Streptococcus pyogenes ist ein humanpathogenes Bakterium, welches verschiedene Gewebe besiedeln kann und dadurch unterschiedliche Krankheiten verursacht. Die enorme Anpassungsfähigkeit des Bakteriums beruht auf dessen Fähigkeit, verschiedene, vom Wirt induzierte Stresskonditionen zu ertragen. Genetische Faktoren, die in diesem Zusammenhang eine Rolle spielen, sind Toxin-Antitoxin (TA) Systeme. Typ II TA Systeme kodieren für zwei Proteine, ein Toxin und ein Antitoxin, die einen stabilen TA Komplex bilden. Verschlechtern sich die Wachstumsbedingungen, kann das Antitoxin proteolytisch abgebaut werden, wodurch das freigesetzte Toxin essentielle zelluläre Prozesse des Bakteriums inhibiert. In dieser Studie charakterisierte ich zwei chromosomal kodierte ParDE TA Systeme des pathogenen Bakteriums S. pyogenes. Ähnlich zu anderen Systemen werden das Toxin und das Antitoxin beider hier charakterisierten Systeme co-transkribiert und durch Stresseinwirkung (z.B. Aminosäure-mangel) induziert. Zudem konnten weitere posttranskriptionelle bzw. posttranslationale Mechanismen zur Regulierung der Genexpression beider Systeme nachgewiesen werden. Die extrachromosomale Expression der Toxine ParE1 und ParE2 führten in S. pyogenes und Escherichia coli zum Zelltod, wobei die Co-expression der entsprechenden Antitoxine ParD1 und ParD2 die Toxizität minderte. Allerdings verursachte die Überexpression der Antitoxine allein ebenfalls eine Inhibierung des Zellwachstums. ParD1 hemmte die Zellteilung in E. coli, wobei der N-Terminus des Proteins entscheidend für diesen Effekt zu sein schien. Zusammengefasst erweitern die Ergebnisse dieser Arbeit unser Verständnis von ParE Toxinen und verdeutlichen die diversen Mechanismen, welcher sich TA Systeme bedienen, um die bakterielle Physiologie zu beeinflussen. Zusätzlich gibt diese Arbeit einen Einblick in mögliche Mechanismen, die S. pyogenes implementiert, um Stresskonditionen im Wirt zu überdauern. / Streptococcus pyogenes is a human pathogen with a remarkable ability to colonize different tissues and to endure diverse host-induced stress conditions through mechanisms that have yet to be fully understood. One strategy employed by bacteria to cope with changing environments are toxin-antitoxin (TA) genetic modules. Under non-ideal conditions, the antitoxin is subject to proteolysis and thus the freed toxin protein can target crucial pathways in the cell modulating bacterial growth. This study, describes the characterization of two chromosomally encoded ParDE-like TA systems from the human pathogen S. pyogenes. The antitoxin-toxin genes of the parDEF1 and parDE2 TA systems are co-transcribed and triggered by stress-induced conditions. The parDE2 TA showed an inspected mRNA processing under amino acid starvation which suggest a putative post-transcriptional regulation. At the post-translational level, both systems are controlled by ClpXP antitoxin-protein degradation in vivo, an important factor for TA triggering. Furthermore, bacterial plasmid-based expression of the toxins ParE1 and ParE2 resulted in effects in cell viability while the antitoxin molecules ParD1 and ParD2 were able to prevent the toxins lethality, respectably. Unlike canonical antitoxins, both ParD1 and ParD2 molecules also displayed deleterious effects, which seemed to be exclusive and related with the N-terminus domain potentially involved in DNA-interaction. Finally, the ParE toxins presented remarkable plasticity, able to harm not only gyrase but also topoisomerase IV, two important bacterial drug targets that modulate DNA-topology. These results expand the view on the ParE molecular targets and highlight the diverse mechanisms TAs employ to modulate bacterial physiology. We also provide more insights into possible mechanisms that S. pyogenes employs to endure stress in the host and efficiently cause disease.

Die Entwicklung des grampositiven Bodenbakteriums Streptomyces ist in einem komplexen Lebenszyklus koordiniert, bestehend aus drei Stufen: vegetativem Hyphenwachstum, Luftmycelbildung und Sporulation. C-di-GMP kontrolliert die Enwicklung über zwei Effektorproteine: dem Masterregulator BldD und dem Anti-Sigmafaktor RsiG. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das membranständige GGDEF-EAL Protein CdgC eine wichtige aktive Diguanylatzyklase (DGC) in S. venezuelae ist. Chromosomale Deletion von cdgC führte zu einer flachen, gräulichen Koloniemorphologie mit radialen Stegen und hydrophiler Oberfläche sowie zu frühzeitiger Sporulation ohne Lufthyphenbildung. Phänotypische Analysen zeigten, dass die DGC-Aktivität von CdgC essentiell ist für dessen biologische Rolle und deuten auf einen zusätzlichen Protein-spezifischen morphologischen Effekt von CdgC hin. CdgC-FLAG akkumuliert im Laufe des Lebenszyklus und scheint BldD-abhängig über eine c-di-GMP vermittelte Feedbackschleife reguliert zu werden. Frühere RNA-seq Daten, verifiziert für repräsentative Gene mittels qRT-PCR, deuten eine differentielle Expression der Bestandteile des hydrophoben Mantels als Ursache der Lufthyphendefizienz an. Konfokalmikroskopische Aufnahmen des bakteriellen Tubulin-Homologons FtsZ deuten einen c-di-GMP-sensitiven Einfluss von CdgC auf die Koordination der Zellteilung an. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass CdgC mit sich selbst sowie drei potentiellen Membranproteinen interagiert. Demnach trägt CdgC zur Koordination von Zellteilungs- und hydrophoben Zelloberflächenproteinen bei und beeinflusst damit c-di-GMP-abhängig den Zeitpunkt der Sporenbildung. Insgesamt führt diese Studie CdgC als GGDEF-EAL-Tandemprotein mit spezifischem Knockout- Phänotyp ein, der von seiner DGC-Aktivität sowie seinem Membrananker bestimmt wird. Zudem ist CdgC, als Reaktion auf eine noch unbekannte Signalübertragungskaskade, an der Koordinierung von Zeitpunkt und Verlauf der Sporulation ausschlaggebend beteiligt. / The proliferation of Gram-positive soil bacteria Streptomyces is temporally and genetically coordinated with a complex developmental life cycle, including three main stages of differentiation: vegetative hyphal growth, formation of aerial mycelium and sporulation. The key factor of Streptomyces developmental control is c-di-GMP with to-date two identified effector proteins: the master regulator BldD and the anti-sigma factor RsiG. In this thesis, the membrane-associated GGDEF-EAL protein CdgC, was identified as a major active diguanylate cyclase (DGC) in S. venezuelae. Deletion of cdgC results in the unique flat gray colony morphology with radial wrinkles and a hydrophilic surface, that shows enhanced sporulation without forming aerial hyphae. Phenotypic analyses suggest, that the DGC activity is essential for its biological role, but hint to an additional protein specific role. The protein levels of CdgC-FLAG were found to accumulate during the life cycle of S. venezuelae. Further investigation of CdgC-FLAG in a strain carrying a DNA-binding deficient BldD_D116A allele indicated, that BldD represses the expression of CdgC in a regulatory feedback loop along with the DGCs CdgA, CdgB and CdgE. RNA‐sequencing data indicated that reduced expression levels of the major compounds of the hydrophobic sheath result in the initiation of sporulation out of the vegetative mycelium and were verified for representative examples via qRT-PCR. Confocal microscopic imaging of the bacterial tubulin homolog FtsZ indicated a contribution of CdgC via its DGC activity in coordination of the cell division. In addition, BTH screenings revealed self-interaction and identified three membrane associated interaction partners. In conclusion, this study introduces the GGDEF-EAL tandem protein CdgC, whose specific knockout phenotype is governed by its DGC activity and membrane association. CdgC seems to drive timing and mode of sporulation in response to an unknown signal to a major extend.

Streptomyceten weisen einen komplexen Lebenszyklus auf, dessen Verlauf durch den sekundären Botenstoff Bis-(3´- 5´)-zyklisches dimeres Guanosinmonophosphat (c-di-GMP) und die c-di-GMP-Effektorproteine BldD und RsiG reguliert wird. Der Auf- bzw. Abbau von c-di-GMP wird von Diguanylatzyklasen (DGC) mit GGDEF-Domänen bzw. Phosphodiesterasen (PDE) mit EAL- oder HD-GYP-Domänen katalysiert. In S. venezuelae, einem Modellorganismus der Streptomyceten, konnten zehn potenziell c-di-GMP metabolisierende Enzyme identifiziert werden, von welchen mit RmdA und RmdB zwei GGDEF-EAL-Tandem-Proteine im Fokus dieser Arbeit stehen. Die chromosomale Deletion der für RmdA und RmdB kodierenden Gene führt zu einer ausgeprägten Verzögerung der Entwicklung in S. venezuelae. Mit Hilfe chromosomaler Mutationen konnten die EAL-Motive der EAL-Domänen als essenziell für die in vivo Funktion beider Proteine identifiziert werden. Beide Proteine zeigen in vitro PDE-Aktivität und RmdA konnte als bifunktionales Enzym charakterisiert werden, da es in vitro auch DGC-Aktivität aufweist. Mittels Nukleotidextraktionen konnte RmdB als Haupt-PDE in S. venezuelae identifiziert werden, welche über den gesamten Entwicklungsverlauf für den Abbau von c-di-GMP verantwortlich ist. Aber auch RmdA hat während des Übergangs von der vegetativen zur reproduktiven Wachstumsphase Einfluss auf die globale zelluläre c-di-GMP Konzentration. Durchgeführte Transkriptomanalysen und qRT-PCR-Experimente ergaben, dass in den Deletionsmutanten die Expression einiger wichtiger entwicklungsspezifischer Gene im Vergleich zum Wildtyp herunterreguliert ist. Dies ist vermutlich auf die erhöhten c-di-GMP Konzentrationen in den Deletionsmutanten zurückzuführen, wodurch die Aktivität der c-di-GMP-Effektorproteine BldD und RsiG beeinflusst wird und die verzögerte Entwicklung der Deletionsmutanten erklärt werden kann. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass RmdB mit dem Sigmafaktor der Sporulation, WhiG, interagieren kann. / Streptomycetes show a complex life cycle. The transition between the different developmental stages is regulated by the secondary messenger bis- (3´- 5´) -cyclic dimeric guanosine monophosphate (c-di-GMP) and the c-di-GMP effector proteins BldD and RsiG. c-di-GMP is synthesized by diguanylate cyclases (DGCs) with GGDEF domains, and its degradation is catalyzed by phosphodiesterases (PDE) with EAL or HD-GYP domains. In S. venezuelae, the Streptomyces strain which was used as a model organism in this work, there are ten potentially c-di-GMP metabolizing enzymes, of which two GGDEF-EAL tandem proteins, RmdA and RmdB, are the focus of this work. The deletion of the genes coding for RmdA and RmdB leads to a pronounced developmental delay in S. venezuelae. With the help of chromosomal mutations, the EAL motif was identified as essential for the in vivo function of RmdA and RmdB. Furthermore, both proteins were characterized in vitro as active PDEs and RmdA as a bifunctional enzyme, which also showed DGC activity. RmdB was identified as the master PDE in S. venezuelae by means of nucleotide extraction and is responsible for the hydrolysis of c-di-GMP over the course of development investigated. Also RmdA has an influence on the global cellular c-di-GMP concentration during the transition from the vegetative to the reproductive growth phase. A transcriptome analysis, qRT-PCR experiments and related follow-up experiments showed that the deletion of rmdA and rmdB leads to a differential expression of genes which code for important development-specific factors and regulators. This is presumably due to the increased c-di-GMP concentrations in the deletion mutants, with the c-di-GMP effector proteins BldD and RsiG delaying the transition to the next growth phase. Furthermore, it could be shown that RmdB can interact with the sigma factor of sporulation, WhiG.

Lebewesen nutzen nukleotid-basierte sekundäre Botenstoffe um extra- und intrazelluläre Signale zur Induktion einer entsprechenden Zellantwort weiterzuleiten. Das zyklische Dinukleotid c-di-AMP steuert verschiedene physiologische Prozesse und ist für viele Bakterien unter bestimmten Bedingungen essentiell. Dieses Signalmolekül muss präzise reguliert werden, da seine Akkumulation oft toxisch ist. Diadenylatzyklasen mit einer DAC-Domäne synthetisieren c-di-AMP, welches von Phosphodiesterasen (PDE) mit DHH/DHHA1- oder HD-Domänen abgebaut wird. Streptomyceten sind im Boden lebende, Gram-positive Actinobakterien mit einem komplexen Lebenszyklus, während welchem sie vielzählige sekundäre Metabolite, inklusive Antibiotika, produzieren. Die Regulierung des zellulären c-di-AMP und seine Bedeutung in der Streptomyceten-Biologie waren zu Beginn dieser Studie weitgehend unbekannt. Zur c-di-AMP-Synthese nutzen Streptomyces die DAC DisA, besitzen aber keine der typischen PDEs sowie die meisten der bekannten c-di-AMP-bindenden Effektoren. Diese Arbeit zeigt, dass DisA die wichtigste c-di-AMP-Synthetase in Streptomyces venezuelae ist. AtaC wurde als eine PDE identifiziert, welche eine neue Klasse von c-di-AMP PDEs begründet. Während eine ataC-Deletion zu Störungen in Differenzierung und Wachstum in S. Venezuelae führt, führt die Inaktivierung von disA zur Sensitivität gegenüber erhöhten Konzentrationen von monovalenten Kationen im Medium. CpeA und CpeD wurden als erste c-di-AMP-bindende Proteine im Streptomyces Signalnetzwerk charakterisiert. Die entsprechenden Gene sind in Operons mit putativen Kation/Proton-Antiportern cpeB bzw. cpeE kodiert und die jeweiligen Genprodukte interagieren c-di-AMP-abhängig in vivo. Obwohl Deletion von cpe und Überexpression von cpeABC in S. venezuelae keine Phänotypen zeigten, verbesserte die CpeABC-Expression in Escherichia coli das Wachstum in Kalium-supplementierten Medien, was auf eine Funktion von cpe in der Regulation von Kalium hindeutet. / Nucleotide second messengers are used by all forms of life to transduce extra and intracellular signals and translate them into a physiological cell response. The cyclic dinucleotide c-di-AMP is a signaling molecule involved in diverse functions in bacterial physiology and is essential for many bacteria under certain growth conditions. However, this second messenger has to be tightly regulated since increased levels of c-di-AMP can be toxic. In many bacteria diadenylate cyclases with a conserved DAC domain synthesize c-di-AMP and phosphodiesterases (PDEs) with a DHH/DHHA1 or HD domain degrade it. Streptomyces spp. are soil-inhabiting gram-positive Actinobacteria characterized by a sophisticated developmental life cycle during which they produce various secondary metabolites, including antibiotics. The regulation and role of c-di-AMP is not well understood in Streptomyces biology. For c-di-AMP synthesis, streptomycetes utilize the DAC DisA but do not encode any canonical PDE and most of the known effector proteins for c-di-AMP signal transduction are absent. In this work, I demonstrated that DisA is the primary c-di-AMP synthetase in Streptomyces venezuelae and characterized AtaC as the founding member of a novel class of c-di-AMP-specific PDEs. In S. venezuelae, deletion of ataC interferes with development and growth, whereas disA inactivation affects bacterial survival under high ion osmotic stress conditions. Further, I identified CpeA and CpeD as the first c-di-AMP-binding proteins in Streptomyces. The respective genes are encoded in operons with the predicted cation/proton antiporters cpeB and cpeE, respectively, and the gene products interact in vivo in a c-di-AMP-dependent manner. Although neither cpe deletion nor overexpression of cpeABC produced a phenotype in S. venezuelae, expression of cpeABC in Escherichia coli improved growth in liquid media supplemented with potassium, suggesting that Cpe transporters are involved in potassium homeostasis.