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Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2009 / Made available in DSpace on 2013-12-05T21:48:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 275858.pdf: 1157381 bytes, checksum: 127edb550711b7d6376d0ab38c97e9fe (MD5)

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Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Bioética, 2011 / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-04-18T15:50:47Z No. of bitstreams: 1 2011_ClaudiaSeveroWanderleyPereira.pdf: 2009486 bytes, checksum: dc32ab298dfbb6acd16da4b64c24dfe0 (MD5) / Approved for entry into archive by Leila Fernandes (leilabiblio@yahoo.com.br) on 2012-04-19T15:01:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_ClaudiaSeveroWanderleyPereira.pdf: 2009486 bytes, checksum: dc32ab298dfbb6acd16da4b64c24dfe0 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-04-19T15:01:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_ClaudiaSeveroWanderleyPereira.pdf: 2009486 bytes, checksum: dc32ab298dfbb6acd16da4b64c24dfe0 (MD5) / Introdução – O progresso da ciência evoluiu em trajetória acelerada e possibilitou a criação de técnicas inovadoras que permitiram um crescente domínio sobre o mundo natural. Com isso, a ciência e a tecnologia conquistam cada vez mais espaço, penetram fundo na vida biológica, adquirindo poderes de manipular, alterar e transformar o organismo vivo. Nesse contexto, o limite do corpo humano deixou de ser uma característica pertinente à natureza do vivente e passou a ser uma falha orgânica evitável pela ação beneficente da ciência moderna. Entretanto, sabe-se que, no contexto das possibilidades beneficentes da tecnociência, surgem situações perigosas, das quais é difícil tratar os limites. Assim sendo, indaga-se se a aplicação dos novos recursos tecnológicos implicaria sempre um “bem” aos indivíduos. Para isso, a temática escolhida foi estudar o desenvolvimento das pesquisas em células-tronco embrionárias no Brasil, sob o ponto de vista teórico da bioética. Esse tema se tornou relevante por estar alinhado às perspectivas das situações emergentes do campo da bioética e aos possíveis conflitos que podem ser gerados pela aplicação de novas tecnologias na área da medicina regenerativa. Objetivo - Avaliar as pesquisas com embriões humanos, destacando aquelas que têm por finalidade a busca de soluções para as doenças degenerativas, com o objetivo de conhecer em que medida essas pesquisas atendem ao princípio da beneficência. Método – Foi realizada uma pesquisa documental, exploratória e descritiva, com abordagens quantitativa e qualitativa no banco de dados do Diretório de Grupos de Pesquisa, do Conselho Nacional de Pesquisa Científica (CNPq). Foram coletados dados de 88 grupos de pesquisas em células-tronco referentes às informações sobre a composição e localização dos grupos, sobre as linhas de pesquisas desenvolvidas e sobre a produção bibliográfica dos integrantes dos grupos. Resultados – Os objetivos do trabalho serviram de referência para a análise dos dados coletados e os resultados foram apresentados em forma de gráficos. Os resultados mais relevantes da pesquisa foram: que 69 grupos realizam pesquisas em células-tronco adultas, 11 grupos pesquisam células-tronco embrionárias e apenas 8 grupos pesquisam células-tronco embrionárias em doenças degenerativas; que os 88 grupos estudados desenvolvem 501 Linhas de Pesquisa, sendo 89 Linhas em células-tronco adultas, 15 Linhas em células-tronco embrionárias e apenas 8 Linhas em células-tronco embrionárias em doenças degenerativas; que a maioria v dos grupos de pesquisa está localizada na Região Sudeste e São Paulo contém 36 Grupos, a maior concentração; que a genética é a área predominante das pesquisas em células-tronco embrionárias, seguindo-se pela área das doenças degenerativas; e que nos 88 grupos, 550 pesquisadores estudam células-tronco adultas, 155 pesquisadores estudam células-tronco embrionárias e apenas 46 pesquisadores estudam células-tronco embrionárias em doenças degenerativas. Considerações finais – Verifica-se que as pesquisas estão concentradas na Região Sudeste, que o número de Linhas de Pesquisa em células-tronco embrionárias em doenças degenerativas é baixo em relação ao número das Linhas de Pesquisa em outras áreas do conhecimento e que a maioria dos grupos e dos pesquisadores concentra as pesquisas em outras áreas e não em células-tronco embrionárias em doenças degenerativas. Também se pode concluir, na confrontação dos resultados, evidenciados pelo reduzido número de linhas de pesquisas em CTE. Observou-se em doenças degenerativas, que o princípio da beneficência não foi considerado na definição do objeto das pesquisas com células-tronco embrionárias em doenças degenerativas, no período entre 2005 e 2008. ___________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction - The progress of science has developed rapidly and allowed the creation of innovative techniques that have allowed an increasing dominance over the natural world. Thus, science and technology conquer more space, penetrate deeply into biological life, acquiring powers to manipulate, change and transform the living organism. In this context, the limit of the human body is no longer a relevant characteristic of the nature of living and became an organ failure preventable by beneficent action of modern science. However, it is known that in the context of charitable possibilities of techno science, dangerous situations arise, which is difficult to manage the limits. So, one wonders whether the application of new technological resources would always be a “good” for the individual. For this, the theme was chosen to study the development of research on embryonic stem cells in Brazil, under the theoretical point of view of bioethics. This topic has become important because it is aligned with the prospects of emerging situations in the field of bioethics and with the possible conflicts that can be generated by the application of new technologies in the field of regenerative medicine. Objective - To evaluate research on human embryos, highlighting those that are intended to provide solutions for degenerative diseases, in order to know the extent to which these studies meet the principle of beneficence. Methods – It was made a documentary, exploratory and descriptive research, using quantitative and qualitative approaches in the database Directory of Research Groups, the National Council for Scientific Research. Data were collected from 88 research groups of stem cell, relating to information about the composition and location of groups, about the lines of research and about bibliographic production of group members. Results - The objectives of the study served as a reference for the analysis of collected data and the results were presented in graphical form. The most relevant results of the survey were: 69 groups conduct research on adult stem cells, 11 groups research embryonic stem cell and only 8 groups studies embryonic stem cells in regenerative medicine; 88 groups develop 501 research lines, in which, 89 lines are about adult stem cells, 15 lines are about embryonic stem cells and only 8 lines are about embryonic stem cells in regenerative medicine; the majority of research groups are located in the Southeast and São Paulo has 36 groups, the highest concentration; the genetics is the predominant area of research in embryonic stem cells, followed by the area of vii degenerative diseases; and 550 researchers study adult stem cells, 155 researchers study embryonic stem cells and only 46 researchers study embryonic stem cells in regenerative medicine. Conclusion - It is possible to say that the research is concentrated in the Southeast, the number of research lines in embryonic stem cells in regenerative medicine is insignificant compared to the number of research lines in other areas and that the majority of the groups and researchers directs the studies in other areas than embryonic stem cells in regenerative medicine. Also, by confronting the results obtained and the concepts of bioethics, it is possible to conclude that the principle of beneficence was not present in the definitions of the research object with embryonic stem cells in regenerative medicine, between 2005 and 2008.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-11-21T17:09:44Z No. of bitstreams: 1 2016_DanielaAbreudeMoraes.pdf: 10204740 bytes, checksum: ed1d4a82672c2fbd2b778a4152cd90cc (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-30T20:35:17Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_DanielaAbreudeMoraes.pdf: 10204740 bytes, checksum: ed1d4a82672c2fbd2b778a4152cd90cc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-30T20:35:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_DanielaAbreudeMoraes.pdf: 10204740 bytes, checksum: ed1d4a82672c2fbd2b778a4152cd90cc (MD5) / Introdução: Células-tronco mesenquimais (MSCs) são células progenitoras multipotentes potencial fonte para várias terapias celulares. MSCs são caracterizadas pela expressão dos marcadores celulares CD73, CD90 e CD105, e ausência de expressão dos marcadores CD34, CD45, CD11a, CD19 e HLA-DR. CD90 é uma glicoproteína presente na membrana de MSC, várias células adultas e células-tronco de câncer. A função de CD90 em MSC ainda é pouco elucidada. Objetivo: Obter MSCs com expressão reduzida de CD90 para investigar a função desse marcador na morfologia, proliferação e diferenciação de MSCs humanas. Metodologia: Foi avaliada a função de CD90 na morfologia, proliferação, supressão da proliferação de células T e diferenciação osteogênica e adipogênica de MSCs por meio da redução da expressão desse marcador, usando vetores lentivirais que expressam shRNA contra CD90. Resultados: O estudo mostrou que a redução da expressão de CD90 resultou em maior eficiência das diferenciações osteogênica e adipogênica de MSCs in vitro e, inesperadamente, resultou também no decréscimo da expressão dos marcadores CD44 e CD166. Conclusão: O estudo sugere que CD90 controla a diferenciação de MSCs e possa agir como um obstáculo a ser superado para que haja diferenciação e a manipulação de CD90, na presença de um correto estímulo para a diferenciação pode levar a taxas de diferenciação in vitro de MSCs mais eficientes. / Introduction: Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are multipotent progenitor cells used in several cellular therapies. MSCs are characterized by the expression of CD73, CD90 and CD105 cell markers, and the absence of CD34, CD45, CD11a, CD19 and HLA-DR cell markers. CD90 is a glycoprotein present in the MSC membranes, various adult cells and cancer stem cells. The role of CD90 in MSCs remains unknown. Here, we sought to analyse the role of CD90 plays in the characteristic properties of in vitro-expanded human MSCs. Methodology: We investigated the function of CD90 in: the morphology; proliferation rate; suppression of T cell proliferation; and osteogenic/adipogenic differentiation of MSCs by reducing the expression of this marker using CD90 target shRNAs lentiviral vectors. Results: The present study shows that a reduction in CD90 expression enhances the osteogenic and adipogenic differentiation of MSCs in vitro and, unexpectedly, causes a reduction the expression of CD44 and CD166. Conclusion: Our study suggests that CD90 controls the differentiation of MSCs by acting as an obstacle in the pathway of differentiation commitment which may be overcome, in the presence of the correct differentiation stimuli, supporting the idea that CD90 level manipulation may lead to more efficient differentiation rates in vitro.

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As células-tronco mesenquimais (MSCs) são consideradas o tipo de célula-tronco adulta mais plástico, além de possuírem uma localização perivascular e residirem em todos órgãos e tecidos adultos. Nos últimos anos, as MSCs isoladas do tecido adiposo (ADSCs) têm recebido grande atenção por parte da medicina regenerativa, por serem facilmente isoladas e compartilharem várias características com as MSCs de medula óssea. Vários aspectos básicos da biologia das ADSCs têm sido estudados, mas pouco ainda se sabe sobre os mecanismos envolvidos na resistência destas células à exposição a agentes citotóxicos e genotóxicos, como quimioterápicos utilizados no tratamento do câncer. Desta forma, este trabalho teve como objetivo investigar o potencial citotóxico e genotóxico de duas drogas comumente utilizadas em terapias anti-câncer, cisplatina (CIS) e paclitaxel (PAC) sobre ADSCs humanas, através dos ensaios MTT e cometa. Através do ensaio MTT confirmamos a já descrita resistência das ADSCs humanas aos agentes quimioterápicos e utilizando o ensaio cometa, mostramos que CIS e PAC não são capazes de induzir danos significativos ao DNA destas células. Assim, estes dados mostram que as ADSCs humanas não são sensíveis ao tratamento com os agentes testados. / As células-tronco mesenquimais (MSCs) são consideradas o tipo de célula-tronco adulta mais plástico, além de possuírem uma localização perivascular e residirem em todos órgãos e tecidos adultos. Nos últimos anos, as MSCs isoladas do tecido adiposo (ADSCs) têm recebido grande atenção por parte da medicina regenerativa, por serem facilmente isoladas e compartilharem várias características com as MSCs de medula óssea. Vários aspectos básicos da biologia das ADSCs têm sido estudados, mas pouco ainda se sabe sobre os mecanismos envolvidos na resistência destas células à exposição a agentes citotóxicos e genotóxicos, como quimioterápicos utilizados no tratamento do câncer. Desta forma, este trabalho teve como objetivo investigar o potencial citotóxico e genotóxico de duas drogas comumente utilizadas em terapias anti-câncer, cisplatina (CIS) e paclitaxel (PAC) sobre ADSCs humanas, através dos ensaios MTT e cometa. Através do ensaio MTT confirmamos a já descrita resistência das ADSCs humanas aos agentes quimioterápicos e utilizando o ensaio cometa, mostramos que CIS e PAC não são capazes de induzir danos significativos ao DNA destas células. Assim, estes dados mostram que as ADSCs humanas não são sensíveis ao tratamento com os agentes testados.

As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são as células reprogramadas com fatores de transcrição, como Oct-4, Sox-2, Klf-4 e c-MYC (OSKM). As iPSCs são geralmente obtidas pela expressão ectópica de vetores retrovirais e lentivirais contendo os fatores transcricionais OSKM. No entanto, a utilização de sistemas de expressão virais pode levar a mutagênese de inserção e geração de células tumorais. Assim, é preferível que a reprogramação celular ocorra temporariamente por meio de fatores OSKM fusionados com sequências de peptideos para a transdução de proteínas. Neste sentido, os genes sintéticos codificadores de transdução de péptidos fusionados ao N ou C-terminal de OSKM pode ser obtido por ferramentas da bioinformática específicos e sintetizados utilizando técnicas químicas avançadas. Esses genes sintéticos podem ser aplicados para a síntese de proteínas utilizando tanto técnicas in vivo quanto in vitro. Assim, o objetivo deste trabalho foi gerar fatores OSKM fusionados a transportana (TP10) usando genes sintéticos e sistema de transcrição e de tradução in vivo. Além disso, três genes sintéticos adicionais também foram obtidos para expressão de Oct-4 contendo TP10 fusionado na região N-terminal (N-OCT4-TP10), C-terminal (C-OCT4-TP10), e sem TP10 (Oct-4). A expressão ectópica dos três genes sintéticos para Oct-4 foram testadas in vivo em duas diferentes linhagens comerciais de E. coli que expressam a enzima de T7 RNA polimerase. Os dados de Western blot indicaram que todos os genes sintéticos de Oct-4 foram capazes de produzir proteínas recombinantes. No entanto, a expressão mais elevada foi obtida com a construção N-OCT4-TP10. Além disso, as proteínas do fator de transcrição Oct-4 obtitdas foram avaliadas quanto a sua capacidade de ligação a sua respectiva seqüência-alvo de DNA sendo avaliada por meio dos extratos brutos das proteínas de E. coli contendo ou não Oct-4 proteínas ectópica. Os dados do ensaio de ligação demonstraram que todas as sequências de Oct-4 foram capazes de se ligar às suas sequências de reconhecimento. Em conclusão, as proteínas Oct-4 funcionais fusionadas com o peptideo o transdutor pode ser obtido a partir de genes sintéticos, permitindo potencialmente elaborar protocolos de reprogramação virais livres. / Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed cells with a transcription factors such as Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-MYC (OSKM). iPSCs are generally obtained by ectopic expression of retroviral and lentiviral vectors containing tOSKM. However, the use of viral expression systems can lead to insertional mutagenesis and generation of tumor cells. Thus, it is preferable to temporarily reprogram cell by means of OSKM factors fused to peptides sequences for protein transduction. In this sense, synthetic genes coding to transduction peptides fused to the N- or C-termini of OSKM can be designed by specific bioinformatics tools and synthesized using advanced chemical techniques. Those synthetic genes can be applied for protein synthesis using both in vivo and in vitro techniques. Thus, the objective of this work was to generate OSKM factors fused to transportan (TP10) using synthetic genes and in vivo transcription and translation systems. Moreover, three additional synthetic genes also were obtained for Oct-4 expression containing TP10 fused to: (i) N-terminus (N-OCT4-TP10), e, (ii) C-terminus (C-OCT4-TP10), and (iii) without TP10 (Oct-4). Ectopic expression of the three synthetic genes for Oct-4 was tested in vivo in two different commercial strains of E. coli expressing the enzyme T7 RNA polymerase. Western blot data indicated that the all Oct-4 synthetic genes were able to produce the recombinant protein. However, highest expression was obtained with the construction N-OCT4-TP10. Furthermore, the binding capacity of Oct-4 fusion proteins in these respective target DNA sequences was assessed by the evaluation of E. coli protein extracts containing or not ectopic Oct-4 fusion proteins. Data from binding assay demonstrated that all Oct-4 sequences are able to bind to its recognition sequences. In conclusion, functional Oct-4 proteins fused to transducer peptides can be obtained from synthetic genes, allowing to potentially design viral-free reprogramming protocols.

Células-tronco mesenquimais (CTMs) estão entre os tipos de células-tronco encontradas a partir da fase fetal até a vida adulta de um indivíduo. As CTMs caracterizam-se pela morfologia similar à de fibroblastos associada à presença das proteínas de superfície celular CD73, CD90 e CD105, não apresentando expressão de marcadores hematopoiéticos, tais como CD34 e CD45. As CTMs são consideradas multipotentes e capazes de diferenciarem-se em osteoblastos, adipócitos e condroblastos. Além de humanos, as CTMs já foram isoladas de uma série de organismos modelo, dentre eles o camundongo e o frango doméstico (Gallus gallus). Apesar de pouco difundido nesse campo de estudo, o modelo G. gallus apresenta uma série de características que o torna uma alternativa interessante ao modelo murino. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar molecularmente as CTMs deincubação. Como resultado, obtiveram-se células com as características esperadas para uma CTM clássica. As CTMs isoladas apresentaram morfologia característica, expressão das proteínas de superfície CD73, CD90 e CD105 e ausência de marcadores hematopoiéticos. Além disso, as células mostraram-se capazes de diferenciarem-se em osteoblastos e pré-adipócitos. No entanto, as células isoladas de coração, apesar de apresentarem características de CTMs, foram incapazes de diferenciarem-se em adipócitos. A análise do perfil transcricional destas células, em comparação às obtidas de medula óssea, revelou que as mesmas superexpressam genes relacionados a morfogênese cardíaca, a angiogênese, a diferenciação de células de músculo cardíaco e a coagulação sanguínea. Considerando as características apresentadas pelas células isoladas de músculo cardíaco, existe a possibilidade de ter havido o isolamento de um tipo específico de célula-tronco cardíaca denominada de células derivadas de epicárdio (EDPCs – do inglês Epicardium derived cells). Desta forma, os resultados obtidos neste trabalho indicam que é possível isolar CTMs de medula óssea e músculo esquelético de fetos de frango. No entanto, as células obtidas de músculo cardíaco reúnem características de potenciais EPDCs e mais estudos são necessários para determinar a sua identidade. / Mesenchymal stem cells (MSC) are found in both fetal and adult individuals. MSC are characterized by their fibroblast-like morfology, the expression of the surface proteins like CD73, CD90 and CD105 and absence of hepatopoietic markers, such as CD34 e CD45. Besides, MSC are considered multipotent stem cells due to their capacity to differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondroblasts. MSC have been already isolated from human being and several model organisms, as mice and chicken (Gallus gallus). Unfortunately, G. gallus is not widely applied for the study of MSC, but it can be an interesting alternative to the murine model. In this context, the aim of this work was to isolate and molecularly characterize MSC derived from bone marrow, cardiac and skeletal muscle of 18-19 days chicken fetuses. Cells isolated from bone marrow and skeletal muscle presented the expected characteristics for MSC. They expressed CD73, CD90 and CD105, but were negative for hematopoietic markers. Moreover, the cells were able to differentiate into osteoblastic and adipogenic lineages. Cells obtained from cardiac muscle presented the same molecular and morphological characteristics, except that they were not able to differentiate into adipocytes. Transcriptional profile analysis of cardiacderived cells revealed that they overexpress genes related to heart morphogenesis, angiogenesis processess, smooth muscle cells differentiation and blood coagulation. There is a possibility that cells isolated from cardiac muscle are of an specific type named epicardium derived cells (EPDCs). The results obtained in this work point that is possible to isolate MSC from bone marrow and skeletal muscle from chicken fetuses. Nevertheless, cells obtained from cardiac muscle gather characteristics of putative EPDCs and further studies are necessary to elucidate the real identity of cardicac muscle isolated cells.

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