La vacuole est un organite qui joue un rôle important dans de nombreux processus de la cellule végétale, et en particulier dans la protection contre les toxiques cellulaires. Parmi ceux-ci, le cadmium est un polluant courant qui affecte les fonctions physiologiques de la plante. La vacuole est connue pour sa capacité à séquestrer les ions métalliques présents dans le cytosol. Toutefois, les acteurs protéiques de cette compartimentation, et notamment les transporteurs, ne sont pas bien connus. Afin de mieux comprendre le rôle de cet organite dans les mécanismes de protection contre le stress métallique, nous avons mis en place une série d'outils d'analyse du protéome vacuolaire, dans le but de réaliser une caractérisation protéomique de référence de cet organite, utile pour l'étude de sa dynamique en conditions de stress. Mon travail a consisté dans un premier temps à mettre au point une méthode de purification de vacuoles à partir de cellules en culture d'Arabidopsis thaliana. La pureté des échantillons obtenus a été confirmée à l'aide de tests biochimiques (western-blots et mesures d'activités enzymatiques) et nous avons pu initier l'analyse par spectrométrie de masse des constituants protéiques de la membrane et de la fraction soluble de la vacuole. Celle-ci a permis d'identifier 689 protéines non-redondantes, dont 110 transporteurs. La localisation in vivo de 5 d'entre elles a été réalisée via l'expression in planta de ces protéines fusionnées à la GFP. Cette première approche protéomique a été complétée d'une étude plus approfondie du protéome vacuolaire, visant à en acquérir des notions quantitatives et organisationnelles. Pour cela, des gels d'électrophorèses bidimensionnelles (IEF / SDS-PAGE) ont été réalisés à partir de la fraction soluble des vacuoles. Les spots résolus ont été quantifiés via le logiciel d'analyse d'images PDQuest et identifiés par spectrométrie de masse. Cette étude a permis de mettre en évidence un certain nombre de protéines majeures de ce compartiment et a porté le nombre total de protéines vacuolaires identifiées par nos travaux à 709. Quelques protéines connues pour être cytosoliques ont toutefois été retrouvées, et une cartographie du protéome cytosolique a également été réalisée afin de la comparer avec celle du protéome soluble de la vacuole et tenter de mieux comprendre l'origine de ces protéines. Cette analyse a été complétée d'une expérience préliminaire de digestion de vacuoles intactes par la protéinase K. Les résultats obtenus suggèrent la présence de protéines à l'intérieur de la vacuole (probablement en cours de dégradation), et d'autres associées à la face externe du tonoplaste probablement de façon spécifique. Enfin, la présence de complexes protéiques a été évaluée à travers la réalisation d'électrophorèses en conditions non dénaturantes qui ont permis de retrouver des complexes connus (ATPase vacuolaire) mais aussi de mettre en évidence plusieurs complexes putatifs de protéines diverses (protéases, glycosidases ...). Un dernier aspect de mon travail a enfin consisté à développer un outil informatique d'exploitation de données d'analyses à haut débit. La confrontation, grâce à cette structure, des résultats de protéomiques vacuolaires et d'autres d'expression génique lors d'un stress cadmium ont permis d'identifier des protéines présentes dans (ou associées à) la vacuole dont le niveau de transcrit est modulé lors d'un stress. Ces analyses croisées ont notamment mis en évidence la protéine DWARF1, qui catalyse une étape de la biosynthèse des brassinostéroïdes, une classe d'hormones. L'étude de l'implication de cette hormone a alors montré que celle-ci est capable de moduler la tolérance au cadmium de plantules, très probablement via des mécanismes qui n'ont encore jamais été identifiés. L'ensemble de ce travail constitue une base pour l'étude ultérieure de la dynamique du protéome vacuolaire. Il propose des méthodes et des outils d'analyse, ainsi qu'une série de données de référence, pour mieux comprendre les processus vacuolaires de la détoxication métallique, et a d'ores et déjà permis de mettre en évidence des aspects nouveaux du fonctionnement de cet organite.

Orientador: Claudia R. B. Haddad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T21:05:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dalio_RonaldoJoseDurigan_M.pdf: 923106 bytes, checksum: 4cfd1d62015260abdbf750e8baf62aa6 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Plantas de Cajanus cajan receberam aplicações de brassinosteróide ou de clotrimazol (inibidor de síntese de brassinosteróides) e foram submetidas à salinidade. O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito de duas concentrações de brassinosteróide (1 x 10-7 e 0,5 x 10-9 M) e uma de clotrimazol (1 x 10-4 M), no crescimento, composição bioquímica e transporte de aminoácidos em plantas de C. cajan, submetidas à duas concentrações de NaCl (200 e 400 mM). A salinidade afetou os parâmetros de crescimento (massas frescas e secas, comprimento da parte aérea e da maior raiz, número de folhas, área e suculência foliar), os parâmetros bioquímicos (teores de nitrato, prolina, aminoácidos livres, proteínas totais, açúcares solúveis, sacarose, clorofilas e carotenóides) e o padrão dos aminoácidos transportados. A proporção da maioria dos aminoácidos transportados no xilema diminuiu sob salinidade, com exceção de alanina e serina. A concentração de NaCl a 400 mM provocou as maiores alterações. A aplicação de clotrimazol mostrou-se eficiente na inibição dos efeitos provocados por brassinosteróide na grande maioria dos parâmetros estudados, sob salinidade. Não houve diferença em relação à eficiência das duas concentrações de brassinosteróide utilizadas na maioria dos parâmetros avaliados. A aplicação de brassinosteróide amenizou o efeito do estresse salino na maioria dos parâmetros de crescimento, dos parâmetros bioquímicos e no padrão de aminoácidos transportados em plantas de C. cajan, submetidas à salinidade / Abstract: Plants of Cajanus cajan received applications of brassinosteroid or clotrimazol (brassinosteroids synthesis inhibitor), and were subjected to salt stress. The goal of this study was to verify the effect of two concentrations of brassinosteroid (1.0 x 10-7and 0.5 x 10-9M), and one concentration of clotrimazol (1.0 x 10-4 M) on growth, biochemical composition and transport of amino acids in plants of C. Cajan, cultivated under two concentrations of NaCl (200 and 400 mM). The salt affected growth (fresh and dry mass, shoot length and main root length, number of leaves, leaf area and succulence of leaves) and biochemical parameters (nitrate, proline, free aminoacids, total protein, soluble sugars, sucrose, chlorophylls and carotenoids concentrations), and changed the pattern of amino acids transported. The proportion of most of the amino acids transported in the xylem was reduced by salinity. Alanine and serine were exceptions. The largest alterations were caused by 400 mM of NaCl. Clotrimazol was effective in inhibiting the effects caused by brassinosteroid for the great majority of studied parameters. There was no difference between the two concentrations of brassinosteroid for most parameters evaluated, under salinity. The application of brassinosteroid was effective diminishing the effect of salt on most of the growth and biochemical parameters, and in the patterns of amino acids transported in plants of C. Cajan subjected to salt stress / Mestrado / Mestre em Biologia Vegetal

Orientador: Claudia Regina Baptista Haddad / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T21:10:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Chone_RosanaMarySartor_M.pdf: 46520912 bytes, checksum: 140ac9102b951f96df903dee18f16c8a (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: O cultivo do cafeeiro é de grande importância econômica mundial. O consumo crescente de café arábica tem levado os pesquisadores a buscar variedades que produzam bebidas de melhor qualidade e com baixos teores de cafeína. Os programas de melhoramento genético concentram esforços na busca destas características com destaque para cultivares da espécie Coffea arabica, a mais cultivada no mundo. A embriogênese somática é importante para manter características selecionadas em programas de melhoramento genético e produzir os indivíduos selecionados em grande escala, além de contribuir para estudos fisiológicos e moleculares. A embriogênese somática direta apresenta vantagens pela redução de insumos e mão de obra, devido à eliminação da fase calogênica, porém, apresenta baixa eficiência, quando comparada com a via indireta, para a espécie C. arabica. Apesar da importância da embriogênese somática direta, nada se sabe sobre os fatores que controlam a sua ocorrência em genótipos de C. arabica e tampouco há estudos com utilização de brassinosteróides na fase de indução desse tipo de embriogênese in vitro. O brassinosteróide, 24-epibrassinolídeo, foi utilizado isoladamente e em conjunto com uma citocinina, N6-(2-isopentenyl) adenina (2-iP), para avaliar seus efeitos sobre a embriogênese somática direta e verificar possíveis alterações endógenas no metabolismo desses hormônios durante a indução da embriogênese em explantes foliares da cultivar Mundo Novo de Coffea arabica. Os explantes foram cultivados em meio de cultura MS modificado, adicionado de 2-iP a 10 µM, acrescido ou não de 24-epibrassinolídeo. Foram utilizadas as seguintes concentrações do brassinosteróide: 0,01 µM, 0,10 µM e 1 µM, em dois experimentos realizados em diferentes épocas do ano. Análises de microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura foram realizadas para compreensão dos eventos anatômicos e morfológicos da via de embriogênese relacionada às diferentes combinações hormonais praticadas. Avaliações de variáveis qualitativas e quantitativas dos explantes foliares dos dois experimentos foram realizadas in vitro durante 130 e 240 dias. Na tentativa de compreender melhor a participação dos brassinosteróides na via de embriogênese somática, explantes foliares induzidos apenas com a citocinina, 2-iP, foram submetidos a análises de Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Os embriões somáticos obtidos tanto no tratamento com uso exclusivo de citocinina, como no tratamento com citocinina associada ao 24-epibrassinolídeo foram cultivados em meio de cultura para germinação e desenvolveram-se em plântulas. A aplicação do brassinosteróide levou à iniciação do processo de embriogênese somática direta, promovendo a formação de estruturas embriogênicas. Sua aplicação conjunta com citocinina aumentou o número de embriões, o número de explantes com embriões, levou à formação de embriões em condição na qual apenas a aplicação de citocinina foi insuficiente e acelerou a via embriogênica. Promoveu o desenvolvimento de embriões mais bem definidos, com características meristemáticas típicas. O aumento de picos na região do espectro de RMN, característico de moléculas esteroidais, coincidente com o período em que ocorre a embriogênese somática direta, pode ser indicativo da participação de brassinosteróides endógenos durante esse processo. Este trabalho abre perspectivas para a utilização de brassinosteróides em embriogênese somática direta em processos produtivos de C. arabica / Abstract: Coffee cultivation is of worldwide economic importance. The increasing consumption of coffee has led to search for varieties that produce better quality beverages with lower caffeine contents. Genetic improvement have concentrated their efforts on the search for these characteristics with emphasis on cultivars of the species Coffea arabica, the most cultivated in the world. Somatic embryogenesis is important to maintain selected characteristics in genetic improvement and produce selected individuals on a large scale, as well as contributing to physiological and molecular studies. Direct somatic embryogenesis shows the advantages of reduced consumables and less manual labor, due to elimination of the callus phase, but is inefficient with the species C. arabica when compared with the indirect pathway. Despite the importance of direct somatic embryogenesis, nothing is known about factors controlling its occurrence in C. arabica genotypes, nor are there any studies on use of brassinosteroids in the in vitro induction of this type of embryogenesis. The brassinosteroid 24-epibrassinolide was used alone and together with cytokinin N6-(2-isopentenyl) adenine (2-iP) to evaluate its effects on direct somatic embryogenesis and verify endogenous alterations in metabolism of these hormones during induction of embryogenesis in foliar explants of cultivar Mundo Novo of species Coffea Arabica. The explants were cultivated in modified MS culture medium with the addition of 10 µM 2-iP, with or without 24-epibrassinolide. The following concentrations of brassinosteroid were used: 0.01 µM, 0.10 µM and 1 µM, in two experiments carried out at different times of the year. Light microscopy and scanning electronic microscopy analyses were carried out in order to understand anatomic and morphologic events of embryogenic pathway as related to different hormone combinations applied. The qualitative and quantitative variables of the foliar explants were evaluated in the two experiments at points in time from 130 and 240 days. In an attempt to better understand the participation of the brassinosteroids in the somatic embryogenesis pathway, foliar explants induced only by the cytokinin 2-iP were submitted to nuclear magnetic resonance (RMN) analyses. The somatic embryos obtained both using the treatment with the exclusive use of cytokinin and in treatment with cytokinin associated with 24-epibrassinolide were cultivated in a culture medium for germination and developed into plant embryos. The application of brassinosteroid led to initiation of direct somatic embryogenesis process, promoting the formation of embryogenic structures. Its application together with cytokinin increased number of embryos, the number of explants with embryos, led to formation of embryos in a condition in which only application of cytokinin was insufficient and accelerated embryogenic pathway. It also promoted development of much better defined embryos with typically meristematic characteristics. The increase in peaks in the region of the RMN spectrum, characteristic of steroidal molecules, coinciding with the period in which direct somatic embryogenesis occurred, could be an indication of participation of endogenous brassinosteroids during the process. This work widens the perspectives for the use of brassinosteroids in direct somatic embryogenesis for productive processes with C. arabica / Mestrado / Biologia Vegetal / Mestra em Biologia Vegetal

Orientador: Jorge Vega / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T03:46:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gouvea_JorgeAlbertode_D.pdf: 1143224 bytes, checksum: 108744e4f1f8e8833644140838007856 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo:A aplicação de determinados reguladores de crescimento em plantas pode resultar na indução de resistência contra ataques subseqüentes de patógenos. Este fenômeno é conhecido como resistência sistêmica adquirida (SAR) e vários mecanismos estão envolvidos, entre eles a resposta de hipersensibilidade (HR), o aumento na atividade das enzimas peroxidases (POX) e da fenilalanina amônia-liase (PAL) nos tecidos resistentes. A fim de se detenninar o efeito do ácido salicílico (AS) e de um brassinolídeo (BR 16) na resposta hipersensível, plantas de feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.), cultivar Moruna (nc) foram tratadas com estes reguladores de crescimento e inoculadas com o Southern bean mosaic virus (SBMV). Detenninou-se o número de lesões necróticas das folhas primárias e a atividade das enzimas guaiacol peroxidases (g-POX) e PAL. Houve uma redução significativa no número de lesões necróticas nas plantas tratadas com ambos os reguladores de crescimento e um aumento significativo na atividade das g-POX, mas nenhum efeito na atividade da PAL. O efeito da aplicação de AS e BR 16 na resposta suscetível foi verificado através da aplicação destes reguladores de crescimento em plantas de feijoeiro da cultivar lalo, inoculadas com o SBMV. Os tratamentos promoveram uma redução significativa na concentração viral na sa folha trifoliolada, 28 dias após a inoculação das folhas primárias. Os resultados indicam que as aplicações de ácido salicílico e do brassinolídeo BR 16 podem ter promovido uma indução de resistência tanto local quanto sistêmica, em plantas de feijoeiro. O aumento na atividade das enzimas g-POX, envolvidas nos processos de detoxificação de espécies reativas de oxigênio, promovido pelo tratamento com ambos os reguladores de crescimento, sugere uma participação destas na redução do número de lesões necróticas das plantas inoculadas com o SBMV / Abstract: The use of certain growth regulators in plants can result in the induction of resistance against attacks of some plant pathogens. This phenomenon is known as Systemic Acquired Resistance (SAR) and several mechanisms are involved in the induction of SAR.,among them are the Hypersensitive Reaction (HR), the increase in the activity of some enzymes like peroxidases (POX) and Phenylalanine ammonia-Iyase (PAL). Two different growth regulators (salicylic acid "SA" and a brassinosteroid "BR 16") were used in order to determine the induction of local resistance in bean plants (Phaseolus vulgaris L.) of cultivar Moruna (nc). Afier the application, the plants were mechanically inoculated with Southern bean mosaic virus (SBMV), genus Sobemovirus. The number of necrotic lesion was determined in the the primary leaves and the activity of the enzymes guaiacol peroxidases (g-POX) and Phenylalanine ammonia-Iyase (pAL) were also measured. There was a significant reduction in the number of necrotic lesions in the treated plants with both growth regulators and a significant increase in the activity ofthe g-POX, but there was no effect in the PAL activity. The effect ofthe application of SA and BR 16 in the induction of systemic resistance was verified through the application of these growth regulators in bean plants cultivar Jalo, inoculated with SBMV. The treatments promoted a significant reduction in the viral concentration in the SIDleaf, 28 days afier the inoculation of the primary leaves. The results indicated that the applications of SA and of the BR 16 promoted both local and systemic resistances. The increase in the activity of the guaiacol peroxidases, enzymes involved in the scavenning of reactive oxygen species, caused by the treatment with both growth regulators, suggested a contribution in the reduction of the number of necrotic lesions in the plants inoculated with SBMV. The use of SA and BR 16 did not change the activity of PAL, enzyme involved in the lignification process and in the mechanisms of plant defense against infections / Doutorado / Doutor em Biologia Vegetal

Orientador: Marlene Aparecida Schiavinato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T08:53:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Longatti_ClaudiaAparecida_M.pdf: 1449126 bytes, checksum: be3aefaf910ddbe46531e367581164f3 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O metabolismo geral de uma planta pode ser afetado pelo excesso de sais no solo, visto que a salinidade pode causar reduções no crescimento e acelerar a senescência. Os brassinosteróides são hormônios vegetais envolvidos no aumento da tolerância a vários tipos de estresses, inclusive o estresse salino. Com o objetivo de avaliar a influência da aplicação de brassinosteróide no crescimento e metabolismo do nitrogênio em plantas de Cajanus cajan sob diferentes condições de estresse salino, plantas noduladas de C. cajan foram cultivadas em casa de vegetação na ausência ou presença de brassinosteróide (24-epibrassinolídeo), sob diferentes concentrações de NaCl (0 mM, 100 mM e 200 mM). A salinidade afetou o crescimento, reduzindo a área, o comprimento do caule, a longevidade foliar, o teor de umidade de folhas, caules e raízes, bem como a atividade da nitrogenase, os teores de pigmentos fotossintetizantes, de malondialdeído e de nitrogênio total em folhas verde maduras, e a proficiência e eficiência do uso de nitrogênio. A aplicação de brassinosteróide amenizou o efeito do NaCl nas reduções da área foliar e teores de clorofila a e total. Também atenuou o efeito do estresse salino na atividade da nitrogenase. Esse efeito positivo do brassinosteróide sobre a atividade da enzima refletiu-se no aumento da concentração de compostos nitrogenados nas folhas verde-maduras e reduziu, ainda, a perda de N nas folhas senescentes. A maior concentração de N total nas folhas verde-maduras de plantas tratadas com o 24-epibrassinolídeo levou à redução da eficiência de utilização desse elemento / Abstract: The general metabolism of a plant can be affected by salinity excess in soil, due to the fact that salinity can cause growth reduction and accelerate senescence. The brassinosteroids are plant hormones involved in increasing tolerance in several types of stress, including salt stress. In order to verify the influence of the application brassinosteroid on development and nitrogen metabolism in Cajanus cajan plants under different levels of salt stress, nodulated plants of C. cajan were cultivated in the greenhouse in the absence or presence of 24-epibrassinolide, under different concentrations of NaCl (0 mM, 100 mM and 200 mM). Salinity affected growth reducing leaf area, branch length, leaf longevity, moisture content of leaves, stems and roots, as well as activity of nitrogenase, amounts of photosynthetic pigments, malondialdehyde and total nitrogen in mature green leaves; nitrogen use proficiency and efficiency. The application of brassinosteroid attenuated the effect of NaCl on the leaf area and on the concentrations of chlorophyll a and total chlorophyll. The hormone also attenuated the effect of salt stress on the activity of nitrogenase. The positive effect of the hormone on the activity of the enzyme led to an increase in the concentration of nitrogenous compounds in the mature green leaves and reduced the lost of nitrogen in senescent leaves. The higher concentration of total nitrogen in mature green leaves of the plants treated with 24-epibrassinolide led to a reduction in nitrogen use efficiency / Mestrado / Biologia Vegetal / Mestre em Biologia Vegetal