Thesis (D.P.H.)--University of Michigan.

Thesis (D.P.H.)--University of Michigan.

Bactérias psicrotróficas foram isoladas de leite cru refrigerado oriundo de duas indústrias de beneficiamento localizadas no sul do Brasil. Contagens de bactérias psicrotróficas foram entre 4,9 e 7,8 logUFC/mL e de 5,3 a 7,2 logUFC/mL, em amostras coletadas no caminhão-tanque e no silo de armazenamento da indústria, respectivamente. Dentre as bactérias isoladas, 90% foram Gram-negativas. A maioria das cepas apresentaram baixa atividade proteolítica, mas cepas de Burkholderia cepacia, Klebsiella oxytoca e Aeromonas sp. apresentaram valores superiores a 20 U/mL em azocaseina como substrato. Proteases das cepas selecionadas foram resistentes aos tratamentos térmicos convencionais e causaram coagulação de leite UAT depois de cinco dias de estocagem em temperatura ambiente. A atividade proteolítica de uma variedade psicrotrófica de Burkholderia cepacia isolada de leite cru refrigerado foi caracterizada. A atividade proteolítica na azocaseina apresentou atividade máxima com pH 6-7 e decréscimo com pHs ácido e alcalino. A enzima apresentou relativa estabilidade térmica entre 40-55°C durante 25 min, mantendo pelo menos 80% de sua atividade inicial a 40°C. O ensaio de coagulação do leite demostrou que a protease da B. cepacia causou coagulação do leite desnatado a partir do segundo dia, enquanto a coagulação do leite integral foi observada a partir do quinto dia. A aderência desta cepa ao aço inoxidável foi avaliada e os substratos apresentaram níveis de cerca de 107 UFC/cm², independente dos diferentes tempos de imersão. A cepa denominada de 1A4 apresentou expressiva atividade proteolítica em pH 6-7 e 40ºC, atividade de coagulação do leite e capacidade de aderir ao aço inoxidável. Estes resultados indicam que B. cepacia representa um potencial perigo a qualidade do leite e produtos lácteos. / Psychrotrophic bacteria were isolated from refrigerated raw milk of two processing plants at Southern Brazil. Psychrotrophic counts were between 4.9 and 7.8 log CFU/mL, and 5.3 to 7.2 log CFU/mL, for samples collected at the truck and the milk storage silo, respectively. Among the bacterial isolates, 90% were Gram-negative. Most strains presented low proteolytic activity, but strains of Burkholderia cepacia, Klebsiella oxytoca and Aeromonas sp. showed higher than 20 U/mL on azocasein as substrate. Crude proteases from selected strains were resistant to conventional heat treatments and caused coagulation of UHT milk after 5 days storage at room temperature. The proteolytic activity of a psychrotrophic strain of Burkholderia cepacia isolated from refrigerated raw milk was characterized. The proteolytic activity on azocasein showed maximum activity at pH 6-7 and decrease at acid and alkaline pHs. The enzyme showed relative thermal stability in the range 40-55°C during 25 min, maintaining at least 80% its initial activity at 40°C. Milk coagulation assay showed that the crude protease from B. cepacia caused coagulation from day 2 for skimmed milk, whereas coagulation was observed from day 5 for whole milk. The adherence of this strain to stainless steel was evaluated, and the substrata had around 107CFU/cm², regardless the different immersion time evaluated. The strain 1A4 showed elevated proteolytic activity at pH 6-7 and 40ºC, high milk coagulating-activity, and elevated capability to adhere to stainless steel. These results indicate that B. cepacia may represent a potential hazadous to milk and dairy products.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi caracterizar a identificacao, o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos, a similaridade genetica e os mecanismos de resistencia a trimetoprim/sulfametoxazol (SXT) entre os isolados clinicos do complexo Burkholderia cepacia (CBc). Metodologia: Foram avaliados 82 isolados clinicos do CBc recuperados de pacientes atendidos em dois hospitais universitarios localizados na regiao sudeste do Brasil. A identificacao bacteriana foi realizada pelo sequenciamento do gene recA e pela espectrometria de massas MALDI-TOF MS. O perfil de sensibilidade aos antimicrobianos foi determinado para ceftazidima, cloranfenicol, levofloxacina, meropenem, minociclina, ticarcilina/acido clavulanico e SXT. Os resultados do perfil de sensibilidade tambem foram comparados entre quatro tecnicas distintas, microdiluicao em caldo, diluicao em agar, Etest e disco difusao, sendo a microdiluicao em caldo considerada a tecnica referencia. A concordancia geral e por categoria de sensibilidade, assim como as taxas de erros, foram calculadas de acordo com as recomendacoes do CLSI M23-A3. Os genes que conferem resistencia aos betalactamicos e ao SXT foram pesquisados por meio das tecnicas de PCR e sequenciamento dos respectivos amplicons. A similaridade genetica entre os isolados que carreavam genes de resistencia foi determinada por PFGE. O DNA plasmidial e cromossomal dos isolados foram extraidos utilizando as tecnicas de Kieser e kits comerciais, respectivamente. A localizacao dos genes de resistencia foi determinada por Southern blot e hibridizacao utilizando sondas especificas. O contexto genetico dos genes de resistencia encontrados entre os isolados do CBc foi determinado por PCR e sequenciamento das regioes conservadas 3ÆCS e 5ÆCS do integron de classe 1. A tecnica de conjugacao foi realizada utilizando como amostra receptora E.coli J53. Resultados: Foram identificadas, pelo sequenciamento do gene recA, B. cenocepacia (n=44), B. multivorans (n=12), B. vietnamiensis (n=10), B. contaminans (n=9) e B. cepacia (n=7). Comparando os resultados obtidos pelo recA com aqueles do MALDI-TOF MS, 100% e 75,6% dos isolados foram concordantes na identificacao ao nivel de genero e especie, respectivamente. Boas taxas de sensibilidade foram encontradas para ceftazidima (86,6%), meropenem (87,8%), minociclina (87,8%) e SXT (97,6%). A concordancia geral entre as tecnicas avaliadas foi maior que 93% entre microdiluicao em caldo e diluicao em agar, exceto para cloranfenicol (89%). Entre a tecnica referencia e os resultados obtidos pelo Etest, a concordancia geral foi maior que 92%, exceto para ceftazidima (78%), SXT (80,4%) e cloranfenicol (85,3%). A concordancia por categoria entre microdiluicao em caldo e disco difusao foi maior que 90% para a maioria dos antimicrobianos testados, exceto para cloranfenicol (52,4%), SXT (74,4%) e levofloxacina (83,3%). Dois isolados (B. cenocepacia e B. cepacia) apresentaram resistencia ao SXT e carreavam o gene dhfr22 inserido em um integron que classe 1. Entre os isolados resistentes a ceftazidima (7,3%), em apenas um (B. cenocepacia) foi detectado o gene blaOXA-10-like, tambem inserido em um integron de classe 1 o qual continha um gene cassete que confere resistencia aos aminoglicosideos, aadA1. De acordo com os resultados da hibridizacao, blaOXA-10-like estava inserido em um plasmideo de ~70 Kb. Entretanto, nao conseguimos realizar a transferencia deste plasmideo pela tecnica de conjugacao. Os dois isolados de B. cenocepacia que carreavam genes de resistencia apresentaram perfil clonal semelhante pelo PFGE. Conclusoes: O MALDI-TOF MS demonstrou ser uma excelente tecnica alternativa para a identificacao dos isolados do CBc. Boas taxas de sensibilidade foram observadas para os antimicrobianos usualmente empregados no tratamento das infeccoes causadas por estes micro-organismos. Em geral, foi observada boa concordancia entre as tecnicas de sensibilidade avaliadas neste estudo, exceto para as metodologias Etest e disco difusao na predicao da sensibilidade ao SXT. O gene dhfr22 demonstrou ser o principal mecanismo entre os isolados resistentes ao SXT. De acordo com os nossos conhecimentos, descrevemos, pela primeira vez, a presenca do gene blaOXA-10-like em um isolado clinico do CBc / FAPESP: 2012/04910-9 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Bactérias psicrotróficas foram isoladas de leite cru refrigerado oriundo de duas indústrias de beneficiamento localizadas no sul do Brasil. Contagens de bactérias psicrotróficas foram entre 4,9 e 7,8 logUFC/mL e de 5,3 a 7,2 logUFC/mL, em amostras coletadas no caminhão-tanque e no silo de armazenamento da indústria, respectivamente. Dentre as bactérias isoladas, 90% foram Gram-negativas. A maioria das cepas apresentaram baixa atividade proteolítica, mas cepas de Burkholderia cepacia, Klebsiella oxytoca e Aeromonas sp. apresentaram valores superiores a 20 U/mL em azocaseina como substrato. Proteases das cepas selecionadas foram resistentes aos tratamentos térmicos convencionais e causaram coagulação de leite UAT depois de cinco dias de estocagem em temperatura ambiente. A atividade proteolítica de uma variedade psicrotrófica de Burkholderia cepacia isolada de leite cru refrigerado foi caracterizada. A atividade proteolítica na azocaseina apresentou atividade máxima com pH 6-7 e decréscimo com pHs ácido e alcalino. A enzima apresentou relativa estabilidade térmica entre 40-55°C durante 25 min, mantendo pelo menos 80% de sua atividade inicial a 40°C. O ensaio de coagulação do leite demostrou que a protease da B. cepacia causou coagulação do leite desnatado a partir do segundo dia, enquanto a coagulação do leite integral foi observada a partir do quinto dia. A aderência desta cepa ao aço inoxidável foi avaliada e os substratos apresentaram níveis de cerca de 107 UFC/cm², independente dos diferentes tempos de imersão. A cepa denominada de 1A4 apresentou expressiva atividade proteolítica em pH 6-7 e 40ºC, atividade de coagulação do leite e capacidade de aderir ao aço inoxidável. Estes resultados indicam que B. cepacia representa um potencial perigo a qualidade do leite e produtos lácteos. / Psychrotrophic bacteria were isolated from refrigerated raw milk of two processing plants at Southern Brazil. Psychrotrophic counts were between 4.9 and 7.8 log CFU/mL, and 5.3 to 7.2 log CFU/mL, for samples collected at the truck and the milk storage silo, respectively. Among the bacterial isolates, 90% were Gram-negative. Most strains presented low proteolytic activity, but strains of Burkholderia cepacia, Klebsiella oxytoca and Aeromonas sp. showed higher than 20 U/mL on azocasein as substrate. Crude proteases from selected strains were resistant to conventional heat treatments and caused coagulation of UHT milk after 5 days storage at room temperature. The proteolytic activity of a psychrotrophic strain of Burkholderia cepacia isolated from refrigerated raw milk was characterized. The proteolytic activity on azocasein showed maximum activity at pH 6-7 and decrease at acid and alkaline pHs. The enzyme showed relative thermal stability in the range 40-55°C during 25 min, maintaining at least 80% its initial activity at 40°C. Milk coagulation assay showed that the crude protease from B. cepacia caused coagulation from day 2 for skimmed milk, whereas coagulation was observed from day 5 for whole milk. The adherence of this strain to stainless steel was evaluated, and the substrata had around 107CFU/cm², regardless the different immersion time evaluated. The strain 1A4 showed elevated proteolytic activity at pH 6-7 and 40ºC, high milk coagulating-activity, and elevated capability to adhere to stainless steel. These results indicate that B. cepacia may represent a potential hazadous to milk and dairy products.

Bactérias psicrotróficas foram isoladas de leite cru refrigerado oriundo de duas indústrias de beneficiamento localizadas no sul do Brasil. Contagens de bactérias psicrotróficas foram entre 4,9 e 7,8 logUFC/mL e de 5,3 a 7,2 logUFC/mL, em amostras coletadas no caminhão-tanque e no silo de armazenamento da indústria, respectivamente. Dentre as bactérias isoladas, 90% foram Gram-negativas. A maioria das cepas apresentaram baixa atividade proteolítica, mas cepas de Burkholderia cepacia, Klebsiella oxytoca e Aeromonas sp. apresentaram valores superiores a 20 U/mL em azocaseina como substrato. Proteases das cepas selecionadas foram resistentes aos tratamentos térmicos convencionais e causaram coagulação de leite UAT depois de cinco dias de estocagem em temperatura ambiente. A atividade proteolítica de uma variedade psicrotrófica de Burkholderia cepacia isolada de leite cru refrigerado foi caracterizada. A atividade proteolítica na azocaseina apresentou atividade máxima com pH 6-7 e decréscimo com pHs ácido e alcalino. A enzima apresentou relativa estabilidade térmica entre 40-55°C durante 25 min, mantendo pelo menos 80% de sua atividade inicial a 40°C. O ensaio de coagulação do leite demostrou que a protease da B. cepacia causou coagulação do leite desnatado a partir do segundo dia, enquanto a coagulação do leite integral foi observada a partir do quinto dia. A aderência desta cepa ao aço inoxidável foi avaliada e os substratos apresentaram níveis de cerca de 107 UFC/cm², independente dos diferentes tempos de imersão. A cepa denominada de 1A4 apresentou expressiva atividade proteolítica em pH 6-7 e 40ºC, atividade de coagulação do leite e capacidade de aderir ao aço inoxidável. Estes resultados indicam que B. cepacia representa um potencial perigo a qualidade do leite e produtos lácteos. / Psychrotrophic bacteria were isolated from refrigerated raw milk of two processing plants at Southern Brazil. Psychrotrophic counts were between 4.9 and 7.8 log CFU/mL, and 5.3 to 7.2 log CFU/mL, for samples collected at the truck and the milk storage silo, respectively. Among the bacterial isolates, 90% were Gram-negative. Most strains presented low proteolytic activity, but strains of Burkholderia cepacia, Klebsiella oxytoca and Aeromonas sp. showed higher than 20 U/mL on azocasein as substrate. Crude proteases from selected strains were resistant to conventional heat treatments and caused coagulation of UHT milk after 5 days storage at room temperature. The proteolytic activity of a psychrotrophic strain of Burkholderia cepacia isolated from refrigerated raw milk was characterized. The proteolytic activity on azocasein showed maximum activity at pH 6-7 and decrease at acid and alkaline pHs. The enzyme showed relative thermal stability in the range 40-55°C during 25 min, maintaining at least 80% its initial activity at 40°C. Milk coagulation assay showed that the crude protease from B. cepacia caused coagulation from day 2 for skimmed milk, whereas coagulation was observed from day 5 for whole milk. The adherence of this strain to stainless steel was evaluated, and the substrata had around 107CFU/cm², regardless the different immersion time evaluated. The strain 1A4 showed elevated proteolytic activity at pH 6-7 and 40ºC, high milk coagulating-activity, and elevated capability to adhere to stainless steel. These results indicate that B. cepacia may represent a potential hazadous to milk and dairy products.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-02-22T14:08:58Z No. of bitstreams: 1 Paulo Castelo Branco de Gouveia Filho.pdf: 1165549 bytes, checksum: 16f843e48f36122b99e932a78381d634 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-22T14:08:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paulo Castelo Branco de Gouveia Filho.pdf: 1165549 bytes, checksum: 16f843e48f36122b99e932a78381d634 (MD5) Previous issue date: 2017-02-24 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Glanders is an often fatal zoonosis that affects horses, donkeys and mules, caused by Burkholderia mallei. Complement Fixation (CF) is the test prescribed by the World Organization for Animal Health (OIE) for its diagnosis. This work was conducted with the objective of evaluating the performance of CF using antigen produced with Brazilian strains of B. mallei (Biovetech, Recife Brazil) for the diagnosis of glanders compared to the antigen c.c.pro (GmbH, Oberdorla, Germany), which employs strains from Yugoslavia, India and Indonesia. The tests were performed in parallel using the protocol of cold incubation (4 ° C, 12 hours) of the serum, complement and antigen mixture. Of the 259 sera evaluated, 102 and 133 presented positive and negative results, respectively, in both tests. Twenty-four negative sera in the c.c.pro antigen test showed a positive result in the Biovetech antigen test. The calculated concordance index kappa was 0.81, considered almost perfect. / O mormo é uma zoonose frequentemente fatal que afeta equinos, asininos e muares, causada pela Burkholderia mallei. A Fixação do Complemento (FC) é o teste prescrito pela Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) para seu o diagnóstico. Este trabalho foi conduzido com o objetivo de avaliar o desempenho da FC empregando antígeno (Biovetech, Recife Brasil), produzido com cepas brasileiras de B. mallei para diagnóstico do mormo comparativamente ao antígeno c.c.pro (GmbH, Oberdorla, Alemanha), que emprega cepas da Iuguslávia, India e Indonésia. Os testes foram realizados em paralelo utilizando o protocolo de incubação a frio (4ºC, 12 horas) da mistura soro, complemento e antígeno. Dos 259 soros avaliados, 102 e 133 apresentaram resultado positivo e negativo, respectivamente, em ambos os testes. Vinte e quatro soros negativos no teste com antígeno c.c.pro apresentaram resultado positivo no teste com antígeno Biovetech. O índice de concordância ajustada kappa calculado foi 0,81, considerado quase perfeito.

The aspartate transcarbamoylase (ATCase) was purified from Burkholderia cepacia 25416. In the course of purification, three different ATCase activities appeared namely dodecameric 550 kDa holoenzyme, and two trimeric ATCases of 140 kDa (consists of 47 kDa PyrB subunits) and 120 kDa (consists of 40 kDa PyrB subunits) each. The 120 kDa PyrB polypeptide arose by specific cleavage of the PyrB polypeptide between Ser74 and Val75 creating an active polypeptide short by 74 amino acids. Both the 40 and 47 kDa polypeptides produced active trimers. To compare the enzyme activity of these trimers, an effector assay using nucleotides was performed. The 140 kDa trimer showed inhibition while the 120 kDa polypeptide showed less inhibition. To verify the composition of the pyrBC holoenzyme complex, B. cepacia dihydroorotase (DHOase, subunit size of 45 kDa) was purified by the pMAL protein fusion and purification system and holoenzyme reconstruction was performed using purified ATCase and DHOase. Both the 140 kDa and the 120 kDa trimers could produce holoenzymes of 550 kDa and 510 kDa, respectively. The reconstructed ATCase holoenzyme from cleaved ATCase showed better reconstruction compared to that from uncleaved ATCase in the conventional ATCase activity gel assay. To characterize the relationship between pyrimidine pathway and virulence factor production, motility tests and biofilm assays were conducted using pyrC- mutant. Even though no significant difference in growth rates was observed, there were significant differences between the wild type and mutant in the production of biofilm and virulence factors. This study will help us to understand the structure and regulation of ATCase holoenzyme with DHOase, and facilitate the use of B. cepacia as an applicable bio-tool. Additionally, we can potentially pursue more efficient drug targets for B. cepacia.

Doctor Scientiae / An esterase and lipase producing Burkholderia multivorans strain was isolated by culture enrichment strategies. A shotgun library of Burkholderia multivorans genomic DNA (prepared in E. coli/pUC18) was screened for lipase and esterase activities. Three positive recombinant clones, pTEND5, pHOLA6 and pRASHI4, conferring esterolytic and lipolytic phenotypes respectively, were identified. Full-length sequencing of DNA inserts was performed using subeloning and "primer-walking" strategies. Nucleotide sequence analysis revealed that the pRASH14 plasmid DNA consisted of two open reading frames (ORPI and ORP2) encoding 356 and 350 amino acids, respectively. Database searches revealed that ORPI and ORP2 were homologous to lipases and chaperones from subfamily I.2. In the pTEND5 sequence, an open reading frame consisting of 978 bp, encoding 326 amino acids, was identified. Database searches revealed that this open reading frame was homologous to family Vesterases. Nucleotide sequence analysis revealed that pHOLA6, plasmid DNA consisted of 1194 bp encoding 398 amino acids and showed homology to family VIII esterases. The primary structures of LipA, EstEFH5 and EstBL from pRASHI4, pTEND5 and pHOLA6, respectively, showed a classical GxSxG motif, which is conserved in many serine hydrolases. In addition, EstBL also showed a consensus SxxK motif, the serine of which acts as a catalytic nucleophile in class C B-lactames and some peptidases.

This diploma thesis focuses on an optimalization of simple laboratory model systems which serve as an innovative tool for an experimental study on the adsorption of bacterial cells on solid surfaces. In the description of living biological systems, an adsorption is labelled as an adhesion. Designed model systems were validated with a physical-chemical analysis. Various techniques were used to determine bacteria properties, more specifically Burkholderia cepacia and Bacillus megaterium. The solid surfaces after sorption of bacterial cells of Bacillus megaterium were subjected to a structural and visual analysis. Applying the theoretical approach (e.g. using different physical-chemical models) to study the adhesion of microorganisms to a particular surface allows a prediction of the conditions for a successful adhesion. The results will give us a better understanding of a formation and development of a biofilm.