Orientador: Antonio Carlos Boschero / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-13T22:56:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_CarlosAlbertoda_M.pdf: 1075017 bytes, checksum: 4d6994468f70b6a0b07661d1e5585482 (MD5) Previous issue date: 1990 / Resumo: Neste trabalho estudou-se discriminativamente o efeito do tiopental sobre a permeabilidade ao K+ em ilhotas de Langerhans isoladas de rato. As ilhotas foram isoladas pelo método da colagenese, marcadas durante 90 minutos com 86RbCl (substituto de K+) e perfundidas em solução de Krebs-bicarbonato em diferentes condições experimentais. Os resultados indicam que: Tiopental (0.2 e 2.0 mM) reduziu o efluxo de a 86Rb de ilhotas perfundidas na presença ou ausência de glicose, com o meio contendo, ainda, 20 ou 100 µg/ml de um bloqueador especifico dos canais de K+ modulados pelo ATP, ou seja a tolbutamida. O efeito inibidor de tiopental sobre o efluxo do 86Rb foi mais marcante quando a perfusão das ilhotas foi processada em solução contendo diazoxida , substância que promove a abertura dos canais de K + modulados pelo ATP. Tiopental não inibiu o aumento do e f l u x o de 86Rb induzido pela teofilina, a qual mobiliza Ca2 + de compartimentos intracelulares. Contudo, tiopental inibiu significativamente o efluxo de 86Rb em presença do TEA que bloqueia as permeabilidades de K+/Ca2+ e Vm dependentes, esse efeito inibidor foi detectado também quando na presença de tolbutamida . Seu efeito inibidor sobre o e fluxo do 86Rb em presença de uma concentração despolarizar te de K+ (50 mM) foi sublimiar em comparação aos outros procedimentos estimulantes as células B. Com base nos resultados obtidos em experimentos com sulfuniluréias hipoglicemiantes e hiperglicemiantes, constatamos que o tiopental atua bloqueando preferencialmente de maneira dose-dependente e reversível os canais de K+ modulados pelo ATP. / Abstract: We investigated here the effects of tiopental on the K+-permeability in isolated islets of Langerhans. Islets-obtained from adult rats by collagenase digestion were prelabeled with 86RbCl during 90 min (86Rb was used as a substitute for k +) and perifused in a Krebs-bicarbonate solution. The results indicate that: Tiopental (0.2 and 2.0 mM) significantly reduced the 86Rb efflux from islets perfused in a medium containing or not 2.8 mM glucose. In the presence of 20 or 100 µg/ml of tolbutamide, a blocker of the ATP-modulated K+ channels, the effect of tiopental in reducing the 86Rb efflux is still present. On the presence of the hiperglicemiant sulfonilureia Diazoxide the effects of tiopental were much more marked. On the other hand, tiopental did not affect the increase in the 86Rb efflux provoked by teophylline that mobilises Ca2+ from internal stores and hence stimulates the Ca2+-dependent K+ permeability. Tiopental reduced the 86Rb efflux from islets perifused in the presence of TEA that blocks the Ca2+-dependent K+ permeability. This effect was noticeable even in the presence of tolbutamide. The reduction in the 86Rb efflux provoked by tiopental was only Marginal when the islets were perifused in the presence of high K+ concentration (50 mM). These results suggest that tiopental reduces the K+ permeability from pancreatic islets (in a dose-dependent manner) on the ATP-modulated K+ channels. As a provocative idea, we suggest that the delay in the response may be due to the low lipossolubility of the barbiturate in the plasma Membrane. / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Ciências Biológicas

Orientadores: Antonio Carlos Boschero, Antonio Ari Gonçalves / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T02:38:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_SilvanaAuxiliadoraBordinda_D.pdf: 7203388 bytes, checksum: c77a4e34c567f2a9f3b4744751eab31c (MD5) Previous issue date: 1995 / Resumo: O presente trabalho teve como proposta caracterizar o subtipo funcional de mAChR na célula ß pancreática, bem como elucidar os mecanismos iônicos envolvidos na estimulação muscarínica. Para isto, foram utilizadas ilhotas de ratos e camundongos, isoladas por digestão enzimática ou microdissecção. A resposta celular frente a estimulação pelo agonista muscarínico OXO-M foi analisada sob diferentes aspectos: (1) secreção de insulina; (2) efluxo de radioisótopos (45Ca e 86Rb); (3) concentração citoplasmática de Ca2+ ([Ca2+]i); (4) atividade elétrica; e (5) expressão dos mAChRs. Os resultados mostram que OXO-M aumentou, de forma dose-dependente, a secreção de insulina por ilhotas de roedores. Na presença de alta concentração (50 µM), OXO-M induziu uma resposta bifásica da secreção, tanto na presença de 5,6 quanto de 16,7 mM de glicose. O aumento da secreção induzido pela OXO-M foi drasticamente reduzido pela retirada de Ca2+ do meio perfusor, e completamente abolido na ausência de glicose. Entretanto, na ausência de glicose mas na presença de K+ em concentração despolarizante (40 mM), OXO-M aumentou significativamente a secreção de insulina. O efeito potencializador da OXO-M foi inibido pelos antagonistas 4-DAMP (M3); p-F-HHSiD (M3>M1>M2) e pirenzepina (M1) com valores de IC50 para estes antagonistas de ~ 5, 20 e 340 nM, respectivamente. A análise molecular do subtipo de mAChR expresso nas ilhotas pancreáticas, realizada pela amplificação do cDNA por PCR, demonstrou a presença dos subtipos M1 e M3 no tecido. Entretanto, o estudo farmacológico indicou que o subtipo M3 representa o receptor muscarínico que medeia a estimulação da célula ß. Em outra série de experimentos, foram estudados os movimentos iônicos envolvidos na estimulação celular induzida pela OXO-M. Na presença de 5,6, 11,2 ou na ausência de glicose, OXO-M aumentou a [Ca2+]i de células ß isoladas. Este aumento foi parcialmente inibido pela adição de EGT A no meio de perfusão. OXO-M (50 µM) também aumentou o efluxo de 45Ca de ilhotas perfundidas, tanto na presença quanto na ausência de Ca2+ no meio extracelular. Entretanto, na ausência de Ca2+ (condição que representa o fluxo unidirecional provindo de compartimentos intracelulares), o aumento no efluxo foi transiente. A curva obtida pela diferença entre os efluxos normalizados, em ambas as condições experimentais, demonstrou a presença de um segundo componente, de aparecimento tardio e provavelmente decorrente da entrada de Ca2+ nas células. Tanto na presença quanto na ausência de glicose, OXO-M aumentou o efluxo do 86Rb. OXO-M também aumentou a atividade elétrica induzida pela glicose. Em 11,2 mM de glicose, OXO-M (0,1 e 10 µM) produziu diferentes efeitos sobre a atividade elétrica. Em ambas as concentrações, o agonista provocou o aumento na freqüência de bursts. Por outro lado, em presença de concentrações micromolares OXO-M induziu alterações multifásicas na atividade elétrica, caracterizada pela inibição transiente da atividade elétrica (i.e., polarização da membrana), seguida pelo aumento na freqüência de bursts e por uma pequena despolarização da membrana na fase silente. O efeito polarizante da OXO-M foi inibido pela ChTX, um bloqueador dos canais de K+ ativados por Ca2+ (KCa). A permeabilidade ao K+, calculada a partir dos valores de efluxo do 86Rb e de potencial de membrana, aumentou durante a fase de polarização, mas não foi diferente do controle durante o estado estacionário. Concluindo, o efeito potencializador da OXO-M sobre a secreção de insulina induzida pela glicose depende da ativação dos receptores muscarínicos do subtipo M3, presentes na membrana da célula ß. Semelhante ao observado na estimulação por outros agonistas (p.e., ACh e CCh), o aumento na secreção depende da presença de glicose e Ca2+ no meio extracelular. A polarização transiente induzida por concentrações micromolares de OXO-M representa a ativação dos canais KCa. Por outro lado, a permeabilidade ao K+ no período estacionário indica que a despolarização da membrana não é conseqüência do bloqueio de canais de K+, mas provavelmente da ativação de uma corrente sensível aos níveis intracelulares de Ca2+ (CRAC). Assim, o balanço entre a ativação dos canais KCa e CRAC poderiam determinar o grau de despolarização induzi da por agonistas muscarínicos, mecanismo este provavelmente importante na modulação da secreção de insulina durante a estimulação colinérgica / Abstract: The effects of the muscarinic agonist oxotremorine-m (OXO-M) on insulin secretion, 45Ca and 86Rb fluxes, cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i), and electrical activity in pancreatic rodent ß-cells were studied. ln the presence of glucose, OXO-M produced a dose-dependent potentiation of insulin secretion from rat and mouse islets. Higher doses of OXO-M (50 µM) induced a biphasic insulin response, both at low (5.6 mM) or high (16.7 mM) glucose concentration. ln a Ca2+-deficient medium containing glucose (5.6 mM), OXO-M evoked only a reduced first phase of insulin secretion. ln the absence of glucose, OXO-M (up to 200 µM) did not effected basal secretion. However, in the absence of glucose, but at a depolarizing K+ concentration (40 mM), OXO-M significantly increased insulin release from incubated islets. The potentiating effects of OXO-M were inhibited by the muscarinic receptor antagonists 4-DAMP (M3), p-F-HHSiD (M3> M1>M2), and pirenzepine (M1) in a dose-dependent manner; half maximal inhibitory concentration values were ~ 5, 20, and 340 nM, respectively. cDNAs encoding for M1 and M3 muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs) were detected in rat pancreatic islet cells by polimerase chain reaction (PCR) amplification techniques. The PCR products showed bands with the expected base pair number corresponding to M1 and M3 selected sequences. ln other series of experiments, we studied the ionic movements under muscarinic stimulation. At zero, 5.6 or 11.2 mM glucose, OXO-M increased the [Ca2+]i in isolated ß-cells. The increment in the [Ca2+]i was partially inhibited by the addition of EGTA in the perifusion medium. OXO-M (50 µM) also increased 45Ca efflux from islets perifused either in the presence or in the absence of Ca2+. However, under the latter condition, the efllux (which reflects intracellular Ca2+ mobilization) was transient. The normalized difference between emuxes revealed the presence of a delayed and sustained second component, originating from the extracellular space. Either in presence or absence of glucose, OXO-M increased 86Rb efflux. OXO-M also produced a dose-dependent increase on the glucoseinduced electrical activity. At 11.2 mM glucose, OXO-M (0.1 and 10 µM) had two distinct effects: both concentrations increased the steady-state burst frequency; however, micromolar concentrations of OXO-M induced a multiphasic change in the pattern of electrical activity, including a transient inhibition of electrical activity and then a phase of high burst frequency, which was accompanied by a small depolarization in the membrane during the silent phase. The polarizing effect of OXO-M was almost completely suppressed by charibdotoxin (ChTX), a blocker of the large conductance [Ca2+ ]i ¿ activated potassium channel (KCa). K+-permeability values, calculated from 86Rb efflux and electrical measurements, increased during the polarizing phase, but was not different from control values (no OXO-M) during the steady state period. In conclusion, the potentiation of glucose-induced insulin secretion by OXO-M depends on the activation of a muscarinic M3 receptor subtype, present in the ß-cell plasma membrane. As already observed for others muscarinic agonists, such as ACh and CCh, OXO-M potentiated-insulin secretion depends on the presence of suitable amount of glucose and Ca2+ in the extracellular medium. The rapid and transient polarization induced by OXO-M (over 1 µM) represents the activation of the maxi K+-channel. As OXO-M did not changed K+ permeability during the steady-state period, the depolarizing effect of OXO-M does not reflects a decrease in K+-permeability. Instead, it may be the consequence of activation of a current sensitive to the depletion of intracellular Ca2+ stores (CRAC). Thus, the balance between the activation of KCa channel and CRAC could dictate the degree of depolarization induced by muscarinic agonists. Finally, although the KCa channel was not implicated in the repolarization of glucose-induced electrical activity in ß-cells, our results support the idea that the maxi K+-channel could play a role in the cholinergic modulation of insulin secretion / Doutorado / Fisiologia e Biofisica / Doutor em Ciências

Orientador: Antonio Ari Gonçalves / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-20T16:12:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Giacomini_AnaCristinaVendramettoVarrone_M.pdf: 10703008 bytes, checksum: 5a65c64675ea012ba407bd05c15c6244 (MD5) Previous issue date: 1994 / Resumo: O sistema nervoso parassimpático está envolvido na modulação da secreção de insulina e no metabolismo de carboidratos no fígado e em outros tecidos. O presente trabalho teve como objetivo estudar os efeitos agudos e crônicos da vagotomia subdiafragmática seletiva sobre a sensibilidade das ilhotas de Langerhans aos segretagogos (glicose e carbamilcolina) in vitro, sobre a sensibilidade à insulina in vivo e sobre o armazenamento de glicogênio hepático. Os ratos foram anestesiados, submetidos à vagotomia nos ramos hepático e pancreático e, após 15, 30 e 60 dias foram utilizados nos protocolos descritos a seguir. Para estudar os efeitos da vagotomia sobre a sensibilidade das ilhotas destes ratos, essas foram isoladas por colagenase, incubadas com 86Rb+ (substituto do 42K+) e perfundidas para medir a taxa de efluxo como estimativa da permeabilidade ao K+ (PK). Ilhotas isoladas de ratos vagotomizados do ramo pancreático (15 e 30 dias) apresentaram alteração na sensibilidade à glicose (16, 7mM) e à carbamilcolina (CCh 100 µM). A PK foi reduzida na presença de glicose em ilhotas de ratos controle (1,95% min-1) e de ratos vagotomizados do ramo pancreático (2,51 % min-l e 2,43% min-1 após 15 e 30 dias, respectivamente) embora em menor intensidade nos últimos. Embora, a PK tenha sido inibida nas ilhotas de ratos submetidos à vagotomia hepática ao mesmo nível que nas ilhotas de ratos controle, durante a condição inicial (glicose ausente), a PK nos ratos vagotomizados foi menor que no controle. A CCh (100 µM) não aumentou PK na presença de glicose (5,6mM) nas ilhotas isoladas de ratos submetidos à vagotomia pancreática. Entretanto, nas i1hotas isoladas de ratos vagotomizados no ramo hepático, a CCh 100 µM aumentou o efluxo de forma semelhante ao verificado nas ilhotas de rato controle. A vagotomia também alterou o armazenamento de glicogênio hepático. Após a vagotomia hepática (15 e 60 dias) a concentração de glicogênio hepático foi reduzida. Todavia ratos submetidos à vagotomia pancreática exibiram diminuição na reserva hepática no período agudo (15 dias) enquanto que no período crônico (60 dias), ocorreu aumento dessa concentração. O teste de tolerância à insulina mostrou diferença significativa entre os valores iniciais de glicemia nos ratos vagotomizados (114,31 + 3,11 ramo hepático e 138,23 + 7,81 ramo pancreático) em relação ao grupo controle (91,17 + 5,19). A administração de insulina i.p. induziu uma rápida remoção da glicose (50% de remoção nos minutos 10 e 11) nos ratos vagotomizados dos ramos hepático e pancreático, respectivamente. Os dados obtidos nesse teste indicaram que os ratos vagotomizados são mais sensíveis à insulina. Este resultado é compatível com o baixo padrão de secreção de insulina relatado por outros autores. Nossos resultados sugerem um efeito trófico da inervação vaga pancreática sobre as ilhotas de Langerhans, especialmente sobre as células ß / Abstract: Parasympathetic nervous system is involved in the modulation of insulin secretion and in the balance of carbohydrate metabolism in liver and other tissues. This work was carried out to study the short and long time effects of se1ective subdiaphragtnatic vagotomy on events re1ated to glycemic control: "in vitro" sensitivity of is1ets of Langerhans to glucose and carbamy1cho1ine and "in vivo" sensitivity to insu1in and hepatic glycogen storage. The rats were anesthetized and hepatic or pancreatic vagotomy was performed. After 15,30 or 60 days of recovery, rats was submitted to experimental protoco1s as described bellow. Studies of the effects of vagotomy on the K + permeability (PK) was conducted on collagenase isolated islets of Langerhans using 86Rb+ as a substitute for 42K +. The islets iso1ated from pancreatic vagotomized rats (15 and 30 days) had their sensitivity to glucose (16,7mM) and carbamylcholine (CCh) (100 µM) altered. The PK was reduced by glucose (16, 7mM), but in a lesser extent that in the control islets (2,51 % min-l 15 days; 2,43% min-l 30 days; 1,95% min-1 control). On the other hand, CCh (100 µM) did not increased the PK in the presence of glucose (5,6 mM) as were seen in the islets for control group. However, in the hepatic vagotomized rats, CCh increased PK. As for the effect of glucose (16,7 mM) the data is conflicting. Although PK was inhibited by glucose (16,7 mM) to the same level as seen in the control, during the initial condition (i.e, no glucose) the PK of the vagotomized islets was lesser than the control. These results suggest that the vagotomy of the pancreatic branch alters the sensitivity of the islets to glucose and CCh. Vagotomy also affected the storage of glycogen on liver. Hepatic vagotomy (15 and 60 days) induced reduction of glycogen storage. In the pancreatic vagotomized group the glycogen storage was diminished 15 days after the surgery, but was increased after 60 days. Vagotomized rats presented higher initial glucose (114,31 + 3,11 mg/100mg in hepatic and 138,23 +7,81 mg/100mg in pancreatic) than control group. Exogenous i.p. insulin induced a fast removal of glucose from plasma (50% concentration) at the 10 and 11 min for hepatic and pancreatic, respectively. The vagotomized rats showed a high glucose removal rate, indicative of high sensitivity to insulin. This is compatible to a low insulin secretion pattern as reported by other authors. Taken together, these results suggest that the pancreatic vagal innervation exerts a trophic effect on the pancreatic islets, especially to the ß cell / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Antonio Ari Gonçalves / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-17T07:48:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Langone_Francesco_M.pdf: 6206901 bytes, checksum: 70637f306a943939bb36d161167b390f (MD5) Previous issue date: 1986 / Resumo: Neste trabalho nos propusemos estudar os efeitos do tiopental sobre a permeabilidade da célula beta do pâncreas ao 'K POT. +¿ e ao 'CA POT. 2+¿. Tal propósito advém do fato de que o tiopental afeta a permeabilidade a esses íons nas células nervosas, modificando sua fisiologia. Dessa maneira, esse barbitúrico pode vir a ser um instrumento de interesse ao estudo da fisiologia das células secretoras de insulina. Os experimentos constituíram-se do registro da atividade elétrica de células beta de ilhotas microdissecadas de camundongo e da avaliação de efluxo de 'CA SOB. 45¿ em ilhotas de ratos, isoladas pela técnica da colagenase. Para os estudos eletrofisiológicos, as ilhotas foram microdissecadas, introduzidas numa câmera (volume = 1 'MM POT. 3¿) e perfundidas constantemente, à razão de 1,4 ml/min. As soluções perfusoras foram mantidas em banho-maria a ¿37 GRAUS¿C. Para evitar a perda de calor, a solução passou através de cânulas no interior de uma câmera trocadora de calor. Os registros intracelulares foram obtidos através de microeletrodos, ligados a um sistema de amplificação e registro gráfico. Os resultados obtidos são resumidos a seguir: Preliminarmente, caracterizamos a atividade elétrica das células beta. Quando foi introduzido 11,1 mM de glicose à solução perfusora, as células apresentaram resposta bifásica típica, com uma freqüência de ¿bursts¿ que variou de 2 a 5 por minuto. A remoção da glicose interrompeu a atividade elétrica e hiperpolarizou a membrana da célula beta. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Not informed. / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Ciências Biológicas

Orientadores: Antonio Carlos Boschiero, Alex Rafacho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T03:03:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Protzek_AndreOtavioPeres_D.pdf: 8312725 bytes, checksum: 2126056342598338000e5d9925e59082 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Os glicocorticoides (GC) são amplamente utilizados devido aos seus efeitos anti-inflamatórios. Porém, o tratamento com GC pode induzir efeitos deletérios sobre a homeostase glicêmica como a resistência à insulina (RI), intolerância à glicose e, dependendo do tempo e dose, pode levar a instalação do Diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Neste sentido, ratos têm sido vastamente utilizados como modelo animal para elucidar as compensações pancreáticas envolvidas na hiperinsulinemia induzida por GC e, poucos estudos enfocando os efeitos do tratamento com GC foram realizados em camundongos. Além disso, não é completamente elucidado se a hiperinsulinemia compensatória induzida pelo tratamento com GC esta associada com alteração do clearance de insulina. Assim, nossos objetivos foram avaliar se: as compensações do pâncreas endócrino em resposta ao tratamento com GC são similares entre camundongos e ratos e, identificar possíveis mecanismos que as expliquem; e se a hiperinsulinemia compensatória induzida pelo tratamento com GC em camundongos e ratos esta associada com alterações do clearance de insulina e a expressão da proteína insuling degrading enzyme (IDE) no fígado. Para isto, camundongos Swiss e ratos Wistar machos foram tratados com o glicocorticoide sintético dexametasona (1 mg/kg p.c.; 5 dias consecutivos). O tratamento com GC induziu RI, hiperinsulinemia e dislipidemia em ambas as espécies, embora mais pronunciado em ratos, que também apresentaram intolerância à glicose e hiperglicemia no jejum. Ambas as espécies tratadas com GC apresentaram incremento da secreção de insulina ex vivo estimulada com glicose, massa e proliferação de células ?, que foram associados com aumento da sinalização da via Ir-?/AKT/mTOR e redução da via AMPK/ACC/AS160 em ilhotas isoladas. O clearance de insulina reduziu em camundongos e ratos tratados com GC, o que foi associado com redução da expressão de IDE no fígado. Desta forma, nossos resultados indicam que camundongos são menos sensíveis aos efeitos deletérios do tratamento com GC sobre a homeostase glicêmica, quando comparado com ratos. Ainda, camundongos e ratos apresentam compensações pancreáticas semelhantes (incremento da função e massa de células ?) em resposta ao tratamento com GC, que foi associado com aumento da sinalização da via canônica de insulina e redução da via não canônica em ilhotas isoladas. Além disso, a redução do clearance de insulina foi, ao menos em parte, devido a redução da expressão de IDE no fígado, o que contribuiu para a hiperinsulinemia compensatória em ambas as espécies tratadas com GC. Em conclusão, estes resultados corroboram a hipótese de que fármacos que inibam a expressão ou atividade da IDE no fígado podem ser uma intervenção anti-diabetogênica que auxilie na manutenção da homeostase glicêmica sem sobrecarregar as células ? / Abstract: Glucocorticoids (GCs) are widely used as anti-inflammatory agent, but they may induce adverse metabolic effects such as insulin resistance (IR), glucose intolerance, and occasionally, diabetes mellitus type 2. Healthy rats have been used as animal models to elucidate the islet compensatory mechanisms involved in these metabolic disturbances, and only a few studies, which have focused on the in vivo effects of GCs, have been conducted in mice models. Yet, whether the reduced insulin clearance also contributes to the compensatory hyperinsulinemia in GC-treated rodents is not fully understood. Here, we aimed to elucidate whether mice and rats share the pancreatic compensations that result in response to dexamethasone (DEX) treatment and also to identify the possible mechanisms that can explain its effects. Yet, we investigated whether the hyperinsulinemia induced by GC treatment in mice and rats is associated with altered hepatic insulin degrading enzyme (IDE) expression and insulin clearance. For this, male Swiss mice and Wistar rats were treated with the synthetic GC dexamethasone (1 mg/kg b.w.; 5 days). DEX treatment induced IR, hyperinsulinemia and dyslipidemia in both species (there was a higher magnitude in rats), but treatment had a greater effect in rats that had glucose intolerance and increased basal blood glucose compared to the control group. Ex vivo insulin secretion at different glucose concentrations was higher in both groups of DEX-treated rodents compared to their controls. Mice and rats showed a significant increase in ?-cell mass due to increased ?-cell proliferation, which was associated with upregulation of the Ir-?/AKT/mTOR and downregulation of AMPK/ACC/AS160 signaling. Insulin clearance reduced in GC-treated mice and rats, which were associated with reduced hepatic IDE expression. Thus, mice are less vulnerable than rats to the deleterious effect of GCs on glucose homeostasis. In addition, rats and mice share common islet compensations (increased ?-cell function and mass) in response to GC treatment, which were associated with increased canonical and decreased non-canonical insulin signaling. Farther, the reduced insulin clearance in GC-treated rodents was, at least in part, due to reduced hepatic IDE expression, which contributed to the compensatory hyperinsulinemia. These findings corroborate the idea that pharmacological interventions that inhibit hepatic IDE may be an alternative anti-diabetic agent that helps to maintain glucose homeostasis due to hyperinsulinemia instead of hypoglycemic agent, which increase the overload in the ?-cells and may lead to ?-cell failure and DM2 / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Débora Cristina Damasceno / Coorientador: Yuri Karen Sinzato / Banca: Mara Sandra Hoshida / Banca: Luciane Dias Alargão Dias Melicio / Resumo: Introdução:Muitos estudos mostram a regeneração pancreática em um ambiente diabético e não exploram este processo no organismo saudável. Para compreender melhor os mecanismos envolvidos na regeneração das ilhotas pancreáticas sem o envolvimento do diabete. Objetivo:Avaliar a estrutura morfológicadas ilhotas pancreáticas desde o período neonatal até a idade adulta de ratas. Metodologia:Recém-nascidos do sexo feminino foram distribuídos aleatoriamente em diferentes grupos de estudo para coleta do pâncreas e soro em diferentes períodos de vida (5, 15, 90 dias de vida e no 18,5º dia de prenhez). Para a análise histopatológica, foram considerados os aspectos morfológicos observados na coloração de hematoxilina e eosina (HE). A análise morfométrica foi realizada em sistema computadorizado de imagem (software KS-300, versão 3.0, Zeiss). Para análise imunoistoquímica, foram utilizados os anticorpos anti insulina, anti PDX-1, anti GLP-1, anti Ki-67 e anti caspase-3. A avaliação imunoistoquímica foi realizada por contagem de células positivas através da grade de Weibel modificada. Resultados:Com cinco dias de vida, foi observado menor área comparado a dos outros períodos. Na fase adulta e durante a prenhez, as ratas apresentaram diminuição do número de células positivas para insulina e aumento de células quiescentes comparado às dos dias 5 e 15 de vida pós-natal. Um pico de proliferação celular foi observado no 15°dia de vida e, em todos os momentos estudados, foi observado maior frequência de morte celular das células não-beta (β) das ilhotas pancreáticas (células α, δe PP) em relação às células βpancreáticas. Durante a prenhez, houve diminuição do número de células positivas para GLP-1 em relação aos dias 5 e 15 de vida. Conclusão:As ilhotas pancreáticas apresentaram mudançasem sua morfologia, sobretudo durante os primeiros 15 dias de vida, sendo estas mudanças suficientes para ... / Abstract: Not available / Mestre

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / La Diabetes Mellitus es una de las enfermedades crónicas no transmisibles más frecuentes del ser humano de cualquier edad. Se considera un problema de salud pública por su elevada morbilidad y mortalidad. La Diabetes Mellitus tipo 2 es la forma de presentación más común, representando un 85-90% de los casos totales, que se caracteriza por una resistencia insulínica en conjunto con una secreción insuficiente de insulina desde las células β pancreáticas. Se ha descrito que el estrés oxidativo en células β pancreáticas, dado por un aumento en especies reactivas de oxígeno (ROS), provoca alteraciones en estas células, con una disminución en la secreción de insulina, lo que contribuiría a la pérdida del control glicémico. En este trabajo se evaluó el efecto del peróxido de hidrógeno (H2O2), un compuesto químico que puede producir estrés oxidativo, sobre la secreción de insulina y el control de calcio intracelular en células β pancreáticas de rata, evaluando las respuestas a la glucosa y un agonista colinérgico. El H2O2 presentó un efecto dual sobre la secreción de insulina: en condiciones basales de glucosa produjo un aumento en la secreción de insulina, mientras que disminuyó la secreción de insulina inducida por niveles estimuladores de glucosa (GSIS). Las mediciones de calcio indicaron que el aumento en la secreción basal de insulina se debe a un incremento de la concentración de calcio intracelular inducido por el H2O2. Se encontró que la aplicación del antioxidante N-acetil cisteína (NAC) protegió a las células beta pancreáticas contra los cambios en la función secretora en la presencia de H2O2. Sin embargo, NAC en si causó una pérdida parcial de la GSIS. Por otra parte, se observó que el H2O2 no aumentó la secreción basal de insulina cuando el agonista colinérgico, carbacol, estaba presente. Las mediciones de calcio realizadas en células β pancreáticas sugieren que frente a altas concentraciones de H2O2 (100 µM), el estímulo con carbacol podría inducir una disminución de la concentración de calcio intracelular. En presencia de glucosa estimuladora, el H2O2 inhibió la secreción de insulina inducida por carbacol a partir de los 25 µM de H2O2, efecto que se correlacionó con una disminución tanto en la descarga del calcio almacenado como en el porcentaje de células que responden al estímulo colinérgico. Estos efectos podrían ser prevenidos con la aplicación del antioxidante NAC. En conjunto, los datos demuestran que las especies reactivas del oxigeno presentan un rol importante y complejo en la función de las células β pancreáticas. Por una parte, la capacidad de NAC para interferir con la GSIS sugiere que las ROS son necesarias para responder adecuadamente a la glucosa. Por otro lado, un exceso de ROS produce un daño similar a la glucotoxicidad y una inhibición de la respuesta colinérgica, lo que podría afectar en forma negativa la respuesta secretora a nutrientes y señales neuro-hormonales, contribuyendo a la falla del control glicémico asociada con la Diabetes mellitus tipo 2. Se sugiere la realizacion de nuevos experimentos conducentes a dilucidar los componentes de la via colinérgica que se inhiben en presencia de altas concentraciones de H2O2

O Diabetes mellitus (DM) é um grande problema de saúde pública, projeções indicam que em 2030, 366 milhões de indivíduos sofrerão da doença. Durante os últimos anos, tornou-se evidente que a ausência de células produtoras de insulina é um denominador comum em todos os tipos de DM. Assim, várias pesquisas têm procurado desenvolver células produtoras de insulina in vitro. A betacelulina (BTC) é uma proteína ligante de EGFR, relacionada com a proliferação de células β pancreáticas in vitro e, com o aumento no metabolismo da glicose em modelos animais do diabetes. As células-tronco mesenquimais (MSCs) são células multipotentes, presentes na medula óssea, e vastamente estudadas para terapia celular. O objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos da superexpressão do gene da betacelulina sobre células MSCs de ratos. Foi estabelecida uma cultura de longo termo de células MSCs. Após caracterização, estas foram submetidas à transfecção gênica com o gene da BTC por eletroporação. Células transfectadas foram cultivas em meio de cultivo D-MEM suplementado de 10mM Nicotinamida. Análises de radioimunoensaio demonstraram que 104 MSCs transfectadas com o gene da BCT foram capazes de produzir até 0,45 ng/mL de insulina in vitro. In vivo, as células MSC superexpressando BTC foram capazes de diminuir a hiperglicemia induzida por Streptozotocina em ratos. Nossos resultados demonstraram que os efeitos positivos da superexpressão de BTC em MSCs. / Betacellulin (BTC), a ligand of the epidermal growth factor receptor, has been shown to promote growth and differentiation of pancreatic β-cells and to improve glucose metabolism in experimental diabetic rodent models. Mesenchymal stem cells (MSCs) have already been proved to be multipotent. Recent work has attributed to rat and human MSCs the potential to differentiate into insulin secreting cells. Our goal was to evaluate the effects of betacellulin overexpression in rat MSCs. MSCs were characterized by flow cytometry and mesoderm differentiation markers. MSCs were electroporated with a plasmid containing BTC cDNA. Transfected cells were cultivated in H-DMEM with 10mM Nicotinamide. Radioimmunoassay analysis showed that 104 MSC-BTC cells produced up to 0,4ng/mL of insulin, in contrast, MSCs transfected with the empty vector produced insignificant levels of insulin. Also MSC-BTC cells were positive for insulin in immunohistochemistry. RT-PCR showed expression of pancreatic marker genes. When transplanted to streptozotocin diabetic rats, MSC-BTC cells could revert hyperglycemia. Our results demonstrate that BTC overabundance enhances glucose-induced insulin secretion in mesenchymal stem cells in vitro as well as in vivo.

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:51:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-27Bitstream added on 2014-08-13T17:59:32Z : No. of bitstreams: 1 000776793.pdf: 3333104 bytes, checksum: ef4af27a6609c9136872bbf27eeb0084 (MD5) / Introdução:Muitos estudos mostram a regeneração pancreática em um ambiente diabético e não exploram este processo no organismo saudável. Para compreender melhor os mecanismos envolvidos na regeneração das ilhotas pancreáticas sem o envolvimento do diabete. Objetivo:Avaliar a estrutura morfológicadas ilhotas pancreáticas desde o período neonatal até a idade adulta de ratas. Metodologia:Recém-nascidos do sexo feminino foram distribuídos aleatoriamente em diferentes grupos de estudo para coleta do pâncreas e soro em diferentes períodos de vida (5, 15, 90 dias de vida e no 18,5º dia de prenhez). Para a análise histopatológica, foram considerados os aspectos morfológicos observados na coloração de hematoxilina e eosina (HE). A análise morfométrica foi realizada em sistema computadorizado de imagem (software KS-300, versão 3.0, Zeiss). Para análise imunoistoquímica, foram utilizados os anticorpos anti insulina, anti PDX-1, anti GLP-1, anti Ki-67 e anti caspase-3. A avaliação imunoistoquímica foi realizada por contagem de células positivas através da grade de Weibel modificada. Resultados:Com cinco dias de vida, foi observado menor área comparado a dos outros períodos. Na fase adulta e durante a prenhez, as ratas apresentaram diminuição do número de células positivas para insulina e aumento de células quiescentes comparado às dos dias 5 e 15 de vida pós-natal. Um pico de proliferação celular foi observado no 15°dia de vida e, em todos os momentos estudados, foi observado maior frequência de morte celular das células não-beta (β) das ilhotas pancreáticas (células α, δe PP) em relação às células βpancreáticas. Durante a prenhez, houve diminuição do número de células positivas para GLP-1 em relação aos dias 5 e 15 de vida. Conclusão:As ilhotas pancreáticas apresentaram mudançasem sua morfologia, sobretudo durante os primeiros 15 dias de vida, sendo estas mudanças suficientes para ...

O Diabetes mellitus (DM) é um grande problema de saúde pública, projeções indicam que em 2030, 366 milhões de indivíduos sofrerão da doença. Durante os últimos anos, tornou-se evidente que a ausência de células produtoras de insulina é um denominador comum em todos os tipos de DM. Assim, várias pesquisas têm procurado desenvolver células produtoras de insulina in vitro. A betacelulina (BTC) é uma proteína ligante de EGFR, relacionada com a proliferação de células β pancreáticas in vitro e, com o aumento no metabolismo da glicose em modelos animais do diabetes. As células-tronco mesenquimais (MSCs) são células multipotentes, presentes na medula óssea, e vastamente estudadas para terapia celular. O objetivo do presente trabalho foi avaliar os efeitos da superexpressão do gene da betacelulina sobre células MSCs de ratos. Foi estabelecida uma cultura de longo termo de células MSCs. Após caracterização, estas foram submetidas à transfecção gênica com o gene da BTC por eletroporação. Células transfectadas foram cultivas em meio de cultivo D-MEM suplementado de 10mM Nicotinamida. Análises de radioimunoensaio demonstraram que 104 MSCs transfectadas com o gene da BCT foram capazes de produzir até 0,45 ng/mL de insulina in vitro. In vivo, as células MSC superexpressando BTC foram capazes de diminuir a hiperglicemia induzida por Streptozotocina em ratos. Nossos resultados demonstraram que os efeitos positivos da superexpressão de BTC em MSCs. / Betacellulin (BTC), a ligand of the epidermal growth factor receptor, has been shown to promote growth and differentiation of pancreatic β-cells and to improve glucose metabolism in experimental diabetic rodent models. Mesenchymal stem cells (MSCs) have already been proved to be multipotent. Recent work has attributed to rat and human MSCs the potential to differentiate into insulin secreting cells. Our goal was to evaluate the effects of betacellulin overexpression in rat MSCs. MSCs were characterized by flow cytometry and mesoderm differentiation markers. MSCs were electroporated with a plasmid containing BTC cDNA. Transfected cells were cultivated in H-DMEM with 10mM Nicotinamide. Radioimmunoassay analysis showed that 104 MSC-BTC cells produced up to 0,4ng/mL of insulin, in contrast, MSCs transfected with the empty vector produced insignificant levels of insulin. Also MSC-BTC cells were positive for insulin in immunohistochemistry. RT-PCR showed expression of pancreatic marker genes. When transplanted to streptozotocin diabetic rats, MSC-BTC cells could revert hyperglycemia. Our results demonstrate that BTC overabundance enhances glucose-induced insulin secretion in mesenchymal stem cells in vitro as well as in vivo.