INTRODUÇÃO: As células-tronco mesenquimais são capazes de regenerar diferentes tipos de tecidos, no entanto, a maioria dos métodos para sua obtenção são invasivos. Recentemente, foi descoberta a existência destas células no sangue menstrual. OBJETIVO: Padronizar as técnicas de coleta e transporte do fluido menstrual, bem como a caracterização, isolamento, expansão e criopreservação de células-tronco do fluido menstrual e avaliar a disponibilidade de células tronco mesenquimais no fluido menstrual. MÉTODOS: No período de agosto de 2011 a março de 2012 foram selecionadas 20 voluntárias com ciclo menstrual regular, sem doença ginecológica. O fluido menstrual foi coletado no dia de maior fluxo e submetido a imunofenotipagem e cultivo celular. Foram realizadas duas passagens em meio de cultura até atingir semi-confluência das células-tronco, as quais foram, em seguida, criopreservadas. RESULTADOS: Os parâmetros analisados apresentaram os seguintes valores médios: volume de fluido menstrual 6,90±5,60mL; tempo de transporte 17,20±5,50h; número de células totais 3,95 x106±3,88 x106 com 76,05%±24,57 de células viáveis. Após a cultura, as células mesenquimais aumentaram de 0,14%±0,26 para 96,19%±2,14. Na primeira passagem de cultura, após 15 a 21 dias, as colônias formaram grupos que atingiram a confluência, que a partir da segunda passagem ocorreu em cerca de 3 dias. As células-tronco mesenquimais criopreservadas eram viáveis. CONCLUSÃO: As células-tronco do fluido menstrual podem ser obtidas sem métodos invasivos. O fluido menstrual pode ser transportado em condições ideais de temperatura até 24 horas após a coleta. As células tronco mesenquimais podem ser caracterizadas por imunofenotipagem, isoladas, cultivadas e expandidas e, em seguida, criopreservadas. O fluido menstrual contém células tronco mesenquimais viáveis e apropriadas para cultivo / INTRODUCTION: Mesenchymal stem cells may renovate different tissues, but techniques to obtain these cells are invasive. Recently, those cells were detected in menstrual blood. OBJECTIVE: Patterning techniques of collection, transportation, characterization, isolation, expansion and cryopreservation of stem cells in menstrual fluid. METHODS: From August 2011 to March 2012 twenty volunteers were selected with regular menstrual cycle without gynecological diseases. They collected menstrual fluid on the most intense flux day to analysis by immunophenotyping and cellular culture. Culture was made in 2 stages until reached semi-confluence of stem cells and these cells were cryopreserved. RESULTS: Average of menstrual fluid volume was 6,90±5,60mL, transportation time was 17,20±5,50h, and total number of cells was 3,95 x106±3,88 x106 witch 76,05%±24,57 were viables. After culture, mesenchymal stem cells increased from 0,14%±0,26 to 96,19%±2,14. After 15 to 21 days of culture in first passage, colonies formed clusters that reached confluence. In second passage, it happens after 3 days of culture and stem cells were cryopreserved. CONCLUSION: Stem cells of menstrual fluid may be easily obtained without invasive methods. Menstrual fluid can be transported in good conditions of temperature up to 24 hours of collection. Mesenchymal stem cells of menstrual fluid may be characterized by immunophenotyping, as well as it is possible to isolated, cultivate and cryopreserved them. Menstrual fluid has viable and proper for culture mesenchymal stem cells

Orientador: Cecília Amélia de Carvalho Zavaglia / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Mecânica / Made available in DSpace on 2018-08-20T20:36:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigues_LeonardoRibeiro_D.pdf: 27919489 bytes, checksum: c5885ca5237fb42cea7f7189a4070b0e (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A engenharia tecidual associada à nanotecnologia ganhou destaque no meio científico devido a sua multidisciplinaridade e capacidade de atingir várias áreas de estudo, inclusive no campo da medicina regenerativa. Para que o processo de regeneração tecidual óssea ocorra de forma esperada é possível utilizar scaffolds, que com sua estrutura porosa e com poros interconectados estruturam e organizam a região injuriada durante a recuperação do tecido. A organização da estrutura 3D da região afetada deve ser estudada para que seja possível criar scaffolds apropriados ao tamanho e forma do defeito existente. Com o scaffold já implantado deve ser avaliada a interação dos materiais com as células da região danificada. A partir desse princípio, o objetivo deste trabalho foi sintetizar nanopartículas de hidroxiapatita (HA) e betafosfato tricálcico ('beta'-TCP) utilizando a nova rota química baseada na utilização da sacarose como agente formador do gel (sucrose-based route) para síntese das nanopartículas, que são utilizadas na produção dos scaffolds, formando compósitos HA/TCP que serão utilizados como suporte para células tronco mesenquimais (MSCs) nos testes de substituição de tecidos ósseos. As nanopartículas foram caracterizadas por DRX, FRX, equação de Scherrer, MEV, MET, EELS, ESEM, NTA, FTIR e potencial Zeta. A partir dos dois fosfatos de cálcio (HA e 'beta'-TCP), foram feitos dois tipos de compósitos (esponja cerâmica e pastilha porosa) que foram caracterizados por ensaio mecânico de compressão axial, DRX, picnometria, microtomografia de raios X (Micro- CT), ESEM, FTIR e ensaio de degradação. Após a caracterização dos compósitos, os scaffolds foram submetidos a testes in vitro e in vivo e caracterizados por lupa de fluorescência, microscopia confocal, MEV, EDS, radiografia, MTT e histologia. Os resultados sugerem que os compósitos obtidos possam ser utilizados na potencialização da diferenciação osteogênica de MSCs provendo o desenvolvimento de novos modelos de bioengenharia tecidual na reconstrução óssea / Abstract: Tissue engineering associated with nanotechnology stood out because of its multidisciplinarity and results, in addition to targeting many areas of study in the field of regenerative medicine. For the process of bone regeneration to occur in appropriate form, the injured area must be organized. The reorganization of the 3D structure in the affected area should be studied in order to create scaffolds of appropriate size and shape similar to the existing defect. The implanted scaffold should be evaluated regarding the interaction of the material with the cells on the damaged region. From this principle, the objective of this work was to synthesize nanoparticles of hydroxyapatite (HA) and tricalcium phosphate ('beta'-TCP) using the new sucrosebased route which is based on the use of sucrose as a chelating agent for synthesis of nanoparticles, which are used in the production of scaffolds, forming composite HA / TCP that will be used as support for mesenchymal stem cells (MSC) in the replacement tests of bone tissue. The nanoparticles were characterized by XRD, XRF, Scherrer equation, SEM, TEM, EELS, ESEM, NTA, FTIR and Zeta potential. With two calcium phosphates (HA and TCP) it was prepared two types of composites (ceramic sponge and porous ceramic cylinder), which were characterized by mechanical test, XRD, pycnometry, X-ray microtomography (Micro-CT) ESEM, FTIR and degradation test. Scaffolds were tested in vivo and in vitro and they were characterized by magnifying fluorescence, confocal microscopy, SEM, EDS, radiography, MTT and histology. The results suggest that the scaffolds obtained can be used to improve the osteogenic differentiation of the MSC providing the development of new types of bone tissue engineerinG / Doutorado / Materiais e Processos de Fabricação / Doutor em Engenharia Mecânica

As células tronco mesenquimais derivadas do âmnio (AMSCs) são células multipotentes com alto potencial para se diferenciar em múltiplas linhagens. Podem ser isoladas sem recurso a procedimentos invasivos e usadas sem levantar quaisquer implicações éticas. O presente estudo visa isolar e caracterizar as células mesenquimais progenitoras da membrana amniótica de gatos domésticos para futura aplicação em terapia celular. As células foram isoladas de quatro membranas fetais, coletadas durante as campanhas rotineiras de castração em gatas no último terço de gestação, após anestesia geral. A porção dorsal do âmnio foi separada mecanicamente, lavada com PBS e submetida à digestão com colagenase. As células coletadas foram propagadas em cultivo (DMEN-F12/-MEM) e criopreservadas em várias passagens enquanto se efetuava a avaliação da cinética de crescimento e das características morfológicas. Em cultivo, as AMSCs demonstraram aderência à placa e uma morfologia similar a dos fibroblastos. A análise imunofenotípica revelou presença de marcadores específicos de MSCs CD73 e CD90 e ausência de marcadores hematopoiéticos CD34, CD45 e CD79 sugerindo a presença de células mesenquimais multipotentes na membrana amniótica de gatos domésticos. Em condições apropriadas, estas células diferenciaram-se em linhagens específicas osteogênica e adipogênica. Entretanto, após inoculação em camundongos imunodeficientes não foi registrado formação de teratomas. Estes achados sugerem que o âmnio de gatos domésticos pode ser considerado uma importante fonte de MSCs com maior atração para medicina regenerativa. / The amnion derived mesenchymal stem cells (AMSCs) are multipotent cells with a high ability to differentiate into multiple lineages. They can be obtained by non-invasive methods and therefore are exempt from the normal ethical problems involving stem cell use. The aim of this study was to isolate and characterize the progenitor mesenchymal cells from the cat amniotic membrane for future application in cell therapy. The cells were isolated from four fetal membranes collected after a routine ovarian hysterectomy process from cats in their third gestational trimester, under general anesthesia. The dorsal portion of amnion was mechanically separated, washed with PBS and subjected to collagenase digestion. The isolated cells were propagated in culture media (DMEMF12 or -MEM) and frozen in various passages while the growing kinetics and cell morphology were analyzed. In culture medium, AMSCs were adherent to the plastic culture dish and had a morphology similar to fibroblasts. Immunophenotyping assays showed the presence of MSCs specific markers CD73 and CD90 and absence of hematopoietic markers CD34, CD45 and CD79 suggesting the presence of multipotent mesenchymal cells in the cat amniotic membrane. Under appropriate conditions, these cells differentiated into osteogenic and adipogenic cell lineages. Moreover, after injection into immunodeficient mice, no tumors were generated. These findings suggest that the cat amniotic membrane can be considered an important and useful source of MSCs for regenerative medicine.

O enfisema pulmonar é caracterizado pela destruição das paredes alveolares, sendo a fumaça de cigarro o principal agente etiológico. Pretendeu-se, neste estudo, comparar os efeitos terapêuticos do transplante de células mononucleares da medula óssea (BMMC) e células mesenquimais (CTM) em animais com enfisema pulmonar induzido por exposição à fumaça de cigarro. Camundongos fêmeas da linhagem C57Bl6/J foram expostos à fumaça de cigarro durante 90 dias e, 21 dias após o término do período de exposição, receberam BMMC ou CTM derivadas da medula óssea de camundongos machos da linhagem C57Bl6/J, expressando a proteína GFP. As análises morfométricas mostraram que os tratamentos com BMMC e CTM foram eficientes na recuperação do parênquima pulmonar dos animais expostos à fumaça de cigarro. Testes de fluorescência direta e PCR mostraram a migração de BMMC e CTM para o pulmão. Desta forma, pode-se concluir que, morfologicamente, a terapia celular com BMMC ou CTM é eficaz no tratamento do enfisema pulmonar resultante da exposição à fumaça de cigarro em modelo animal. / Pulmonary emphysema is characterized by destruction of alveolar walls, and the cigarette smoking is the main etiologic agent. It was intended in this study to compare the therapeutic effects of the transplantation of bone marrow mononuclear cells (BMMC) and mesenchymal stem cells (MSC) in animals with pulmonary emphysema induced by exposure to cigarette smoke. C57Bl6/J female mice were exposed to cigarette smoke for 90 days and 21 days after the end of the exposure time, received BMMC or MSC derived from bone marrow of C57Bl6/J male mice expressing the GFP protein. The morphometric analysis showed that treatments with BMMC and MSC were efficient in recovering the lung of animals exposed to cigarette smoke. Fluorescence and PCR tests showed the migration of BMMC and MSC to the lung. Thus, it is concluded the cell therapy with BMMC or CTM is morphologically effective in the treatment of pulmonary emphysema resulting from exposure to cigarette smoke in an animal model.

INTRODUÇÃO: Apesar dos primeiros relatos sobre o uso clínico de células estromais derivadas do tecido adiposo (ADSC) sugerirem que esta abordagem seja factível e efetiva na reconstrução de partes moles, não existem na literatura ensaios clínicos randomizados e com inclusão de controles. Assim sendo, foi objetivo deste estudo investigar se um novo protocolo para o isolamento de ADSC e seu uso em conjunto com os enxertos de gordura é de fato capaz de aumentar a sobrevivência destes enxertos. MÉTODOS: Pacientes com microssomia craniofacial (n=18) foram selecionados e randomicamente distribuídos para o grupo EC (com suplementação de ADSC) ou o grupo EE (sem suplementação de ADSC). Para o grupo EC, ADSC imediatamente isoladas a partir de metade do volume lipoaspirado foram utilizadas para o enriquecimento de células progenitoras do enxerto. A quantidade de tecido adiposo transplantado foi determinada pela simetria com o lado não afetado, não sendo realizado qualquer tipo de supercorreção. O número total de células viáveis isoladas antes e após a suplementação dos enxertos de gordura foi calculado, e através de citometria de fluxo estas células foram examinadas quanto à presença de marcadores de superfície para células mesenquimais. Tomografia computadorizada foi realizada para avaliar ambas as hemifaces no pré-operatório e no pós-operatório de seis meses. A espessura do revestimento de partes moles em quatro diferentes pontos de referência e o volume das hemifaces foram calculados. Morbidade geral e variáveis transoperatórias foram registradas. RESULTADOS: Para ambos os grupos o volume médio injetado foi de aproximadamente 28 mL. O número médio de células viáveis isoladas antes e após a suplementação dos enxertos foi 5,6 x 105 e 9,9 x 105 células por mL de tecido adiposo (p=0,015). Análise de citometria de fluxo revelou que ADSC foram positivas para marcadores de células mesenquimais (>95% para CD 73 e CD 105). No pós-operatório de seis meses, o índice de espessura média nos pontos de 1 a 4 foi de 0,91 (p=0,002), 1,02 (p=0,01), 1,05 (p=0,001), e 1,00 (p=0,04) no grupo EC, e 0,80 (p=0,58), 0,95 (p=0,18), 0,85 (p=0,009), e 0,84 (p=0,59) no grupo EE. Para o grupo EC o volume de gordura mantido após seis meses foi de 84 % e para o grupo EE foi de 51 % (p=0,003). Nenhuma complicação foi detectada. CONCLUSÕES: Estes resultados sugerem que o isolamento e a suplementação de ADSC é efetivo, seguro e superior à lipoenxertia convencional para o aumento de partes moles da face em pacientes portadores de microssomia craniofacial / INTRODUCTION: Although first reports of the clinical use of adipose-derived stromal cells (ADSC) suggest that this approach may be feasible and effective for soft tissue reconstruction, there is a lack of randomized, controlled clinical trials in the literature. Hence, this study aimed to investigate whether a novel protocol for isolation of ADSC and their use in combination with fat tissue could really improve the long-term retention of the grafts. METHODS: Patients with craniofacial microsomia (n=18) were selected and randomly assigned to group EC (with supplementation of ADSC) or group EE (without supplementation of ADSC). For group EC, ADSC freshly isolated from half of the aspirated fat sample were used to enrich for progenitor cells in the graft. Amount of transplanted adipose tissue was determined by trying to obtain symmetry with the unaffected side without any overcorrection. Number of viable cells isolated before and after the supplementation of the grafts was calculated, and these cells were examined for mesenchymal cell surface markers using flow cytometry. Computed tomography was performed to assess both hemifaces preoperatively and at six months postoperatively. Soft tissue thicknesses at four different reference points and the hemifaces volume were calculated. Overall morbidity and surgical variables were recorded. RESULTS: For both groups mean injected volume was 28 mL. Average number of viable cells isolated before and after supplementation of the grafts was 5,6 x 105 and 9,9 x 105 cells per mL of fat tissue (p=0,015). Flow cytometry analysis revealed that the ADSC were positive for mesenchymal cell markers (>95% for CD 73 and CD 105). At six months postoperatively, average thickness ratio at points 1 to 4 was 0,91 (p=0,002), 1,02 (p=0,01), 1,05 (p=0,001), and 1,00 (p=0,04) in group EC, and 0,80 (p=0,58), 0,95 (p=0,18), 0,85 (p=0,009), and 0,84 (p=0,59) in group EE. For group EC surviving fat volume at six months was 84 % and for group EE it was 51 % (p=0,003). No complications were detected. CONCLUSIONS: These results suggest that this strategy for isolation and supplementation of ADSC is effective, safe and superior to conventional lipoinjection for facial recontouring in patients with craniofacial microsomia

A cicatrização de feridas crônicas e de defeitos complexos representam desafios para a cirurgia plástica reconstrutiva. Novos tratamentos emergiram com a utilização de células tronco mesenquimais, com especial interesse para as derivadas de tecido adiposo (CTMs-TA), por possuir algumas vantagens em relação às derivadas da medula óssea. Algumas doenças poderiam se beneficiar com o uso das CTMs-TA, em particular, as feridas de pacientes portadores de anemia falciforme que ainda representam um desafio terapêutico. Neste estudo, investigou-se a existência de possíveis áreas doadoras preferenciais de CTMs-TA no tecido adiposo (TA) por meio da comparação de aspectos qualitativos e quantitativos das CTMs-TA derivadas de cinco diferentes áreas corporais. Posteriormente, analisou-se a influência do sobrenadante dessas células, rico em citocinas e fatores de crescimento, sobre a migração de fibroblastos de indivíduos normais e de portadores de anemia falciforme in vitro. Não foram observadas diferenças qualitativas entre as CTMs-TA das cinco áreas analisadas. A região do dorso apresentou número maior de CTMs, com diferença significativa em relação à região das coxas. A adição de sobrenadante produzido por CTMs-TA demonstrou aumento da velocidade de migração dos fibroblastos de forma similar para os normais e os falciformes. O microambiente desfavorável presente nas feridas falciformes parece exercer importante influência sobre esses fibroblastos, pois uma vez corrigido o microambiente com os meios de cultivo apropriados, as células apresentaram taxa de duplicação e velocidade de migração semelhante à dos fibroblastos normais in vitro. / The healing of chronic wounds and complex defects represents challenges for reconstructive plastic surgery. New treatments have emerged with the use of multipotent mesenchymal cells, with special interest for the adipose-derived stem cells (ADSCs) as it has some advantages over the bone marrow-derived. Some diseases could benefit from the use of ADSCs, in particular, the wounds of patients with sickle cell anemia that still represent a therapeutic challenge. In this study, we investigated the existence of possible preferential donor areas of ADSCs in adipose tissue by comparing qualitative and quantitative aspects of ADSCs derived from five different body areas. Later, we analyzed the influence of the supernatant of these cells, rich in cytokines and growth factors, on the migration of fibroblasts from healthy individuals and from patients with sickle cell anemia in vitro. No qualitative differences were observed among the ADSCs of the five areas analyzed. The dorsum presented a higher number of ADSCs, with a significant difference in relation to the thigh. Addition of supernatant produced by ADSCs has been shown to increase the rate of migration of fibroblasts in a similar way to healthy and sickle cells. The unfavorable microenvironment present in sickle wounds seems to exert a significant influence on these fibroblasts because once the microenvironment was corrected with the appropriate culture media, the cells had a doubling rate and migration rate similar to normal fibroblasts in vitro.

A cicatrização de feridas crônicas e de defeitos complexos representam desafios para a cirurgia plástica reconstrutiva. Novos tratamentos emergiram com a utilização de células tronco mesenquimais, com especial interesse para as derivadas de tecido adiposo (CTMs-TA), por possuir algumas vantagens em relação às derivadas da medula óssea. Algumas doenças poderiam se beneficiar com o uso das CTMs-TA, em particular, as feridas de pacientes portadores de anemia falciforme que ainda representam um desafio terapêutico. Neste estudo, investigou-se a existência de possíveis áreas doadoras preferenciais de CTMs-TA no tecido adiposo (TA) por meio da comparação de aspectos qualitativos e quantitativos das CTMs-TA derivadas de cinco diferentes áreas corporais. Posteriormente, analisou-se a influência do sobrenadante dessas células, rico em citocinas e fatores de crescimento, sobre a migração de fibroblastos de indivíduos normais e de portadores de anemia falciforme in vitro. Não foram observadas diferenças qualitativas entre as CTMs-TA das cinco áreas analisadas. A região do dorso apresentou número maior de CTMs, com diferença significativa em relação à região das coxas. A adição de sobrenadante produzido por CTMs-TA demonstrou aumento da velocidade de migração dos fibroblastos de forma similar para os normais e os falciformes. O microambiente desfavorável presente nas feridas falciformes parece exercer importante influência sobre esses fibroblastos, pois uma vez corrigido o microambiente com os meios de cultivo apropriados, as células apresentaram taxa de duplicação e velocidade de migração semelhante à dos fibroblastos normais in vitro. / The healing of chronic wounds and complex defects represents challenges for reconstructive plastic surgery. New treatments have emerged with the use of multipotent mesenchymal cells, with special interest for the adipose-derived stem cells (ADSCs) as it has some advantages over the bone marrow-derived. Some diseases could benefit from the use of ADSCs, in particular, the wounds of patients with sickle cell anemia that still represent a therapeutic challenge. In this study, we investigated the existence of possible preferential donor areas of ADSCs in adipose tissue by comparing qualitative and quantitative aspects of ADSCs derived from five different body areas. Later, we analyzed the influence of the supernatant of these cells, rich in cytokines and growth factors, on the migration of fibroblasts from healthy individuals and from patients with sickle cell anemia in vitro. No qualitative differences were observed among the ADSCs of the five areas analyzed. The dorsum presented a higher number of ADSCs, with a significant difference in relation to the thigh. Addition of supernatant produced by ADSCs has been shown to increase the rate of migration of fibroblasts in a similar way to healthy and sickle cells. The unfavorable microenvironment present in sickle wounds seems to exert a significant influence on these fibroblasts because once the microenvironment was corrected with the appropriate culture media, the cells had a doubling rate and migration rate similar to normal fibroblasts in vitro.

Orientador: Rui Seabra Ferreira Junior / Resumo: Atualmente são muitos casos de pacientes que perdem estrutura óssea em acidentes ou reabsorção patológica. A bioengenharia óssea é um tratamento promissor que visa reconstruir estas estruturas sem a morbidade do enxerto autógeno. O tecido ósseo é um conjuntivo especializado com a função principal de proteção e sustentação dos tecidos moles, mas também é responsável pela produção de tipos celulares e homeostase de minerais. Sua reparação é complexa com diferentes tipos celulares e agentes quimiotáticos que funcionam de forma orquestrada até a reparação. As terapias celulares vêm sendo estudadas para promover a reparação de defeitos que o organismo por si não consegue resolver. Células menos especializadas como as células-tronco embrionárias (ESCs) possuem grande potencial terapêutico, mas são complicadas eticamente. Já as células-tronco mesenquimais (MSC) podem ser autólogas, o que minimiza o risco de imunogenicidade mas necessitam área doadora do paciente. Atualmente ainda não há consenso quanto ao uso de células tronco na terapia regenerativa pois há grandes variáveis como a melhor forma de aplicação, a quantidade correta e o melhor tipo celular para a regeneração óssea. As células produzem mediadores químicos no local enxertado, que segundo pesquisas recentes é o principal mecanismo de reparação tecidual. Estes mediadores são depositados em abundância no meio de cultura durante a cultura celular e usados na bioengenharia com a ajuda de scaffolds. Os biopolímeros de fibrina ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Chapter I present a review about bone repair and its biological events, bioengineering, cells, fibrin biopolymer as scaffold and the secretoma derived from cell culture. Many patients nowadays lose bone structure in accidents or pathological reabsorption. Bone bioengineering is a promising treatment that aims to reconstruct these structures without autogenous graft morbidity. Bone tissue is a specialized connective tissue specialized in protecting and supporting soft tissues, but it is also responsible for the production of cell types and mineral homeostasis. The bone healing is a complex process where different cell types and chemotactic agents work in an orchestrated way. The cell therapies can promote the repair of defects that the body cannot solve. Less specialized cells like embryonic stem cells (ESCs) have great therapeutic potential, but are ethically complicated. In contrast, mesenchymal stem cells (MSCs) may be autologous, which minimizes the risk of immunogenicity but requires a patient's donor area. Currently there is still no consensus regarding the use of stem cells in regenerative therapy, studies uses different methods, cells and biomaterials for bone regeneration. Recent researches advocate that paracrine secretions by cells are main mechanism of tissue repair. These mediators are deposited in abundance in the culture medium during cell culture. Fibrin biopolymers (BF) are natural biomaterials to the body and can function as drug delivery of growth factors, c... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Introdução: O fígado é um órgão chave na manutenção da homeostasia corpórea e o transplante hepático ainda continua sendo o padrão-ouro no tratamento da insuficiência hepática aguda. A falta de doadores tem favorecido o desenvolvimento da terapia celular. Células derivadas de medula óssea podem se diferenciar em células tipo-hepatócitos em menos de 24 horas e a comunicação através de vesículas extracelulares (VEs) é um dos mecanismos propostos para explicar essa capacidade. Muitos estudos têm demonstrado que as células-tronco mesenquimais (CTMs) da medula tem alta plasticidade para se diferenciar em hepatócitos, mas os protocolos normalmente utilizados levam entre 7 e 28 dias. Objetivo: Analisar a capacidade de diferenciação das CTMs da medula em se tornar uma célula tipo-hepatócito através do mecanismo de comunicação celular por VEs em cultura (6 e 24 horas). Materiais e métodos: Para avaliar o efeito de hepatócitos primários isolados de ratos saudáveis e lesados com CCl4 na diferenciação das CTMs foi utilizado um sistema de co-cultivo com insertos que não permitem o contato entre as células colocando as CTMs na câmera superior e os hepatócitos na câmera inferior do sistema. Meio condicionado de hepatócitos com lesão foi utilizado para avaliar a capacidade das CTMs de capturar VEs e se diferenciar em célula-tipo hepatócito. Os marcadores de célula tipo-hepatócito avaliados foram expressão gênica (alfa fetoproteina, albumina e citoqueratina-18), armazenamento de glicogênio e liberação de ureia. Para rastrear VEs, hepatócitos de ratos lesados foram marcados com PKH-26. As VEs foram obtidas por ultracentrifugação do sobrenadante e analisadas por citometria de fluxo. Hepatócitos e CTMs também foram analisados por citometria de fluxo na busca de marcação positiva. Resultados: CTMs co-cultivadas durante 6 e 24 horas com hepatócitos não apresentaram expressão de genes hepáticos, mesmo quando expostas a um ambiente de lesão. Os ensaios funcionais confirmaram a falta de sinais de diferenciação, sendo que não foi observado armazenamento de glicogênio nem liberação de ureia nas CTMs. Um achado interessante foi que ao analisar o sobrenadante da câmera superior do sistema de co-cultivo, não foram achadas VEs marcadas com PKH-26 nem CTMs com rastros do marcador. Por outro lado, os experimentos utilizando meio condicionado mostraram que as CTMs têm capacidade de capturar VEs. A citometria de fluxo mostrou que às 6 horas e 24 horas respetivamente 2,28% e 3,97% das CTMs eram positivas para o marcador PKH-26. Quando analisadas no microscópio de fluorescência, foram vistos pontos vermelhos nas CTMs alguns dos quais parecem carregar a proteína albumina. Porém a expressão gênica e analise de ureia não se adequaram a um perfil de célula tipo-hepatócito. Conclusões: O sistema de co-cultivo não foi adequado para permitir a transferência e comunicação através de VEs entre hepatócitos e CTMs sendo que as VEs não conseguem atingir a câmara superior. Os experimentos com meio condicionado sugerem que as CTMs têm capacidade de capturar VEs derivadas de hepatócitos, porém a captação não conduz ao desenvolvimento de um perfil de célula tipo-hepatócito em 6 e 24 horas. São necessários mais estudos para esclarecer a dinâmica de transferência das VEs e suas consequências em longo prazo. / Introduction: Liver is a key organ for corporeal homeostasis maintenance and whole organ replacement still remains the gold standard procedure to treat acute liver failure. Shortage of liver donor has promoted the increase on cell-therapy research. Bone marrow (BM) derived cell have shown potential for differentiation into hepatocyte-like cells in a short time and extracellular vesicles communication (EVs) is one of the proposed mechanisms. Plasticity of bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) is extensively supported by scientific literature but protocols applied to differentiation usually take from 7 to 28 days. Objective: To analyze in vitro differentiation potential of BM-MSCs into hepatocyte-like cells through EVs transfer mechanism in 6 and 24 hours. Materials and Methods: Co-culture system with cell-impermeable inserts and conditioned medium experiments were used to explore the effects of healthy and CCl4-injured hepatocytes, over BM-MSCs differentiation. Assessment of hepatocyte-like cell profile on BM-MSCs was revealed by gene expression (alpha fetoprotein, albumin and cytokeratin-18), glycogen storage and urea release. Hepatocytes from CCl4-injured rats were labeled by PKH-26 to track EVs. Ultracentrifugation was used to isolate EVs from supernatant medium of the two chamber of the co-culture system. PKH-26 positive EVs and PKH-26 positive cells were revealed by flow cytometry analysis and fluorescent microscopy. BM-MSCs cultured with conditioned medium were stained with ALB-FITC antibody. Results: Co-cultured BM-MSCs for 6 and 24 hours, showed no expression of hepatocyte-like genes, even after exposure to damaged microenvironment. Functional assays confirm the lack of differentiation signs there were no glycogen storage or urea release. Interestingly, EVs traffic analysis revealed no PKH-26 positive EVs at the upper chamber of co-culture system and no positive BM-MSCs were found either. On the other hand, conditioned medium experiment showed that BM-MSCs could uptake EVs. Flow cytometry analysis showed positive PKH-26 BM-MSCs at 6 (2.28%) and 24 (3.97%) hours. Flourescence microscopy revealed red points into BM-MSCs and immunofluorescence suggest that some EVs contain albumin. Gene expression and urea assay of BM-MSCs were not in accordance with a hepatocyte-like profile. Conclusions: Co-culture system, by using cell-impermeable membrane, was not adequate to promote EVs transfer between hepatocyte and BM-MSCs since EVs do not pass from the lower to the upper chamber. Conditioned medium experiments can suggest that BM-MSCs could uptake hepatocyte-derived EVs but this not drive to a hepatocyte-like profile in a short period of time. More studies will be necessary to clarify the dynamic of EVs transfer and their long time effects.

A manutenção do estado progenitor durante o cultivo de células mesenquimais progenitoras derivadas do tecido adiposo (MSCs-TA), caracterizado pelo potencial de diferenciação e da capacidade de autorrenovação, é atualmente um dos maiores desafios da terapia celular. Sabendo da influência da angiogênese no desenvolvimento de tecidos de origem mesenquimal, avaliamos se um ambiente pro-angiogênico mimetizado em cultura forneceria condições para manutenção de um estado progenitor durante o processo de expansão celular. Utilizando como modelo de um ambiente pró-angiogênico o cultivo no meio EGM-2, o qual é suplementado pelos fatores de crescimento EGF, FGF-2, IGF e VEGF, nós demonstramos que a presença de tais fatores pró-angiogênicos é fundamental para a manutenção do estado progenitor de MSCs-TA em cultura. Verificamos que a presença de tais fatores de crescimento possibilitaram às MSCs-TA apresentarem um alto potencial de diferenciação adipogênico e osteogênico em comparação ao meio convencional DMEM/F12 e ao meio EBM, ausente de fatores. Além disso, o cultivo na presença de fatores pró-angiogênicos aumentou o potencial clonogênico das MSCs-TA, ao mesmo tempo em que aumentou a capacidade proliferativa destas células. Dentre os fatores de crescimento, EGF e FGF-2 foram responsáveis pelos efeitos mais robustos. Ao mesmo tempo, células cultivadas nas presença destas citocinas foram capazes de manter a morfologia fibroblastóide e apresentaram alta expressão do fator de pluripotência Klf-4. Em concordância com estes achados, o transplante subcutâneo de MSCs-TA cultivadas nestas condições mostrou que aquelas mantidas em EGM-2 geram um tecido semelhante ao tecido formado pela fração estromal vascular não cultivada. Estes resultados reforçam o papel do ambiente pró-angiogênico na manutenção do estado progenitor de MSCs-TA, e que tal estado foi proporcionado pela ação dos fatores de crescimento pró-angiogênicos EGF, FGF-2, IGF e VEGF nas células em cultivo, com destaque para as citocinas EGF e FGF-2. Em conclusão, o uso do ambiente pró-angiogênico no cultivo de MSCs-TA mostrou-se como uma abordagem promissora para a manutenção do estado progenitor destas células in vitro. / The maintenance of the progenitor state in the culture of adipose tissue derived- mesenchymal progenitor cell (TA-MSCs), characterized by the differentiation potential and self-renewal capability, is currently one of the major challenges of cell therapy. The information that the angiogenesis influences the development of mesenchymal tissues, has led us to evaluate how a pro-angiogenic environment mimicked in culture would provide conditions for maintaining a progenitor state during the cell expansion process. We designe a model for a pro-angiogenic environment in which cells grown in EGM-2 supplemented with the following growth factors: EGF, FGF-2, IGF and VEGF, and demonstrated that the presence of such pro-angiogenic growth factors was crucial for maintenance of the progenitor of AT-MSCs in culture. We observed that the presence of such growth factors allowed to AT-MSCs a high potential of adipogenic and osteogenic differentiation compared to conventional DMEM/F12 medium and the EBM medium, in the absence of the factors. Furthermore, the culture in presence of pro-angiogenic growth factors increased the clonogenic potential of AT-MSCs and increased the proliferative capability of these cells. Among the growth factors, EGF and FGF-2 were responsible for most robust effects. At the same time, cells cultured in the presence of these cytokines were able to maintaining the fibroblastoid morphology and presented high expression levels of Klf-4 pluripotency factor. In agreement with these observations, the subcutaneous transplantation of AT-MSCs cultured under these conditions showed that those cells kept in EGM-2 generated a tissue-like to tissue formed by the stromal vascular fraction uncultivated. These results reinforce the role of the pro-angiogenic environment in the maintenance of the progenitor state of AT-MSCs, and that such a state was provided by the action of the pro-angiogenic growth factors EGF, FGF-2, IGF and VEGF in cultured cells, highlighting EGF and FGF-2 cytokines. In conclusion, we showed that the use of a pro-angiogenic environment in AT-MSCs culture is a promising approach to the maintain the progenitor state of these cells in vitro.