Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2003. / Härtill 5 uppsatser.

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O linfoma de Burkitt (LB) é neoplasia linfóide de células B de alto grau que apresenta translocação constante envolvendo o proto-oncogene C-MYC. A associação com o vírus de Epstein-Barr (EBV) varia de acordo com a forma clinicopatológica. O presente estudo tem por objetivo analisar as características clinicopatológicas, imunoistoquímicas, incluindo a expressão do fator de transcrição MUM1/IRF4 e das proteínas p53 e p63, e investigar a associação com infecção pelo Herpesvírus humano 8 (HHV-8) e EBV, através de hibridização in situ e PCR, em 234 casos bem caracterizados de LB no Brasil, provenientes das 5 regiões geográficas em pacientes pediátricos e adultos, incluindo casos associados ao HIV. As características clínicas do LB no Brasil, de maneira geral, foram semelhantes às observadas na forma esporádica do LB ocorrendo nos países desenvolvidos. A infecção pelo EBV foi observada em 52,5% dos casos. A maior associação com EBV foi verificada nas regiões Norte e Nordeste e a menor na região Sul. Através de PCR, demonstrou-se predomínio de EBV do tipo A, sendo exceção a região Centro-Oeste. O fator de transcrição MUM1/IRF4 foi expresso em 39,2% dos tumores e apresentou correlação inversa com infecção pelo EBV. A expressão das proteínas p53 e p63 foi observada em 16,2% e 3,8% dos casos, respectivamente. Não se identificou infecção pelo HHV-8. O LB no Brasil apresenta características clinicopatológicas variáveis entre as regiões geográficas. A associação com infecção pelo EBV é intermediária entre a forma endêmica de LB e a forma esporádica ocorrendo em países desenvolvidos, sendo maior em regiões com indicadores sociais menos favoráveis. / Burkitt lymphoma (BL) is a high grade B cell lymphoma with a consistent translocation involving the proto-oncogene C-MYC. The association with the Epstein-Barr virus (EBV) varies depending on the clinicopathological form. This study aims to analyze the clinicopathologic, immunohistochemical features, including the expression of transcription factor MUM1/IRF4 and p53 and p63 proteins, and investigate the association with infection by human herpesvirus-8 (HHV-8) and EBV, by in situ hybridization and PCR, in 234 well-characterized cases of BL in Brazil from the 5 different geographic regions, in adult and pediatric patients, including HIV associated cases. The clinical characteristics of BL in Brazil, in general, were similar to those observed in the sporadic form of BL occurring in developed countries. EBV infection was seen in 52.5% of cases. The strongest association with EBV was found in the North and Northeast and the lowest in the South. PCR study demonstrated predominance of EBV type A, except in the Central-West region. The transcription factor MUM1/IRF4 was expressed in 39.2% of the tumors and showed inverse correlation with EBV infection. The expression of p53 and p63 proteins was observed in 16.2% and 3.8% of cases, respectively. No evidence of HHV-8 infection was found. The BL in Brazil is clinicopathologic diverse and regionally distinct. The association with EBV infection is intermediate between the endemic form of BL and sporadic form occurring in developed countries and is higher in regions with the less favorable social indicators

Notre équipe à montré que les cellules de lymphome de Burkitt (LB) infectées par le variant P3HR1 du virus d’Epstein Barr (EBV) sont plus résistantes à l’apoptose que les cellules de LB EBV(-) ou infectées par la souche sauvage. Le variant P3HR1 porte une délétion de son génome à l’origine de l’expression d’une forme tronquée d’EBNA-LP (EBNA-LPt). Nous avons étudié le rôle fonctionnel d’EBNA-LPt dans les cellules de LB infectées par le variant P3HR1. Nous avons, dans un premier temps, identifié par une étude protéomique ses partenaires cellulaires et viraux. Nous avons ainsi confirmé l’interaction entre EBNA-LPt et la PP2A, déjà établie par notre équipe, et montré qu’elle forme également des complexes avec d’autres protéines impliquées dans de nombreux processus cellulaires, notamment dans l’apoptose et dans la régulation transcriptionnelle. Nous avons ensuite, par une étude du transcriptome, montré le rôle de régulateur transcriptionnel des deux formes d’EBNA-LP exprimées de façon stable dans les cellules de LB EBV(-). En effet, nous avons montré que les deux formes d’EBNA-LP sont capables de réguler l’expression des gènes cellulaires indépendamment du contexte viral. Certains de ces gènes sont communs aux deux formes d’EBNA-LP, d’autres sont spécifiques de chaque forme. Nous avons constaté que le domaine Y1Y2 est indispensable à la surexpression, par EBNA-LP, du gène cellulaire codant pour la protéine ID1 qui est impliquée dans la stabilisation de la LMP1 et dans l’immortalisation cellulaire. Nous avons également remarqué que certains gènes sont régulés de la même façon en présence d’EBNA-LP seule ou dans un contexte viral complet. Enfin et pour mieux comprendre les mécanismes de résistance à l’apoptose dans les cellules de LB infectées par la souche P3HR1, nous avons élargi notre étude du transcriptome à des cellules traitées ou non par un inducteur de l’apoptose, la cycloheximide. Nos résultats préliminaires montrent que les voies de signalisation des récepteurs au TNF (TNFR1 et 2) sont rapidement et fortement induites dans les cellules sensibles alors qu’elles sont faiblement et tardivement induites dans les cellules résistantes. Cette étude montre également que la voie de signalisation JNK est probablement activée de façon très précoce dans les cellules sensibles contrairement aux cellules résistantes. / Our group has previously shown that Burkitt’s lymphoma (BL) cells infected by the P3HR1 variant of Epstein-Barr virus (EBV) are more resistant to apoptotsis than EBV (-) BL cells or cells infected by wild-type EBV. The genome of the P3HR1 variant carries a deletion responsible for the expression of a truncated form of EBNA-LP (tEBNA-LP). We studied the functional role of tEBNA-LP in BL cells infected by the P3HR1 variant. A proteomic study allow us to identify cellular and viral partners of tEBNA-LP. These results confirmed the interaction between tEBNA-LP and PP2A, already established by our group, and showed that tEBNA-LP can form complexes with other proteins involved in many cellular processes including apoptosis and regulation of transcription. We have then demonstrated by a transcriptomic study, the transcriptional regulatory role of both forms of EBNA-LP stably expressed in EBV(-) BL cell lines. Indeed, we showed that both forms of EBNA-LP can regulate the expression of cellular genes independently of viral context. Some of these genes are common to both forms of EBNA-LP, others are specific to each form. We found that Y1Y2 domaine of EBNA-LP is essential to overexpression of the cellular gene encoding ID1 protein which is involved in LMP1 stabilization and cellular mmortalization. We also noted that some genes are similarly regulated in the presence of EBNA-LP alone or in the presence of viral genome. Finally, to better undertand the mecanisms of resistance to apoptosis in BL cell lines infected by the P3HR1 variant we extended our transcriptomic analysis to cell lines treated or not with an apoptosis inducer, cycloheximide. Our preliminary results show that TNF receptors signaling pathways (TNFR1 and 2) are rapidly and strongly induced in sensitive cell lines while being weakly and belatedly induced in the resistant cell lines. This study also shows that the JNK signaling pathway is probably activated very early in the sensitive cells in contrast to resistant cell lines.

Le lymphome de Burkitt (BL) est due dans 80% des cas à une translocation chromosomique t(8;14)(q24;q32). Cette translocation marque l’évènement initial de la transformation maligne d’une cellule B normale, par délocalisation de l’oncogène CMYC à proximité du locus du gène codant pour la chaîne lourde d’immunoglobuline IGH par le mécanisme de réparation de l’ADN NHEJ durant l’hypermutation somatique (SMH). La probabilité de cette translocation est inversement proportionnelle à la distance qui sépare les loci portés par les deux chromosomes. La translocation (8;14) (q24;q32) qui apparaît durant les étapes de différentiation des lymphocytes B est encore plus importante chez les patients infectés par le virus Epstein-Barr (EBV) et le virus de l’immunodéficience humaine (VIH-1). L’objectif de notre étude est de déterminer les origines possibles de la translocation t(8;14) (q24;q32)dans les lymphocytes B normaux humains. Nous nous sommes intéressés tout d’abord à la dynamique de la localisation nucléaire des loci IGH et CMYC dans les lymphocytes B activés. Nous avons particulièrement étudié l’impact des virus EBV et VIH-1 sur l’organisation des gènes IGH et CMYC.Nous avons utilisé la technique d’hybridation in situ à fluorescence FISH pour la détection de CMYC (8q24) et IGH (14q32). Dans les lymphocytes B naïfs, CMYC est localisé du côté de la périphérie nucléaire, en revanche IGH est central, les deux loci sont complétement distants dans le noyau.L’activation des lymphocytes B induisait une augmentation de la colocalisation IGH-CMYC. La proximité physique entre les deux loci augmente la probabilité de leur translocation durant la SHM et favorise la t(8;14) (q24;q32) dans les lymphocytes B. Nous avons montré que les virus EBV et VIH-1ont un effet important sur la délocalisation IGH-CMYC dans les lymphocytes B. Nous avons aussi déterminé une molécule virale VIH-1 qui intervenait aussi dans la dérégulation de la localisation nucléaire des gènes IGH et CMYC. Nous avons déterminé deux mécanismes différents et indépendants impliqués dans la dynamique des loci IGH et CMYC : le premier mécanisme intervient dans le processus de développement normal des lymphocytes B, et le deuxième mécanisme dépend des virus ainsi que des molécules virales (particulièrement la Tat-HIV-1). / Eighty percent of Burkitt's lymphomas (BL) cases bear translocation t(8;14)(q24;q32). Thistranslocation is the initial event in malignant transformation of normal B-cell and derives from nonhomologousend joining of the oncogene CMYC to the immunoglobulin heavy chain locus IGH duringSomatic Hypermutation (SHM) of IGH. The probability of this translocation is inversely proportionalto the distance between the loci of involved chromosomes. The translocation t(8;14)(q24;q32) occursduring normal development of B-lymphocytes and more probable in patients infected with Epstein-Barr virus (EBV) and the human immunodeficiency virus (HIV-1).The subject of this study was to determine the possible origin of the translocation t(8;14)(q24;q32) inhuman normal B-lymphocytes. We followed the dynamics of the nuclear localization of IGH andCMYC genes in activated B-lymphocytes. We payed particular attention to the impact of EBV andHIV-1 viruses on dynamics of both IGH and CMYC. We applied Fluorescence in situ hybridization(FISH) for detection of CMYC (8q24) and IGH (14q32). In naïve B-cells CMYC is mainly localized inthe periphery of nucleus, whereas IGH is preferentially localized in the nuclear centre, i.e. these lociare distanced by a radius of cell nucleus. Activated B-lymphocytes displayed dramatic increase ofnumber of cells with colocalized IGH and CMYC. Close physical proximity of CMYC to IGH duringSHM amplifies the probability of occurance of translocation t(8;14)(q24;q32) in human Blymphocytes.Interestingly, we observed even more pronounced impact of EBVand HIV-1onproximity of IGH and CMYC. Finaly, among the molecules of HIV-1 we revealed those which possessthe most regulative role on dynamics of both IGH and CMYC. Our results suggest about twoindependent mechanisms of IGH and CMYC dynamics: the first is appropriate for normal developmentof B-lymphocytes and the second depends on virus and viral molecules, such as transactivator of viraltranscription HIV Tat.

Le syndrome de Williams-Beuren (SWB} est une maladie génétique rare causée par une microdélétion de la région 7q11.23. A la suite de l'observation clinique d'une jeune fille atteinte du SWB ayant développé un lymphome de Burkitt à l'âge de 7 ans, nous nous sommes intéressé au lien génétique entre SWB et cancer. L'étude d'une série de cas de cancers survenus chez des enfants atteints de SWB a montré que les lymphomes non-hodgkiniens de type B étaient surreprésentés dans cette population puisque 73% des cancers chez les enfants atteints du SWB étaient des LNH-B. La région critique du SWB a été explorée par CGH-array et séquencage haut-débit dans les échantillons sains et tumoraux de 2 patients atteints de SWB. Aucune perte d'hétérozygotie de la région 7q11.23 n'a été trouvé. En outre, une délétion somatique de la région 7q11.23 a été identifiée dans un lymphome de Burkitt sporadique (Guenat D et al., J Hematol Oncol, 2014). Nous avons ensuite exploré les mécanismes de réponses aux dommages à l'ADN dans des lignées de fibroblastes primaires dérivées de patients atteints du SWB ainsi que dans des lignées 293T traitées avec des siRNA ciblant RFC2, BAZ1B et GTF2/, 3 gènes localisés en 7q11.23 et codant des protéines de réparation de l'ADN. Les cellules dérivées de patients SWB ont montré un défaut de signalisation dans les voies ATM/ATR-dépendantes en réponse aux dommages à l'ADN (Guenat D et al., DNA repair, article soumis). L'haploinsuffisance de la région 7q11.23 associée au SWB pourrait donc jouer un rôle dans la lymphomagenèse B par l'altération de voies de réponse aux dommages à l'ADN ATM/ATR-dépendantes. Cependant, ces résultats mériteraient d'être confirmés dans des modèles murins reproduisant le génotype complet du SWB. Enfin, des données épidémiologiques exhaustives sur l'incidence des pathologies tumorales chez les individus atteints du SWB sont indispensables pour affirmer qu'une prédisposition au cancer existe chez ces patients / Williams-Beuren syndrome (WBS) is a genetic disorder caused by a microdeletion at 7q11.23. The case of a young girl with WBS who developed a Burkitt lymphoma at the age of 7 leads us to explore the genetic link between WBS and cancer. The study of a series of cancers occurred in WBS patients during childhood have shown that B-cell non hodgkin lymphoma are over-represented in this population since 73% cancer cases in WBS were B-NHL. The critical region of WBS was explored by array-CGH and high-throughput sequencing in normal and tumor samples from WBS patients. No loss of heterozygosity at 7q11.23 was found. ln addition, a somatic deletion at 7q11.23 was observed in a sporadic case of Burkitt lymphoma (Guenat D et al., J Hematol Oncol, 2014). DNA damage response mechanisms were then explored in primary fibroblast cell lines derived from WBS patients as well as in 293T cell line treated with siRNA targeting RFC2, GTF2/ and BAZ1 B, 3 genes mapping at 7q11.23 that encode proteins involved in DNA damage response. WBS patients cell lines have shown a defect in ATM/ ATR-dependent DNA damage response pathways (Guenat D et al., DNA Repair, article submitted). Haploinsufficiency of the 7q11.23 region associated with WBS might play a role in B-cell lymphomagenesis through the alteration of ATM/ATR-dependent DNA damage response pathways. However, these results deserve to be confirmed in mouse models that reproduce the complete genotype of human WBS. Finally, strong epidemiological data would be required to confirm the predisposition to cancer in WBS patients.

O linfoma de Burkitt (LB) é neoplasia linfóide de células B de alto grau que apresenta translocação constante envolvendo o proto-oncogene C-MYC. A associação com o vírus de Epstein-Barr (EBV) varia de acordo com a forma clinicopatológica. O presente estudo tem por objetivo analisar as características clinicopatológicas, imunoistoquímicas, incluindo a expressão do fator de transcrição MUM1/IRF4 e das proteínas p53 e p63, e investigar a associação com infecção pelo Herpesvírus humano 8 (HHV-8) e EBV, através de hibridização in situ e PCR, em 234 casos bem caracterizados de LB no Brasil, provenientes das 5 regiões geográficas em pacientes pediátricos e adultos, incluindo casos associados ao HIV. As características clínicas do LB no Brasil, de maneira geral, foram semelhantes às observadas na forma esporádica do LB ocorrendo nos países desenvolvidos. A infecção pelo EBV foi observada em 52,5% dos casos. A maior associação com EBV foi verificada nas regiões Norte e Nordeste e a menor na região Sul. Através de PCR, demonstrou-se predomínio de EBV do tipo A, sendo exceção a região Centro-Oeste. O fator de transcrição MUM1/IRF4 foi expresso em 39,2% dos tumores e apresentou correlação inversa com infecção pelo EBV. A expressão das proteínas p53 e p63 foi observada em 16,2% e 3,8% dos casos, respectivamente. Não se identificou infecção pelo HHV-8. O LB no Brasil apresenta características clinicopatológicas variáveis entre as regiões geográficas. A associação com infecção pelo EBV é intermediária entre a forma endêmica de LB e a forma esporádica ocorrendo em países desenvolvidos, sendo maior em regiões com indicadores sociais menos favoráveis. / Burkitt lymphoma (BL) is a high grade B cell lymphoma with a consistent translocation involving the proto-oncogene C-MYC. The association with the Epstein-Barr virus (EBV) varies depending on the clinicopathological form. This study aims to analyze the clinicopathologic, immunohistochemical features, including the expression of transcription factor MUM1/IRF4 and p53 and p63 proteins, and investigate the association with infection by human herpesvirus-8 (HHV-8) and EBV, by in situ hybridization and PCR, in 234 well-characterized cases of BL in Brazil from the 5 different geographic regions, in adult and pediatric patients, including HIV associated cases. The clinical characteristics of BL in Brazil, in general, were similar to those observed in the sporadic form of BL occurring in developed countries. EBV infection was seen in 52.5% of cases. The strongest association with EBV was found in the North and Northeast and the lowest in the South. PCR study demonstrated predominance of EBV type A, except in the Central-West region. The transcription factor MUM1/IRF4 was expressed in 39.2% of the tumors and showed inverse correlation with EBV infection. The expression of p53 and p63 proteins was observed in 16.2% and 3.8% of cases, respectively. No evidence of HHV-8 infection was found. The BL in Brazil is clinicopathologic diverse and regionally distinct. The association with EBV infection is intermediate between the endemic form of BL and sporadic form occurring in developed countries and is higher in regions with the less favorable social indicators

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2002. / Härtill 5 uppsatser.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2004. / Härtill 5 uppsatser.

Le glycolipide Gb3/CD77 qui est fortement exprimé en surface des cellules de lymphome de Burkitt (LB) est le récepteur d’une toxine bactérienne la Vérotoxine-1 (VT-1). Notre équipe a montré précédemment que, dans les cellules de LB, la VT-1 induit une cascade apoptotique mettant en jeu les caspases et la mitochondrie. Mon travail a consisté à poursuivre l’analyse des bases moléculaires de ce processus, notamment en m’intéressant au rôle de la protéine pro-apoptotique Bid. Bid est un membre de la famille Bcl-2 qui est clivé par la caspase-8 au cours de l’apoptose et dont la forme tronquée (t-Bid) se relocalise à la mitochondrie. Grâce à l’utilisation de clones cellulaires de LB où Bid a été inhibée puis réexprimée sous forme non clivable et d’un inhibiteur de la caspase-8, nous avons montré que lors de l’apoptose induite par la VT1 : 1) la protéine entière Bid (full-length Bid ou FL-Bid) contrôle l’activation de protéines pro-apoptotiques Bax et de Bak ; 2) t-Bid et FL-Bid sont, toutes les deux, impliquées dans la libération des protéines pro-apoptotiques (cytochrome c et Smac/DIABLO) de l’espace intermembranaire de la mitochondrie vers le cytosol ; 3) FL-Bid contrôle l’homodimérisation de Bax et de Bak qui contribuerait à la libération initiale du cytochrome c et de Smac/DIABLO alors que t-Bid est nécessaire à l’hétérodimérisation de Bax et Bak qui permettrait l’amplification de cette libération. L’ensemble de ces résultats montre donc une coopération fonctionnelle entre Bax et Bak au cours de l’apoptose induite par la VT-1 et surtout met en évidence que l’activation de la voie caspase-8/t-Bid n’est absolument pas requise pour initier la mort cellulaire.Gb3/CD77 est aussi exprimé à la surface de certains lymphocytes B normaux, où il constitue un marqueur de différenciation mais sa fonction endogène reste encore indéterminée. Une deuxième partie de mon travail a consisté à essayer d’identifier le ligand physiologique de Gb3/CD77 pour comprendre son rôle biologique. Grâce à une analyse en spectrométrie de masse, nous avons identifié deux protéines potentiellement partenaires de Gb3/CD77 : la galectine-7 et la protéine S100A11. / The Gb3/CD77 glycolipid, which is strongly expressed in Burkitt's lymphoma (BL) cells, is a receptor for the bacterial toxin Verotoxin-1 (VT-1). Previously, our group has shown that VT-1 induces an apoptotic pathway in BL cells which is dependent on caspases and mitochondria. Here, we provide new insights into this pathway. A pro-apoptotic member in the Bcl-2 family, Bid is cleaved by caspase-8 and its truncated form t-Bid is translocated to mitochondria. Using LB cell clones where Bid was inhibited prior to being reexpressed as a non-cleavable mutated form (BID D59A) and a caspase-8 inhibitor to explore VT-1-induced apoptosis, we showed that 1) the full length Bid (FL-Bid) controls the activation of pro-apoptotic proteins Bax and Bak; 2) Both t-Bid and FL-Bid are involved in the release of pro-apoptotic proteins (cytochrome c and Smac/DIABLO) from the mitochondrial intermembrane space to the cytosol; 3) FL-Bid controls the homo-oligomerization of both Bax and Bak, likely contributing to the initial release of cytochrome c and Smac/DIABLO while t-Bid is needed for their hetero-oligomerization followed by amplification of the release. Together, these results reveal a functional cooperation between Bax and Bak during VT-1-induced apoptosis and, most importantly, that activation of caspase-8 and t-Bid is not required to induce the onset of cell death. Gb3/CD77 is also expressed in a proportion of normal B-lymphocytes where it constitutes a differentiation marker but whose function remains uncharacterized. In an effort to look for physiological ligands, we have used a biochemical approach followed by mass spectrometry analysis. Two proteins have been identified as potentially Gb3/CD77 partners, namely galectin-7 and protein S100A11.