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Análisis Comparativo del Metabolismo de Lactato para Células CHO en Glucosa y GalactosaWilkens Díaz-Muñoz, Camila January 2011 (has links)
En estudios anteriores se ha mostrado que células CHO productoras de tPA sufren una
alteración del estado metabólico cuando el cultivo es suplementado con una mezcla de glucosa
y galactosa. Este cambio se caracteriza por la reincorporación de lactato a la célula, pero su
destino metabólico no ha sido determinado aún.
Para comprender las condiciones que permiten la utilización de lactato como fuente de
carbono se realizaron cuatro experimentos en cultivo batch con distintas combinaciones de
glucosa y galactosa. Cuando el medio es suplementado solamente con glucosa se observa una
producción sostenida de lactato. En cambio, en las condiciones con glucosa y galactosa se ve
que primero se utiliza exclusivamente glucosa y se produce lactato, y una vez que se agota
esta fuente de carbono comienza el consumo de galactosa junto a lactato. Al comparar
mediante análisis de flujos metabólicos los estados de las células con y sin alteración
metabólica, se observa un cambio en la distribución de flujos involucrados en el metabolismo
del piruvato. Cuando la tasa específica de consumo de la fuente de carbono principal es baja no
se produce suficiente piruvato para que las células mantengan sus requerimientos energéticos.
Este resultado es consistente con los entregados por el modelo dinámico del metabolismo de
glucosa y galactosa desarrollado en este trabajo. Inicialmente en los cultivos se observan flujos
intracelulares altos, los cuales disminuyen lenta pero continuamente hasta alcanzar una
condición en que no se produce suficiente piruvato para mantener el metabolismo energético de
la célula.
El consumo de lactato es posible en cultivos suplementados con glucosa y galactosa
debido a que la célula alcanza condiciones intra y extracelulares específicas que permiten la
inversión de la reacción catalizada por la enzima lactato dehidrogenasa y del gradiente que
impulsa transporte de lactato. La evidencia encontrada en este trabajo sugiere que durante el
consumo de glucosa se produce piruvato en exceso lo que lleva su acumulación y posterior
conversión hacia lactato el cual se acumula también en el interior de la célula. Las altas
concentraciones de lactato en el medio intracelular y la acidificación de éste debido a la
glicólisis promueven el flujo del ácido láctico hacia el exterior de la célula mediante el
transportador de monocarboxilatos. Cuando comienza el consumo de galactosa, el cual es más
lento que el de glucosa, la concentración de piruvato, lactato y H+ disminuye permitiendo la
inversión de la dirección de transporte del transportador y de la enzima lactato dehidrogenasa,
promoviendo el consumo de lactato. Mediante el análisis de flujos metabólicos se determinó que
en esta etapa del cultivo la mayoría de los recursos celulares y el ácido láctico son utilizados
para mantener el metabolismo energético lo que explica también la disminución de la
proliferación celular observada.
Los resultados obtenidos indican que las concentraciones de piruvato, H+, lactato intra y
extracelular, el estado RedOx y su evolución en el tiempo son los responsables en determinar la
dirección del metabolismo del lactato. El entendimiento de la vía del lactato permitiría nuevos
diseños de medio de cultivo, en los cuales se produzcan concentraciones menores de lactato.
En cultivos donde el lactato es consumido o producido en una nueva tasa se observa una
viabilidad extendida y por lo tanto en estas condiciones es factible alcanzar mayores niveles de
producción de proteína recombinante.
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Desenvolvimento de processo de inoculação com microcarregador Cytoline 1 visando o cultivo de célula CHO-K1 em biorreator de leito fixoQuerino, Marcelo Vargas 20 August 2004 (has links)
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Previous issue date: 2004-08-20 / Universidade Federal de Sao Carlos / The use of the technology of animal cell culture for the expression of recombinant proteins has been gaining major interest within biotechnology due the obtation of recent efficient medicaments in the chronic diseases. In this work
was utilized the recombinant lineage CHO-K1, denominate CHOZMD, anchorage-dependent. It is capable of expressing a disintegrin with antimetastics properties. Knowing the precedent of well performance of fixed bed bioreactors with utilization of microcarriers in large scale animals cells cultures. It was fixed as purpose of this work the definition of a method to prepare of inoculum to this bioreactor utilizing Cytoline 1 commercial macroporous microcarrier in spinner flask. The cultures realized in spinner flasks of 500 mL with Cytoline 1
microcarriers with DMEM medium in range of pH in 7.0 to 7.4. It showed that the electrostatic incompatibility between the cell and the microcarrier matrix composed of polyethylene and silica was responsible by decreased adhesion cell and, consequently, by intense cell death for firsts hours of experiments. In function this was necessary to utilize an inoculum with high cell concentration and a better pH medium control to reach satisfactory results in the culture. Following this strategy was possible to achieve highest maximum specific growth cell rate (μmáx) for the CHOZMD cell of 0.24d-1 while for wild CHO-K1 cell was obtained 0.36d-1, both comparable with other works encounter in the literature.
The best value obtained of cell productivity with recombinant cell was of 6,096 cel/mL·h and for wild cell was of 10,596 cel/mL·h The lager concentrations of adherents cells on microcarriers were obtained in this experiments that utilized
concentrated inoculums, in the case of recombinant cell was obtained 1.39·106 cel/mL and in the case with wild cell of 1.65·106 cel/mL. For the preparation of an inoculum for a fixed bed bioreactor when prepared in spinner with Cytoline 1
microcarrier recommend: adoption of an inoculum approximate of 2.0·106 cel/mL in exponential growth phase and with rigorous control of pH medium in 7.3. / O uso da tecnologia de cultivo de célula animal para a expressão de proteínas recombinantes vem ganhando interesse crescente dentro da biotecnologia em função da obtenção de novos medicamentos eficientes no tratamento de doenças crônicas. Neste trabalho foi utilizada a linhagem
recombinante CHO-K1 (Chinese Hamster Ovary), denominada CHOZMD, dependente de ancoramento. Capaz de expressar uma desintegrina com propriedades antimetastáticas. Conhecendo os precedentes de bom desempenho do biorreator de leito fixo com utilização de microcarregadores no cultivo de células animais em larga escala fixou-se como objetivo deste trabalho a definição de um método para preparo de inóculo para esse biorreator utilizando o microcarregador macroporoso comercial Cytoline 1 em frasco spinner. Os cultivos realizados em frasco spinner de 500 mL com microcarregadores Cytoline 1 em meio DMEM em pH variando entre 7,0 e 7,4 mostraram que a baixa compatibilidade entre a célula e a matriz do microcarregador composta de polietileno e sílica foi responsável pela baixa adesão celular. Em função disso foi necessário utilizar um inóculo com alta concentração celular e um melhor controle
do pH do meio para alcançar resultados satisfatórios nos cultivos. Seguindo essa estratégia foi possível conseguir velocidades específicas máximas de crescimento celular (μmáx) para a célula CHOZMD de 0,24d-1 enquanto que para a célula CHO-K1 selvagem obteve-se 0,36d-1, ambas comparáveis as de outros trabalhos encontrados na literatura. O melhor valor obtido de produtividade celular com célula recombinante foi de 6.096 células/mL·h e para a célula selvagem foi de 10.569 células/mL·h. As maiores concentrações de células aderidas aos microcarregadores foram obtidas nos experimentos que utilizaram inóculos concentrados, no caso da célula recombinante obteve-se 1,39·106 células/mL e no caso com célula selvagem 1,65·106 células/mL. Para o preparo de um inóculo adequado para um biorreator de leito fixo quando preparado no spinner com
microcarregador Cytoline 1 recomenda-se a adoção de um inóculo em torno de 2,0·106 células/mL na fase exponencial de crescimento e controle rigoroso do pH do meio em 7,3.
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