Os cladóceros são popularmente conhecidos como pulgas d’água, habitam principalmente ambientes aquáticos de água doce e são considerados bons indicadores tróficos. Esses microcrustáceos são usados tanto em pesquisas básicas, quanto aplicadas, como estudos ecológicos, evolutivos e ecotoxicológicos. A despeito da dificuldade na análise de caracteres morfológicos, uma grande riqueza de espécies de cladóceros já foi detectada em Minas Gerais usando essas ferramentas. Devido a essa dificuldade, ferramentas moleculares são cada vez mais aplicadas para acessar essa biodiversidade. Atualmente, o marcador molecular conhecido como Código de Barras do DNA – DNA barcode, que tem como base um segmento do gene mitocondrial, o citocromo c oxidase subunidade 1 (COI) tem sido cada vez mais utilizado na taxonomia, identificação de espécies crípticas e estudos de diversidade. Neste contexto, nós avaliamos a diversidade genética de espécies de Cladocera de um ponto do Reservatório da Usina Hidrelétrica de Furnas e outro no município de Heliodora (ambos no Sul de Minas Gerais). Este é o primeiro inventário molecular de Cladocera no Brasil, cujo objetivo foi conhecer a diversidade de espécimes brasileiros e compará-los geneticamente com exemplares de outros países, verificando, assim, problemas taxonômicos e existência de espécies crípticas. Obtivemos sequências para 11 espécies de Cladocera, distribuídas nas famílias Sididae, Daphnidae, Bosminidae e Chydoridae. Os fragmentos amplificados variaram de 493 a 659 pares de base, das quais 90% foram maiores que 500pb. Algumas destas sequências de COI (Bosmina freyi e Bosminopsis deitersi) constituem as primeiras da espécie no mundo. Ainda verificamos que a maioria dos isolados brasileiros são molecularmente diferentes dos espécimes do México, Canadá e Guatemala. Para Daphnia laevis as divergências genéticas obtidas entre o isolado brasileiro e o argentino as classificam como integrantes da mesma entidade taxonômica, dados esses que dão força ao conceito de endemismo continental. Além da avaliação da diversidade, com a determinação do COI de Ovalona kaingang (Cladocera: Chydoridae) confirmamos as análises morfológicas recentes que realocaram espécies do grupo pulchella para Ovalona, já que as divergências genéticas entre Ovalona e as outras espécies do banco de dados são superiores a 19,1%. Portanto, o uso do DNA barcode foi eficiente como marcador molecular tanto na detecção da diversidade genética dos espécimes de Cladocera, quanto como ferramenta taxonômica. Futuramente nossos dados poderão ser aplicados em estudos de diversidade filogenética, distribuição geográfica, padrões biogeográficos e auxiliar em revisões taxonômicas. / Cladocerans are popularly known as water fleas, inhabit mainly freshwater aquatic environments and are considered good trophic indicators. These microcrustaceans have been used in basic and applied research, such as ecological, evolutionary and ecotoxicological studies. Morphological tools have been used to detect species richness of cladocerans from Minas Gerais, but given the difficulty of this morphological analysis, it is interesting to access this biodiversity by molecular tools as the DNA barcode. This molecular marker is based on a short segment of the mitochondrial gene cytochrome c oxidase subunit 1 (COI). It has been increasingly used in taxonomy, identification of cryptic species and diversity studies. In this context, we characterized the genetic diversity of Cladocera species from a point in the Furnas Hydroelectric Power Plant Resevoir and another in the Heliodora city (both in the south of Minas Gerais). This is the first molecular Cladocera inventory in Brazil, whose objective was to differentiate the Brazilian isolates of specimens from other countries, thus verifying taxonomic problems and cryptic species. We obtained sequences for 11 Cladocera species, distributed in Sididae, Daphnidae, Bosminidae and Chydoridae. The amplified fragments range from 493 to 659 base pairs, of which 90% were larger than 500 bp. Some of these COI sequences (for Bosmina freyi and Bosminopsis deitersi) represent the first molecular data in the world. We also found that the majority of Brazilian isolates are molecularly different from specimens from Mexico, Canada and Guatemala. For Daphnia laevis the genetic differences found between the Brazilian and Argentine isolates qualify them as members of the same taxonomic entity, reinforcing the concept of continental endemism. Besides the evaluation of diversity, with the determination of the COI for Ovalona kaingang (Cladocera: Chydoridae) we confirmed the morphological data, relocating the pulchella-group species to Ovalona, since the genetic differences between Ovalona and other species from the database were higher than 19.1%. Therefore, the use of DNA barcode was efficient to detect the genetic diversity of Cladocera specimens as a taxonomic tool. In the future our data can be applied to phylogenetic diversity studies, geographic distribution, biogeographic patterns and to assist in taxonomic revisions. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Made available in DSpace on 2016-01-07T13:39:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 nilceia_ramos_ioc_2014.pdf: 985413 bytes, checksum: d50610d797598fa42cb546cf07dafa32 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O gênero Klebsiella compreende bactérias em forma de bastonete, gram-negativas e imóveis que pertencem à família Enterobacteriaceae. As espécies Klebsiella pneumoniae e Klebsiella oxytoca, patógenos oportunistas, são as mais importantes, sob o ponto de vista da clínica. Estas espécies têm sido relacionadas a um número crescente de infecções hospitalares multirresistentes. K. pneumoniae é classificada em três grupos filogenéticos: KpI, KpII e KpIII e os genes que codificam as \03B2-lactamases de classe A cromossômicas SHV, OKP e LEN, estão relacionadas à estes grupos, respectivamente. Da mesma forma, o gene blaOXY codifica a \03B2\2013lactamase de classe A cromossômica que caracteriza a espécie K. oxytoca. blaSHV é um gene cromossômico e plasmidial que codifica \03B2\2013lactamases de espectro restrito (NSBLs) e estendido (ESBL). Até o momento, 183 alelos de blaSHV foram identificados, mas o espectro de atividade de vários destes alelos ainda não foi determinado. As \03B2-lactamases LEN são codificadas em cromossomos e são NSBLs. Recentemente a espécie K. variicola foi identificada. Esta espécie se caracteriza pela fixação de nitrogênio e nenhum gene constitutivo de \03B2-lactamase foi associado à esta espécie. Este estudo objetivou determinar o espectro de resistência de alelos de blaSHV identificados em K. pneumoniae e também identificar, em nível de espécie, isolados carreadores do gene blaLEN. Por PCR e sequenciamento, alelos de blaSHV e blaLEN foram definidos comparando suas sequências com bancos de dados usando as ferramentas blastN e blastP Estes genes foram clonados e expressos em sistema heterólogo, e o espectro de resistência dos transformantes foi avaliado. A taxonomia genômica dos isolados deste gênero foi realizada com base em sequências de genes recuperados de genomas de espécies de Klebsiella e aplicou-se as abordagens MLSA, rMLST e cgMLST. Identificamos blaSHV-28 (n=2), blaSHV-110 (n=1) e alelos novos de blaSHV (n=3). Os transformantes para estes genes apresentaram resistência à amoxicilina, ampicilina e piperacilina, o que corresponde a um espectro restrito de resistência. Quanto a blaLEN, foram identificados oito novos alelos em nove isolados. Dois deles eram idênticos aos encontrados no genoma de K. variicola AT-22 e todos estes alelos codificam NSBLs. A taxonomia genômica de Klebsiella definiu três grupos: K. variicola, K. pneumoniae e K.oxytoca. Curiosamente, alguns isolados de K. pneumoniae agruparam com o K. variicola AT-22, sugerindo pertencerem à esta espécie. Todos os isolados do grupo K. variicola albergavam o gene blaLEN indicando que esta seria a \03B2-lactamase constitutiva de K. variicola, e, por conseguinte, que o grupo KpIII é composto por isolados de K. variicola. Aqui nós determinamos que alelos de blaSHV cromossômicos, incluindo blaSHV-28 e blaSHV-110, previamente identificados como ESBLs, são NSBLs e concluímos que K. variicola pode estar sendo subestimada em infecções humanas / The genus Klebsiella comprises non - motile, g ra m - negative, rod - shaped bacteria, presenting a polysaccharide - based capsule, belonging to the Enterobacteriaceae family. The two most clinically i mport ant species from the genus are the opportunistic pathogens Klebsiella pneumoniae and Klebsiella oxytoca . These species have been related to an increasing number of multiresistant hospital - acquired infections. K. pneumoniae is classified into three phylogen etic groups: KpI, KpII and KpIII. Three chromosomal class A β - lactamase genes were recognized in K pneumoniae : bla SHV , bla OKP and bla LEN , which are related to KpI, KpII and KpIII groups, respectively. Similarly, the bla OXY gene is the chromosomal class A β - lactamase that characterizes the K. oxytoca species. The bla SHV is a chromosomal - and plasmid - borne gene encoding narrow (NSBLs) and extended spectrum β - lactamases (ESBLs). So far, 183 bla SHV alleles were identified but the activity spectrum of dozen of a lleles remain to be determined. LEN enzymes are chromosomal encoded with restrict activity against β - lactams and confers resistance only to penicillins. More recently, K. variicola species were identified and this species has the ability of fixing nitrogen . There are few studies concerning this species and no constitutive β - lactamase gene has been described in this species. This study aimed to determine the resistance spectrum of bla SHV alleles identified in K. pneumoniae strains and also to identify, at sp ecies level, strains carrying bla LEN chromosomal class A β - lactamase gene. PCR and sequencing were performed and bla SHV , and bla LEN alleles were determined by comparing their sequences with the database using blastN and blastP tools. These genes were clone d and expressed in a heterologous system, and the antibiotic resistance spectrum of the transformants was evaluated by susceptibility test. The genomic taxonomy of strains from this genus were performed based on genes from draft and complete genome sequenc es from Klebsiella species using MLSA, rMLST and cgMLST approaches. Strains harboring bla SHV - 28 (n=2), bla SHV - 110 (n=1) and new bla SHV alleles (n=3) were identified. All the transformants showed resistance to amoxicillin, ampicillin, piperacill in, ticarcil lin , which correspond to a restricted spectrum of resistance. Concerning bla LEN alleles, here were identified eight new alleles in nine strains. Two of them were identical to the one found in K. variicola AT - 22 genome. The antibiotic resistance profile pre sented by the transformants indicated that all these bla LEN alleles encode for NSBLs. The Klebsiella genomic taxonomy revealed three groups corresponding to K. variicola , K. pneumoniae and K. oxytoca species. Curiously, some K. pneumoniae grouped with the K. variicola AT - 22, suggesting that those strains, in fact, belong to K. variicola species and had been misidentified as K. pneumoniae . Moreover, it was observed that all strains from K. variicola cluster harbored the bla LEN gene. This finding indicated th at the bla LEN gene is a constitutive K. variicola β - lactamase, and therefore, the KpIII group is composed by K. variicola strains. Here we determined that different chromosomal bla SHV alleles, including bla SHV - 28 e bla SHV - 110 , previously labeled as ESBLs, and the new ones, are NSBLs. Also, we concluded th at K. variicola can play an underestimated role in human infections .

Submitted by Angelo Silva (asilva@icict.fiocruz.br) on 2016-07-20T13:39:17Z No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 71861.pdf: 5007629 bytes, checksum: 55da00139dd89620d62ea58fe070c552 (MD5) / Approved for entry into archive by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2016-07-28T16:45:07Z (GMT) No. of bitstreams: 2 71861.pdf: 5007629 bytes, checksum: 55da00139dd89620d62ea58fe070c552 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-28T16:45:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 71861.pdf: 5007629 bytes, checksum: 55da00139dd89620d62ea58fe070c552 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O vírus dengue infecta um número estimado de 50-100 milhões de pessoas 100 milhões de pessoas anualmente em todo o mundo e no Brasil, dengue foi relatada pela primeira vez em 1981, desde então, a infecção tornou-se hiper-endêmica. As práticas atuais de diagnóstico não detectam o vírus em cerca de 50% dos casos suspeitos. Metagenômica é uma estratégia que pode ser aplicada na identificação de qualquer organismo em uma amostra, uma vez que recupera sequências de ácidos nucléicos que são analisadas contra bases de dados. Neste estudo, o nosso objetivo foi aplicar abordagens de metagenômica para analisar casos fatais de pacientes que apresentaram sintomas similares a dengue, mas com teste negativo para este vírus e também amostras de pacientes com suspeita febre amarela. e também amostras de pacientes com suspeita febre amarela. e também amostras de pacientes com suspeita de febre amarela. DNA e RNA genômico foram extraídos, amplificados com iniciadores randômicos e processados no sequenciador Illumina HiSeq2500. Em seguida, aplicamos um pipeline de bioinformática para filtragem de sequências de baixa qualidade e remoção de sequências humanas. Vários programas foram utilizados para classificar as reads metagenômicas: Kraken, GOTTCHA, SURPI, Metaphlan2, Taxoner e Blastn. As análises in silico identificaram patógenos que foram posteriormente confirmados por ensaios in vitro aplicando reagentes específicos Deste modo, identificamos vírus e bactérias em 13% das amostras. Quatro desses vírus, com potencial de patogenicidade estavam em amostras distintas: Parvovírus B19, vírus da Hepatite A, vírus da Hepatite G e vírus Torque-teno. Todos eles, com exceção do vírus da Hepatite A estavam nos casos fatais. As bactérias identificadas foram N. meningitidis do serogrupo C em duas amostras e S. pneumoniae em duas outras amostras. Esses são patógenos que causam surtos e epidemias no Brasil e têm alta taxa de mortalidade. Particularmente, N. meningiditis sorogrupo C é o determinante de surtos atuais de N. meningiditis no Brasil. Além disso, dois genomas completos foram recuperados, o do Parvovírus B19 de um dos casos fatais (5,6 kb) e o do vírus Chikungunya (12 kb) que estava presente na amostra utilizada como controle positivo para as análises de metagenômica. Aqui, podemos demonstrar a aplicabilidade da metagenômica tanto na identificação quanto recuperação de genomas completos de patógenos a partir de amostras clínicas humanas / Dengue virus infects an estimated 50-100 million people annually worldwide and in Brazil, dengue was first reported in 1981, since then the infection became hyper-endemic. The current diagnostic practices cannot detect the virus around 50% of suspected cases. Metagenomic is a strategy that can be applied to recover any organism in a sample. In this study, our aim was to apply metagenomics approaches to analyse fatal cases of patients presenting dengue-like symptoms, but testing negative for this virus and samples of patients with suspect yellow fever. Genomic DNA and RNA were extracted, amplified with random primers and sequenced in the Illumina HiSeq2500 sequencer. We then followed a bioinformatics filtering pipeline to remove both low-quality sequences and human sequences. Several tools were used to classify the metagenome reads: Kraken, GOTTCHA, SURPI, Metaphlan2, Taxoner and Blastn. The in silico analysis identified pathogens that were further confirmed by in vitro assays applying specific reagents. In this way, we were able to detect viruses and bacteria in 13% of the samples Four viruses, with pathogenicity potential were identified in distinct samples: Parvovirus B19, Hepatitis A virus, Hepatitis G virus and Torque-teno virus. All of them, except Hepatitis A virus were present in fatal cases. The Parvovirus B19 is in fact a pathogen that has been eventually associated to fatal cases. The bacteria identified were N. meningitides serogroup C in two samples and S. pneumoniae in two other samples. Those are pathogens that cause outbreaks and epidemics in Brazil and have high mortality rate. Particularly, N. meningiditis outbreaks in Brazil. Moreover, two complete genomes were recovered, the B19V from one of the fatal cases (5.6 kb) and the Chikungunya virus (12 kb) that was in the sample used as a positive control to the metagenomics approach. Here, we demonstrated th applicability of metagenomics in both the identification and recovery of complete genomes of pathogens from human clinical samples

Made available in DSpace on 2015-09-17T15:24:33Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-11-14. Added 1 bitstream(s) on 2015-09-17T15:47:39Z : No. of bitstreams: 1 000845681_20151210.pdf: 189961 bytes, checksum: 626ba3afd7d4464a91e4d466ac13aa2d (MD5) Bitstreams deleted on 2015-12-11T11:22:36Z: 000845681_20151210.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-11T11:23:15Z : No. of bitstreams: 1 000845681.pdf: 755600 bytes, checksum: c43874dde055a455b691f7d4b7308f0d (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A seção Setacea foi reconhecida como grupo monofilético na revisão recente da ordem Batrachospermales. Porém, seu status taxonômico não pode ser determinado, porque posicionou-se dentro do grupo denominado Australasica, composto por táxons da Austrália e Nova Zelândia. Estudos anteriores combinando dados moleculares e morfológicos enfocaram apenas as relações filogenéticas entre os grupos maiores (gêneros ou seções) e abordagens visando avaliar o número de espécies só foram iniciadas muito recentemente e são ainda escassas e baseadas em poucas amostras. Dessa maneira, as seguintes hipóteses foram testadas neste estudo: 1) a seção Setacea do gênero Batrachospermum constitui grupo monofilético dentro da ordem Batrachospermales; o reconhecimento desse grupo associado ao fato de Batrachospermum ser parafilético poderá resultar na elevação desta seção para um nível superior (possivelmente um gênero); 2) as espécies atualmente reconhecidas na seção com base em caracteres morfológicos serão confirmadas pelos dados moleculares; além dessas espécies, outras (particularmente espécies crípticas) deverão ser encontradas e reconhecidas dentro da seção. Este estudo teve como objetivos: 1) inferir as relações filogenéticas da seção Setacea com os outros grupos (gêneros e seções) da ordem Batrachospermales, bem como os limites de variação inter e intra-específica das espécies dentro da seção, com base na análise das sequências do gene rbcL e da região de barcode do gene cox1; 2) elaborar estudo de revisão para a seção Setacea por meio da reavaliação dos caracteres taxonômicos diagnósticos para espécies deste grupo, à luz dos novos dados moleculares. Foram analisadas 15 amostras, sendo 13 provenientes das regiões sul e sudeste do Brasil, uma do Japão e outra da Espanha. Os espécimes foram coletados em águas com temperaturas baixas a moderadas, ligeiramente ácidas a neutras, agitadas.. / Section Setacea of the genus Batrachospermum was recognized as a monophyletic group in a recent revision of the order Batrachospermales. However, its taxonomic status was not clearly determined because it was positioned within a group named Australasica composed by taxa from Australia and New Zealand. Previous studies combining molecular and morphological data focused only on the phylogenetic relationships among the major groups (genera or sections), whereas approches aiming to evaluate the number of species were initiated just recently and are still scarce and poorly sampled. Based on this background, the following hypotheses were tested in this study: 1) the section Setacea represents a monophyletic group within the order Batrachospermales; the recognition of the group associated to the fact that the genus Batrachospermum is paraphyletic could result in the raising of the section to a higher taxonomic level (possibly genus); 2) the species presently recognized in the section based on morphological characters will be confirmed by molecular evidence; in addition, other species (particularly cryptic species) are expected to be found and recognized within the section.This study aimed to: 1) infer the phylogenetic relationships of section Setacea with other groups (genera and sections) of the Batrachospermales, as well as the inter and intra-specific limits of variation for the species within the section based on sequence analysis for the rbcL and cox1 barcode region: 2) elaborate a revisionary study by reevaluating the diagnostic taxonomic characters for the species of the sectionin the light of the new molecular data. Fifteen samples were analyzed, thirteen from southern and southeastern Brazil and two from other continents (Asia - Japan; Europe - Spain). The specimens were collected in waters with low to moderate temperatures, slightly acidic, turbulent and mean to moderate oxygen concentrations (oligotrophic and oligosaprobic... / FAPESP: 2012/20134-9 / FAPESP: 2013/03031-4 / FAPESP: 2012/12016-6