Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2015-12-09T16:05:03Z No. of bitstreams: 1 liviabittencourtdosreis.pdf: 1213157 bytes, checksum: a26b9976306bd51e1af0a50577f782cc (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2015-12-10T13:58:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 liviabittencourtdosreis.pdf: 1213157 bytes, checksum: a26b9976306bd51e1af0a50577f782cc (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-10T13:58:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 liviabittencourtdosreis.pdf: 1213157 bytes, checksum: a26b9976306bd51e1af0a50577f782cc (MD5) Previous issue date: 2015-02-25 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A Brucella abortus é uma bactéria Gram-negativa que apresenta forma de vida intracelular facultativa e é responsável por causar a brucelose, doença que afeta humanos e animais. A resposta imune contra este patógeno envolve vários mecanismos da imunidade inata e adquirida, entre os quais a citocina IFN- típica do perfil TH1, bem como as células T CD8+, executam papeis importantes. Além das respostas imunitárias clássicas que são induzidas durante infecções por patógenos, as vias imunorregulatórias do hospedeiro podem também tornar-se ativadas no intuito de delimitar a amplitude e duração das respostas imunes, prevenindo a imunopatologia excessiva. Vários dados na literatura mostram o papel de algumas células e citocinas importantes no estabelecimento desta imunorregulação, tais como células T e B regulatórias e as citocinas IL-10 e TGF- Sobreviver a uma infecção requer, portanto, a geração de uma resposta imune controlada. Apesar da importância da imunorregulação, diversos patógenos tem exibido a capacidade de estimular os mecanismos de regulação como uma forma de se evadir do sistema imune e assim estabelecer sua infecção. Devido a isso a investigação do processo imunorregulador que surge em resposta a infecção ou que é induzida pelo próprio agente patogênico torna-se importante, podendo fornecer informações sobre novas abordagens terapêuticas para o controle da infecção. Nesse contexto, o objetivo do presente estudo foi avaliar os mecanismos imunológicos envolvidos na imunomodulação induzida pela bactéria B. abortus em modelo murino. Como metologia, animais C57BL/6 foram infectados com B. abortus e sacrificados uma, três e seis semanas pós-infecção. Um grupo de animais não infectados foi utilizado como controle. Primeiramente, avaliamos a carga bacteriana presente no baço e o índice de proliferação celular de animais infectados ou não, pelo método de MTT e por citometria de fluxo. Analisamos também os níveis de citocinas (IFN-e IL-10) pelo método de ELISA e a produção de células T e B regulatórias por citometria de fluxo, em esplenócitos derivados desses animais. Por fim, avaliamos a influência da infecção com B. abortus no curso da Encefalomielite auto-imune experimental (EAE). Como resultados, verificamos uma diminuição na proliferação celular em animais infectados, sendo esta mais proeminente em linfócitos TCD8+ e células NK+ (natural killer). Concomitantemente, foi percebido um aumento na produção da citocina IL-10. Além disso, animais infectados apresentaram maior número de células TCD4+ e TCD8+ com perfil regulatório bem como células CD19+ produtoras de IL-10, principalmente na terceira semana pós-infecção. Em relação à EAE, de forma inesperada, foi percebido um aumento do escore clínico em animais infectados, comparados aos controles. Dessa forma, foi possível concluir que a infecção por Brucella abortus é capaz de induzir a presença de elementos imunorreguladores porém, estes elementos não foram suficientes para causar uma melhora no curso da EAE. / Brucella abortus is a Gram-negative and facultative intracellular bacterium, responsible for brucellosis in humans and animals. The immune response against this pathogen involves different mechanisms from innate and acquired immunity, including IFN-, a typical cytokine from TH1 profile, as well as CD8+ T-cells. Aside from the classic immune responses induced during an infection caused by a pathogen, the immunoregulatory pathways of the host can also be activated, limiting the range and the response time of immune responses, preventing an excessive immunopathology. Data from the literature shows the role of a range of cells and cytokines in establishing this immunoregulation such as T- and B-cell regulators and IL-10 and TGF- cytokines. Survival to an infection process therefore requires the generation of a controlled immune response. Despite the importance of immunoregulation, a diversity of pathogens have shown the capacity to stimulate some regulation mechanisms to evade the immune system and then establish the infection. In this way, the investigation of the immunoregulation processes that occur in response to the infection or are induced by the pathogenic agent become important, as these can provide information about new therapeutic approaches for the control of infections. In this context, this study aimed to evaluate the immunological mechanisms involved in the immunomodulation induced by B. abortus, in a mouse model. C57BL/6 animals were infected with B. abortus and sacrificed after one, three and six weeks of infection. Non-infected animals were used as a control group. Bacterial load was evaluated in the spleen and the cellular proliferation index was evaluated for infected and non-infected animals using the MTT method and flow cytometry. Cytokine levels (IFN-e IL-10) were evaluated through ELISA and regulatory profiles of T-cells and B-cells were assessed by flow cytometry in the splenocytes of these animals. The influence of B. abortus infection was also evaluated using a experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model. As results, a decrease in cellular proliferation was observed in infected animals, with a more prominent effect in TCD8+ lymphocytes and NK (natural killer) cells. An increase in IL-10 levels was concomitantly observed. Infected animals presented a higher number of T- cells (CD4+CD25+FoxP3+ and CD8+CD25+FoxP3+) and B-cells (CD19+IL-10+) with a regulatory profile, especially after the third week of infection. Regarding EAE, an unexpected increase in clinical score was observed in infected animals when compared to control group. Thus, we concluded that Brucella abortus infection is able to induce immunoregulatory elements, although it is insufficient to cause an improvement in EAE.

Although it is known that cell-mediated immunity (CMI) plays a key role in protection against brucellosis, the exact immune mechanisms leading to protection are still not fully understood. Better understanding of the mechanisms would help in the development of a human Brucella vaccine and help in improving animal vaccines. In this research, B. abortus strain RB51 and a closely-related, nonpathogenic Ochrobactrum anthropi (strain 49237) bacterium were used to study the immune response against brucellosis in mice. Both O. anthropi strain 49237 and recombinant strain 49237 expressing Brucella protective antigen copper-zinc superoxide dismutase (Cu/Zn SOD) induced a mix of Th1 and Th2 type immune responses but failed to provide protection against virulent Brucella challenge. After changing the immune response to a predominantly Th1 type of response using CpG oligonucleotides as an adjuvant, both strains provided protection with the recombinant strain inducing significantly higher protection. It was also demonstrated that vaccination with strain RB51 induced Th1 immune responses characterized by high interferon-gamma (IFN-g) production with no interleukin-4 (IL-4) secretion as well as high IgG2a and minimal IgG1 production. A colorimetric cytotoxic T lymphocytes (CTL) assay was developed to demonstrate that strain RB51 induced an antigen-specific CTL reaction that probably plays an important role in protection. The results suggest that optimal protection against brucellosis requires IFN-g-secreting T cells and antigen-specific CTLs. Recombinant strain RB51 overexpressing Brucella Cu/Zn SOD and simultaneously expressing mycobacterial 85A antigen induced higher IFN-g production and CTL activity than the parent RB51 strain. The combined results suggest that the recombinant O. anthropi strain could be used as a human vaccine against brucellosis and that the recombinant RB51 strain could be used as an effective vaccine against both brucellosis and tuberculosis in animals. / Ph. D.

A legislação brasileira permite o uso de leite cru na fabricação de queijos curados se o período de cura for superior a 60 dias (a 5°C ou mais). Entretanto, não há evidência científica sólida de que durante a cura ocorre suficiente inativação de Brucella abortus, sob a perspectiva da segurança dos alimentos. Além disso, não há metodologia oficial para quantificação de brucelas em matriz alimentar. Desta forma este projeto propõe um protocolo para estudos da curva de decaimento de Brucella abortus durante a cura de queijos. Três partidas de queijo tipo parmesão foram feitas com leite tipo A pasteurizado, artificialmente contaminado com uma cepa pouco patogênica de Brucella abortus (1119-3). O queijo foi curado a 18°C e analisado a cada 3-4 dias até o 60º dia ou até que duas análises consecutivas fossem negativas. As amostras foram submetidas à pesquisa quantitativa de brucela em meio Farrel (36°C/3 dias). A média do Tempo de Redução Decimal (D18°C), ponderado pelas incertezas, foi de 4,31 ± 0,49 dias. Estes resultados são preliminares e é necessário realizar mais análises para gerar dados mais precisos sobre esse parâmetro, especialmente usando cepas de campo. O Tempo de Redução Decimal associado à cura do queijo é um parâmetro importante para os modelos de avaliação de risco da transmissão de brucelose pelo consumo de queijo. / Brazilian legislation allows the use of raw milk to produce ripened cheeses, when the ripening period is over 60 days (at 5°C or above). However, there is not solid scientific evidence that the ripening process inactivates enough amounts of Brucella abortus, from the food safety perspective. In addition, there is no official methodology for brucela counting in food matrix. So, this project proposes a protocol to study the decay curve of Brucella abortus during cheese ripening. Three batches of parmesan type cheese were made with pasteurized milk artificially contaminated with a less pathogenic strain of Brucella abortus (1119-3). The cheese was ripened at 18°C and analyzed each 3-4 days until 60th or until two consecutive negative results. The samples were submitted to quantitative culture for brucela in Farrel medium (36°C/3 days). The average of Decimal Reduction Time (D18°C), weighted by uncertainties, was 4,31 ± 0,49 days. This is a preliminary result and we need to run more samples to generate more accurate data about this parameter, specially using field strains. The Decimal Reduction Time associated with ripening step is an important data to input risk assessment models for cheese-born brucelosis.

A Brucella abortus causa diminuição da eficiência reprodutiva em bovinos e é também o agente de uma das zoonoses mais difundidas no mundo. A doença é alvo de programas de controle em muitos países e, no Brasil, seu combate foi melhor organizado a partir de 2001, com o lançamento de programa nacional pelo MAPA. O objetivo do presente estudo foi aperfeiçoar a detecção de B. abortus em homogeneizados de órgãos de fetos abortados por vacas infectadas. Assim, foram comparados diferentes protocolos de extração de DNA, visando à detecção de B. abortus pela PCR em amostras clínicas colhidas de fetos abortados ou bezerros oriundos de vacas experimentalmente desafiadas com B. abortus cepa 2308. Para tanto, foram construídos dois grupos padrão ouro com base na bacteriologia clássica, constituídos por: 32 pulmões (17 positivos ao isolamento), 26 baços (11 positivos ao isolamento), 23 fígados (8 positivos ao isolamento) e 22 linfonodos bronquiais (7 positivos ao isolamento). Todas essas amostras foram submetidas a três distintos protocolos de extração de DNA, seguidos do mesmo processo de amplificação com os primers B4 e B5. A análise dos resultados consolidados mostrou uma sensibilidade de 95% para o protocolo da proteinase K (PK), 86% para o do isotiocianato de guanidina (GT) e de 88% para o de Boom. Os valores encontrados de Sensibilidade para pulmão, baço, fígado e linfonodo foram, respectivamente, 100%, 100%, 100% e 71% (PK), 82%, 100%, 88% e 71% (GT) e 94%, 100%, 63% e 86% (Boom). No grupo dos animais dos quais não foi possível isolar brucellas (gold standard negativo), a PCR resultou positiva em 8 amostras para o protocolo de extração PK (4 pulmões, 1 fígado e 3 linfonodos), em 6 amostras para o protocolo de extração GT (1 pulmão, 3 fígados e 2 linfonodos) e em 37 amostras para o protocolo de extração Boom (10 pulmões, 10 baços, 10 fígados e 7 linfonodos). Esses resultados permitem afirmar que o protocolo de extração PK apresentou a melhor sensibilidade diagnóstica e que o protocolo de extração de Boom apresentou o melhor desempenho nas amostras onde o isolamento foi negativo. Dentre os órgãos estudados, o baço apresentou a maior probabilidade de detecção de B. abortus. Assim, a melhor estratégia para detecção de B. abortus em homogeneizados de órgãos de fetos abortados é a utilização do isolamento e da PCR em paralelo. / Infection by Brucella abortus diminishes the reproductive efficiency in bovines and it is also the agent of one of the most spread zoonosis in the world. In many countries control programs aim this disease, and in Brazil its combat was better organized since 2001 with the creation of the national program by the Ministry of Agriculture, Livestock and Supplies (MAPA). The objective of the present study was to improve the detection of B. abortus in aborted fetus homogenates from infected cows. For that reason, different DNA extraction protocols were compared, focusing the PCR detection of B. abortus in clinical samples collected from aborted fetus or calves obtained from cows experimentally defied with the 2308 B. abortus strain. Therefore, two gold standard groups were built based on classical bacteriology, formed by: 32 lungs (17 isolation positives samples), 26 spleens (11 isolation positives samples), 23 livers (8 isolation positives samples) and 22 bronchial lymph nodes (7 isolation positives samples). All samples were submitted to three distinct DNA extraction protocols, followed by the same amplification process with the primers B4 and B5. The analysis of the consolidated results showed a 95% sensibility for the proteinase K protocol (PK), 86 % for the guanidine isotiocianate (GT) and 88% for the Boom. The sensibility values obtained for lungs, spleen, liver and lymph node were, respectively, 100%, 100%, 100% and 71% (PK), 82%, 100%, 88% and 71% (GT) and 94%, 100%, 63% and 86% (Boom). In the group of animals in which it was not possible to isolate brucellas (negative gold standard), the PCR resulted positively in 8 samples for the PK extraction protocol (4 lungs, 1 liver and 3 lymph nodes), in 6 samples for the GT extraction protocol (1 lung, 3 livers and 2 lymph nodes) and in 37 samples for the Boom extraction protocol (10 lungs, 10 spleens, 10 livers and 7 lymph nodes). These results permit affirming that the PK extraction protocol showed the best diagnostic sensibility and that the Boom extraction protocol showed the best performance in negative isolation samples. Within the studied organs, the spleen showed the highest probability of B. abortus detection. Therefore, the best strategy for B. abortus detection in organs homogenates from aborted fetus is the utilization of isolation and in parallel, the PCR.

O estudo objetivou avaliar a eficácia do programa de vacinação contra brucelose bovina no estado do Rio Grande do Sul tendo como indicador a prevalência e individualizar os fatores de risco para a doença. O Estado foi dividido em sete regiões. Para cada região foram amostradas aleatoriamente um número preestabelecido de propriedades nas quais foi testado um número também preestabelecido de fêmeas com idade igual ou superior a 24 meses, aleatoriamente selecionadas. O protocolo do sorodiagnóstico foi composto de triagem com o teste do antígeno acidificado tamponado, seguido de teste confirmatório dos sororreagentes com o teste 2-Mercaptoetanol. Nas propriedades foi aplicado um questionário epidemiológico sobre possíveis fatores de riscos associados à brucelose bovina. No estado do Rio Grande do Sul, a prevalência de focos foi de 3,54% [2,49 4,88] e a de animais 0,98% [0,57 1,57]. Nas regiões, as prevalências de focos variaram de 0,66% a 9,03% e a de animais de 0,06% a 2,03%. Rebanhos com 15 ou mais vacas, tipologia corte e compartilhamento de pastagens emergiram como fatores de risco para brucelose bovina no estado. A situação epidemiológica da brucelose bovina no Rio Grande do Sul manteve-se estável desde 2004, a despeito de boas coberturas vacinais terem sido registradas a partir de 2009. Assim, o estado deve continuar seu programa de vacinação, dando ênfase para a qualidade do processo e estimulando a utilização da vacina não indutora de anticorpos. Adicionalmente, o estado deve realizar um grande esforço de educação para que os produtores testem os animais de reprodução para brucelose antes de introduzi-los em suas propriedades e evitem o compartilhamento de pastagens entre rebanhos de condição sanitária desconhecida. / This study aimed to evaluate the effectiveness of a bovine brucellosis vaccination program in Rio Grande do Sul, with prevalence as the indicator, and to identify risk factors for the disease. The state was divided into seven regions. For each region, a predetermined number of properties were randomly sampled, in which a pre-established number of randomly selected females aged over 24 months were tested. The serodiagnosis protocol consisted of a screening test using buffered acidified antigen, followed by a confirmatory test using 2-mercaptoethanol. An epidemiological questionnaire was utilized to identify possible risk factors associated with bovine brucellosis. In the state of Rio Grande do Sul, the prevalence of infected herds was found to be 3.54% [2.49-4.88], and the prevalence of infected animals was 0.98% [0.57-1.57]. In assessments of specific regions, the infected herd prevalence ranged from 0.66% to 3.09%, and among the animals, from 0.06% to 2.03%. In herds comprising 15 or more cows, beef type and pasture sharing emerged as risk factors for bovine brucellosis in the state. The epidemiological status of bovine brucellosis in Rio Grande do Sul has remained unchanged since 2004, even though adequate vaccination coverage has been recorded since 2009. Thus, the state should continue its vaccination program, with emphasis on the quality of the process and on encouraging the use of non-antibody inducing vaccines. In addition, the state must make a greater effort to educate producers on the importance of testing for brucellosis in breeding animals before introducing them onto their properties, and on the importance of avoiding shared grazing among herds whose health conditions are unknown.

O Pantanal é considerado uma das maiores planícies inundáveis do mundo e possui uma rica biodiversidade. Das onze espécies de tatus registradas no Brasil, sete ocorrem no Pantanal. Os tatus dividem suas áreas de vida com diversas outras espécies silvestres e com o gado, pois a produção extensiva de bovinos de corte é a principal atividade econômica da região. Estudos anteriores demonstraram exposição à Brucella abortus e Leptospira interrogans em diversas espécies silvestres no Pantanal, porém sabe-se pouco quanto à exposição e/ou presença desses agentes em tatus neste bioma. Dessa forma, o presente estudo teve por objetivo determinar a prevalência de anticorpos anti-Brucella e anti-Leptospira interrogans através do teste do Antígeno Acidificado Tamponado (AAT) e Soroaglutinação Microscópica (SAM) em amostras de soro de tatus de vida livre, provenientes do Pantanal da Nhecolândia e realizar a pesquisa direta do DNA dos agentes através do emprego da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em amostras de sangue. Foram testados 48 indivíduos de quatro espécies, sendo Dasypus novemcinctus (n=2), Cabassous unicinctus (n=8), Euphractus sexcinctus (n=16) e Priodontes maximus (n=22). Não foi observado produto amplificado pela PCR em nenhum animal testado, da mesma forma, nenhum tatu apresentou anticorpos anti-Brucella pelo AAT. Na sorologia para L. Interrogans foi encontrada prevalência de 31,25 % (5/16) em E. sexcinctus e 18,18% (4/22) em P. maximus. Esses indivíduos foram positivos para os sorovares Autumnalis/Butembo, Cynopteri/Cynopteri e Pomona/Pomona, com títulos variando de 1: 200 a 1: 1600. Os resultados obtidos reforçam a importância da vigilância de patógenos em populações de vida livre, especialmente quando existe contato com animais de produção, além de contribuir para o conhecimento de agentes infecciosos em tatus da região do Pantanal. / Pantanal is considered one of the worlds largest wetlands. Seven of the eleven species of armadillos that occur in Brazil, from a total of 21 recognized species in the world, have been recorded in this area. The main local economic activity is beef cattle production, which leads to intense wildlife-livestock contact, potentially increasing wildlife exposure to several pathogens, including those with zoonotic and economic relevance. Previous studies demonstrated that several wildlife species have been exposed to Brucella abortus and Leptospira interrogans in Pantanal; however, the exposure and/or presence of zoonotic pathogens in armadillos in this biome is still poorly understood. In order to address this question, we employed conventional polymerase chain reaction (PCR), the Rose Bengal Test (RBT) and the Microscopic Agglutination Test (MAT) to investigate the exposure and/or infection by Brucella abortus and Leptospira interrogans in blood samples of four armadillos species: nine-banded armadillo (Dasypus novemcinctus) (n=2), southern naked-tailed armadillo (Cabassous unicinctus) (n=8), yellow armadillo (Euphractus sexcinctus) (n=16) and giant armadillo (Priodontes maximus) (n=22) caught at Nhecolândia, Pantanal, Brazil. We did not detect Brucella abortus by PCR or exposure to this pathogen via the RBT in the evaluated armadillos. On the other hand, the Microscopic Agglutination Test (MAT) detected Leptospira interrogans exposure in 31.25 % (5/16) of E. sexcinctus and 18.18% (4/22) P. maximus specimens. These individuals were positive to serovars Autumnalis/Butembo, Cynopteri/Cynopteri and Pomona/Pomona, this latter with titers ranging from 1:200 to 1:1600. Our results reinforce the importance of pathogen surveillance in wildlife living in areas of livestock production and further contribute to the study of zoonotic pathogens in armadillos in the Pantanal region.

A Brucella abortus causa diminuição da eficiência reprodutiva em bovinos e é também o agente de uma das zoonoses mais difundidas no mundo. A doença é alvo de programas de controle em muitos países e, no Brasil, seu combate foi melhor organizado a partir de 2001, com o lançamento de programa nacional pelo MAPA. O objetivo do presente estudo foi aperfeiçoar a detecção de B. abortus em homogeneizados de órgãos de fetos abortados por vacas infectadas. Assim, foram comparados diferentes protocolos de extração de DNA, visando à detecção de B. abortus pela PCR em amostras clínicas colhidas de fetos abortados ou bezerros oriundos de vacas experimentalmente desafiadas com B. abortus cepa 2308. Para tanto, foram construídos dois grupos padrão ouro com base na bacteriologia clássica, constituídos por: 32 pulmões (17 positivos ao isolamento), 26 baços (11 positivos ao isolamento), 23 fígados (8 positivos ao isolamento) e 22 linfonodos bronquiais (7 positivos ao isolamento). Todas essas amostras foram submetidas a três distintos protocolos de extração de DNA, seguidos do mesmo processo de amplificação com os primers B4 e B5. A análise dos resultados consolidados mostrou uma sensibilidade de 95% para o protocolo da proteinase K (PK), 86% para o do isotiocianato de guanidina (GT) e de 88% para o de Boom. Os valores encontrados de Sensibilidade para pulmão, baço, fígado e linfonodo foram, respectivamente, 100%, 100%, 100% e 71% (PK), 82%, 100%, 88% e 71% (GT) e 94%, 100%, 63% e 86% (Boom). No grupo dos animais dos quais não foi possível isolar brucellas (gold standard negativo), a PCR resultou positiva em 8 amostras para o protocolo de extração PK (4 pulmões, 1 fígado e 3 linfonodos), em 6 amostras para o protocolo de extração GT (1 pulmão, 3 fígados e 2 linfonodos) e em 37 amostras para o protocolo de extração Boom (10 pulmões, 10 baços, 10 fígados e 7 linfonodos). Esses resultados permitem afirmar que o protocolo de extração PK apresentou a melhor sensibilidade diagnóstica e que o protocolo de extração de Boom apresentou o melhor desempenho nas amostras onde o isolamento foi negativo. Dentre os órgãos estudados, o baço apresentou a maior probabilidade de detecção de B. abortus. Assim, a melhor estratégia para detecção de B. abortus em homogeneizados de órgãos de fetos abortados é a utilização do isolamento e da PCR em paralelo. / Infection by Brucella abortus diminishes the reproductive efficiency in bovines and it is also the agent of one of the most spread zoonosis in the world. In many countries control programs aim this disease, and in Brazil its combat was better organized since 2001 with the creation of the national program by the Ministry of Agriculture, Livestock and Supplies (MAPA). The objective of the present study was to improve the detection of B. abortus in aborted fetus homogenates from infected cows. For that reason, different DNA extraction protocols were compared, focusing the PCR detection of B. abortus in clinical samples collected from aborted fetus or calves obtained from cows experimentally defied with the 2308 B. abortus strain. Therefore, two gold standard groups were built based on classical bacteriology, formed by: 32 lungs (17 isolation positives samples), 26 spleens (11 isolation positives samples), 23 livers (8 isolation positives samples) and 22 bronchial lymph nodes (7 isolation positives samples). All samples were submitted to three distinct DNA extraction protocols, followed by the same amplification process with the primers B4 and B5. The analysis of the consolidated results showed a 95% sensibility for the proteinase K protocol (PK), 86 % for the guanidine isotiocianate (GT) and 88% for the Boom. The sensibility values obtained for lungs, spleen, liver and lymph node were, respectively, 100%, 100%, 100% and 71% (PK), 82%, 100%, 88% and 71% (GT) and 94%, 100%, 63% and 86% (Boom). In the group of animals in which it was not possible to isolate brucellas (negative gold standard), the PCR resulted positively in 8 samples for the PK extraction protocol (4 lungs, 1 liver and 3 lymph nodes), in 6 samples for the GT extraction protocol (1 lung, 3 livers and 2 lymph nodes) and in 37 samples for the Boom extraction protocol (10 lungs, 10 spleens, 10 livers and 7 lymph nodes). These results permit affirming that the PK extraction protocol showed the best diagnostic sensibility and that the Boom extraction protocol showed the best performance in negative isolation samples. Within the studied organs, the spleen showed the highest probability of B. abortus detection. Therefore, the best strategy for B. abortus detection in organs homogenates from aborted fetus is the utilization of isolation and in parallel, the PCR.

A legislação brasileira permite o uso de leite cru na fabricação de queijos curados se o período de cura for superior a 60 dias (a 5°C ou mais). Entretanto, não há evidência científica sólida de que durante a cura ocorre suficiente inativação de Brucella abortus, sob a perspectiva da segurança dos alimentos. Além disso, não há metodologia oficial para quantificação de brucelas em matriz alimentar. Desta forma este projeto propõe um protocolo para estudos da curva de decaimento de Brucella abortus durante a cura de queijos. Três partidas de queijo tipo parmesão foram feitas com leite tipo A pasteurizado, artificialmente contaminado com uma cepa pouco patogênica de Brucella abortus (1119-3). O queijo foi curado a 18°C e analisado a cada 3-4 dias até o 60º dia ou até que duas análises consecutivas fossem negativas. As amostras foram submetidas à pesquisa quantitativa de brucela em meio Farrel (36°C/3 dias). A média do Tempo de Redução Decimal (D18°C), ponderado pelas incertezas, foi de 4,31 ± 0,49 dias. Estes resultados são preliminares e é necessário realizar mais análises para gerar dados mais precisos sobre esse parâmetro, especialmente usando cepas de campo. O Tempo de Redução Decimal associado à cura do queijo é um parâmetro importante para os modelos de avaliação de risco da transmissão de brucelose pelo consumo de queijo. / Brazilian legislation allows the use of raw milk to produce ripened cheeses, when the ripening period is over 60 days (at 5°C or above). However, there is not solid scientific evidence that the ripening process inactivates enough amounts of Brucella abortus, from the food safety perspective. In addition, there is no official methodology for brucela counting in food matrix. So, this project proposes a protocol to study the decay curve of Brucella abortus during cheese ripening. Three batches of parmesan type cheese were made with pasteurized milk artificially contaminated with a less pathogenic strain of Brucella abortus (1119-3). The cheese was ripened at 18°C and analyzed each 3-4 days until 60th or until two consecutive negative results. The samples were submitted to quantitative culture for brucela in Farrel medium (36°C/3 days). The average of Decimal Reduction Time (D18°C), weighted by uncertainties, was 4,31 ± 0,49 days. This is a preliminary result and we need to run more samples to generate more accurate data about this parameter, specially using field strains. The Decimal Reduction Time associated with ripening step is an important data to input risk assessment models for cheese-born brucelosis.

O Pantanal é considerado uma das maiores planícies inundáveis do mundo e possui uma rica biodiversidade. Das onze espécies de tatus registradas no Brasil, sete ocorrem no Pantanal. Os tatus dividem suas áreas de vida com diversas outras espécies silvestres e com o gado, pois a produção extensiva de bovinos de corte é a principal atividade econômica da região. Estudos anteriores demonstraram exposição à Brucella abortus e Leptospira interrogans em diversas espécies silvestres no Pantanal, porém sabe-se pouco quanto à exposição e/ou presença desses agentes em tatus neste bioma. Dessa forma, o presente estudo teve por objetivo determinar a prevalência de anticorpos anti-Brucella e anti-Leptospira interrogans através do teste do Antígeno Acidificado Tamponado (AAT) e Soroaglutinação Microscópica (SAM) em amostras de soro de tatus de vida livre, provenientes do Pantanal da Nhecolândia e realizar a pesquisa direta do DNA dos agentes através do emprego da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em amostras de sangue. Foram testados 48 indivíduos de quatro espécies, sendo Dasypus novemcinctus (n=2), Cabassous unicinctus (n=8), Euphractus sexcinctus (n=16) e Priodontes maximus (n=22). Não foi observado produto amplificado pela PCR em nenhum animal testado, da mesma forma, nenhum tatu apresentou anticorpos anti-Brucella pelo AAT. Na sorologia para L. Interrogans foi encontrada prevalência de 31,25 % (5/16) em E. sexcinctus e 18,18% (4/22) em P. maximus. Esses indivíduos foram positivos para os sorovares Autumnalis/Butembo, Cynopteri/Cynopteri e Pomona/Pomona, com títulos variando de 1: 200 a 1: 1600. Os resultados obtidos reforçam a importância da vigilância de patógenos em populações de vida livre, especialmente quando existe contato com animais de produção, além de contribuir para o conhecimento de agentes infecciosos em tatus da região do Pantanal. / Pantanal is considered one of the worlds largest wetlands. Seven of the eleven species of armadillos that occur in Brazil, from a total of 21 recognized species in the world, have been recorded in this area. The main local economic activity is beef cattle production, which leads to intense wildlife-livestock contact, potentially increasing wildlife exposure to several pathogens, including those with zoonotic and economic relevance. Previous studies demonstrated that several wildlife species have been exposed to Brucella abortus and Leptospira interrogans in Pantanal; however, the exposure and/or presence of zoonotic pathogens in armadillos in this biome is still poorly understood. In order to address this question, we employed conventional polymerase chain reaction (PCR), the Rose Bengal Test (RBT) and the Microscopic Agglutination Test (MAT) to investigate the exposure and/or infection by Brucella abortus and Leptospira interrogans in blood samples of four armadillos species: nine-banded armadillo (Dasypus novemcinctus) (n=2), southern naked-tailed armadillo (Cabassous unicinctus) (n=8), yellow armadillo (Euphractus sexcinctus) (n=16) and giant armadillo (Priodontes maximus) (n=22) caught at Nhecolândia, Pantanal, Brazil. We did not detect Brucella abortus by PCR or exposure to this pathogen via the RBT in the evaluated armadillos. On the other hand, the Microscopic Agglutination Test (MAT) detected Leptospira interrogans exposure in 31.25 % (5/16) of E. sexcinctus and 18.18% (4/22) P. maximus specimens. These individuals were positive to serovars Autumnalis/Butembo, Cynopteri/Cynopteri and Pomona/Pomona, this latter with titers ranging from 1:200 to 1:1600. Our results reinforce the importance of pathogen surveillance in wildlife living in areas of livestock production and further contribute to the study of zoonotic pathogens in armadillos in the Pantanal region.

Espécies de Brucella são causadoras da brucelose, uma das doenças zoonóticas mais difundidas em todo o mundo, que é causa aborto em animais domésticos e infecção potencialmente debilitante em humanos. Apesar da identificação de diferentes espécies dentro do gênero, baseada na diferença de hospedeiro e patogenicidade, o gênero tem sido descrito como geneticamente homogêneo. Técnicas moleculares têm sido empregadas com o intuito de diferenciar e tipificar estes microrganismos, sendo que a abordagem mais promissora visa a identificação de polimorfismos entre as espécies e biovares. O objetivo do trabalho foi analisar o perfil genético de diferentes cepas de B. abortus obtidos a partir da técnica de SE-AFLP a fim de determinar a sequência dos fragmentos obtidos e genes que poderiam estar presentes nos fragmentos selecionados e compará-las com bancos de genes e de proteínas de procariotos. Foram selecionados 19 fragmentos, que foram purificados, sequenciados e, as sequências obtidas, submetidas a diversas ferramentas de bioinformática visando sua caracterização e identificação. Nenhum dos fragmentos de nucleotídeos apresentou similaridade entre si e/ou com outra sequência já conhecida de outros microrganismos, inclusive com sequências conhecidas do gênero Brucella. Das 114 proteínas hipotéticas geradas pela tradução destas sequências genômicas 57% (65 sequências) apresentaram baixo grau de similaridade com proteínas descritas e disponíveis em BLASTp (proteínas não-redundantes e SwissProt), variando entre 29 e 43. Do total de proteínas similares 85% foram atribuídas e proteínas funcionais e 14% a proteínas hipotéticas. Essas novas sequências deverão ser utilizadas em outros trabalhos visando verificar sua abrangência e especificidade dentro das espécies e biovares de Brucella. / Brucella species are the cause of brucellosis, one of the most widespread zoonotic diseases around the world, which is cause abortion in domestic animals and potentially debilitating infection in humans. Despite the identification of different species within the genus, based on the difference of host and pathogenicity, the genre has been described as genetically homogeneous. Molecular techniques have been employed in order to differentiate and classify these organisms, and the most promising approach aims to identify polymorphisms between species and biovars. The objective of this study was to analyze the genetic profile of different strains of B. abortus obtained by the technique of SE-AFLP to determine the sequence of the fragments obtained and genes that may be present in the selected fragments and compare them to databases of genes and proteins in prokaryotes. We selected 19 fragments that were purified, sequenced and the sequences obtained, subject to several bioinformatics tools aiming at its characterization and identification. None of the fragments showed nucleotide similarity between themselves and / or other sequence already known from other organisms, including known sequences of the genus Brucella. Of the 114 hypothetical proteins generated by translation of genomic sequences 57% (65 sequences) showed low level of similarity to proteins described and available in blastp (protein non-redundant and SwissProt), ranging between 29 and 43. Of the proteins similar 85% were attributed to functional proteins and 14% to hypothetical proteins. These new sequences should be used in other studies to verify its completeness and specificity within the species and biovars of Brucella.