Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2665.pdf: 1669132 bytes, checksum: dfe7f18cc9241784c82420b0409bd47e (MD5) Previous issue date: 2009-09-21 / Universidade Federal de Sao Carlos / Disintegrins are toxins commonly found in snake venoms whose biological effects occour upon interaction with surface receptors known as integrins. DisBa-01, an RGD disintegrin isolated from a cDNA library made with mRNAs from the venom gland of Bothrops alternatus, bears anti-metastatic, anti-angiogenic and anti-thrombotic activity in nude mice, partially mediated by interaction with integrin _v_3. Studies with Wistar rats also show that protein has angiogenic activity during regeneration after surgery. The objectives of this study were to evaluate the effects of DisBa-01 on adhesion, deadhesion and proliferation of C2C12 myoblasts and evaluate the electrophoretic profile of secreted proteins of DisBa-01-treated cells. Myoblasts (103 cells/well) were incubated with five concentrations of DisBa-01 under different incubation times and adhesion substracts (plastic, collagen type I or fibronectin). The supernatant was collected for 2DE analysis and the cells were quantified. Also, flow cytometry was used to evaluate the expression of integrins (_2, _4, _5, _v, _v_3, _1 and _4). DisBa-01 inhibited adhesion to fibronectin in high concentration (1000nM) and to collagen type I in all tested concentrations, but did not detach cells from collagen or fibronectina matrix nor affected myoblast proliferation. Flow cytometry showed that integrins _v and _1 were present. 2DE analysis points to an increase of secreted proteins, mainly in higher DisBa- 01 concentration (1000nM). In conclusion, C2C12 myoblasts are sensitive to DisBa-01, suggesting this protein initiates a sinalization cascade mediated by integrins, which modifies protein expression and secretion. / Desintegrinas são toxinas frequentemente encontradas em venenos de serpentes e cujos efeitos biológicos ocorrem devido à interação com receptores de superfície conhecidos como integrinas. A DisBa-01, uma desintegrina RGD isolada de mRNAs da glândula venenífera de Bothrops alternatus, possui atividade anti-metastática, anti-angiogênica e anti-trombótica em camundongos atímicos, parcialmente mediada pela interação com a integrina _v_3. Estudos in vivo com ratos Wistar também indicam que esta proteína pode ter atividade pró-angiogênica durante regeneração pós-cirúrgica. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da DisBa-01 na adesão, desadesão e proliferação celular de mioblastos C2C12, além de avaliar o perfil eletroforético das proteínas secretadas por estas células sob condições normais e tratadas. As células (103 células/poço) foram incubadas com diferentes concentrações de DisBa-01 em diferentes tempos e substratos (plástico, colágeno tipo I e fibronectina). O meio de cultura foi recolhido para análise por eletroforese bidimensional (2DE) e as células foram quantificadas. Além disso, foi realizada citometria de fluxo para avaliar a expressão de integrinas (_2, _4, _5, _v, _v_3, _1 e _4). A DisBa-01 inibiu a adesão das células à fibronectina em alta concentração (1000nM), além de inibir a adesão das células ao colágeno em todas as concentrações testadas, mas não promoveu a desadesão de células aderidas a estes dois substratos tampouco afetou significativamente a proliferação de mioblastos. A análise por citometria de fluxo identificou as integrinas _v e _1, corroborando em parte os resultados obtidos. A análise por 2DE do sobrenadante indicou que a DisBa-01 induz a um aumento no número de proteínas secretadas, principalmente na maior concentração testada (1000nM). Em conclusão, os mioblastos C2C12 são sensíveis à DisBa-01, sugerindo que esta proteína inicia uma cascata de sinalização celular mediada por integrinas que modifica a secreção protéica.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseACA.pdf: 1948849 bytes, checksum: 00677b36766e019e8a7e13bd7b288172 (MD5) Previous issue date: 2004-03-11 / The Low Intensity Laser Therapy (LILT) constitutes one of the resources most used by physical therapists, with the goal of stimulating the process of repairing the skeleton muscle tissue. On the other hand, the intense utilization, its respective action mechanisms and therapeutic effectiveness are not scientifically proved. Based on this, we elaborated the present study aiming to investigate the influence of the LILT, at wavelengths (λ) usually used at clinical practices (670, 685 and 830 nm), on the function of the Myogenic Precursor Cells (MPCs), directly responsible for the tissue regeneration process. The beginning phase was carried out throughout in vitro experiments, determining the alterations started by radiations over the proliferation ability and the cellular differentiation. The MPCs used were in the second passage, after had been extracted from four days old Wistar rats. To analyze the proliferation, it was elaborated, for each λ, a dose-response data curve including the control group constituted of non-radiated cells, and the irradiated groups with doses of 0.3; 0.6; 0.9; 1.2; and 1.5 J/cm2. This procedure was carried out with the cells under the influence of 5 or 10% of fetal bovine serum (FBS). The dose demonstrating the highest effectiveness on the cellular proliferation in each radiation, was used to establish the influence on the process of cellular differentiation, and investigated throughout the analysis of the expression of the genes related to the isoforms IIa and IIx of the myosin heavy chain (MHC). The final phase of the study was pointed towards the radiation action evaluation, at the same dose parameters used before, on the muscle regeneration process in vivo, after induced cryoscopy lesion at the Tibialis anterior muscles of adults Wistar rats. There were evaluations of the histological, histochemical aspects for the Succinic Dehydrogenase enzyme (SDH) and the activity of the Lactate Dehydrogenase enzymes (LDH) and Citrate Sintase (CS). The outcomes demonstrated that the radiation at λ of 670, 685 and 830 nm promoted an increase of 56.8, 70.6 and 84.8 % on the proliferate ability of the PMCs. These values were achieved with the 1.2, 0.6 and 0.3 J/cm2 doses respectively, and with the cells under the influence of 5% of FBS. The highest concentration of serum (10% of FBS) determined a less pronounced bio-stimulating effect, rising only 13.6, 17.5 and 10.9 %, respectively. In relation to the MHC isoforms expression rate, it showed that there was a significant fall of the IIa isoform, due to the action of the 685 nm, and an increase of the IIx isoform, due to the action of the 685 and 830 nm radiations, in relation to the non-radiated cells rate. By means of in vivo analysis, it was possible to demonstrate the ability of radiation at λ of 685 and 830 nm on increasing DHL enzymes and CS during the muscle regeneration process. Therefore, according to the outcomes it is allowed to attribute to the LILT an ability λ and dose-dependent of influencing the proliferation function and the metabolism of the MPCs. It was not possible to infer its effect on the cellular differentiation process, because of the inverted effect on the MHC isoforms expression, though. / A terapia LASER de baixa intensidade (TLBI) constitui um dos recursos mais utilizados pelos fisioterapeutas com o intuito de estimular o processo de reparo do tecido muscular esquelético. Em contrapartida à intensa utilização, seus respectivos mecanismos de ação e sua efetividade terapêutica não se encontram cientificamente comprovados. Com base nesse contexto, elaboramos a presente pesquisa com o objetivo de investigar a influência exercida pela TLBI, nos comprimentos de onda (λ) freqüentemente utilizados na prática clínica (670, 685 e 830 nm), sob a função das células precursoras miogênicas (CPMs), responsáveis diretas pelo processo de regeneração tecidual. A fase inicial foi realizada por meio de experimentos in vitro, determinando as alterações desencadeadas pelas radiações sobre a capacidade de proliferação e diferenciação celular. As CPMs utilizadas encontravam-se na 2a passagem, após terem sido extraídas dos músculos de ratos Wistar com 4 dias após o nascimento. Para analisar a proliferação foi elaborada, para cada λ, uma curva doseresposta compreendendo o grupo controle, constituído por células não irradiadas, e os grupos irradiados com as doses de 0.3, 0.6, 0.9, 1.2 e 1.5 J/cm2. Esse procedimento foi realizado com as células sob influência de 5 ou 10 % de soro fetal bovino (SFB). A dose demonstrando a maior efetividade sobre a proliferação celular em cada radiação foi utilizada para estabelecer a influência sobre o processo de diferenciação celular, investigada por meio da análise da expressão dos genes relacionados as isoformas IIa e IIx da cadeia pesada de miosina (MHC). A fase final da pesquisa foi direcionada a avaliar a ação das radiações, nos mesmos parâmetros dosimétricos previamente utilizados, sobre o processo de regeneração muscular in vivo após criolesão induzida no músculo tibial anterior de ratos Wistar adultos. Foram avaliados os aspectos histológicos, histoquímicos para a enzima Succinato Desidrogenase (SDH) e a atividade das enzimas Lactato Desidrogenase (LDH) e Citrato Sintase (CS). Os resultados demonstraram que as radiações nos λ de 670, 685 e 830 nm proporcionaram um aumento de 56.8, 70.6 e 84.8 % na taxa de proliferação das CPMs. Esses valores foram alcançados com as respectivas doses 1.2, 0,6 e 0,3 J/cm2 e com as células sobre a influência de 5% de SFB. A maior concentração de soro determinou um efeito bioestimulante menos pronunciado, com elevação de 13.6, 17.5 e 10.9 % respectivamente. Em relação à taxa de expressão das isoformas de MHC foi demonstrado que houve uma significativa diminuição da isoforma IIa, pela ação da radiação de 685 nm, e uma elevação da isoforma IIx, pela ação das radiações de 685 e 830 nm, em relação às células não irradiadas. A análise in vivo demonstrou a capacidade das radiações nos λ de 685 e 830 nm em elevar a atividade das enzimas LDH e CS durante o processo de regeneração muscular. Conjuntamente os resultados permitem atribuir à TLBI uma capacidade λ e dose-dependente de influenciar a função proliferativa e o metabolismo das CPMs. Porém, não foi possível inferir seu efeito sobre o processo de diferenciação celular em virtude do efeito inverso sobre a expressão das isoformas de MHC.

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2018-06-18T22:38:09Z No. of bitstreams: 1 Erika Cassia Barroso Batista.pdf: 1153764 bytes, checksum: d2f3d36a962ecb178963820d00e754fa (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-18T22:38:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Erika Cassia Barroso Batista.pdf: 1153764 bytes, checksum: d2f3d36a962ecb178963820d00e754fa (MD5) Previous issue date: 2015-12-16 / The activation, proliferation and migration of myogenic precursor cells are essential for muscle regeneration after injury, orchestrated by cells and local components, mainly inflammatory cells, especially macrophages. These are identified as a target for the treatment of muscle injuries. Laser therapy has shown good results in treatment of injuries and the ability to accelerate the migration of various cell types, but there are no reports on their effect on macrophage products influencing the migration of myogenic precursor cells. The aim of the study was to evaluate the effect of low level laser (LLL) on migration of myoblasts cultured with macrophage culture supernatants of different phenotypes. Therefore, C2C12 cells were cultured with supernatants from cultures of macrophages (J774) treated with LPS and IFN-γ (for the activation phenotype M1), IL-4 (M2a phenotype) and IL-10 and dexamethasone (M2c phenotype) and LLL irradiated at wavelengths of 660nm and 780nm (70mW; 17,5J / cm2; 14.3 s; 0,8J). Supernatants from macrophage cultures were harvested 24h after irradiation and transferred to myoblast cultures. Migration was assessed using the scratch assay and the results statistically analyzed. Myoblasts cultured with phenotype macrophage supernatants M2c and irradiated with LBP (660nm) showed higher migration capability that cultured with supernatants of M2C phenotype of macrophages after 12 hours of cultivation. There was no difference between the other groups. The LLL was able to modulate the migration of myoblasts C2C12 when M2c supernatants of macrophage phenotype / A ativação, proliferação e migração das células precursoras miogênicas são essenciais na regeneração muscular após lesões, orquestrados pelas células e componentes locais, principalmente pelas células inflamatórias, em especial os macrófagos. Estes são apontadas como alvo para o tratamento das lesões musculares. A laserterapia tem demonstrado bons resultados no tratamento destas lesões e na capacidade de acelerar a migração de vários tipos celulares, mas não existem relatos sobre seu efeito nos produtos de macrófagos que influenciam a migração de células precursoras miogênicas. O objetivo do estudo foi avaliar o efeito do laser de baixa potência (LBP) sobre a migração de mioblastos cultivadas com sobrenadantes de culturas de macrófagos de diferentes fenótipos. Para tanto, as células C2C12 foram cultivadas com sobrenadantes de culturas de macrófagos (J774) tratadas com LPS e IFN- γ (ativação para o fenótipo M1), IL-4 (fenótipo M2a) e IL-10 e dexametasona (fenótipo M2c) e irradiadas com LBP nos comprimentos de onda de 660nm e 780nm (70mW; 17,5J/cm2; 14,3 s; 0,8J). Os sobrenadantes das culturas de macrófagos foram colhidos 24h após as irradiações e transferidos para culturas de mioblastos. A migração foi avaliada por meio do ensaio de ferida e os resultados submetidos à análise estatística. Após 12h de cultivo, os mioblastos cultivados com sobrenadantes de macrófagos de fenótipo M2c e irradiados com LBP (660nm) mostraram maior capacidade de migração que os cultivados com sobrenadantes de macrófagos de fenótipo M2c não irradiados. Não houve diferença entre os demais grupos. O LBP foi capaz de modular a migração de mioblastos C2C12 quando cultivados com sobrenadantes de macrófagos de fenótipo M2c.