Recentemente, uma nova molécula de sinalização bacteriana, o AMP dimérico cíclico (c-di-AMP) emergiu como um regulador central dos processos fisiológicos essenciais, tais como a homeostase celular, verificação da integridade do DNA e virulência bacteriana, entre outros. O c-di-AMP é produzido a partir da condensação de duas moléculas de adenosina trifosfato (ATP) por proteínas denominadas diadenilato ciclases, que contém o domínio DisA_N, também denominado DAC. Existem 2842 sequências de proteínas que contém o domínio DAC, provenientes de 2386 organismos encontradas no banco de dados Protein Families Database (Pfam). Essas proteínas são divididas em subfamílias sendo as três subfamílias mais abundantes: DacA (69,1%), proteínas de membrana associadas a sinalização intracelular de alterações decorrentes do meio externo; DisA (24,1%), primeira diadenilato ciclase a ser amplamente estudada, é uma proteína intracelular encontrada na forma de octâmeros ativos em solução, a qual, indiretamente, controla a divisão celular através da verificação da integridade do DNA e DacB (5,5%), proteínas citoplasmáticas expressa, particularmente, durante a formação de esporos bacterianos. Uma característica interessante é que a maioria dos organismos contém uma única e essencial proteína com domínio DAC. Os organismos que contém duas ou mais proteínas-DAC, tais como Clostridium e Bacillus spp., são uma exceção. Em Staphylococcus aureus (S. aureus), um patógeno humano oportunista e responsável por inúmeras doenças infecciosas, uma única diadenilato ciclase é encontrada pendurada na porção interna da membrana celular (Sau_DacA). A atividade desta proteína é potencialmente regulada através da interação direta com uma proteína YbbR-like, que contém um domínio sensor extracelular. Sau_DacA conserva todos os elementos-chave de uma diadenilato ciclase bacteriana, e por ser a única presente em S. aureus, revela-se um excelente alvo de estudo para o desenvolvimento de novos fins terapêuticos. No entanto, até o presente momento, existem poucas informações em relação a estrutura proteica, ao mecanismo de síntese de c-di-AMP e regulação do mecanismo de síntese de nucleotídeo destas proteínas, sendo, portanto, neste aspectos que o presente trabalho pretendeu contribuir. Através de uma série de ensaios, estruturais, calorimétricos, espectroscópicos e bioquímicos, aliados a mutações sítio-dirigidas, identificou-se a relevância de uma conformação dimérica para a estabilidade conformacional e térmica para a proteína ser funcionalmente ativa, assim como a importância dos motivos conservados DGA (Aspartato-Glicina-Alanina) e RHR (Arginina-Histidina-Arginina) para a atividade da Sau_DacA. O loop L5 localizado entre o sítio ativo e a interface dimérica mostrou-se relevante, uma vez que nele é encontrado o motivo DGA - de ligação ao ATP - e o mesmo encontra-se estabilizado em uma posição favorável para ligação do ATP, apenas na conformação dimérica da proteína. Nossos resultados aliados a dados da literatura possibilitaram a proposição de um mecanismo de síntese de c-di-AMP que deve ocorrer via encontro face-a-face de dois sítios de ligação de ATP presentes em dímeros proteicos distintos, podendo a taxa de síntese de o nucleotídeo sofrer interferência via interação proteína-proteína com a proteína receptora de sinal Sau_YbbR. Desta forma, contribuímos para uma melhor compreensão da estrutura e função da Sau_DacA, possibilitando o uso desta como alvo para o desenvolvimento de novos fármacos, uma vez que é sabido que a biossíntese de c-di-AMP é essencial para a maioria dos patógenos que o sintetizam. / Recently, a new bacterial signaling molecule, the dimeric cyclic AMP (c-di-AMP) has emerged as a central regulator of essential physiological processes, such as cell wall homeostasis, DNA integrity and bacterial virulence, among others. C-di-AMP is synthesized from two molecules of adenosine triphosphate (ATP) by proteins containing DisA_N domain, also called diadenilato cyclases (DACs). A survey in the Protein Families Database database (Pfam) found 2842 protein sequences containing the DAC domain, from 2386 different organisms. These proteins are divided into subfamilies and the three most abundant are: DacA (69,1%), a membrane protein associated with intracellular signaling resulting from an external environment change; DisA (24,1%), the first and most widely studied diadenilate cyclase, an intracellular protein found as active octamers in solution which indirectly controls cell division by DNA integrity verification; and DacB (5,5%), a cytoplasmic proteins, particularly expressed during bacterial spores formation. An interesting feature is that most organisms contain just a single and essential DAC-protein. Organisms containing two or more DAC-containing proteins, such as Clostridium and Bacillus spp., are exceptions. In Staphylococcus aureus (S. aureus), an opportunistic human pathogen responsible for some life-threating diseases, there is a single membrane attached diadenilate cyclase, hanging in the inner portion of the cell membrane (Sau_DacA). The activity of this protein is potentially regulated through direct interaction with YbbR, which contains an extracellular sensor domain. Sau_DacA conserves all key elements of bacterial di-adenylate cyclase, and for being the only di-adenylate cyclase from S. aureus, proves to be an excellent study target for new therapeutic purposes. However, to date, there is a lack of information about structure, c-di-AMP synthesis mechanism and regulation of nucleotide synthesis by Sau_DacA. Therefore, in this context the present work aims to contribute. Through a series of structural, calorimetric, spectroscopic and biochemical assays combined with site-directed mutations, we solved the structure of a soluble construct of Sau_DacA and identified a dimeric interface relevance for the conformational and thermal stability to the protein. This dimer is functionally active and highlights the importance of conserved motifs DGA (Aspartate-Glycine-Alanine) and RHR (Arginine-Histidine-Arginine) for the activity of Sau_DacA. The L5 loop, located between the active site and the dimer interface where is allocated the ATP binding motif (DGA), is stabilized in a favorable position for ATP binding, just in protein dimeric conformation. Our results combined with literary allowed us infer the synthesis of c-di-AMP occurs by face-to-face encounter of two distinct ATP binding site and its rate of synthesis could be regulated through direct protein interaction with. In this way, we contribute to a better understanding of Sau_DacA structure and function, assisting in its use as a target for new drugs development since it is known the biosynthesis of c-di-AMP is essential for most pathogens that synthesize.

Recentemente, uma nova molécula de sinalização bacteriana, o AMP dimérico cíclico (c-di-AMP) emergiu como um regulador central dos processos fisiológicos essenciais, tais como a homeostase celular, verificação da integridade do DNA e virulência bacteriana, entre outros. O c-di-AMP é produzido a partir da condensação de duas moléculas de adenosina trifosfato (ATP) por proteínas denominadas diadenilato ciclases, que contém o domínio DisA_N, também denominado DAC. Existem 2842 sequências de proteínas que contém o domínio DAC, provenientes de 2386 organismos encontradas no banco de dados Protein Families Database (Pfam). Essas proteínas são divididas em subfamílias sendo as três subfamílias mais abundantes: DacA (69,1%), proteínas de membrana associadas a sinalização intracelular de alterações decorrentes do meio externo; DisA (24,1%), primeira diadenilato ciclase a ser amplamente estudada, é uma proteína intracelular encontrada na forma de octâmeros ativos em solução, a qual, indiretamente, controla a divisão celular através da verificação da integridade do DNA e DacB (5,5%), proteínas citoplasmáticas expressa, particularmente, durante a formação de esporos bacterianos. Uma característica interessante é que a maioria dos organismos contém uma única e essencial proteína com domínio DAC. Os organismos que contém duas ou mais proteínas-DAC, tais como Clostridium e Bacillus spp., são uma exceção. Em Staphylococcus aureus (S. aureus), um patógeno humano oportunista e responsável por inúmeras doenças infecciosas, uma única diadenilato ciclase é encontrada pendurada na porção interna da membrana celular (Sau_DacA). A atividade desta proteína é potencialmente regulada através da interação direta com uma proteína YbbR-like, que contém um domínio sensor extracelular. Sau_DacA conserva todos os elementos-chave de uma diadenilato ciclase bacteriana, e por ser a única presente em S. aureus, revela-se um excelente alvo de estudo para o desenvolvimento de novos fins terapêuticos. No entanto, até o presente momento, existem poucas informações em relação a estrutura proteica, ao mecanismo de síntese de c-di-AMP e regulação do mecanismo de síntese de nucleotídeo destas proteínas, sendo, portanto, neste aspectos que o presente trabalho pretendeu contribuir. Através de uma série de ensaios, estruturais, calorimétricos, espectroscópicos e bioquímicos, aliados a mutações sítio-dirigidas, identificou-se a relevância de uma conformação dimérica para a estabilidade conformacional e térmica para a proteína ser funcionalmente ativa, assim como a importância dos motivos conservados DGA (Aspartato-Glicina-Alanina) e RHR (Arginina-Histidina-Arginina) para a atividade da Sau_DacA. O loop L5 localizado entre o sítio ativo e a interface dimérica mostrou-se relevante, uma vez que nele é encontrado o motivo DGA - de ligação ao ATP - e o mesmo encontra-se estabilizado em uma posição favorável para ligação do ATP, apenas na conformação dimérica da proteína. Nossos resultados aliados a dados da literatura possibilitaram a proposição de um mecanismo de síntese de c-di-AMP que deve ocorrer via encontro face-a-face de dois sítios de ligação de ATP presentes em dímeros proteicos distintos, podendo a taxa de síntese de o nucleotídeo sofrer interferência via interação proteína-proteína com a proteína receptora de sinal Sau_YbbR. Desta forma, contribuímos para uma melhor compreensão da estrutura e função da Sau_DacA, possibilitando o uso desta como alvo para o desenvolvimento de novos fármacos, uma vez que é sabido que a biossíntese de c-di-AMP é essencial para a maioria dos patógenos que o sintetizam. / Recently, a new bacterial signaling molecule, the dimeric cyclic AMP (c-di-AMP) has emerged as a central regulator of essential physiological processes, such as cell wall homeostasis, DNA integrity and bacterial virulence, among others. C-di-AMP is synthesized from two molecules of adenosine triphosphate (ATP) by proteins containing DisA_N domain, also called diadenilato cyclases (DACs). A survey in the Protein Families Database database (Pfam) found 2842 protein sequences containing the DAC domain, from 2386 different organisms. These proteins are divided into subfamilies and the three most abundant are: DacA (69,1%), a membrane protein associated with intracellular signaling resulting from an external environment change; DisA (24,1%), the first and most widely studied diadenilate cyclase, an intracellular protein found as active octamers in solution which indirectly controls cell division by DNA integrity verification; and DacB (5,5%), a cytoplasmic proteins, particularly expressed during bacterial spores formation. An interesting feature is that most organisms contain just a single and essential DAC-protein. Organisms containing two or more DAC-containing proteins, such as Clostridium and Bacillus spp., are exceptions. In Staphylococcus aureus (S. aureus), an opportunistic human pathogen responsible for some life-threating diseases, there is a single membrane attached diadenilate cyclase, hanging in the inner portion of the cell membrane (Sau_DacA). The activity of this protein is potentially regulated through direct interaction with YbbR, which contains an extracellular sensor domain. Sau_DacA conserves all key elements of bacterial di-adenylate cyclase, and for being the only di-adenylate cyclase from S. aureus, proves to be an excellent study target for new therapeutic purposes. However, to date, there is a lack of information about structure, c-di-AMP synthesis mechanism and regulation of nucleotide synthesis by Sau_DacA. Therefore, in this context the present work aims to contribute. Through a series of structural, calorimetric, spectroscopic and biochemical assays combined with site-directed mutations, we solved the structure of a soluble construct of Sau_DacA and identified a dimeric interface relevance for the conformational and thermal stability to the protein. This dimer is functionally active and highlights the importance of conserved motifs DGA (Aspartate-Glycine-Alanine) and RHR (Arginine-Histidine-Arginine) for the activity of Sau_DacA. The L5 loop, located between the active site and the dimer interface where is allocated the ATP binding motif (DGA), is stabilized in a favorable position for ATP binding, just in protein dimeric conformation. Our results combined with literary allowed us infer the synthesis of c-di-AMP occurs by face-to-face encounter of two distinct ATP binding site and its rate of synthesis could be regulated through direct protein interaction with. In this way, we contribute to a better understanding of Sau_DacA structure and function, assisting in its use as a target for new drugs development since it is known the biosynthesis of c-di-AMP is essential for most pathogens that synthesize.

No description available.

名古屋大学博士学位論文 学位の種類 : 博士(医学)(課程) 学位授与年月日:平成23年3月25日 亀ヶ谷太一氏の博士論文として提出された

No description available.

No description available.

Lebewesen nutzen nukleotid-basierte sekundäre Botenstoffe um extra- und intrazelluläre Signale zur Induktion einer entsprechenden Zellantwort weiterzuleiten. Das zyklische Dinukleotid c-di-AMP steuert verschiedene physiologische Prozesse und ist für viele Bakterien unter bestimmten Bedingungen essentiell. Dieses Signalmolekül muss präzise reguliert werden, da seine Akkumulation oft toxisch ist. Diadenylatzyklasen mit einer DAC-Domäne synthetisieren c-di-AMP, welches von Phosphodiesterasen (PDE) mit DHH/DHHA1- oder HD-Domänen abgebaut wird. Streptomyceten sind im Boden lebende, Gram-positive Actinobakterien mit einem komplexen Lebenszyklus, während welchem sie vielzählige sekundäre Metabolite, inklusive Antibiotika, produzieren. Die Regulierung des zellulären c-di-AMP und seine Bedeutung in der Streptomyceten-Biologie waren zu Beginn dieser Studie weitgehend unbekannt. Zur c-di-AMP-Synthese nutzen Streptomyces die DAC DisA, besitzen aber keine der typischen PDEs sowie die meisten der bekannten c-di-AMP-bindenden Effektoren. Diese Arbeit zeigt, dass DisA die wichtigste c-di-AMP-Synthetase in Streptomyces venezuelae ist. AtaC wurde als eine PDE identifiziert, welche eine neue Klasse von c-di-AMP PDEs begründet. Während eine ataC-Deletion zu Störungen in Differenzierung und Wachstum in S. Venezuelae führt, führt die Inaktivierung von disA zur Sensitivität gegenüber erhöhten Konzentrationen von monovalenten Kationen im Medium. CpeA und CpeD wurden als erste c-di-AMP-bindende Proteine im Streptomyces Signalnetzwerk charakterisiert. Die entsprechenden Gene sind in Operons mit putativen Kation/Proton-Antiportern cpeB bzw. cpeE kodiert und die jeweiligen Genprodukte interagieren c-di-AMP-abhängig in vivo. Obwohl Deletion von cpe und Überexpression von cpeABC in S. venezuelae keine Phänotypen zeigten, verbesserte die CpeABC-Expression in Escherichia coli das Wachstum in Kalium-supplementierten Medien, was auf eine Funktion von cpe in der Regulation von Kalium hindeutet. / Nucleotide second messengers are used by all forms of life to transduce extra and intracellular signals and translate them into a physiological cell response. The cyclic dinucleotide c-di-AMP is a signaling molecule involved in diverse functions in bacterial physiology and is essential for many bacteria under certain growth conditions. However, this second messenger has to be tightly regulated since increased levels of c-di-AMP can be toxic. In many bacteria diadenylate cyclases with a conserved DAC domain synthesize c-di-AMP and phosphodiesterases (PDEs) with a DHH/DHHA1 or HD domain degrade it. Streptomyces spp. are soil-inhabiting gram-positive Actinobacteria characterized by a sophisticated developmental life cycle during which they produce various secondary metabolites, including antibiotics. The regulation and role of c-di-AMP is not well understood in Streptomyces biology. For c-di-AMP synthesis, streptomycetes utilize the DAC DisA but do not encode any canonical PDE and most of the known effector proteins for c-di-AMP signal transduction are absent. In this work, I demonstrated that DisA is the primary c-di-AMP synthetase in Streptomyces venezuelae and characterized AtaC as the founding member of a novel class of c-di-AMP-specific PDEs. In S. venezuelae, deletion of ataC interferes with development and growth, whereas disA inactivation affects bacterial survival under high ion osmotic stress conditions. Further, I identified CpeA and CpeD as the first c-di-AMP-binding proteins in Streptomyces. The respective genes are encoded in operons with the predicted cation/proton antiporters cpeB and cpeE, respectively, and the gene products interact in vivo in a c-di-AMP-dependent manner. Although neither cpe deletion nor overexpression of cpeABC produced a phenotype in S. venezuelae, expression of cpeABC in Escherichia coli improved growth in liquid media supplemented with potassium, suggesting that Cpe transporters are involved in potassium homeostasis.

No description available.

No description available.

No description available.