SV2, (16,9%; p=0,0013). Houve diferença significativa (p<0,0001) entre o grupo controle e os grupos vitrificados nas soluções SV1 e SV2, tanto na taxa de clivagem (respectivamente, 79,2%; 22,1% e 43,3%) quanto no desenvolvimento até o estádio de blastocisto (respectivamente, 35,6%; 0% e 4,1%). A análise dos resultados de abundância relativa obtida a partir das células do cumulus oophorus de 5 CCOs bovinos em cada um dos seis grupos experimentais, após três repetições, não mostrou diferença significativa entre os diferentes grupos testados para os transcritos de link protein (p=0,738), HAS2 (p=0,772), conexina 43 (p=0,130) e HSP70-1 (p=0,333). / The major challenge in the cryopreservation of bovine immature oocytes is still developing a method that provides adequate results of survival and viability after vitrification. As the action of cryoprotectants employed, the efficiency of in vitro maturation (IVM) process directly influences the embryonic development. The mucification and expansion of the granulosa cells from the cumulus oophorus-oocyte complex (COC), caused by copious synthesis and deposition of extracellular matrix components, is observed during oocyte maturation in vitro. Such changes in the cumulus appearance are used as indicative of the oocyte maturation occurrence and contribute to fertilization. The gene expression of proteins associated with the extracellular matrix of the cumulus cells could be on the oocyte and/or IVM medium composition influences. The aim of this study was to evaluate, through the RT-PCR technique, the gene expression of hyaluronic acid synthase protein 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), connexin 43 (GJA1) and heat shock protein 70 (HSP70-1) in the cumulus oophorus cells of bovine immature oocytes exposed and/or vitrified in cryoprotectant solutions and then matured in vitro. We compared two vitrification solutions (VS): VS1 = 20% ethylene glycol (EG) + 20% 1,2 propanediol (PRO), and VS2 = 20% EG + 20% DMSO + 0.5 M sucrose. The COCs were obtained from cow ovaries, collected right after slaughter. After the morphological selection, the COCs were allocated into six experimental groups: G1- imature COCs; G2- COCs subjected to IVM; G3- COCs exposed to VS1 and subjected to IVM; G4- imature COCs exposed to VS2 and submitted to IVM; G5- COCs vitrified with VS1 and subjected to IVM; and G6- COCs vitrified with VS2 and submitted to IVM. The IVM was performed in TCM 199 supplemented with oestrus mare serum, at 39°C, under 5% of CO2 and maximum relative humidity, for 22 to 24 hours. After IVM, five COCs in each group (G2 to G6) were collected, the oocytes were stripped of cumulus cells by vortexing and the cells were concentrated by centrifugation and placed in conical tubes of 0.5 ml in liquid nitrogen. In each group COCs were subjected to in vitro fertilization and culture under similar conditions from used in MIV. The RNA extraction from samples containing the cumulus cells was performed by using TRIzol® reagent protocol. Total RNA was re-suspended and the samples were subjected to the specific capture of mRNA using a commercial kit for magnetic separation. The mRNAs were reverse transcribed into cDNA using the RT-PCR technique to evaluate patterns of expression of the four bovine transcripts (link protein, HAS2, connexin 43 and HSP70-1). The immature oocytes group exposed to VS1 showed a blastocyst rate (30.1%) similar to the control group (38.1%) and significantly higher than the group exposed to VS2, (16.9%, p = 0.0013). Significant difference (p <0.0001) was observed between the control group and groups vitrified in the VS1 and VS2, both in the rate of cleavage (respectively, 79.2%, 22.1% and 43.3%) and the development to the blastocyst stage (respectively, 35.6%, 0% and 4.1%). The results of relative abundance obtained from the cumulus cells of the five bovine COCs in each experimental group, after three repetitions, showed no significant difference between the groups tested for the transcripts of link protein (p = 0.738 ), HAS2 (p = 0.772), connexin 43 (p = 0.130) and HSP70-1 (p = 0.333).

O herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1) está amplamente disseminado no rebanho bovino brasileiro. Visando aprofundar o conhecimento sobre a patogenicidade para o trato respiratório de amostras dos subtipos deste vírus mais freqüentemente encontrados no Brasil (BHV-1.1 e BHV-1.a), isolados autóctones oriundos de casos de doença respiratória foram inoculados em bovinos suscetíveis. As amostras de ambos os subtipos foram capazes de induzir doença respiratória após inoculação pela via intranasal, em intensidade que variou de moderada a grave, independentemente do subtipo de vírus inoculado. Foi ainda caracterizada a resposta imune humoral induzida por tais amostras quanto ao perfil de classes e subclasses de imunoglobulinas, sendo esta igualmente indistinguível com relação aos vírus inoculados. O perfil de classes de imunoglobulinas apresentadas pelos animais permitiu a determinação do status da infecção nos animais inoculados através da análise da resposta sorológica. Na segunda etapa deste trabalho foram testadas as propriedades vacinais de um vírus recombinante, do qual foi deletada a glicoproteína E (gE; 265gE-), gerado a partir de uma amostra brasileira de BHV-1.2a. Experimentos de inoculação do recombinante 265gE- em animais suscetíveis e o desafio destes animais com a amostra parental virulenta demonstraram a segurança e eficácia desta amostra na prevenção de sinais clínicos da infecção pelo BHV-1. Posteriormente, o recombinante 265gE- foi inoculado em vacas em diferentes estágios da gestação. Não foram observadas quaisquer anormalidades nestas gestações e as 22 vacas vacinadas deram à luz a animais saudáveis. Conclui-se que o recombinante é imunogênico e capaz de conferir significativa proteção frente ao desafio com a amostra parental virulenta do vírus. O recombinante também não causou enfermidade nas vacas inoculadas nem tampouco aos fetos quando inoculado em diferentes estágios da gestação.